Summary
En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.
Abstract
La malaria es una enfermedad potencialmente mortal causada por parásitos de Plasmodium , p. falciparum siendo la más frecuente en el continente africano y responsable de la mayoría de las muertes relacionadas con el paludismo a nivel mundial. Varios factores, incluyendo el secuestro de parásito en los tejidos, disfunción vascular y las respuestas inflamatorias influyen en la evolución de la enfermedad en personas infectadas por la malaria. P. falciparum-glóbulos rojos infectados (iRBCs) liberar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) que contiene diferentes tipos de carga moléculas que median la comunicación celular y patogénesis entre parásitos y huésped. EVs se toman eficientemente por las células en las que modula su función. Aquí se discuten estrategias para abordar el papel de EVs en las interacciones huésped parásito. En primer lugar, se describe un método sencillo para el etiquetado y seguimiento EV internalización por las células endoteliales, usando un tinte de vinculador de celda verde. En segundo lugar, se presenta una forma sencilla de medir permeabilidad en una monocapa de células endoteliales mediante el uso de un fluorescente etiquetado dextrano. Por último, os mostramos cómo investigar el papel de pequeñas moléculas de ARN no codificante en función de la célula endotelial.
Introduction
Según la Organización Mundial de la salud, había 212 millones de nuevos casos de malaria en todo el mundo en 2015 y aproximadamente 429.000 personas murieron, principalmente a niños menores de cinco años de edad1. Los mecanismos que conducen a la enfermedad severa, que a menudo se asocia con disfunción vascular, siendo mal definidas2. Plasmodium- iRBCs secretan esferas pequeñas de bi-lípidos de membrana conocidas como vesículas extracelulares (EVs). Es sabido que los EVs son potencialmente relevantes para el proceso de infección y la respuesta inmune del huésped a la infección; sin embargo, poco se sabe sobre la función exacta de estas vesículas pequeñas durante la infección de la malaria3. Es posible que juegan dos papeles importantes: por un lado, podría contribuir a la patogenesia activando macrófagos4,5; y por otro lado, podría mediar comunicación celular entre parásitos y entre parásitos y huésped6,7. De hecho, parásitos pueden transferir proteínas o ácidos nucleicos entre sí a través de EVs. Por ejemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs puede transferir factor de virulencia Serum Resistance-Associated (SRA) y puede dirigirse a otros T. brucei y host eritrocitos8. Además, por p. falciparum- iRBCs comunicarse entre sí mediante la transferencia de ácidos nucleicos dentro de EVs. Esto permite que los parásitos optimizar y sincronizar su crecimiento. De hecho, EVs podría ser el regulador principal de conversión gametocyte y por lo tanto contribuir a la regulación de la fase de transmisión7.
No sólo lo EVs regulan los parásitos, también median las interacciones huésped parásito. Recientemente hemos descubierto que los EVs de iRBCs contienen microRNAs derivados del host (miRNAs; especies pequeñas de RNA en el rango de 21-25 nucleótidos9) que son tomados por células endoteliales humanas. Los miRNAs en el EVs forman un complejo con antes2 estable (un miembro de la RNA-inducido silenciando complejo), que una vez entregado a las células del receptoras, es capaz de silenciar genes específicamente y que afectan a las propiedades de barrera de las células10. Protocolos se han desarrollado para investigar la función de los vehículos eléctricos. Aquí, describimos primero un protocolo que permite el etiquetado fluorescente de EVs para investigar su absorción por las células del receptoras. Además, mediante el uso de un microscopio confocal, es posible rastrear el destino de la EV interior de la célula. Varios tintes fluorescentes pueden utilizarse para rastrear la EVs. El tinte reactivo amino, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato Succinimidyl (CFSE) y fluorescente de calceína-AM se convierten una vez dentro de las vesículas. Preferimos utilizar la etiqueta anfifílicas, PKH, porque da una señal más brillante y más uniforme. Este enfoque proporciona información importante para entender las interacciones entre células receptores y EVs. Mientras que en algunos casos EVs se unen a la superficie de las células, algunas vesículas se toman rápidamente. A absorción, EVs entregar sus cargas a las células, en el cual ejercen sus funciones reguladoras.
Aquí, describimos un protocolo para medir la función de barrera de las células endoteliales en vitro mediante la cuantificación de la transferencia de un dextrano fluorescente a través de una monocapa celular. Marcadores más sensibles pueden utilizarse como marcadores radiactivos. Sin embargo, requieren precauciones especiales para el uso. Otros ensayos existen para medir la función de barrera en vitro como resistencia eléctrica transendothelial (TEER), que mide la integridad de la ensambladura apretada. Finalmente visualizar ZO-1, una proteína de Unión estrecha, por inmunofluorescencia permite la evaluación de la integridad de la ensambladura apretada bien10. Como EVs son entidades complejas y heterogéneas que contienen varias cargas con característica reguladora potencial, es útil para sobreexpresar un ARN específico para estudiar su efecto sobre la célula receptora. Por lo tanto, definimos también un protocolo que pretende generar líneas celulares estables expresando la miRNA de interés10.
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Protocol
Glóbulos rojos humanos fueron obtenidos de la sangre de donantes sanos, siguiendo las directrices de Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parásito p. falciparum (3 7) y la producción de EV fueron descritos previamente en Mbagwu, et al. 11 debido a p. falciparum es un patógeno humano, consulte las normas locales para el manejo. Las culturas deben conservarse estéril todo el tiempo.
1. fluorescencia de etiquetado de los vehículos eléctricos
Nota: El siguiente procedimiento aprovecha la tecnología de etiquetado estable incorporación de un colorante fluorescente verde (PKH67) con grandes colas alifáticas en la región del lípido de la membrana EV. La reacción se realiza en un volumen que contiene una concentración final de 20 μm de PKH67 la coloración final de 200 μl. Realizar todos los pasos en la temperatura ambiente (20-25 ° C)
- Coloque 100 μg de EVs en 1 mL de PBS en un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugue lo EVs en un tubo de microcentrífuga a máxima velocidad (20.000 x g) durante 7 minutos para que sedimenten.
Nota: Puesto que leucocito-asociado de malaria está presente en EVs, debe observar un pellet marrón rojo oscuro. Si el sobrenadante es rojizo, con lisis del EVs. - Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante con cuidado, para evitar retirar cualquier EVs.
Nota: Minimizar la cantidad de buffer restante antes de resuspender EVs en diluyente C para aumentar la reproducibilidad y eficacia de la tinción. - Resuspender el precipitado de EV en 100 μl de diluyente de C (2 X EV suspensión) y pipetee suavemente para asegurar la completa dispersión.
- Preparar un tubo nuevo de microcentrífuga y añadir 4 μL de la solución de tinte etanólico de PKH67 a 100 μl de diluyente C. Vortex bien para mezclar. Preparar esta solución colorante de 2 x (40 μm) inmediatamente antes de la tinción.
Nota: Para evitar coloración heterogénea, no agregue la solución de colorante etanol PKH67 directamente a la pelotilla de EV. - Rápidamente, se combinan los 100 μl de 2 X EV suspensión (paso 1.4) con 100 μl de 2 X solución de colorante (criterio 1.5). Luego, mezcle la muestra mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
- Incubar la suspensión EV/tinte de paso 1.6 durante 5 minutos protegida de la luz y mezcla por Vortex 3 - 4 veces durante la incubación de 5 minutos.
Nota: Incubando la suspensión EV/tinte por más tiempo no proporciona ninguna ventaja, ya que la coloración es tan rápida. - Detener la reacción de tinción mediante la adición de un volumen igual (200 μL) de suero e incubar durante 1 min permitir la Unión de exceso de tinte.
Nota: Antes de parar la tinción, agotan el suero de EVs por centrifugación a 20.000 x g durante 20 minutos. - Lavar 3 veces con PBS y giro a 20.000 x g durante 5 minutos vuelva a suspender el servicio voluntario europeo en 100 μl de PBS a una concentración final de 1 μg/μl.
2. visualizar la absorción de EVs por Microscopía Confocal
Nota: El siguiente protocolo describe el seguimiento de la internalización de la EV por las células endoteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Las células endoteliales son las células endoteliales de la médula ósea humanas semi inmortalizadas como se describe en12.
- Trabajar en un ambiente estéril, cubrir el cubreobjetos con un exceso de 0.01% poly-L-lisina 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Aspirar la solución de poli-l-lisina y permita que el cubreobjetos se seque por completo.
- Realizar un recuento de células endoteliales viables mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro.
- Transferencia de 1 x 105 células endoteliales en 1 mL de endotelial célula crecimiento medio completo que contiene la mezcla del suplemento a los cubreobjetos poly-L-lisina-revestida y dejar que las células crecen a una monocapa.
Nota: El medio contiene factores de crecimiento que permiten a las células para formar una monocapa y forman a uniones estrechas. - Una vez que las células forman una capa monomolecular, cuidadosamente aspirar el medio y añadir 1 mL de medio fresco para lavar las células. Repita el lavado una vez más. Añadir 50 μg de PKH67 marca EVs e incubar durante 4 h.
Nota: Para encontrar el momento óptimo para la absorción, puede realizarse un curso de tiempo. - Después de 4 h, Aspire el medio y lavar las células 3 veces con PBS para eliminar el exceso y EVs. Fijar las células con solución de paraformaldehído al 3% en PBS durante 15 minutos.
Nota: El metanol puede interrumpir actina durante el proceso de fijación; por lo tanto, es mejor evitar cualquier metanol con fijadores u otros fijadores disolventes. Se recomienda usar el formaldehido libre de metanol como fijador. - Lavar las células 3 veces con PBS. Añadir cuidadosamente 250 μl de 0,1% Tritón X-100 en PBS para permeabilizar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Lavar 3 veces con PBS. Añadir 400 μL de solución amortiguadora de bloqueo (5% de BSA en PBS) durante 30 min a RT para bloquear la fijación no específica.
- Lavar las células una vez con PBS. Prepare la solución de tinción por dilución 5 μl de la solución madre phalloidin en 200 μL BSA de PBS/1% por cada cubreobjetos. Pipetee 200 μL de la solución de tinción en el cubreobjetos e incubar por 20 min a TA.
- Lavar 3 veces con PBS. Contratinción al ADN para 30 s con Hoechst 33342 a una concentración final de 2 μg/mL en 200 μL de PBS.
- Lavar 2 x el cubreobjetos por añadir 400 μL de PBS. Cuidadosamente tomar el cubreobjetos con el fórceps e invertir en la parte superior una gota de los medios de montaje en un portaobjetos de vidrio de preservador de fluorescencia. Retire suavemente el exceso de medio con un pañuelo y sello de cada lado con esmalte de uñas.
- Almacenar las diapositivas protegidas de la luz a 4 ° C.
- Visualizar las células utilizando un microscopio confocal de láser excitaciones 405 488 y 543 nm y un 63 X, objetivo de aceite de 1,3 NA con emisiones fluorescentes en 450-470 nanómetro (azul), 505-530 nm (verde) y 620 nm.
Nota: Resultados de tinción de F-actina típica se muestran en la figura 1.
3. permeabilidad de la célula endoteliales
Nota: Permeabilidad de la célula endotelial se evaluó mediante la medición de la transferencia de rodamina B isotiocianato-dextrano (promedio MW 70.000) a través de la monocapa de células endoteliales. Dextran proporciona una excelente herramienta para estudiar la permeabilidad vascular.
- Recuento viable las células endoteliales mediante la exclusión de azul de tripano 0.4% y un hemocitómetro.
- Las células endoteliales con una densidad de 0.6 x 105 células a confluencia en cultivo de tejido de 24 pocillos rellenos (0,4 μm tamaño de poro) y deja inalterado durante al menos 5 días formar monocapas diferenciadas de la placa. Actualizar el medio cada dos días.
- Una vez que las células alcancen una monocapa, cargar el EVs (50 μg en 1 mL) en la cámara alta. Agregue rodamina-dextran para la superior a una concentración final de 20 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
- Supervisar a la transferencia de los dextranos fluorescentes en la parte inferior bien mediante la medición de emisión de fluorescencia de alícuotas medias de 40 μl. Configurar el lector de microplacas de varias etiquetas en el 544 de nm de excitación y 590 emisiones nm para mediciones.
Nota: La cantidad de dextrano difusa puede cuantificarse usando curvas de calibración con la solución. Además, experimentos cinéticos pueden realizarse mediante la eliminación de pequeñas muestras del medio exterior de la cámara durante un tiempo (figura 2). Incluso sin tratamiento, el dextrano se difundirá a través de la monocapa celular.
4. determinar la sensibilidad de puromicina
Nota: Antes de transducción de las líneas celulares con lentivirus, es importante determinar la curva de la muerte de un medicamento seleccionado para esa línea celular particular. Para determinar la cantidad mínima de concentración de fármaco necesaria para matar todas las células, realizar un experimento de respuesta de dosis con dosis incrementales de la droga seleccionada. Porque cada línea de células de mamífero tiene una sensibilidad diferente, antes de experimentación, debe determinarse la concentración óptima de los antibióticos mediante el desarrollo de la valoración de la curva de muerte como se detalla a continuación.
- Contar las células con el hemocitómetro. Resuspender las células endoteliales a una concentración de 1 x 105 células/mL en endotelial célula crecimiento medio completo que contiene la mezcla del suplemento.
- Placa de 1 x 104 células en una placa de 96 pocillos en un volumen final de 100 μl del medio de crecimiento celular endotelial.
- Añada 100 μl de medio con antibióticos para obtener una concentración de 0.1-10 μg/mL (ver figura 3).
- Examinar la viabilidad de la célula cada 2 días un microscopio óptico con objetivo 20 X. Las células de la cultura durante 10-14 días y reemplazar los medios de comunicación que contiene puromicina cada 2-3 días dependiendo del crecimiento de la célula.
- Añadir 10 μL/pocillo MTS reactivo en cada pocillo, mezclar e incubar durante 4 h a 37 ° C en condiciones de cultivo estándar.
- Agitar brevemente la placa sobre un agitador y medir la absorbancia de las células tratadas y no tratadas usando un lector de placas a 490 nm (figura 3).
5. transducción de las células endoteliales con vectores lentivirales
- Placa de 1 x 105 células endoteliales en 1 mL de medio completo el día antes de transducción de señales. Realizar la transducción de señales cuando las células han llegado a 50-80% de confluencia.
- Descongelar los lentivirus en hielo y hacer alícuotas de las poblaciones virales para evitar ciclos de congelación-descongelación. Girar hacia abajo el material a 200 x g durante 30 s, en los tubos antes de abrir para evitar derrames.
- Añadir bromuro de hexadimethrine a las células a una concentración final de 8 μg/mL.
Nota: El bromuro de Hexadimethrine ayuda a la eficiencia de la transducción de señales, sin embargo en algunos casos pueden ser tóxico para las células. Por lo tanto, la concentración óptima debe determinarse mediante la realización de una curva de la muerte antes de la transducción. - Agitar la placa suavemente para mezclar. Añadir la cantidad de partículas virales (entre 0.5-2 x 106 partículas) en una conveniente multiplicidad de infección (MOI) y agitar la placa suavemente por 30 s para mezclar.
- Centrifugar la mezcla de la partícula viral a la célula en la centrifugadora a temperatura ambiente por 45 min a 300 x g para aumentar la eficiencia de la transducción de señales. Incubar la mezcla de la partícula viral a la célula a 37 ° C durante la noche.
- Retire con cuidado el medio que contiene la partícula viral y deseche adecuadamente. Reemplazar con dulce, con medio de cultivo completo.
- Comenzar la selección con puromicina en el segundo día: Quite el medio y sustituirlo con medio fresco que contiene la concentración correcta de puromicina determinada previamente en la sección 4 (figura 3).
- Cosecha de células después de la selección de puromicina y aislar RNA usando un RNA aislar kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realizar síntesis de cDNA con el seleccionado miRNAs mediante una transcripción reversa kit (véase la Tabla de materiales).
- Configurar la reacción de qPCR según el citado Protocolo13.
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Representative Results
Aquí, describimos protocolos para investigar las interacciones de EVs con las células del huésped. La absorción de la fluorescencia etiquetadas EVs es supervisada por microscopía confocal (figura 1). Las células endoteliales toman eficientemente EVs, sin embargo el tiempo de incubación con EVs puede optimizarse para el seguimiento de la absorción. Para una mejor localización de los vehículos eléctricos dentro de las células, mancha de actina con phalloidin. A continuación, utilizamos una membrana de filtro sobre el que crece una monocapa de células endoteliales. Rhodamine B isotiocianato-dextran se aplica en la cámara superior de la membrana de filtro y luego se mide la permeabilidad de la monocapa endotelial mediante el control de la transferencia de los dextranos fluorescentes en la cámara inferior (figura 2A). Por lo general, depende de la permeabilidad de las células endoteliales tras la incubación con una creciente cantidad de EVs (figura 2B). Es importante crecer las células por varios días para asegurarse de que se forman una monocapa, si no que el tinte se difunden rápidamente a través de los pozos. Es importante tener en cuenta que incluso sin tratamiento, el dextrano se difunden lentamente a través de la monocapa celular.
MicroRNAs son componentes clave de los vehículos eléctricos y después de la transferencia a las células del receptoras, que regulan la expresión génica. Para investigar específicamente el papel de los miRNAs, es muy útil para sobreexpresar en la línea celular receptor. Aquí describimos cómo transduce miRNAs en células endoteliales. El primer paso consiste en determinar la concentración de puromicina que mata a las células endoteliales para seleccionar células transduced estable (Figura 4A). Por último, el nivel de expresión de los miRNAs puede ser controlado y validado por qPCR (Figura 4B).
Figura 1: EVs son tomado por las células endoteliales. EVs purificadas fueron marcadas en verde con PKH67 e incubados durante 4 h con una monocapa de células endoteliales. Las células endoteliales no tratadas se utilizan como un control negativo. Después de lavar amplio para quitar EVs no consolidados, las células se tiñeron con phalloidin manchar actina (rojo) y Hoechst 33342 para teñir el núcleo (azul). Las células fueron observadas por microscopía confocal. Imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal de láser y un objetivo de aceite NA 63 x 1.3. Está entusiasmado de Hoechst 33342 a 405 nm y con emisiones en 450-470 nanómetro (azul); PKH67 se complace en 488 nm, emisión recogido en el 505-530 nm (verde); y Phalloidin-594 es excitado a 543 nm, emisiones recogidas a 620 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: efecto de la absorción de EV en la barrera endotelial. (A) esquema de la difusión de dextrano marcado con rodamina: las células endoteliales se cultivan a la confluencia en la parte superior de un filtro de membrana, el dextrano fluorescente se aplica a la cámara superior y difumina con el tiempo a través de la membrana. El efecto de EVs en la permeabilidad se evaluó después de la adición de EVs a la cámara superior midiendo la tasa de difusión de dextrano a la cámara inferior. (B) un aumento de cantidad de EVs se incuban con las células endoteliales. La transferencia de dextrano marcado con rodamina a través de una membrana trans-bien en el tiempo permite las mediciones de permeabilidad. Permeabilidad a través de la capa endotelial se incrementa significativamente después de 2 h de incubación con 50 y 100 μg/mL de EVs. Los datos representan la media (± SEM) de 3 experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: valoración de puromicina. La solución de puromicina (10 mg/mL) se diluye en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera 10% inactivadas por calor (56 ° C, 30 min) fetal, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 m m, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. Se añade un total de 15 μl a 10 mL de medio en tubo A. Luego se mezcla 7,5 mL de la solución del tubo A 2,5 mL de RPMI al tubo B. Por último, se añaden 100 μl de la dilución a 100 μl de células para dar una concentración final de 7.5 μl/mL, 5.62 μl/mL y así sucesivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: generación de las células endoteliales overexpressing miR451a. (A) determinación de la curva de la muerte de puromicina en células endoteliales. Las células endoteliales se incubaron con puromicina en dosis crecientes. La viabilidad se midió mediante ensayo MTS después de 72 h. Los datos representan la media (± SEM) de un experimento representativo. (B) RNAs derivados de las células endoteliales overexpressing miR451a o cosecharon un control negativo y la transcripción de miR451a se cuantificó por PCR en tiempo real. qPCR resultados son normalizados por el método 2-Ct U6 como gene del ama de casa y expresados como media (± SEM) (n = 3 experimentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varias parásitos, incluyendo el Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania y Trichomonas desencadenan la liberación de los vehículos eléctricos por la célula huésped infectada. Dependiendo de los patógenos, el EVs liberado puede modular la respuesta inmune del huésped o median la comunicación celular entre los parásitos6. Sin embargo, hay poca evidencia que sugiere cómo estas vesículas pequeñas contribuyen a la enfermedad de la malaria. Aquí, hemos descrito varias maneras de investigar la función de los vehículos eléctricos durante la infección de Plasmodium . Por ejemplo, la incorporación de vehículos eléctricos por receptores de las células en vivo puede controlarse eficientemente por etiquetado con el tinte fluorescente PKH67. Varios controles debe realizarse con el fin de garantizar la especificidad de la rotulación. Es importante tener en cuenta que una vez mezclado con el diluyente C, el tinte de PKH67 tiende a formar agregados, y por lo tanto es necesario incluir un control con el tinte sin EVs para determinar la tinción inespecífica. La microscopia confocal es el método de elección para diferenciar entre las vesículas limitados a la superficie y realmente internalizado por las células del receptoras. Además, proporciona una excelente herramienta para el seguimiento y monitorear el número de vesículas de las células. Sin embargo, no queda claro cómo la EVs se procesan en el receptor células14; por lo tanto, realizar un curso de tiempo usando puntos de tiempo de 2, 4 y 8 h, puede ser muy útil para determinar las condiciones óptimas para la absorción. La adición de marcadores de compartimiento subcelular puede utilizarse para rastrear el EVs dentro de las células por microscopía confocal. EV la absorción se ha demostrado para ocurrir a través de la membrana fusión o endocitosis15. La fusión puede ser monitoreada por EVs Etiquetadoras con octadecyl rodamina B (R18). La fusión de los vehículos eléctricos con los resultados de las membranas celulares en la dilución del R18, que conduce a un aumento en fluorescencia16. Absorción de EVs por endocitosis puede ser estudiada mediante el uso de inhibidores específicos de la actina, microtúbulos y Dinamina10.
Para estudiar la fisiología de los vehículos eléctricos, es posible etiquetar el iRBCs directamente con los tintes PKH y co de la cultura el iRBCs con las células endoteliales. El problema aquí es que las células requieren diferentes medios y composiciones de gas y la cantidad de transferencia de la EV pueden ser baja. Además, las proteínas vesiculares con una etiqueta fluorescente pueden expresarse en las células de donantes en vitro y en vivo. Sin embargo, hasta ahora no ha sido probado con iRBCs
Glóbulos rojos infectados son cytoadherent a la microvasculatura del cerebro, en un proceso que cree que es responsable de causar malaria cerebral17. Por lo tanto, la transferencia de material del parásito por EVs es probable que influyen en las células endoteliales y función vascular por lo tanto,18. El ensayo en vitro descrito aquí, proporciona una manera fácil para investigar algunas de las propiedades básicas de las células endoteliales, como por ejemplo su permeabilidad19. Prueba adicional como TEER o immunostaining con ZO-1 puede proporcionar más información sobre la integridad apretada de la ensambladura del10.
Además, el modelo de vitro resulta para ser una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos moleculares detrás de la comunicación celular entre los parásitos y las células del huésped. Además de la absorción, esta configuración permite la investigación de mecanismos moleculares implicados en este proceso. Por ejemplo, hemos monitoreado a la transferencia de miR451a a las células de aceptador por PCR en tiempo real y la hibridación fluorescente en situ . Además, se describe cómo generar líneas de células overexpressing un particular miRNA, para abordar directamente el papel de estos pequeños RNA en la función vascular10. Sin embargo, deben realizarse varios controles incluyendo la prueba de células transduced no, puesto que la transducción puede afectar la función celular. Además, los inhibidores de la miRNA pueden utilizarse para neutralizar el efecto de los miRNAs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Novartis para el médico y biológico investigación (PYM), el Gottfried y Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW y PYM) y el grupo de investigación de la Universidad de Friburgo (a PYM). Subvenciones adicionales incluyen las becas de excelencia de gobierno suizo para académicos extranjeros (a KAB y SM). Agradecemos a Isabelle Fellay y Solange Kharoubi Hess para el soporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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