Detta protokoll riktar särskilda celler i vävnad för avbildning i nanoskala upplösning använder ett svepelektronmikroskop (SEM). Stort antal seriella sektioner från harts-embedded biologiskt material är först avbildas i ett ljusmikroskop att identifiera mål och sedan i hierarkiskt i SEM.
Inriktning på specifika celler på ultrastrukturella upplösning inom en blandad cell befolkningen eller en vävnad kan uppnås genom hierarkiska bildåtergivning med en kombination av ljus- och elektronmikroskopi. Prover som inbäddade i harts sektioneras till arrayer bestående av band av hundratals ultrathin sektioner och deponeras på bitar av kisel wafer eller konduktivt belagda coverslips. Arrayer är avbildade i låg upplösning med en digital konsumenten som smartphone kamera eller ljusmikroskop (LM) för en snabb stort område översikt eller ett brett fält fluorescens Mikroskop (fluorescens ljusmikroskopi (FLM)) efter märkning med fluorophores. Efter efter färgning med tungmetaller, är matriser avbildade i ett svepelektronmikroskop (SEM). Val av mål är möjligt från 3D rekonstruktioner genereras av FLM eller 3D rekonstruktioner gjort från de SEM bildstaplar mellanliggande upplösningen om ingen fluorescerande markörer är tillgängliga. För ultrastrukturella analys, valda målen redovisas slutligen i SEM på högupplösta (några nanometer bildpixlar). Ett band-hantering-verktyg som kan eftermonteras på alla ultramicrotome demonstreras. Det hjälper med array produktion och substrat borttagning från snittningen kniv båten. En mjukvaruplattform som tillåter automatiserad avbildning av matriser i SEM diskuteras. Detta synsätt jämfört med andra metoder som genererar stor volym EM data, till exempel seriell block-face SEM (SBF-SEM) eller fokuserad ion beam SEM (FIB-SEM), och har två stora fördelar: (1) harts-embedded provet är bevarad, om än i en skivad upp version. Det kan vara målat på olika sätt och avbildas med olika upplösningar. (2) eftersom avsnitten kan färgas efter, är det inte nödvändigt att använda prover starkt block-färgade med tungmetaller att införa kontrast för SEM avbildning eller återge vävnaden block konduktiv. Detta gör metoden tillämpas på en mängd olika material och biologiska frågor. Särskilt lagstadgade material t.ex., från biopsi banker och patologi labs, kan direkt inbäddade och rekonstrueras i 3D.
För att rekonstruera stora volymer av vävnad på ultrastrukturella upplösning har ett antal olika bildgivande metoder som bygger på SEM används1: omfattande recensioner är tillgängliga t.ex., för SBF-SEM2, FIB-SEM3och Array Tomografi (AT)4. Medan för den senare metoden bevaras provmaterialet som en matris av seriell avsnitt på ett substrat, är SBF-SEM och FIB-SEM destruktiva metoder, arbetar på prov blocket och konsumerar det under imaging. På grund av uttag av kådan i SEM, beror de också på starkt metalliserad prov block5.
Däremot, kan att identifiera vissa celler eller strukturer av intresse inom ett vävnadsprov gagna bestämt från korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)6,7,8. Använda FLM för inriktning hindrar tillämpningen av stora mängder tungmetaller eftersom detta skulle släcka fluorescens signal9. För dessa bara något metalliserad prover är AT metoden för val eftersom arrayer kan enkelt efter färgade med tungmetall efter LM imaging. Dessutom nästan alla Provtyp kan användas för AT, även rutin prover från patologens treasure chest10.
En annan stor fördel av AT är potentialen för hierarkiska11 eller flera resolution imaging12: det är inte nödvändigt att bilden allt på högupplösta, som mål kan väljas i en annan modalitet (t.ex., FLM) eller i SEM-bilder med låg upplösning. Imaging bara intressanta regioner i en vävnads- eller befolkning på högupplösta sparar digitala data lagringsutrymme och producerar mindre datamängder i bilden, som är lättare att hantera. Här, vid arbetsflödet är visat ganska svagt metalliserad prov: högtryck fryst växternas rötter (Arabidopsis thaliana) inbäddad i hydrofil harts.
Här förklaras hur arrayer är beredd, målat och avbildas både FLM och SEM och hur bildstaplar registreras. Också, hur den 3D rekonstruktionen av FLM volymen kan användas att välja specifika celler för avbildning i SEM på nanoskala upplösning illustreras.
Ett arbetsflöde för att rikta specifika celler i en vävnad av multimodala hierarkiska AT visades: en harts-embedded provet är skivade i matriser av seriell avsnitt, som är placerade på ett ledande substrat med hjälp av en specialdesignad substrat hållare. Efter märkning med en fluorophore och imaging i FLM, används rekonstruerade volymen för att välja målceller. Efter ytterligare färgning rundor med tungmetaller att införa kontrast, är dessa mål avbildade över flera hundra avsnitt på nanoskala upplösning i en SEM med hjälp av en automatiserad programvaruplattform.
För att producera tätt packade matriser med flera långa band, krävs en substrat hållare liknar den som beskrivs här. En kunnig och tålmodig person kan kunna bifoga flera band till en kisel substrat, delvis nedsänkt i kniv båten, och hämta matrisen genom att gradvis sänka vattennivån tills banden sitter på substratet. Men i den vår erfarenhet, det finns en tendens att splittras bildas när underlaget är att röra någon del av båtens kniv (jfr not i 1.3.2 i protokollet). Detta förfarande är dessutom mycket svårare med ITO-coated underlag: (1) på grund av insyn i ITO-glas, det är svårt att se kanten av vattnet där ändarna av banden har skall bifogas, och (2) eftersom ITO-belagda ytan är mycket grövre än blankpolerade kisel rånet, band tenderar att bryta under lyft och mindre fragment som består av några sektioner kan flyta, därmed förstöra ordningen på avsnitten.
Hela arbetsflödet är också möjlig utan korrelation till FLM data. I det här fallet kan datainsamling i SEM behöva utföras i flera sessioner. En inledande 3D rekonstruktion eller åtminstone utvärdering av låg eller medelhög upplösning data kan vara nödvändigt att identifiera mål. Dessutom kan konventionella histologiska fläckar för brightfield LM (inte kräver FLM) tillämpas. Andra alternativ6,7,8 är naturligtvis antikropp märkning på arrayer, som redan visats i inledande papperet på18, eller genetiskt kodade fluorescerande proteiner (XFP) eller pre inbäddning märkning med bevarande av fluorescens under provberedning.
En allmän begränsning för metoden diskuteras är användningen av delar av en viss tjocklek och resulterande diskret provtagning av 3D-volymen: upplösning i Z kan bara vara lika bra som tjockleken på avsnitten eftersom SEM samlar endast data från avsnitt ytan (d beroende på den primära energi/landning energi valt). Detta innebär att den resulterande 3D-volymen har Anisotrop voxlar, t.ex., 5 x 5 x 100 nm3 om 100 nm sektioner och en pixel bildstorlek 5 nm används. För mycket små enheter i en storlekar nedan 1 µm, kan detta inte vara tillräckligt för en sann ultrastrukturella beskrivning. En mer teknisk begränsning är noggrannheten i den fasen som används i SEM för automatiserad imaging. På grund av detta är det nödvändigt att välja en ROI som är större än specifikationerna på scenen exaktheten att garantera att hela målområdet är avbildade.
Jämfört med SBF-SEM och FIB-SEM som block-face avbildningsmetoder, har korrelativaj slutgiltig nackdelen med anisotropisk voxlar, som beskrivits ovan. Med FIB-SEM, kan isotrop voxlar av 5 x 5 x 5 nm3 erhållas när en korrekt drift korrigering är på plats.
Luckor i rekonstruerade volymen på grund av förlust av sektioner under beredning av matriser kan också vara en oro som inte påträffas med SBF-SEM eller FIB-SEM. Med bra band stabilisering av lim, detta är vanligtvis endast en fråga för den sista delen av ett band: det kan skadas när frigöra den från den knivsegg som använder ögonfrans. Dock i vår erfarenhet påverkar förlusten av ett avsnitt i varje 20 – 50 avsnitt inte bildregistrering.
Möjlighet att efter fläcken matriser ger däremot, bra signal och kontrast för SEM imaging, även på svagt metalliserad prover, såsom det höga trycket fryst roten tips visas här. Därför är det inte nödvändigt att kompromissa optimal ultrastrukturella bevarandet av många kemiska fixering och metallisering steg. Också, rutinprover från patologi labbet med mellanliggande grader av metallisering leverera utmärkta data10. En sådan post inbäddning kontrastförstärkning är inte möjligt för SBF-SEM och FIB-SEM i allmänhet. Dessutom eftersom dessa metoder är destruktiva, dvskonsumerar provet under imaging, hierarkiska imaging på olika upplösningar och platser eller upprepade imaging vid senare tidpunkter i tid är omöjligt. I princip obegränsade volymer, bestående av stora FOVs (t.ex., upp till flera millimeter för hela musen hjärnor i connectomics) skapad av sömmar mosaiker och stort antal sektioner kan förvärvas genom AT, medan i FIB-SEM, FOVs utöver 100 µm x 100 µm är svåra att uppnå med rutinmässiga instrument.
Ytterligare automatisering av beskrivs AT-arbetsflödet skulle vara en klar fördel, eftersom de ovannämnda metoderna SBF-SEM och FIB-SEM utföra både snittning och imaging inom samma instrument på ett helt automatiserat sätt. Ett slags automatisering av sektionering föreligger: The ATUMtome12 kan generera och samla tusentals sektioner, men användningen av Kapton tejp som substrat gör sådana kedjor svårt att bilden i en FLM. På den ITO-belagd coverslips används här, bör även super-upplösning imaging. Ett mer ytterligare, mycket önskvärt mål för automation vore inspelningen av FLM datastackar. Däremot, automation kan vara dyrt och med undantag för innehavaren av substrat, arbetsflödet presenteras här beroende (när det gäller hårdvara) endast instrumentation vanligtvis tillgängliga i en rutinmässig EM laboratorium eller core facility, gör det låg nivå tillgång.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av grant FKZ 13GW0044 från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning, projekt MorphiQuant-3D. Vi tackar Carolin Bartels för teknisk support.
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |