Summary
이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.
Abstract
말라리아는 변형 체 기생충으로 인 한 생명이 질병, P. falciparum 되 가장 아프리카 대륙에서 우세 하 고 대부분 말라리아 관련 사망자에 대 한 책임 세계적으로. 조직, 혈관 부전, 및 염증 응답 기생충 격리 등 여러 가지 요인 말라리아에 감염 된 사람들에 있는 질병의 진화에 영향. P. falciparum-감염 된 적혈구 (iRBCs) 출시 작은 extracellular 소포 (EVs) 기생충과 호스트 사이의 pathogenesis 및 휴대 통신을 중재 하는 화물 분자의 다른 종류를 포함. EVs는 효율적으로 있는 그들은 그들의 기능을 조절 하는 세포에 의해 촬영. 여기 우리는 기생충-호스트 상호 작용에서 EVs의 역할을 해결 하기 위해 전략을 논의. 첫째, 우리는 녹색 셀 링커 염료를 사용 하 여 레이블 및 내 피 세포에 의해 EV 국제화를 추적 간단 방법을 설명 합니다. 둘째, 우리 보고 붙일 레이블된 dextran을 사용 하 여 내 피 세포 단층에서 침투성을 측정 하는 간단한 방법. 마지막으로, 우리 내 피 세포 기능에 작은 비 코딩 RNA 분자의 역할을 조사 하는 방법을 보여 줍니다.
Introduction
세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이1의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의2. 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염3동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma brucei rhodesiense EVs 독성 요소 Serum Resistance-Associated (SRA)를 전송할 수 있습니다 그리고 다른 T. brucei 와 호스트 모두 적혈구8타겟팅 할 수 있습니다. 또한, P. falciparumiRBCs EVs 내의 핵 산을 전송 하 여 서로 간에 통신 합니다. 기생충을 최적화 하 고의 성장을 동기화 수 있습니다. 사실, EVs gametocyte 변환의 주요 레 귤 레이 터 수 되 고 따라서 전송 단계7의 규정에 기여.
뿐만 아니라 EVs는 기생충을 통제, 그들은 또한 기생충-호스트 상호 작용을 중재. 우리는 최근에 iRBCs에서 EVs 호스트 파생 microRNAs (miRNAs; 21-25의 뉴클레오티드9의 범위에 작은 RNA 종) 인간의 내 피 세포에 의해 채택 되었다을 포함 발견 했다. EVs에 miRNAs 안정 Ago2와 복잡 한 형성 (구성원 RNA 유도 침묵의 복잡 한), 받는 사람 세포에 전달 되 면 구체적으로 유전자 발현을 침묵 하 고 셀10의 장벽 속성에 영향을 미치는입니다. 표준 프로토콜 EVs의 기능을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 자, 먼저 받는 사람 세포에 의해 그들의 통풍 관을 조사 하기 위해 EVs의 형광 라벨 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, confocal 현미경을 사용 하 여 셀 내부 EV의 운명을 추적 수는. 여러 형광 염료 EVs를 추적을 사용할 수 있습니다. 아민-반응성 염료, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 그리고는 소포 안에 한 번 Calcein-오전 될 형광. 밝게 하 고 더 많은 일정 한 신호를 제공 하기 때문에 우리 PKH, amphiphilic 레이블을 사용을 선호 합니다. 이 방법은 EVs와 받는 사람 세포 간의 상호 작용을 이해 하는 중요 한 정보를 제공 합니다. 경우에 따라 EVs는 세포의 표면에 묶는, 하는 동안 일부 소포는 급속 하 게 채택 되었다. 글귀, 시 EVs는 그들은 그들의 규정 하는 기능을 발휘 하는 세포에 그들의 화물을 제공 합니다.
여기, 우리는 세포 단층을 통해 형광 dextran의 전송을 측정 하 여 체 외에서 내 피 세포의 장벽 기능을 측정 하는 프로토콜을 설명 합니다. 방사선된 마커 같은 더 민감한 추적기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 사용 하기 위해 특별 한 안전 조치를 요구 한다. 다른 분석 실험 꽉 접합 무결성 측정 transendothelial 전기 저항 (TEER) 같은 생체 외에서 의 장벽 기능을 측정 하기 위해 존재 한다. 마지막으로 조로-1, 긴밀 접합 단백질 면역 형광에 의해 시각화 뿐만 아니라10으로 꽉 접합 무결성 평가 수 있습니다. EVs 잠재적인 규정 특성을 가진 여러 화물을 포함 하는 복잡 하 고 유형이 다른 엔터티 있기 때문에, 그것을 받는 사람 세포에 미치는 영향을 연구 하는 특정 RNA overexpress 유용 합니다. 따라서, 우리는 또한 관심10의 miRNA를 표현 안정적 셀 라인을 생성 하는 것을 목표로 하는 프로토콜을 정의 합니다.
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Protocol
인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.
참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. 11 P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.
1. 형광 EVs의 라벨
참고: 다음 절차는 EV 막의 지질 지역에서 큰 지방 족 꼬리와 안정적으로 녹색 형광 염료 (PKH67)를 통합 하는 라벨 기술 이용 합니다. 반응은 200 µ L PKH67의 20 µ M 최종 농도 포함 하는 볼륨을 얼룩 마지막에 수행 됩니다. 주위 온도 (20-25 ° C)에서 모든 단계를 수행
- 장소 100 µ g EVs의 microcentrifuge 튜브에 PBS의 1 mL에.
- 펠 렛를 7 분에 대 한 최대 속도 (20000 x g) microcentrifuge 관에서 EVs 원심
참고: 말라리아 EVs에 존재 이므로, 레드-어두운 갈색 펠 릿 관찰 해야. 경우는 상쾌한 붉은, 다음 EVs 있다 lysed. - 원심, 후 어떤 EVs를 제거 피하기 위하여는 상쾌한을 신중 하 게, 발음.
참고: 재현성 및는 얼룩의 효율성을 증가 하기 위하여 희석제 C에 EVs를 resuspending 하기 전에 나머지 버퍼의 양을 최소화 합니다. - 희석제 C의 100 µ L에서 EV 펠 릿 resuspend (EV 정지 X 2)와 완전 한 분산을 막으려고 피펫으로 부드럽게.
- 새로운 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 희석제 C. 소용돌이 잘 혼합의 100 µ L을 PKH67 ethanolic 염료 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 얼룩이 지기 직전이 2 배 염료 솔루션 (40 µ M)를 준비 합니다.
참고: 이기종 얼룩을 방지 하려면 추가 하지 마십시오 PKH67 ethanolic 염료 솔루션 EV 펠 릿에 직접. - 빠르게, 염료 솔루션 (단계 1.5) X 2의 100 µ L EV 정지 (단계 1.4) X 2의 100 µ L 결합 되어 있습니다. 그런 다음 10 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 혼합.
- 빛과 믹스에서 vortexing에 의해 3-4 회 동안 보호 5 분 인큐베이션 단계 1.6 5 분에서에서 EV/염료 정지를 품 어.
참고: 긴 시간에 대 한 EV/염료 정지 잠복기 때문에 얼룩이 지는 그래서 빠른 이점이, 제공 합니다. - 혈 청의 동일한 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 여 착 색 반응 중지 하 고 과잉 염료의 바인딩 수 있도록 1 분 동안 품 어.
참고: 얼룩이 지는 중지 하기 전에 20 분 20000 x g에서 원심 분리 하 여 EVs에서 혈 청을 고갈 합니다. - PBS로 3 번 세척 하 고 스핀 다운 5 분에 대 한 20000 x g에서 1 µ g / µ L의 최종 농도 도달 하는 PBS의 100 µ L에 EVs를 Resuspend.
2. Confocal 현미경 검사 법에 의해 EVs의 시각화
참고: 다음 프로토콜 설명 유리 coverslips에 성장 하는 내 피 세포에 의해 EV 국제화의 추적을 합니다. 내 피 세포는 반 불멸 하 게 인간의 골 수 내 피 세포12에 설명 된 대로.
- 메 마른 환경에서 working coverslips 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온 (RT)에서 10 분의 초과 코트.
- 폴 리-L-리 신 솔루션을 발음 하 고 완전히 말리는 것을 coverslips 허용.
- Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포 수를 수행 합니다.
- 완전 한 내 피 세포 성장 매체 폴 리-L-리 신-코팅 coverslips에 보충 혼합을 포함 하 고는 단층에 성장 하는 세포의 1 mL에 1 x 105 내 피 세포를 전송 합니다.
참고: 매체 성장 인자 세포는 단층을 형성 하 고 꽉 접합을 형성 있도록 포함 되어 있습니다. - 세포는 단층을 형성, 일단 신중 하 게 매체를 발음 하 고 셀을 씻어 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 한 번 더 세척을 반복 합니다. PKH67 표시 된 EVs의 50 µ g을 추가 하 고 4 시간 품 어.
참고: 통풍 관에 대 한 최적의 시간 포인트를 찾으려고 한 시간 코스 수행할 수 있습니다. - 4 h 후 매체, 발음 하 고 3 회 초과 및 언바운드 EVs를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 15 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 솔루션 셀을 수정 합니다.
참고: 메탄올 중단 될 수 있습니다 걸 고정 과정; 따라서, fixatives 또는 다른 용 매 기반 fixatives 포함 된 어떤 메탄올을 피하기 위해 최상 이다. 메탄올-무료 포 름 알 데히드는 정착 액으로 사용 하는 것이 좋습니다. - 3 회 PBS로 세포 세척. 0.1%의 신중 하 게 250 µ L 추가 세포를 permeabilize에 PBS에 트라이 톤 X-100. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.
- PBS로 3 회 세척. 일반적인 바인딩을 차단 하는 RT에 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5 %BSA)의 400 µ L를 추가 합니다.
- PBS 한번 셀을 씻어. 5 µ L의 각 커버 슬립 당 200 µ L PBS/1% BSA의 phalloidin 재고 솔루션 diluting 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 200 µ L는 coverslip에 얼룩 솔루션의 실시간에서 20 분 동안 품 어 고
- PBS로 3 회 세척. 30에 대 한 DNA counterstain 2 µ g/mL PBS의 200 µ L에서의 최종 농도에 Hoechst 33342 s.
- PBS의 400 µ L을 추가 하 여 2는 coverslip 배를 씻어. 조심 스럽게 집게는 coverslip 잡아 하 고 유리 슬라이드에 미디어를 마운트 하는 antifade의 드롭 상단 반전. 부드럽게 휴지로 초과 미디어를 제거 하 고 매니큐어와 양쪽 인감.
- 4 ° c.에 빛에서 보호 하는 슬라이드 저장
- 레이저 업무가 405, 488, 543 nm와 63 X, 형광 방출 450-470 nm (파란색), 505-530 nm (녹색), 및 620에서 1.3 나 오일 목표에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 시각화 nm.
참고: 일반적인 F-말라 얼룩 결과 그림 1에 표시 됩니다.
3. 내 피 세포 침투성
참고: 내 피 세포 침투성 내 피 세포 단층에 걸쳐 rhodamine B isothiocyanate-dextran (평균 MW 70000)의 이전을 측정 하 여 평가입니다. Dextran 혈관 침투성을 공부 하는 훌륭한 도구를 제공 합니다.
- 0.4 %Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포를 계산 합니다.
- 24-잘 조직 문화 삽입 (0.4 µ m 기 공 크기)와 차별화 된 monolayers를 적어도 5 일 동안 그대로 두고 합류 105 셀 x 0.6의 밀도에서 내 피 세포 격판덮개 두 번째 매일 매체를 새로 고칩니다.
- 세포는 단층에 도달, 로드 EVs (1 mL에서 50 µ g) 상단 챔버에. 20 mg/mL의 최종 농도에서 최고 잘 rhodamine dextran을 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 40 µ L 중간 aliquots에서 형광 방출 측정에 의해 잘 아래 형광 dextran의 이전을 모니터링 합니다. 544 nm 여기 및 측정에 대 한 590 nm 방출에서 다중 레이블 microplate 리더를 설정 합니다.
참고: 확산된 dextran 양의 수 측정할 수 재고 솔루션 설립 보정 곡선을 사용 하 여. 또한, 운동 실험 시간 과정 (그림 2) 외부 챔버 매체의 작은 샘플을 제거 하 여 수행할 수 있습니다. 어떤 치료 없이는 dextran 셀 단층을 통해 무마 합니다.
4. 결정 Puromycin 감도
참고: lentivirus와 셀 라인을 시험 하기 전에 그것은 그 특정 셀 라인에 대 한 선택 된 약물의 kill 곡선을 결정 하는 것이 중요. 모든 셀, 선택 된 약물의 증가 복용량을 사용 하는 복용량 응답 실험을 수행 하는 데 필요한 약물 농도의 최소 금액을 결정 합니다. 각 포유류 세포 라인 실험, 전에 다른 감도 있기 때문에 항생제의 최적 농도 아래 서 kill 곡선 적정 개발 하 여 결정 되어야 합니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 내 피 세포 성장 매체 포함 하는 보충 믹스에에서 1 x 105 셀/mL의 농도에서 내 피 세포 resuspend
- 내 피 세포 성장 매체의 100 µ L의 최종 볼륨에서 96 잘 접시로 플레이트 1 x 104 셀.
- 0.1-10 µ g/mL의 농도 얻기 위해 항생제를 포함 하는 매체의 100 µ L를 추가 ( 그림 3참조).
- 세포 생존 능력 20 X 목표를 사용 하 여 가벼운 현미경 2 일 마다 검사 합니다. 10 월 14 일에 대 한 셀을 문화 고 puromycin 세포 성장에 따라 매 2-3 일을 포함 하는 미디어를 대체 합니다.
- 10 µ L/잘 MTS 시 약 각 잘 믹스에 추가 하 고 표준 문화 조건에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.
- 짧게 통에 접시를 흔들 및 490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 치료 및 치료 세포의 흡 광도 측정 nm (그림 3).
5. 변환 Lentiviral 벡터와 내 피 세포의
- 플레이트 1 x 10의 완전 한 매체 변환 전에 하루 1 mL에 내 피 세포를5 . 셀에는 50-80 %confluency 도달 했습니다 때 변환을 수행 합니다.
- 얼음, lentivirus 녹여 그리고 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 바이러스의 aliquots. 스핀 30 200 x g에서 자료 다운 유출 피하기 위하여 열기 전에 튜브에 s.
- Hexadimethrine 브 로마 이드 8 µ g/mL의 최종 농도에 셀을 추가 합니다.
그러나 참고: Hexadimethrine 브 로마 이드 어떤 경우에는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다 변환 효율을 도움이 됩니다. 따라서, 변환 하기 전에 죽이 곡선을 수행 하 여 최적의 농도 결정 한다. - 부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다. 감염 (MOI)의 적당 한 복합성에 (0.5-2 x 106 입자) 사이 바이러스 성 입자의 적절 한 수량을 추가 하 고 부드럽게 30 대 판 소용돌이를 섞어 s.
- 변환 효율을 높이 300 x g에서 45 분 RT에서 원심 분리기에서 셀 바이러스 성 입자 혼합 원심 37 ° C에서 셀 바이러스 성 입자 혼합물을 밤새 품 어.
- 신중 하 게 바이러스 입자에 포함 된 매체를 제거 하 고 적절 하 게 삭제. 신선 하 고, 미리 데워 진 완전 한 문화 매체 바꿉니다.
- 두 번째 날에 puromycin 선택 시작: 매체를 제거 하 고 신선한 매체 puromycin 섹션 4 (그림 3)에서 이전 결정의 정확한 농도 포함 하.
- Puromycin 선택 후 세포를 수확 하 고 RNA는 RNA 키트 제조업체의 지침에 따라 격리를 사용 하 여 분리.
- 선택 된으로 cDNA 합성을 수행 miRNAs 반전 녹음 방송을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).
- 13인용된 프로토콜 따라 정량 반응을 설정 합니다.
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Representative Results
여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장 필터 멤브레인을 사용 합니다. Rhodamine B isothiocyanate-dextran 필터 멤브레인의 최고 약 실에 적용 하 고 내 피 단층의 침투성 바닥 챔버 (그림 2A)에 형광 dextran의 전송을 모니터링 하 여 측정 된다. 일반적으로, 내 피 세포의 침투성은 EVs (그림 2B)의 증가 금액으로 부 화에 따라 영향을 받습니다. 그들은 우물을 통해 단층, 그렇지 않으면 염료는 신속 하 게 확산을 형성할 것 이다 다는 것을 확인 하는 몇 일 동안 세포를 성장 하는 것이 중요 하다. 그것은 중요 한 것은 치료 없이는 dextran 것 이다 확산 천천히 셀 단층을 통해입니다.
MicroRNAs EVs의 핵심 구성 요소 받는 사람 세포를 전송 후, 그들은 유전자 발현 조절. 특히 miRNAs의 역할을 조사 하기 위해 받는 사람 셀 라인에 그들을 overexpress에 매우 유용 하다. 여기는 내 피 세포로 miRNAs transduce 하는 방법에 설명 합니다. 첫 번째 단계 puromycin 안정적 불리고 세포 (그림 4A)을 선택 하려면 내 피 세포를 죽이의 농도 결정 해 이루어져 있다. 마지막으로,는 miRNAs의 표현의 수준은 제어 하 고 정량 (그림 4B)에 의해 검증 될 수 있습니다.
그림 1: EVs는 내 피 세포에 의해 채택. 순화 EVs는 PKH67, 녹색에 내 피 세포의 단층으로 4 h incubated 표시 했다. 치료 되지 않는 내 피 세포는 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 씻은 후 광범위 한 언바운드 EVs를 제거 하려면, 셀 걸 (빨간색) 얼룩 phalloidin와 핵 (파란색) 얼룩 Hoechst 33342 스테인드 했다. 세포는 confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰 되었다. 이미지는 레이저 confocal 현미경 및 63 x 1.3 나 오일 목표를 사용 하 여 촬영 했다. Hoechst 33342 405에 흥분은 nm와 배출 수집 450-470 nm (파랑); PKH67 488에 흥분은 nm, 505-530 nm (녹색); 수집 배출량 그리고 Phalloidin-594 543에서 흥분 nm, 배출량 620에서 수집 된 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 내 피 장벽에 EV 통풍 관의 효과. Dextran rhodamine 표시의 보급의 개략도 (A): 내 피 세포 성장 필터 멤브레인 위에 합류, 형광 dextran 상단 챔버에 적용 되 고 막 통해 시간이 지남에 확산. 침투성에 EVs의 효과입니다 상단 챔버에 EVs의 추가 후 아래쪽 챔버에 dextran의 보급의 속도 측정 하 여 평가 됩니다. EVs의 (B) 증가 금액 내 피 세포와 알을 품는. 시간이 지남에 트랜스-잘 막에 걸쳐 dextran rhodamine 표시의 전송 침투성 측정 할 수 있습니다. 침투성 내 피 계층에 걸쳐 50, 100 µ g/mL EVs의 외피의 2 h 후 크게 증가 된다. 데이터 3 실험에서 평균을 (± s.e.m.)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: puromycin의 적정. Puromycin (10mg/mL)의 재고 솔루션 10% 열 비활성화 (56 ° C, 30 분) 태아 송아지 혈 청, 2mm 글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린/스 보충 RPMI 1640에 희석입니다. 15 µ L의 총 관 a.에 있는 매체의 10 mL에 추가 됩니다. 다음 튜브 A에서 솔루션의 7.5 mL 튜브 B. RPMI의 2.5 mL를 혼합 마지막으로, 희석의 100 µ L 7.5 µ L/mL, 5.62 µ L/mL의 최종 농도 게 셀의 100 µ L에 추가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: miR451a overexpressing 내 피 세포의 생성. 내 피 세포에 puromycin의 살인 곡선의 (A) 결정. 내 피 세포 puromycin 복용량을 증가 함께 알을 품을 했다. 생존은 MTS 분석 결과 72 h 후에 측정 됩니다. 데이터는 하나의 대표적인 실험의 평균을 (± s.e.m.)을 나타냅니다. (B) RNAs miR451a overexpressing 내 피 세포에서 파생 된 또는 부정적인 제어 수확 했다 그리고 miR451a 사본 실시간 PCR에 의해 공인 되었다. 정량 결과가 정부 유전자로 u 6을 사용 하 여 2 Ct 방법으로 정규화 하 고 (± s.e.m.) 의미를 표현 (n = 3 실험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas 등 여러 기생충 감염 된 주인 세포에 의해 EVs의 석방을 트리거합니다. 병원 체에 따라 출시 된 EVs 호스트 면역 반응을 조절 하거나 기생충6사이 셀룰러 통신을 중재 수 있습니다. 그러나, 이러한 작은 소포 말라리아 질병에 기여 하는 방법을 제안 하는 조금 기록이 있다. 여기, 우리는 변형 체 감염 동안 EVs의 기능을 조사 하기 위해 여러 가지 방법으로 설명 했습니다. 예를 들어, 받는 사람 세포 vivo에서 EVs의 통풍 관의 라벨 PKH67 형광 염료와 효율적으로 모니터링할 수 있습니다. 여러 컨트롤 라벨의 특이성을 보장 하기 위해 수행 해야 합니다. 그것은 일단 희석제 C와 혼합, PKH67 염료 양식 집계 하는 경향이 있다 그리고 그것은 일반적인 얼룩 확인 하려면 EVs 없이 혼자 염료를 사용 하 여 컨트롤을 포함 하는 데 필요한 따라서 중요. Confocal 현미경 검사 법은 소포 표면에 바운스되 고 진정으로 받는 세포에 의해 내 면 사이 분화 하는 선택의 방법입니다. 또한, 그것은 추적 하 고 소포는 세포에 의해 촬영의 수를 모니터링 하는 훌륭한 도구를 제공 합니다. 그러나, 그것은 불분명 남아 받는 셀14; EVs는 처리 하는 방법 따라서, 수행 시간 코스의 2, 4, 및 8 h, 시간-포인트를 사용 하 여 통풍 관에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위하여 매우 유용할 수 있습니다. Subcellular 구획 마커 추가 confocal 현미경 검사 법에 의해 셀 내부 EVs를 추적 하기 위해 사용할 수 있습니다. EV 통풍 관 막 융해 또는 endocytosis15통해 발생을 보였다. 퓨전은 octadecyl rhodamine B (R18)와 라벨 EVs에 의해 모니터링할 수 있습니다. EVs의 세포 막과 융합 R18, 형광16증가에 이르게의 희석 결과. EVs의 통풍 관 endocytosis에 의해 말라, microtubule와 dynamin10의 특정 억제제를 사용 하 여 공부 될 수 있다.
EVs의 생리학 연구, PKH 염료와 직접 iRBCs 레이블 및 공동 문화 내 피 세포와 iRBCs 하 가능 하다. 여기 문제는 셀 필요 다른 미디어와 EV의 양과 가스 작곡 부족할 수 있습니다. 또한, 형광 성 꼬리표로 융합 하는 기공을 단백질 기증자 세포에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 표현할 수 있습니다. 그러나, 지금까지 그것은 테스트 되지 않았습니다 iRBCs와 함께
감염 된 Rbc는 대뇌 말라리아17을 책임을 생각 하는 과정에서 두뇌의 microvasculature에 cytoadherent. 따라서 EVs 통해 소재의 기생충 전송 내 피 세포 따라서 혈관 기능18에 영향을 미칠 것입니다. 생체 외에서 분석 결과 설명, 그것의 침투성19의 일부 예를 들면 내 피 세포의 기본 속성을 조사 하는 쉬운 방법을 제공 합니다. TEER 또는 ZO-1와 immunostaining와 같은 추가적인 테스트 꽉 접합 무결성10에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
또한, 생체 외에서 모델 기생충과 호스트 세포 사이의 세포 통신 뒤에 분자 메커니즘을 연구 하는 강력한 도구가 될 것으로 판명. 통풍 관, 외이 설치 수 있습니다 분자 메커니즘의 조사를이 과정에 참여. 예를 들어 우리가 실시간 PCR와 형광 에 제자리에서 교 잡에 의해 수락자 셀에 miR451a의 전송을 모니터링 했습니다. 또한, 우리 overexpressing 관 기능10이 작은 RNA의 역할을 직접 해결 하기 위해 특정 미르 셀 라인을 생성 하는 방법을 설명 합니다. 그러나, 몇 가지 컨트롤이 자체 변환 세포질 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 비 불리고 셀 테스트 수행 되어야 한다. 또한, miRNA 억제제는 miRNAs의 효과 무력화를 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 재정적으로 일부 의학-생물학 연구 (미국적)를,는 고트프리트 줄리아 Bangerter-Rhyner-재단 (MW 미국적)를, 그리고 Fribourg의 대학 (에 미국적)의 연구 수영장에 대 한 노바 티 스 재단에 의해 지원 되었다. 추가 보조금 외국 학자 (갑과 SM) 스위스 정부 우수 장학금 포함 됩니다. 우리 기술 지원에 대 한 이자벨 Fellay와 Solange Kharoubi 헤스 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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