यह प्रोटोकॉल एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग नेनो संकल्प पर इमेजिंग के लिए ऊतक में विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करता है । राल से धारावाहिक वर्गों की बड़ी संख्या में एंबेडेड जैविक सामग्री पहले एक प्रकाश माइक्रोस्कोप में छवि के लिए लक्ष्य की पहचान और फिर SEM में एक पदानुक्रमित तरीके से कर रहे हैं ।
एक मिश्रित कोशिका जनसंख्या या एक ऊतक के भीतर ultrastructural संकल्प पर विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित पदानुक्रमित इमेजिंग प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । राल में एंबेडेड नमूनों ultrathin वर्गों के सैकड़ों के रिबन से मिलकर arrays में खोदी और सिलिकॉन वेफर या conductively लेपित coverslips के टुकड़ों पर जमा कर रहे हैं । arrays कम संकल्प में छवि smartphone कैमरा या प्रकाश माइक्रोस्कोप की तरह एक डिजिटल उपभोक्ता का उपयोग कर रहे है (एल एम) एक तेजी से बड़े क्षेत्र सिंहावलोकन, या एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी (FLM) के लिए fluorophores के साथ लेबल के बाद) । पोस्ट के बाद भारी धातुओं के साथ धुंधला, arrays एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) में imaged हैं । लक्ष्य का चयन FLM द्वारा उत्पंन 3 डी पुनर्निर्माण से या 3 डी पुनर्निर्माण SEM छवि स्टैक्स से मध्यवर्ती संकल्प पर बनाया से संभव है अगर कोई फ्लोरोसेंट मार्करों उपलब्ध हैं । ultrastructural विश्लेषण के लिए, चयनित लक्ष्य अंततः उच्च संकल्प में SEM में दर्ज कर रहे है (कुछ नैनोमीटर छवि पिक्सल) । रिबन-हैंडलिंग उपकरण जो किसी भी ultramicrotome करने के लिए retrofitted किया जा सकता है दिखाया गया है । यह सरणी उत्पादन और खोदी चाकू नाव से हटाने सब्सट्रेट के साथ मदद करता है । एक सॉफ्टवेयर मंच है कि SEM में arrays के स्वचालित इमेजिंग की अनुमति देता है पर चर्चा की है । बड़ी मात्रा EM डेटा जनरेट कर रहा है अन्य विधियों की तुलना में, इस तरह के रूप में धारावाहिक ब्लॉक-चेहरा sem (SBF-sem) या केंद्रित आयन बीम sem (मिथ्या-sem), इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख लाभ है: (1) राल-एंबेडेड नमूना है, हालांकि एक कटा हुआ संस्करण में संरक्षित है । यह विभिन्न तरीकों से सना हुआ हो सकता है और विभिन्न प्रस्तावों के साथ छवि । (2) के रूप में वर्गों के बाद दाग हो सकता है, यह आवश्यक नहीं है के लिए नमूने जोरदार ब्लॉक-भारी धातुओं के साथ सना हुआ SEM इमेजिंग के लिए इसके विपरीत परिचय या ऊतक ब्लॉकों प्रवाहकीय प्रदान करते हैं । यह विधि सामग्री और जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू करता है । बायोप्सी बैंकों और पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं से उदाविशेष रूप से निर्धारित सामग्री, सीधे एंबेडेड और 3 डी में खंगाला जा सकता है ।
ultrastructural संकल्प पर ऊतक की बड़ी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए विभिंन इमेजिंग SEM पर आधारित दृष्टिकोण के एक नंबर का इस्तेमाल किया गया है1: व्यापक समीक्षा उपलब्ध है उदा, SBF के लिए-sem2, मिथ्या-sem3, और सरणी टोमोग्राफी (AT)4। जबकि बाद विधि नमूना सामग्री एक सब्सट्रेट पर धारावाहिक वर्गों की एक सरणी के रूप में संरक्षित है के लिए, SBF-sem और मिथ्या-sem विनाशकारी तरीके हैं, नमूना ब्लॉक पर काम कर रहे हैं और यह इमेजिंग के दौरान खपत. कारण SEM में राल के चार्ज करने के लिए, वे भी दृढ़ता से धातु का नमूना5ब्लॉकों पर निर्भर हैं ।
दूसरी ओर, कुछ कोशिकाओं या एक ऊतक नमूने के भीतर ब्याज की संरचनाओं की पहचान correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों)6,7,8से विशेष रूप से लाभ कर सकते हैं । भारी धातु की बड़ी मात्रा के आवेदन precludes लक्ष्यीकरण के लिए FLM का उपयोग कर के बाद से यह प्रतिदीप्ति संकेत9बुझाना होगा । इस तरह केवल थोड़ा धातु के नमूनों के लिए, पर पसंद की विधि के बाद से arrays आसानी से पोस्ट किया जा सकता है, LM इमेजिंग के बाद भारी धातु के साथ सना हुआ । इसके अलावा, लगभग किसी भी नमूना प्रकार पर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां तक कि पैथोलॉजिस्ट खजाना छाती10से नियमित नमूने.
का एक और बड़ा लाभ पदानुक्रमिक11 या बहु संकल्प इमेजिंग12के लिए क्षमता है: यह उच्च संकल्प पर सब कुछ छवि के लिए आवश्यक नहीं है, लक्ष्य एक अलग तरीके में चुना जा सकता है के रूप में (जैसे, FLM) या में कम संकल्प SEM छवियां । इमेजिंग केवल उच्च संकल्प पर एक ऊतक या कोशिका जनसंख्या के दिलचस्प क्षेत्रों डिजिटल डेटा भंडारण अंतरिक्ष बचाता है और छोटे छवि डेटा सेट है, जो संभाल करने के लिए आसान कर रहे है पैदा करता है । यहां, कार्यप्रवाह में एक बल्कि कमजोर धातु नमूने का उपयोग कर प्रदर्शन किया है: उच्च दबाव जमे हुए संयंत्र जड़ें (Arabidopsis थालियाना) हाइड्रोफिलिक राल में एंबेडेड ।
कैसे arrays, तैयार दाग रहे हैं, और दोनों FLM और SEM में छवि बनाई है, और कैसे छवि स्टैक पंजीकृत है समझाया जाता है । इसके अलावा, कैसे FLM मात्रा के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए नेनो संकल्प में SEM में इमेजिंग के लिए विशिष्ट कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है सचित्र है ।
बहु-मोडल पदानुक्रमित पर एक ऊतक के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक कार्यप्रवाह का प्रदर्शन किया गया था: एक राल-एम्बेडेड नमूना एक कस्टम डिजाइन सब्सट्रेट धारक का उपयोग कर एक प्रवाहकीय सब्सट्रेट पर रखा जाता है, जो धारावाहिक वर्गों के arrays में कटा हुआ है. एक fluorophore और FLM में इमेजिंग के साथ लेबल करने के बाद, पुनर्निर्माण खंड लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । भारी धातुओं के साथ अतिरिक्त दाग दौर के बाद इसके विपरीत परिचय, इन लक्ष्यों को एक SEM में नेनो संकल्प पर कई सौ वर्गों से अधिक छवि एक स्वचालित सॉफ्टवेयर मंच का उपयोग कर रहे हैं ।
कई लंबे रिबन के साथ घनी पैक arrays के उत्पादन के लिए, एक सब्सट्रेट यहां वर्णित एक के समान धारक आवश्यक है । एक कुशल और रोगी व्यक्ति को एक सिलिकॉन सब्सट्रेट करने के लिए कई रिबन संलग्न करने में सक्षम हो सकता है, अर्द्ध चाकू नाव में डूबे, और धीरे से रिबन सब्सट्रेट पर बैठे हैं जब तक पानी के स्तर को कम करने के द्वारा सरणी निकालते हैं. हालांकि, हमारे अनुभव में, वहां के गठन टूटता है जब सब्सट्रेट चाकू नाव (cf. 1.3.2 में प्रोटोकॉल में नोट) के किसी भी हिस्से को छू रहा है की प्रवृत्ति है । इसके अलावा, यह प्रक्रिया बहुत अधिक कठिन है इतो-लेपित सब्सट्रेट्स के साथ: (१) इतो-काँच की पारदर्शिता के कारण, जहाँ रिबन के सिरों को संलग्न करना होता है, वहाँ पानी के किनारे देखना मुश्किल होता है; और (2) क्योंकि इतो लेपित सतह अत्यधिक पॉलिश सिलिकॉन वेफर से ज्यादा मोटा है, रिबन लिफ्ट के दौरान तोड़ने के लिए करते है और छोटे कुछ वर्गों से मिलकर टुकड़े फ्लोट कर सकतेहैं, इस प्रकार वर्गों के आदेश को नष्ट ।
पूरे कार्यप्रवाह भी FLM डेटा के संबंध के बिना व्यवहार्य है । इस मामले में, SEM में डेटा संग्रह कई सत्रों में किया जा करने के लिए हो सकता है । एक प्रारंभिक 3 डी पुनर्निर्माण या कम या मध्यम संकल्प डेटा के कम से मूल्यांकन लक्ष्य की पहचान करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अलावा, brightfield LM (FLM की आवश्यकता नहीं) के लिए पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक दाग लागू किया जा सकता है । बेशक, अंय विकल्प6,7,8 arrays पर लेबल एंटीबॉडी हैं, के रूप में पहले से ही पर प्रारंभिक कागज में प्रदर्शन पर18, या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (XFPs) या पूर्व एंबेडिंग लेबल नमूना तैयारी के दौरान प्रतिदीप्ति के संरक्षण के साथ ।
चर्चा की विधि का एक सामांय सीमा एक निश्चित मोटाई के वर्गों के उपयोग और 3 डी मात्रा के परिणामस्वरूप असतत नमूना है: जेड में संकल्प SEM केवल अनुभाग सतह से डेटा एकत्र के बाद से वर्गों की मोटाई के रूप में के रूप में अच्छा हो सकता है (डी प्राथमिक ऊर्जा/लैंडिंग ऊर्जा पर epending चयनित) । इसका मतलब यह है कि जिसके परिणामस्वरूप 3 डी खंड अनिसोट्रोपिक voxels है, उदा, 5 x 5 x 100 एनएम3 अगर 100 एनएम वर्गों और 5 एनएम के एक छवि पिक्सेल आकार का उपयोग किया जाता है । 1 µm के नीचे आकार श्रेणी में बहुत छोटी एंटिटी के लिए, यह एक सच्चे ultrastructural वर्णन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । एक और तकनीकी सीमा स्वचालित इमेजिंग के लिए SEM में इस्तेमाल मंच की सटीकता है । इस के कारण, यह एक लाभ के लिए मंच सटीकता के विनिर्देशों से बड़ा है कि पूरा लक्ष्य क्षेत्र की छवि है गारंटी का चयन करने के लिए आवश्यक है ।
SBF-sem और मिथ्या-ब्लॉक के रूप में sem-चेहरा इमेजिंग तरीकों की तुलना में, correlative अनिसोट्रोपिक voxels के निश्चित नुकसान है, जैसा कि ऊपर वर्णित है । मिथ्या-SEM के साथ, आइसोट्रोपिक voxels 5 x 5 x 5 एनएम3 प्राप्त किया जा सकता है जब एक उचित बहाव सुधार जगह में है ।
arrays की तैयारी के दौरान वर्गों के नुकसान की वजह से खंगाला मात्रा में अंतराल भी एक चिंता का विषय है कि SBF-sem या मिथ्या-sem के साथ सामना नहीं है हो सकता है । गोंद द्वारा अच्छा रिबन स्थिरीकरण के साथ, यह आमतौर पर केवल एक रिबन के अंतिम खंड के लिए एक मुद्दा है: यह क्षतिग्रस्त हो सकता है जब यह चाकू से रिहा-धार बरौनी का उपयोग कर । हालांकि, हमारे अनुभव में, हर 20 में एक खंड के नुकसान-50 वर्गों छवि पंजीकरण को प्रभावित नहीं करता है ।
दूसरी ओर, संभावना के बाद दाग arrays अच्छा संकेत और SEM इमेजिंग के लिए इसके विपरीत, यहां तक कि उच्च दबाव जमे हुए रूट युक्तियां के रूप में कमजोर धातु के नमूनों पर यहां दिखाया । इसलिए, यह आवश्यक नहीं है कई रासायनिक निर्धारण और धातुरूप कदम द्वारा इष्टतम ultrastructural संरक्षण समझौता । इसके अलावा, धातुरूप के मध्यवर्ती डिग्री के साथ पैथोलॉजी लैब से नियमित नमूने उत्कृष्ट डेटा10उद्धार । इस तरह के बाद एक एंबेडिंग इसके विपरीत वृद्धि SBF-sem और मिथ्या-sem सामांय में के लिए संभव नहीं है । इसके अलावा, के बाद से इन तरीकों विनाशकारी हैं, यानी, इमेजिंग के दौरान नमूना लेने, विभिंन प्रस्तावों और साइटों या समय में बाद में बिंदुओं पर दोहराया इमेजिंग पर पदानुक्रमित इमेजिंग असंभव है । सिद्धांत रूप में, असीमित मात्रा, बड़े FOVs से मिलकर (जैसे, connectomics में पूरे माउस दिमाग के लिए कई मिलीमीटर तक) सिलाई मोज़ाइक द्वारा बनाई गई, और वर्गों की भारी संख्या में द्वारा अधिग्रहीत किया जा सकता है, जबकि मिथ्या-SEM, FOVs परे 100 µm x 100 µm नित्य साधनों से प्राप्त करना कठिन होता है.
पर वर्णित के आगे स्वचालन-कार्यप्रवाह एक निश्चित लाभ होगा, उपर्युक्त तरीकों SBF-sem और मिथ्या-sem दोनों एक ही साधन के भीतर और इमेजिंग प्रदर्शन के बाद से एक पूरी तरह से स्वचालित तरीके से । अनुभाग के स्वचालन के एक प्रकार मौजूद है: ATUMtome12 उत्पंन और वर्गों के हजारों इकट्ठा कर सकते हैं, लेकिन एक सब्सट्रेट के रूप में Kapton टेप का उपयोग ऐसे arrays एक FLM में छवि के लिए मुश्किल बनाता है । पर इतो-लेपित coverslips यहां इस्तेमाल किया, यहां तक कि सुपर संकल्प इमेजिंग संभव होना चाहिए । स्वचालन के लिए एक और, बहुत वांछनीय लक्ष्य FLM डेटा स्टैक की रिकॉर्डिंग होगी । दूसरी ओर, स्वचालन महंगा हो सकता है और सब्सट्रेट धारक के लिए छोड़कर, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह (हार्डवेयर के मामले में) केवल आमतौर पर एक नियमित EM प्रयोगशाला या कोर सुविधा में उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन पर, यह निम्न स्तर का उपयोग कर निर्भर करता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम ग्रांट FKZ 13GW0044 ने जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री फॉर एजुकेशन ऐंड रिसर्च, प्रोजेक्ट MorphiQuant-3d से सपोर्ट किया था । हम तकनीकी सहायता के लिए Carolin Bartels धंयवाद ।
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |