Denne protokollen mål bestemte celler i vev for bildebehandling nanoskala oppløsning bruker en scanning elektron mikroskop (SEM). Stort antall serielle inndelinger fra harpiks-innebygd biologisk materiale er først fotografert i en lys mikroskop å identifisere målet og deretter i en hierarkisk måte i SEM.
Målretting bestemte celler ultrastructural oppløsning i en mikset-celle befolkningen eller en vev kan oppnås ved hierarkisk bildevisning på en kombinasjon av lys og elektronmikroskop. Innebygd i harpiks er delt i matriser bestående av bånd av hundrevis av ultrathin deler og avsatt på biter av silisium wafer eller conductively belagt coverslips. Matriser er avbildet med lav oppløsning ved hjelp av en digital forbrukeren som smarttelefon kamera eller lys mikroskopet (LM) for en rask stort område oversikt, eller et bredt felt fluorescens mikroskop (fluorescens * lys (FLM)) etter merking med fluorophores. Etter post med tungmetaller er matriser avbildet i en scanning elektron mikroskop (SEM). Valg av mål er mulig fra 3D rekonstruksjoner generert av FLM eller 3D rekonstruksjoner laget av SEM bildestakker med middels oppløsning hvis ingen fluorescerende markører. For ultrastructural analyse, valgte målene er endelig registrert i SEM i høy oppløsning (noen nanometer bildepiksler). Et bånd-håndtering verktøy som kan retrofitted til alle ultramicrotome er vist. Det hjelper med matrise produksjon og underlaget fjerning fra snitting kniv båten. En programvareplattform som lar automatisk bildebehandling matriser i SEM er diskutert. Sammenliknet med annen metoder generere store volum EM data, for eksempel seriell blokk-ansikt SEM (SBF-SEM) eller fokusert ion beam SEM (FIB-SEM), denne tilnærmingen har to store fordeler: (1) harpiks-embedded prøven er bevart, om enn på en skiver opp versjon. Det kan være farget på ulike måter og fotografert med forskjellige oppløsninger. (2) som delene kan være etter farget, er det ikke nødvendig å bruke prøver sterkt blokk-farget med tungmetaller å innføre kontrast for SEM imaging eller gjengi vevet blokker ledende. Dette gjør metoden gjelder for en rekke materialer og biologiske spørsmål. Spesielt prefiks materialer f.eksfra biopsi banker og patologi labs, kan direkte innebygd og rekonstruert i 3D.
Rekonstruere store mengder vev ultrastructural oppløsning på en rekke ulike tenkelig tilnærminger basert på SEM har vært brukt1: omfattende vurderinger er tilgjengelige f.eks., for SBF-SEM2, LØGN-SEM3og matrise Tomografi (AT)4. Mens for sistnevnte utvalget materialet er bevart som en matrise av føljetong inndelinger på et substrat, er SBF-SEM og LØGN-SEM destruktive metoder, arbeider på prøven blokken og forbruker det. under bildebehandling. På grunn av lading av harpiks i SEM, avhenge de også sterkt metalized eksempel blokker5.
På den annen side, kan identifisere bestemte celler eller strukturer av interesse i en Vevsprøve tjene spesielt fra correlative lys og elektronmikroskop (CLEM)6,7,8. Bruke FLM for målretting utelukker anvendelse av store mengder heavy metal siden dette ville slukke fluorescens signal9. For slik bare litt metalized prøver er AT metoden for valg siden matriser kan lett bli etter beiset med heavy metal etter LM bildebehandling. Videre nesten alle prøvetype kan brukes for AT, selv rutinemessige prøver fra patologens treasure chest10.
En annen stor fordel av AT er potensialet for hierarkisk11 eller flere resolution tenkelig12: det er ikke nødvendig å image alt på høy oppløsning, som mål kan velges i en annen modalitet (f.eksFLM) eller i SEM-bilder med lav oppløsning. Imaging bare interessant regionene i en vev eller celle befolkningen på høy oppløsning lagrer digitale data lagringen mellomrom og produserer mindre bilde datasett, som er lettere å håndtere. Her AT arbeidsflyten er demonstrert ved hjelp av et heller svakt metalized utvalg: høytrykk frosset planterøttene (Arabidopsis thaliana) innebygd i hydrofile harpiks.
Hvordan arrayene er forberedt, beiset og fotografert både FLM og SEM, og hvordan bildestakker er registrert er forklart. Også, hvordan 3D rekonstruksjon av FLM volumet kan brukes til å velge bestemte celler for bildebehandling i SEM nanoskala oppløsning er illustrert.
En arbeidsflyt for å målrette bestemte celler innenfor en vev av multimodal hierarkisk AT ble demonstrert: en harpiks-embedded prøven er snittet opp til matriser av føljetong seksjoner, som er plassert på en ledende underlaget ved hjelp av en tilpasset designet substrat holder. Etter merking med en fluorophore og bildebehandling i FLM, er rekonstruert volumet brukt for å velge målet celler. Etter flere flekker runder med tungmetaller å innføre kontrast, er disse målene avbildes over flere hundre deler på nanoskala oppløsning i en SEM bruker en automatisert programvare-plattformen.
For produksjon av tett pakket matriser med flere lange bånd, er en substrat holder ligner på det som er beskrevet her nødvendig. En dyktig og tålmodig person kanskje kunne knytte flere bånd til et silisium substrat semi midt i kniv båten, og hente matrisen ved å gradvis redusere vannstanden til bånd sitter på underlaget. I det vår erfaring, det er en tendens til å knuse formasjon når underlaget er berøre noen del av kniv båten (jf Merk i 1.3.2 i protokollen). I tillegg denne prosedyren er mye vanskeligere med ITO-belagt underlag: (1) fordi gjennomsiktighet ITO-glass, er det vanskelig å se kanten av vannet der endene av bånd må knyttes; og (2) ITO-belagt overflaten er mye grovere enn blankpolert silisium kjeks, bånd tendens til å bryte under heis og mindre fragmenter som består av noen deler kan flyte, dermed ødelegge rekkefølgen på delene.
Hele arbeidsflyten er også mulig uten sammenheng FLM data. I dette tilfellet må datainnsamling i SEM utføres i flere økter. En første 3D rekonstruksjon eller i det minste vurdere lav eller middels oppløsning data kan være nødvendig å identifisere mål. I tillegg kan konvensjonelle histologiske flekker for brightfield LM (ikke krever FLM) brukes. Andre alternativer6,7,8 er selvsagt antistoff merking på matriser, som allerede demonstrert i første avisen på18eller genetisk kodet fluorescerende proteiner (XFPs) eller pre innebygging merking med bevaring av fluorescens under eksempel forberedelse.
En generell begrensning av metoden diskutert er bruk av deler av enkelte tykkelse og den resulterende diskret utvalg av 3D-volumet: oppløsning i Z kan bare være så god som tykkelsen på delene siden SEM samler bare data fra delen overflaten (d epending på primær energi/destinasjonsside energi valgt). Dette betyr at det resulterende 3D-volumet har Anisotrop voxels, f.eks., 5 x 5 x 100 nm3 hvis 100 nm seksjoner og en bildestørrelse for piksel 5 nm brukes. For svært små enheter i en størrelse utvalg under 1 µm, kan dette ikke være tilstrekkelig for en sann ultrastructural beskrivelse. En mer teknisk begrensning er nøyaktigheten av scenen brukes i SEM for automatisert imaging. På grunn av dette er det nødvendig å velge en avkastning som er større enn spesifikasjoner på scenen nøyaktigheten garantere at hele målområdet er fotografert.
Sammenlignet SBF-SEM og LØGN-SEM som blokk-ansikt tenkelig metoder, har correlative på den definitive ulempen av Anisotrop voxels, som beskrevet ovenfor. Med liten LØGN-SEM, kan isotropic voxels av 5 x 5 x 5 nm3 hentes når en riktig drift korreksjon er på plass.
Hull i rekonstruert volumet på grunn av tap av delene av matriser kan også være en bekymring som ikke oppstår med SBF-SEM eller LØGN-SEM. Med god bånd stabilisering av lim, er dette vanligvis bare et problem for den siste delen av et bånd: det kan bli skadet når slippe det fra knivblad bruker øyenvippe. Men i vår erfaring påvirker tap av ett avsnitt i hver 20-50 deler ikke bildet registrering.
På den annen side, gir at etter stain matriser god signal og kontrast for SEM bildebehandling, selv om svakt metalized prøver som høytrykk frosset rot tips vises her. Derfor er det ikke nødvendig å invadere optimal ultrastructural bevaring av mange kjemiske fiksering og metallization trinn. Også leverer rutinemessig prøver fra patologi lab med middels grad av metallization utmerket data10. Slike en post innebygging kontrastforbedring er ikke mulig for SBF-SEM og LØGN-SEM generelt. Videre, siden disse metodene er destruktive, dvsforbruker prøven under bildebehandling, hierarkisk imaging på forskjellige oppløsninger og nettsteder eller gjentatte bildebehandling på senere punkter i tid er umulig. I prinsippet ubegrensede volumer, bestående av store FOVs (f.ekstil flere millimeter for hele musen hjerner i connectomics) opprettet av søm mosaikker og stort antall inndelinger kan skaffes ved AT, mens i FIB-SEM, FOVs utover 100 µm x 100 µm er vanskelig å oppnå med rutinemessig instrumenter.
Ytterligere automatisering av beskrevet AT-arbeidsflyten vil være en klar fordel, siden de nevnte metodene SBF-SEM og LØGN-SEM utføre både snitting og bildebehandling innenfor den samme instrumentet i en fullt automatisert måte. En slags automatisering av skjæring eksisterer: The ATUMtome12 kan generere og samle tusenvis av delene, men bruk av Kapton tape som et gjør slike matriser vanskelig å image i en FLM. På den ITO-belagt coverslips brukt her, bør med super oppløsning imaging være mulig. En ytterligere, svært ønskelig mål for automatisering ville være innspillingen av FLM data stabler. På den annen side, automatisering kan være dyrt og unntatt substrat innehaveren, arbeidsflyten presenteres her bruker (i form av maskinvare) bare instrumentering vanligvis tilgjengelig i rutinemessig EM laboratorium eller core anlegg, gjør det lav få tilgang.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av grant FKZ 13GW0044 fra det tyske føderale ministeriet for utdanning og forskning, prosjektet MorphiQuant-3D. Vi takker Carolin Bartels for kundestøtte.
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |