Flere hierarkisk Imaging av føljetong delene for å finne konkrete mobilnettet mål i store volumer

Summary

Denne protokollen mål bestemte celler i vev for bildebehandling nanoskala oppløsning bruker en scanning elektron mikroskop (SEM). Stort antall serielle inndelinger fra harpiks-innebygd biologisk materiale er først fotografert i en lys mikroskop å identifisere målet og deretter i en hierarkisk måte i SEM.

Abstract

Målretting bestemte celler ultrastructural oppløsning i en mikset-celle befolkningen eller en vev kan oppnås ved hierarkisk bildevisning på en kombinasjon av lys og elektronmikroskop. Innebygd i harpiks er delt i matriser bestående av bånd av hundrevis av ultrathin deler og avsatt på biter av silisium wafer eller conductively belagt coverslips. Matriser er avbildet med lav oppløsning ved hjelp av en digital forbrukeren som smarttelefon kamera eller lys mikroskopet (LM) for en rask stort område oversikt, eller et bredt felt fluorescens mikroskop (fluorescens * lys (FLM)) etter merking med fluorophores. Etter post med tungmetaller er matriser avbildet i en scanning elektron mikroskop (SEM). Valg av mål er mulig fra 3D rekonstruksjoner generert av FLM eller 3D rekonstruksjoner laget av SEM bildestakker med middels oppløsning hvis ingen fluorescerende markører. For ultrastructural analyse, valgte målene er endelig registrert i SEM i høy oppløsning (noen nanometer bildepiksler). Et bånd-håndtering verktøy som kan retrofitted til alle ultramicrotome er vist. Det hjelper med matrise produksjon og underlaget fjerning fra snitting kniv båten. En programvareplattform som lar automatisk bildebehandling matriser i SEM er diskutert. Sammenliknet med annen metoder generere store volum EM data, for eksempel seriell blokk-ansikt SEM (SBF-SEM) eller fokusert ion beam SEM (FIB-SEM), denne tilnærmingen har to store fordeler: (1) harpiks-embedded prøven er bevart, om enn på en skiver opp versjon. Det kan være farget på ulike måter og fotografert med forskjellige oppløsninger. (2) som delene kan være etter farget, er det ikke nødvendig å bruke prøver sterkt blokk-farget med tungmetaller å innføre kontrast for SEM imaging eller gjengi vevet blokker ledende. Dette gjør metoden gjelder for en rekke materialer og biologiske spørsmål. Spesielt prefiks materialer f.eksfra biopsi banker og patologi labs, kan direkte innebygd og rekonstruert i 3D.

Introduction

Rekonstruere store mengder vev ultrastructural oppløsning på en rekke ulike tenkelig tilnærminger basert på SEM har vært brukt¹: omfattende vurderinger er tilgjengelige f.eks., for SBF-SEM², LØGN-SEM³og matrise Tomografi (AT)⁴. Mens for sistnevnte utvalget materialet er bevart som en matrise av føljetong inndelinger på et substrat, er SBF-SEM og LØGN-SEM destruktive metoder, arbeider på prøven blokken og forbruker det. under bildebehandling. På grunn av lading av harpiks i SEM, avhenge de også sterkt metalized eksempel blokker⁵.

På den annen side, kan identifisere bestemte celler eller strukturer av interesse i en Vevsprøve tjene spesielt fra correlative lys og elektronmikroskop (CLEM)^6,7,8. Bruke FLM for målretting utelukker anvendelse av store mengder heavy metal siden dette ville slukke fluorescens signal⁹. For slik bare litt metalized prøver er AT metoden for valg siden matriser kan lett bli etter beiset med heavy metal etter LM bildebehandling. Videre nesten alle prøvetype kan brukes for AT, selv rutinemessige prøver fra patologens treasure chest¹⁰.

En annen stor fordel av AT er potensialet for hierarkisk¹¹ eller flere resolution tenkelig¹²: det er ikke nødvendig å image alt på høy oppløsning, som mål kan velges i en annen modalitet (f.eksFLM) eller i SEM-bilder med lav oppløsning. Imaging bare interessant regionene i en vev eller celle befolkningen på høy oppløsning lagrer digitale data lagringen mellomrom og produserer mindre bilde datasett, som er lettere å håndtere. Her AT arbeidsflyten er demonstrert ved hjelp av et heller svakt metalized utvalg: høytrykk frosset planterøttene (Arabidopsis thaliana) innebygd i hydrofile harpiks.

Hvordan arrayene er forberedt, beiset og fotografert både FLM og SEM, og hvordan bildestakker er registrert er forklart. Også, hvordan 3D rekonstruksjon av FLM volumet kan brukes til å velge bestemte celler for bildebehandling i SEM nanoskala oppløsning er illustrert.

Protocol

Merk: Utvalg blokker skal være polymerized og inneholder noen heavy metal. Fiksering og innebygging protokoller for de to utvalgene vises i figur 1A-B har vært beskrevet andre steder¹¹. Kort sagt, var eksemplet i figur 1A kjemisk faste, farget en bloc første med 1% OsO₄, deretter med 1% uranyl acetate, og i Spurrs harpiks. Utvalget vises i figur 1B var høytrykk frosset, fryse erstattet med 0,4% uranyl acetate på aceton, og i Lowicryl HM20 harpiks. Bruk pulver gratis hansker for neste forberedelsene.

1. opprette matriser

1. Trimming av prøven blokken
   Merk: Alltid skru skruene godt når du setter inn deler.
   1. Eksempel blokken inn prøven innehaver av ultramicrotome Plasser holderen i trimming blokk og skyv det inn i den nederste trinnet av ultramicrotome.
   2. Trim vekk harpiks rundt innebygde vev med et barberblad slik at bare en liten kant av harpiks rundt prøven. Trim fra toppen før målet er nådd.
      Merk: Form av blokk-ansiktet kan være trapes eller rektangulære (vi har brukt begge figurene). Det er viktig å bruke de lengste sidene i rektangelet som ledende og etterfølgende kanten slik at et stort område er dekket av lim blandingen stabilisere bånd.
   3. Eksempel holderen inn armen av ultramicrotome og erstatte trimming blokken i den nederste trinnet av knivholderen. Sett inn en diamant trim kniv (normalt 45°), i knivholderen. Juster blokk-ansiktet nøyaktig parallell til trim kniveggen.
      Merk: For å produsere nøyaktig parallell ledende (nederst) og etterfølgende (øvre) kant, snu eller Flytt bare kniven trimme motsatte sider. For store volumer (flere hundre deler) er 90° trim kniv fordelaktig.
   4. Glatt alle fire sidene, og rotere prøve holderen slik at den ledende og etterfølgende kanten er nå i vannrett stilling.
   5. Nøye coat innledende og etterfølgende sidene av blokken med lim blandingen. Bruk en liten pensel dannet fra et par hår festet til en tannpirker¹³. Utføre dette trinnet raskt fordi løsemiddelet av denne blandingen fordamper innen sekunder. Forurens ikke blokk-ansiktet med denne blandingen. La belagt eksempel blokken tørke i 5-10 min.
      Merk: For større antall deler (> 200), kan det være bedre å coat forkanten, fordi med tid, en kul lim kan bygge opp på etterfølgende kanten, og potensielt trekke tilbake deler over knivblad.
2. Utarbeidelse av underlaget
   1. Klippe stykker av silisiumskiver til en størrelse som passer inn i kniv båten (omtrent 2 x 2,5 cm² for Jumbo kniv). Hvis nødvendig, merke wafer brikkene (tall eller bokstaver) med en diamond scriber før rengjøring eller permanent markør etter rengjøring. Rengjør silisium kjeks manuelt med isopropanol og lofri vev.
      NOTE For correlative imaging bruk indium-tin-oxide (ITO)-belagt glass coverslips. De må håndteres svært forsiktig, og ekstra rengjøring er ikke nødvendig.
   2. Fastsette underlaget til den ene enden av transportøren plate bruker en flyttbare selvklebende.
      Merk: Alternativt substrat kantene kan være låst ned parallell til knivblad bruke to striper av teip.
   3. Plasma aktivere (glød utslipp) underlaget med luft for å få en hydrofile overflate. Dette bør gjøres på en slik måte at en dråpe vann plassert på underlaget oppslag til en svært tynn film (lav kontakt vinkel, figur 2C, D). Hydrophilization-parametere avhenger plasma enheten brukes; Hvis parameterne som brukes her, kan du se Tabellen for materiale.
      Merk: Plasma aktivisering er veldig omskiftelig, så utføre dette umiddelbart før substrat forbruk.
   4. Transportøren inn klemmen på et substrat holder, med montert underlaget nærmere knivblad å oppnå optimal fukting av underlaget i kniv båt.
      Merk: En detaljert beskrivelse av underlaget innehaveren, inkludert dataassistert konstruksjon (CAD) tegninger, er gitt i Wacker et al. ¹¹
3. Snitting forberedelse
   1. Sett en Jumbo diamantkniven i knivholderen, angi klaringsvinkelen (0° for Jumbo kniv) og fylle kniv båten med destillert vann. Tilnærming kniven til en distanse på 1-2 mm til prøven.
   2. Lavere underlaget i vannet med skruer 1-3 (figur 2A) på underlaget abonnenten. Kontroller at vannlinjen ligger i den høyeste tredjedelen av underlaget.
      Merk: Kontrolle at limingen mellom substrat og operatør platen er godt kurert av nudging underlaget med ren tang. Det bør ikke flytte.
   3. Fordi det er vanskelig å se bakkeklaring ved en silicon wafer, lavere underlaget før du føler det berører gulvet. Nå heve underlaget litt. Kontroller at underlaget verken transportøren berører kniv båten under sagingen.
   4. Bruk en sprøyte eller pipette justere vannstanden i båten. Mens du ser gjennom Kikkerter, legge til eller fjerne vann til hele området vannflaten viser en homogen refleksjon av topp lys belysning av ultramicrotome.
   5. Slå på bunnen lys i ultramicrotome. Kontroller at armen er i midtposisjon og ikke i retraksjon bruker hånd rattet i ultramicrotome. Tilnærming kniven til prøven til refleksjon av knivblad er synlig i blokk ansiktet.
   6. Bruke alternativene justering av ultramicrotome for å justere prøven mot kniven. Først rotere kniven, da rotere og tilt prøven.
      Merk: Den justeres riktig hvis lys stripen, som kan sees i gapet mellom prøven og kniven, viser parallelle kantene (rett parallelle linjer og ikke kileformet).
   7. Sjekk helling av prøven: Kontroller at lys stripe ikke blir tykkere eller tynnere mens du beveger prøven opp og ned. Eventuelt kan du bruke bue justeringsskruen for å rette opp dette. Knivhammeren nærmere til prøven før det er like over blokk-ansiktet (men ikke berører det).
   8. Angi snittykkelsen (feed), kutte hastighet og kutte vindu på kontrollenheten.
   9. Starte snitting. Om nødvendig, vent til den første hele inndelingen kuttes. Kutte noen deler forsikre at de holde sammen til skjemaet bånd (ellers limet har brukes igjen). Start med en høy feed verdi (maksimum 200 nm for Ultra kniven) til den første hele inndelingen kuttes. Deretter angir du ønsket feed verdi. For tilstrekkelig båndet stabilitet, en snittykkelse på 100 nm og en hastighet på 1 mm/s er et godt utgangspunkt. Laveste oppnåelig snittykkelsen er rundt 60 nm, avhengig av prøven kvalitet.
   10. Stopp skjæring. Fjern alle unødvendige (delvis kuttet) deler fra knivblad og båt med en øyenvippe/cat hår. Hvis det er mange små rusk flyter rundt, fjerne vannet helt med en pipette og fyll båten med ferskvann. Nå er prosessen klar for første produktiv båndet.
4. Snitting
   1. Starte snitting. Når flere deler (det faktiske antallet avhenger av størrelsen på delene og underlaget) har blitt kuttet, stopper snitteprosessen og frigjør båndet fra knivblad ved å forsiktig stryke over knivblad med en øyenvippe¹⁴ eller bedre ennå, en svært myk hår fra en katten sin pels.
   2. Manipulere (push/pull) båndet med øyenvippe mot underlaget og fest den første delen til underlaget.
      Merk: Det er nødvendig å Skyv båndet til det stikker til tørr del av underlaget.
   3. Fortsette snitting og knytte bånd til underlaget. Start på den ene siden og flytte gradvis over til den andre med hver ny bånd.
      Merk: Unngå massive vann bevegelser for å unngå løsne allerede vedlagt bånd. Det samme gjelder for luftstrømmer. Bruk pusten shield leveres med ultramicrotome. Et skap for ultramicrotome anbefaler vi ugunstige miljøforhold,¹⁵.
   4. Når underlaget er helt dekket med bånd (vanligvis 4-5 bånd er mulig), forsiktig løfte ut underlaget fra kniv båten ved hjelp av micromanipulator skruer på underlaget abonnenten.
      Merk: Egnet bevegelser er: Løft vertikalt (skru 1) og rotere/vippe ut (skruen 3), eller en kombinasjon av begge.
   5. La båndet matrisen tørr før den lagrer den i et støvfritt miljø. Etter tørking, fjerne selvklebende montert underlaget snarest fra transportøren (på samme dag, ellers underlaget kan være for vanskelig å fjerne eller kan selv bryte under demounting).

2. flekk for LM avbilding

Merk: Flekker/merking metoder er mulig, inkludert immunofluorescence protokoller. Her er en direkte, ganske uspesifikke flekk valgt skissere cellevegger.

1. Propidium iodide flekker
   1. Dekke bunnen av et stort glass Petriskål (30 cm diameter) med parafilm og linje kanten av parabolen med papir til å bygge en fuktig kammer.
   2. Bruk ca 300-500 µL løsning per dekkglassvæske. Plasser en dråpe for hver dekkglassvæske på parafilm og sette glasset opp ned på miste, slik at delene er i kontakt med flekker væsken. Dekker fatet og Pakk den med aluminiumsfolie å beskytte prøvene fra lys. Inkuber prøvene for 16 timer på 4 ° C.
   3. Fjerne dekkglassvæske med tang og vask det ved å flytte den opp og ned i et 100-mL beaker fylt med 80 mL destillert vann. Gjenta dette trinnet i en annen kanne med ferskvann. Tørr dekkglassvæske med trykkluft.

3. registrere bildestakk i FLM

1. Plasser dekkglassvæske på scenen av en felles wide-field FLM.
2. Velge hvilke aktuelle filter (Table of Materials) til fluorescens overholdes.
3. Med en egnet linsen, ta et bilde av objektet i hver inndeling: Prøv å fylle synsfelt og holde retningen konstant. For rot tipset, ble en 40 X air objektiv brukt.
   Merk: Hvis bånd ikke er helt rett, hjelpe en roterende scene for å reorientere delene mens du tar bilder. Hvis mulig, midtstille bildet på en bestemt funksjon eller holde en funksjon som kanten av delen med samme avstand til kanten av det registrerte bildet.
4. Hvis mulig, bruk 16 bit å begrense mettet piksler og holde eksponeringstid konstant.

4. registrering av FLM bildestakk

1. Importere bildet serien til Fiji¹⁶ som en virtuell stack.
2. Åpne en ny TrakEM¹⁷ (tom) fra fil-menyen.
3. Høyreklikk i bildefeltet og importere stabelen i TrakEM som "En del per lag".
4. Justere lag (Høyreklikk inn bildefelt), angi (første bildet å vare), og velg ingen som referanse. Alle innstillinger, bruker standardverdier og velger stive som ønsket transformasjon.
5. Når registreringen er fullført og vellykket, bevare oppstilt datasettet av Høyreklikk og Velg Eksporter. Gjøre flat bildet, angi fra første til siste bilde og la programvaren vise resulterende stakken. Lagre stabelen i tif-format.

5. farging og montering for SEM avbilding

Merk: For å forberede flekker løsninger se Tabellen for materiale. Løsninger kan lagres på 4 ° C i opptil 12 måneder, beskyttet fra lys og luft.

Forsiktig: Bly citrate og uranyl acetate inneholder tungmetaller som er giftige. Bruk hansker og kast avfall i henhold til lokale myndighetene instruksjoner.

1. Dekke bunnen av et stort glass Petriskål (30 cm diameter) med parafilm og linje kanten av parabolen med papir til å bygge en fuktig kammer.
   Merk: Det er viktig at flere pelleter av NaOH plasseres i Petriskål nær flekker dråper å forhindre overdreven nedbør av bly citrate.
2. Uranyl acetate flekker
   1. Sentrifuge uranyl acetate løsningen 2680 x g i noen sekunder til sediment små partikler.
   2. Bruk ca 300-500 µL løsning per dekkglassvæske. Plasser en dråpe for hver dekkglassvæske på parafilm og sette glasset opp ned på miste, slik at delene er i kontakt med flekker væsken.
   3. Inkuber i 10 min ved romtemperatur, og dekker rett under fargingen.
   4. Fjern dekkglassvæske med tang og vask ved å flytte den opp og ned i et beaker fylt med destillert vann (se trinn 2.1.3).
3. Lede citrate flekker
   1. Under uranyl acetate incubation, forberede bly citrate løsningen.
      Merk: Bly citrate bør alltid filtreres umiddelbart før bruk for å fjerne alle precipitates. Også sentrifuge bly citrate løsningen 2680 x g i noen sekunder som i trinn 5.2.1 Oppgi.
   2. Bruk ca 300-500 µL løsning per dekkglassvæske. Plasser en dråpe for hver dekkglassvæske på parafilm umiddelbart før vask av coverslips etter uranyl acetate farging, og sette glasset opp ned på miste, slik at delene er i kontakt med flekker væsken. Plass dråper (300-500 µL) på parafilm umiddelbart før vask av coverslips etter uranyl acetate farging.
      Merk: For å unngå dannelse av precipitates, pust ikke på bly citrate dråper.
   3. Plasser det vasket dekkglassvæske opp ned på rullegardinlisten (det er ikke nødvendig å tørke den).
   4. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur, og dekker rett under den flekker.
   5. Fjerne dekkglassvæske med tang og vask det som beskrevet ovenfor i et beaker med ferskvann (trinn 5.2.4).
4. Tørr dekkglassvæske med trykkluft.
5. Montering prøver for SEM avbilding
   1. Montere silisiumskiver på aluminium stubber med en klebrig karbon pute.
      Merk: ITO-belagt coverslips kan enten monteres med sølv maling og Cu-tape-den ledende overflaten er koblet til stubben- eller med karbon pads som ovenfor. I så fall, kan en ledende tilkobling fra ITO-overflaten til stubben gjøres med en dråpe sølv maling.

6. hierarkisk Imaging i SEM

Merk: I en feltet utslipp SEM, velge en lav primærenergi (3 kV eller lavere), en bjelke gjeldende i området fra 50 til 800 pA å unngå lading, og en passende arbeidsavstand for effektiv samling av sekundær og/eller tilbake-spredt elektroner. Utvalg av bjelke gjeldende avhenger av egenskapene utvalg (f.eks., innebygging harpiks); elektron dosen vil også være et kompromiss mellom en liten strøm (mindre skadelig for prøven) og en høy strøm, som er gunstig for imaging fart og derfor senker anskaffet totale bildet. Dedikert detektorer for tilbake-spredt elektroner gir god kontrast, er mindre følsomme for lading av prøven og vise mindre av prøvens overflaten gjenstander (Folder, kniv merker). Kontrasten og lysstyrken skal justeres slik at histogrammet er sentrert.

1. SEM bildebehandling
   1. Først definere de fire hjørnene av matrisen ved å flytte et bilde av hvert hjørne på lav forstørrelse, om 100 x. Opprett et område av interesse (ROI) omslutter hele matrisen. Tilordne en tenkelig protokoll med følgende parametere: Bruk en sekundær electron (SE)-detektor, som tillater høyhastighets bildebehandling på et stort bilde pikselstørrelsen (for eksempel 1000 nm) og en kort holdetiden (f.eks 0,2 µs).
      Merk: For å overvinne elektron optisk begrensninger på en stor skanning synsfelt (FOV), som kan føre til forstyrrelser i periferien av bildene, bruke dedikert lav forstørrelse (fra de fleste SEM produsenter) eller bruke medium, 1 til 2 k skanning felt for enkeltbilder.
   2. Generere en inndeling ved å opprette en avkastning beskriver bare vevet i den første delen. Klone det til alle etterfølgende avsnittene bruke stempel-verktøyet. Rotere ROIs når nødvendig for å imøtekomme bøyd bånd.
   3. Ta bildet serien bruker en mellomliggende pikselstørrelsen (rundt 50 nm) og en bor tid lenge nok til å identifisere og gjenkjenne mål strukturen. Bruk en FOV for enkeltbilder i et utvalg av 6-10 k piksler.
      Merk: Atlas 5 programvaren kan automatisk samle mosaikk består av tilstøtende bilder å dekke store Avkastningen/seksjon områder over delene føljetong.
   4. Opprette et område i denne delen set, som inneholder målet strukturen for høyere oppløsning SEM bildebehandling. Gjøre Avkastningen stor nok kontoen for scenen presisjon. Kontrollere og justere plasseringen av områdene.
      Merk: Det er viktig å plassere ROIs slik at ikke sitter sentrum, der autofokus og autostigmation skal utføres, på "tomme" materiale med ingen strukturelle detaljer, f.eks., vacuoles.
   5. Definere autofokus innstillingene og sjekke ytelsen minst lengden på et bånd (dvs.den lengste distansen scenen har å reise) på en liten avkastning nær området blir vist.
   6. Definere en tenkelig protokoll for høyoppløselig SEM oppkjøpet. Se membran avdelinger, velge 3 – 5 nm bilde pikselstørrelsen. Velg en holdetiden avhengig av detektoren slik at bildet ikke er for bråkete.
   7. Før oppkjøpet, definere fokus verdiene på minst den første delen av hvert bånd alternativet av protokollen.
   8. Starte automatisert SEM avbilding over hele serien av målet ROIs.
   9. Eksportere ervervet dataene som bildet serien, fortrinnsvis i tif-format.

7. registrering av SEM bildestakk

1. Importer bildet serien i Fiji som en virtuell stabel.
   Merk: Disse vil være store datafiler mellom noen GB avhengig av antall snitt og størrelsen på Avkastningen.
2. Beskjære bildet SEM stable for videre behandling til et område så nær strukturen av interesse som mulig, og justere lysstyrken og kontrasten.
3. Åpne en ny TrakEM¹⁷ (tom) fra fil-menyen.
4. Høyreklikk i bildefeltet og importere stabelen i TrakEM som "En del per lag".
5. Justere lag (Høyreklikk i bildefeltet), velger minste kvadraters modus, angi (første bildet å vare), og velg ingen som referanse. Innstillingene, bruker standardverdier og velger stive som ønsket transformasjon.
6. Når registreringen er fullført og tilfredsstillende, bevare oppstilt datasettet av Høyreklikk og Velg Eksporter. Gjør et flatt bilde, angi fra første til siste bilde og la programvaren vise resulterende stakken. Lagre stabelen i tif-format.

Representative Results

Arbeidsflyten beskrevet her (figur 1) starter med et utvalg i en harpiks blokk. Under eksempel utarbeidelsen, noen heavy metal bør innføres i vevet, men det er ikke nødvendig å bruke protokoller optimalisert for ganske sterk metallization. Figur 1A viser en plante rot (cress) blokk-farget konvensjonelt med 1% OsO₄ og 1% uranyl acetate, mens Arabidopsis roten i figur 1B er bare svakt metalized bruker 0,5% uranyl acetate. Siste prøven er best egnet for correlative tilnærminger som noen tungmetaller pleier å slukke fluorescens. Med en dedikert substrat holder (figur 2), matriser med flere hundre deler kan produseres (figur 1 c). Etter fluorescerende merking, er slik matriser avbildet i en standard wide-field FLM (figur 1 d), og farget med heavy metal løsninger og avbildet i en SEM på forskjellige oppløsninger (figur 1E-G).

Viktig verktøy for reproduserbar generasjon av matriser, er spesielt når du plasserer flere bånd fra mikrotomens kniv båt på et Substrat substrat holderen (figur 2A, spesialdesignede i forfatternes laboratorium) og en Jumbo diamant kniv med en båt som er stor nok til objektglass (figur 2B). En flat menisk, slik at god observasjon bånd, er nødvendig og kan oppnås ved plasma rengjøring av underlaget: en liten dråpe destillert vann bør ikke danne en linse-lignende struktur på underlaget som i figur 2C (ubehandlet underlaget), men en tynn film (figur 2D, plasma aktivert substrat). Under disse forholdene, bånd knyttet til tørr del av en ITO-belagt dekkglassvæske er lett visualisert (figur 2E) og kan være observert og kontrollert under heis-ut av underlaget fra vannet.

Som et eksempel, ble matriser med propidium iodide merke anlegget cellevegger fotografert med en bred standardfeltet FLM (figur 3A). Siden delene er bare 100 nm tykk, selv over flekker som vist her introduserer litt uskarpe. Etter registrering, de to cellene helt omsluttet rekonstruert volumet ble valgt fra bildestakk (figur 3B) for høy oppløsning bildebehandling i 3D (se også Ekstra film S1). Etter flere flekker med uranyl acetate og bly citrate, arrayene ble fotografert i SEM. finne 3 C viser en oversikt, med 60 nm bildepiksler; mørke plassen i midten av bildet indikerer plasseringen der autofokus funksjonene ble henrettet, og den ekstra dosen førte til liten forurensning. Passende ROIs i disse føljetong delene (skiver 51 til 248 435 skiver totalt) inneholder to målcellene valgt i FLM stakken deretter tatt med en 5 nm pixel bildestørrelse (figur 3D; se også Ekstra film S2).

Automatisert hierarkisk avbilding av arrayene i SEM beskrevet her ble gjort med programvare/hardware plattform løsning ZEISS Atlas 5. Først en oversikt over hele matrisen ble opprettet med SE detektoren, med stor (1000 nm) piksler og svært lav holdetiden (figur 4A). En avkastning beskriver bare vevet ble plassert på den første delen og overføres til alle andre deler av matrisen. Denne delen sett ble deretter innspilt med 60 nm bilde bildepunkter med en lengre holdetiden (figur 4B). Til slutt, et område sett, inneholder to målcellene pluss en "lag" i omkringliggende celler å ta hensyn til scenen unøyaktighet, ble satt opp med følgende parametere: ESB (energi selektiv Backscatter) detektor, 5 nm bildet piksler, svært lang (40 µs) bor tid ( Figur 4C). Zoome inn for å så et bilde viser subcellular detaljer (Figur 4 d) som vacuoles (V), mitokondrier (M), kjernen (N) og endoplasmatiske retikulum (piler). Se også Ekstra film S3 for å zoome inn fra en oversikt over hele matrisen til subcellular detalj av en Målcelle.

Matrisen vises her (200 deler) pluss en ekstra en av 250 deler tok ca 8 timer å produsere, en natt stain for LM og en dag å fortegnelse (manuelt) for FLM. Etter farging tar ca 1-2 h totalt avhengig av antall individuelle matriser. For SEM opptak, noen timer må definere Atlas kjøre, og automatisert opptak var 3-4 h for middels oppløsning (60 nm pikselstørrelsen) delen sett (200 deler, 450 x 200 µm²) og ca 5 dager for den med høy oppløsning (5 nm pikselstørrelsen) avkastning inneholder to målcellene (200 deler, 55 x 30 µm²). Merk at på grunn av lav metall innholdet på eksempel vist her, veldig treg skannehastighet måtte brukes til å nå en god signal-til-støy-gjenkjenning, som indirekte (for øyeblikket detektoren) bor tiden 40 µs for høy oppløsning Avkastningen.

Det er flere trinn i hele arbeidsflyten utsatt for fallgruvene: bånd bør ideelt sett være mer eller mindre rett og plassert i riktig rekkefølge (figur 5A). Imidlertid er bøyd (figur 5B), buede (figur 5 d) eller selv brutt bånd ofte produsert. Dette kan resultere skyldes feil trimming (ledende og etterfølgende kantene ikke akkurat parallell), eller ikke-enhetlig brukt lim, men også fra en asymmetrisk eller ujevnt infiltrere prøve. Spesielt plagsom er prøver inneholder både myk og svært vanskelig komponenter. Sistnevnte komponentene kan være vanskelig å infiltrere som cellen vegg av planterøttene vist nedenfor (figur 5C). I så fall kan Folder (pilspisser) lett være forårsaket av variabel komprimering og avslapping under snitting. For automatisert imaging i SEM, er buet bånd ikke et stort problem, siden ROIs kan roteres til Bøyningen på båndet.

En annen avgjørende skritt i protokollen er flekker: utilstrekkelig vask kan føre til rester på delen (figur 5E, F), og i verste fall dekke området mest interessante (sirkel på en av to målcellene i figur 5F). Også støv (figur 5 d, sterkt lysspredning partikler) introdusert i kniv båten, f.eksmed en skitten substrat bærer, kan forårsake alvorlige problemer: I FLM, støv kan være svært fluorescerende (jf noen sektorer i ekstra film S1) til slik grad det noen registrering algoritmer ikke fungerer. Funksjonen "justere" i TrakEM¹⁷ men kan håndtere slike stabler som vist i Ekstra film S1.

Figur 1: arbeidsflyt for correlative hierarkisk avbilding. Starter fra et utvalg innebygd i en harpiks blokk (A, sterkt metalized utvalg), prøven er første trimmet (B, svakt metalized utvalg) og deretter matriser bestående av flere bånd føljetong deler (C), her plassert på en ITO-belagte dekkglassvæske, er produsert med et ultramicrotome. Etter farging med fluorescerende farge, registreres stabler av bilder i en wide-field FLM (D). Etter ytterligere flekker runder med heavy metal salter, er stabler avbildet i en SEM (E-G) på forskjellige oppløsninger (piksel bildestørrelser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: verktøy for utarbeidelse av matriser. Substrat holderen samlet fra micromanipulators med sju akser bevegeligheten knyttet til et standard ultramicrotome (A): skruer, markert med sirkler, er for loddrett (1) og vannrett (2) bevegelse og vippe (3) av underlaget transportøren . Jumbo diamantkniven med en oversize båten for å imøtekomme store underlag (pil), her med en plasma-aktivert silicon wafer montert på en lysbilde-størrelse aluminium operatør (B). 20 µL dråper destillert vann plassert på en ubehandlet silisium wafer substrat (C) eller på en plasma-aktivert substrat (D). Fire bånd flytende i kniv båten, knyttet til en ITO-belagt dekkglassvæske ved lavere endene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: korrelasjon LM data med SEM data. Oversikter (A, C) og målcellene (B, D) inn med FLM (A, B) og SEM (C, D). (B) er en programvare-zoom, og de opprinnelige dataene ble registrert med en 40 X linsen på en 1,388 x 1,040 pixel kamera chip, mens (C) registreres med 60 nm bilde pikselstørrelsen og (D) med 5 nm bilde pikselstørrelse, illustrerer sanne økningen i oppløsning i SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: hierarkisk imaging i SEM bruker ZEISS Atlas 5 på Oversikt over tabelldata registrert med 1000 nm bilde bildepunkter med SE detektoren (A). Delen angir med Avkastningen plassert på vev i hver seksjon og innspilt med 60 nm piksler i bildet (B). Området angir med en seriell Avkastningen plassert på målet celler og innspilt med 5 nm piksler i bildet (C). Når du zoomer inn slik oppløsning (D), blir intracellulær membran avdelinger som vacuoles (V), kjernen (N), mitokondrier (M) og endoplasmatiske retikulum (piler) synlige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: typiske problemer. 1. som følge av snitteprosessen: bånd ITO-belagt coverslips er ideelt rett (A), men uregelmessig komprimering under snitting kan forårsake bøyd (B) eller buet bånd (D), eller aften folde (C). 2. forårsaket av underlaget og bånd i vann, f.eksunder snitting og flekker: lys spredning partikler på substrat (D), av dråpestørrelse på inndelingen (sirkel i E) eller skitt smurte ut over vev på grunn av utilstrekkelig vaske etter farging (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra film S1: FLM bildestakk. 435 bilder justert i Fiji¹⁶ med TrakEM¹⁷ og lagret som filmfilen (AVI). Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film S2: SEM bildestakk. 210 bilder justert i Fiji¹⁶ med TrakEM¹⁷. Opprinnelige stakken (300 bilder) av datasettet var 15 GB. For å bygge ned stakken fra 3.3 GB (etter justering og beskjæring på bare to målet celler), det ble skalert x og y med en faktor på 0,2 bruker Fiji og deretter lagres som AVI film. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film S3: Zooming med ulik oppløsning nivåer i SEM. Film laget i og eksportert fra Atlas 5 programvaren i MP4-format. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

En arbeidsflyt for å målrette bestemte celler innenfor en vev av multimodal hierarkisk AT ble demonstrert: en harpiks-embedded prøven er snittet opp til matriser av føljetong seksjoner, som er plassert på en ledende underlaget ved hjelp av en tilpasset designet substrat holder. Etter merking med en fluorophore og bildebehandling i FLM, er rekonstruert volumet brukt for å velge målet celler. Etter flere flekker runder med tungmetaller å innføre kontrast, er disse målene avbildes over flere hundre deler på nanoskala oppløsning i en SEM bruker en automatisert programvare-plattformen.

For produksjon av tett pakket matriser med flere lange bånd, er en substrat holder ligner på det som er beskrevet her nødvendig. En dyktig og tålmodig person kanskje kunne knytte flere bånd til et silisium substrat semi midt i kniv båten, og hente matrisen ved å gradvis redusere vannstanden til bånd sitter på underlaget. I det vår erfaring, det er en tendens til å knuse formasjon når underlaget er berøre noen del av kniv båten (jf Merk i 1.3.2 i protokollen). I tillegg denne prosedyren er mye vanskeligere med ITO-belagt underlag: (1) fordi gjennomsiktighet ITO-glass, er det vanskelig å se kanten av vannet der endene av bånd må knyttes; og (2) ITO-belagt overflaten er mye grovere enn blankpolert silisium kjeks, bånd tendens til å bryte under heis og mindre fragmenter som består av noen deler kan flyte, dermed ødelegge rekkefølgen på delene.

Hele arbeidsflyten er også mulig uten sammenheng FLM data. I dette tilfellet må datainnsamling i SEM utføres i flere økter. En første 3D rekonstruksjon eller i det minste vurdere lav eller middels oppløsning data kan være nødvendig å identifisere mål. I tillegg kan konvensjonelle histologiske flekker for brightfield LM (ikke krever FLM) brukes. Andre alternativer^6,7,8 er selvsagt antistoff merking på matriser, som allerede demonstrert i første avisen på¹⁸eller genetisk kodet fluorescerende proteiner (XFPs) eller pre innebygging merking med bevaring av fluorescens under eksempel forberedelse.

En generell begrensning av metoden diskutert er bruk av deler av enkelte tykkelse og den resulterende diskret utvalg av 3D-volumet: oppløsning i Z kan bare være så god som tykkelsen på delene siden SEM samler bare data fra delen overflaten (d epending på primær energi/destinasjonsside energi valgt). Dette betyr at det resulterende 3D-volumet har Anisotrop voxels, f.eks., 5 x 5 x 100 nm³ hvis 100 nm seksjoner og en bildestørrelse for piksel 5 nm brukes. For svært små enheter i en størrelse utvalg under 1 µm, kan dette ikke være tilstrekkelig for en sann ultrastructural beskrivelse. En mer teknisk begrensning er nøyaktigheten av scenen brukes i SEM for automatisert imaging. På grunn av dette er det nødvendig å velge en avkastning som er større enn spesifikasjoner på scenen nøyaktigheten garantere at hele målområdet er fotografert.

Sammenlignet SBF-SEM og LØGN-SEM som blokk-ansikt tenkelig metoder, har correlative på den definitive ulempen av Anisotrop voxels, som beskrevet ovenfor. Med liten LØGN-SEM, kan isotropic voxels av 5 x 5 x 5 nm³ hentes når en riktig drift korreksjon er på plass.

Hull i rekonstruert volumet på grunn av tap av delene av matriser kan også være en bekymring som ikke oppstår med SBF-SEM eller LØGN-SEM. Med god bånd stabilisering av lim, er dette vanligvis bare et problem for den siste delen av et bånd: det kan bli skadet når slippe det fra knivblad bruker øyenvippe. Men i vår erfaring påvirker tap av ett avsnitt i hver 20-50 deler ikke bildet registrering.

På den annen side, gir at etter stain matriser god signal og kontrast for SEM bildebehandling, selv om svakt metalized prøver som høytrykk frosset rot tips vises her. Derfor er det ikke nødvendig å invadere optimal ultrastructural bevaring av mange kjemiske fiksering og metallization trinn. Også leverer rutinemessig prøver fra patologi lab med middels grad av metallization utmerket data¹⁰. Slike en post innebygging kontrastforbedring er ikke mulig for SBF-SEM og LØGN-SEM generelt. Videre, siden disse metodene er destruktive, dvsforbruker prøven under bildebehandling, hierarkisk imaging på forskjellige oppløsninger og nettsteder eller gjentatte bildebehandling på senere punkter i tid er umulig. I prinsippet ubegrensede volumer, bestående av store FOVs (f.ekstil flere millimeter for hele musen hjerner i connectomics) opprettet av søm mosaikker og stort antall inndelinger kan skaffes ved AT, mens i FIB-SEM, FOVs utover 100 µm x 100 µm er vanskelig å oppnå med rutinemessig instrumenter.

Ytterligere automatisering av beskrevet AT-arbeidsflyten vil være en klar fordel, siden de nevnte metodene SBF-SEM og LØGN-SEM utføre både snitting og bildebehandling innenfor den samme instrumentet i en fullt automatisert måte. En slags automatisering av skjæring eksisterer: The ATUMtome¹² kan generere og samle tusenvis av delene, men bruk av Kapton tape som et gjør slike matriser vanskelig å image i en FLM. På den ITO-belagt coverslips brukt her, bør med super oppløsning imaging være mulig. En ytterligere, svært ønskelig mål for automatisering ville være innspillingen av FLM data stabler. På den annen side, automatisering kan være dyrt og unntatt substrat innehaveren, arbeidsflyten presenteres her bruker (i form av maskinvare) bare instrumentering vanligvis tilgjengelig i rutinemessig EM laboratorium eller core anlegg, gjør det lav få tilgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).