Summary
In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.
Abstract
La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.
Introduction
Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età1. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti2. Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste piccole vescicole durante la malaria infezione3. È possibile che essi svolgono due ruoli importanti: da un lato, essi potrebbero contribuire alla patogenesi attivando i macrofagi4,5; e d'altra parte, essi potrebbero mediare la comunicazione cellulare tra parassiti e tra parassiti e host6,7. Infatti, i parassiti possono trasferire proteine o acidi nucleici tra loro tramite EVs. Ad esempio, Trypanosoma brucei rhodesiense SVE può trasferire fattore di virulenza Serum Resistance-Associated (SRA) e puoi indirizzare altri T. brucei e l'host eritrociti8. Inoltre, p. falciparum- iRBCs comunicano tra loro mediante il trasferimento di acidi nucleici all'interno di server virtuale di Exchange. In questo modo i parassiti ottimizzare e sincronizzare la sua crescita. Infatti, EVs potrebbe essere il principale regolatore di conversione gametocyte e quindi contribuire alla regolazione della trasmissione fase7.
Non solo SVE regolano i parassiti, anche mediano interazioni parassita-ospite. Abbiamo recentemente scoperto che SVE da iRBCs contengono derivati host microRNAs (miRNAs; piccole specie di RNA nella gamma di 21-25 nucleotidi9) che sono presi dalle cellule endoteliali umane. I miRNA nel server EVs formano un complesso con Ago2 stabile (un membro del RNA-induced silencing complex), che una volta consegnato il destinatario delle cellule, è in grado di specificamente silenziare l'espressione genica e che influenzano le proprietà barriera delle cellule10. Protocolli standard sono stati sviluppati per studiare la funzione del SVE. Qui, descriviamo in primo luogo un protocollo che consente l'etichettatura fluorescente di EVs per indagare il loro assorbimento dalle cellule recettive. Inoltre, utilizzando un microscopio confocale, è possibile tenere traccia di destino di EV all'interno della cellula. Diversi coloranti fluorescenti utilizzabile per tenere traccia di EVs. L'ammina-reattivo colorante, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) e fluorescenti di calceina-AM diventa una volta all'interno delle vescicole. Preferiamo utilizzare l'etichetta anfifiliche, PKH, perché dà un segnale più luminoso e uniforme. Questo approccio fornisce informazioni importanti per comprendere le interazioni tra EVs e cellule recettive. Mentre in alcuni casi EVs legarsi alla superficie delle cellule, alcune vescicole sono prese velocemente. Dopo l'assorbimento, EVs consegnare loro carichi per le cellule, in cui esercitano le loro funzioni di regolamentazione.
Qui, descriviamo un protocollo per misurare la funzione della barriera di cellule endoteliali in vitro quantificando il trasferimento di un destrano fluorescente attraverso un monostrato cellulare. Più sensibili traccianti possono essere utilizzati come marcatori radioattivi. Tuttavia, richiedono speciali precauzioni per l'uso. Altri saggi esistono per misurare la funzione di barriera in vitro come resistenza elettrica transendoteliale (TEER), che misura l'integrità stretta della giunzione. Infine visualizzare ZO-1, una proteina di giunzione stretta, dall'immunofluorescenza consente la valutazione dell'integrità di giunzione stretta come ben10. Poiché SVE sono entità complesse ed eterogenee, contenente diversi carichi con potenziale normativo caratteristica, è utile iperesprimono un RNA specifico per studiare il suo effetto sulla cellula ricevente. Di conseguenza, si definisce anche un protocollo che mira a generare linee cellulari stabili che esprimono il miRNA di interesse10.
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Protocol
Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).
Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. 11 perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.
1. fluorescenza etichettatura del SVE
Nota: La procedura seguente si avvale della tecnologia d'etichettatura per incorporare stabilmente un colorante fluorescente verde (PKH67) con grandi code alifatiche nella regione del lipido della membrana EV. La reazione è condotta in un volume contenente una concentrazione finale di 20 µM di PKH67 di colorazione finale 200 µ l. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente (20-25 ° C)
- Posto 100 µ g di EVs in 1 mL di PBS in una microcentrifuga.
- Centrifugare lo SVE in un tubo del microcentrifuge alla massima velocità (20.000 x g) per 7 min a pellet.
Nota: Poiché emozoina è presente nel server virtuale di Exchange, un pellet brunastro rosso-scuro dovrebbe essere osservata. Se il supernatante è rossastro, il servizio volontario europeo è lisate. - Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante con attenzione, al fine di evitare la rimozione di qualsiasi server virtuale di Exchange.
Nota: Ridurre al minimo la quantità di residuo buffer presenti prima risospendere EVs in diluente C al fine di aumentare l'efficienza della colorazione e riproducibilità. - Risospendere il pellet di EV in 100 µ l di diluente C (2 X sospensione EV) e delicatamente pipetta per assicurare la completa dispersione.
- Preparare un nuovo tubo del microcentrifuge e aggiungere 4 µ l della soluzione etanolica tintura PKH67 a 100 µ l di diluente C. Vortex bene per mescolare. Preparare la soluzione di colorante 2 x (40 µM) immediatamente prima della colorazione.
Nota: Per evitare macchie eterogenei, non aggiungere la soluzione di colorante etanolica PKH67 direttamente per il pellet di EV. - Rapidamente, è possibile combinare i 100 µ l di sospensione di EV (passo 1.4): 2x con i 100 µ l di soluzione colorante (passo 1,5): 2x. Quindi, mescolare il campione pipettando su e giù per 10 volte.
- Incubare la sospensione EV/colorante dal passaggio 1.6 per 5 min, protetta da luce e mescolare nel Vortex 3 - 4 volte durante l'incubazione di 5 min.
Nota: Incubando la sospensione di EV/colorante per tempi più lunghi non fornisce alcun vantaggio, perché la colorazione è così rapida. - Fermare la reazione di macchiatura aggiungendo un volume uguale (200 µ l) del siero e incubare per 1 min consentire l'associazione di colorante in eccesso.
Nota: Prima di arrestare la macchiatura, impoveriscono il siero da EVs mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 min. - Lavare 3 volte con PBS e spin giù a 20.000 x g per 5 min. Risospendere lo SVE in 100 µ l di PBS per raggiungere una concentrazione finale di 1 µ g / µ l.
2. visualizzare l'assorbimento dello SVE mediante microscopia confocale
Nota: Il seguente protocollo descrive il tracciamento di interiorizzazione EV dalle cellule endoteliali coltivate su vetrini coprioggetti. Le cellule endoteliali sono cellule endoteliali del midollo osseo umane semi-immortalate come descritto in12.
- Lavorare in un ambiente sterile, cappotto coprioggetti con un eccesso di 0.01% poli-L-lisina per 10 min a temperatura ambiente (TA).
- Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e consentire i coprioggetti asciugare completamente.
- Eseguire un conteggio di cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro.
- Trasferire 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento per i coprioggetti rivestiti con poli-L-lisina e lasciare che le cellule crescono di un monostrato.
Nota: Il supporto contiene fattori di crescita che permettono alle cellule di formare un monostrato e a formare giunzioni strette. - Una volta che le cellule formano un monostrato, attentamente aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di terreno nuovo per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio una volta di più. Aggiungere 50 µ g di PKH67-labeled EVs e incubare per 4 h.
Nota: Per trovare il punto di tempo ottimo per l'assorbimento, un corso a tempo può essere eseguito. - Dopo 4 h, aspirare il mezzo e lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere EVs in eccesso e non associato. Fissare le cellule con soluzione di paraformaldeide 3% in PBS per 15 min.
Nota: Metanolo possa interferire con l'actina durante il processo di fissazione; Pertanto, è meglio evitare qualsiasi metanolo contenente fissativi o altri fissativi a base di solvente. Si consiglia di utilizzare metanolo senza formaldeide come fissativo. - Lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere con cautela 250 µ l di 0.1% Triton X-100 in PBS per permeabilize le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 400 µ l di tampone bloccante (5% BSA in PBS) per 30 min a RT per bloccare il legame non specifico.
- Lavare le cellule una volta con PBS. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 5 µ l della soluzione madre falloidina in 200 µ l PBS/1% BSA per ogni vetrino coprioggetto. Dispensare 200 µ l di soluzione colorante il coprivetrino e incubare per 20 minuti a TA.
- Lavare 3 volte con PBS. Colorante di contrasto il DNA per 30 s con Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL a 200 µ l di PBS.
- Lavare il vetrino coprioggetto: 2x aggiungendo 400 µ l di PBS. Attentamente afferrare il coprioggetto con il forcipe e negarlo sulla cima di una goccia di antifade supporti di montaggio su un vetrino. Rimuovere delicatamente il terreno in eccesso con un fazzoletto e sigillare ogni lato con smalto.
- Archiviare le diapositive proteggere dalla luce a 4 ° C.
- Visualizzare le celle utilizzando un microscopio confocale laser eccitazioni 405, 488 e 543 nm e un 63 X, obiettivo di olio 1,3 NA con emissioni fluorescenti a 450-470 nm (blu), 505-530 nm (verde) e 620 nm.
Nota: F-actina tipica colorazione risultati sono mostrati nella Figura 1.
3. endothelial delle cellule permeabilità
Nota: Permeabilità delle cellule endoteliali è valutata misurando il trasferimento di Rodamina B isotiocianato-destrano (medio MW 70.000) lungo il monostrato di cellule endoteliali. Destrano fornisce un ottimo strumento per studiare la permeabilità vascolare.
- Conta cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue 0,4% e un emocitometro.
- Le cellule endoteliali ad una densità di 0,6 x 105 celle alla confluenza in coltura di tessuti 24 pozzetti inserti (dimensione dei pori di 0,4 µm) e lasciare indisturbato per almeno 5 giorni formare strati monomolecolari differenziati della piastra. Aggiornare il mezzo ogni secondo giorno.
- Una volta che le cellule raggiungono un monostrato, caricare il servizio volontario europeo (50 µ g in 1 mL) sulla camera superiore. Aggiungere il rodamina-destrano al pozzo superiore ad una concentrazione finale di 20 mg/mL. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
- Monitorare il trasferimento del destrano fluorescente a fondo anche misurando l'emissione di fluorescenza da aliquote medie di 40 µ l. Impostare il lettore di micropiastre multi-etichetta a 544 nm eccitazione e di 590 nm emissione per misurazioni.
Nota: La quantità di destrano diffusa può essere quantificata utilizzando le curve di calibrazione stabilite con la soluzione di riserva. Inoltre, esperimenti cinetici possono essere eseguiti rimuovendo piccoli campioni del mezzo alloggiamento esterno durante un corso a tempo (Figura 2). Anche senza alcun trattamento, il destrano diffonderà attraverso il monostrato cellulare.
4. determinare la sensibilità con puromicina.
Nota: Prima di trasdurre le linee cellulari con lentivirus, è importante determinare la curva di uccisione di un farmaco selezionato per quella linea particolare cellula. Per determinare l'importo minimo della concentrazione di farmaco necessario uccidere tutte le cellule, è necessario effettuare un esperimento di risposta dose utilizzando dosi incrementali del farmaco selezionato. Poiché ogni linea di cellule di mammifero ha una diversa sensibilità, prima sperimentazione, la concentrazione ottimale dell'antibiotico dovrebbe essere determinata sviluppando la titolazione di curva di uccidere come dettagliato di seguito.
- Contare le celle utilizzando l'emocitometro. Risospendere le cellule endoteliali ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento.
- Piastra di 1 x 104 celle in una piastra a 96 pozzetti in un volume finale di 100 µ l di Medium di crescita delle cellule endoteliali.
- Aggiungere 100 µ l di terreno contenente gli antibiotici per ottenere una concentrazione di 0,1-10 µ g/mL (vedere la Figura 3).
- Esaminare l'attuabilità delle cellule ogni 2 giorni sotto un microscopio chiaro utilizzando un obiettivo X 20. Le cellule della coltura per 10-14 giorni e sostituire i supporti contenenti con puromicina ogni 2-3 giorni a seconda della crescita delle cellule.
- Aggiungere 10 µ l/pozzetto MTS reagente in ciascun pozzetto, mix e incubare per 4 h a 37 ° C in condizioni di coltura standard.
- Agitare brevemente la piastra su un agitatore e misurare l'assorbanza delle cellule trattate e non trattate utilizzando un lettore di piastra a 490 nm (Figura 3).
5. trasduzione delle cellule endoteliali con vettore lentivirale
- Piastra di 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di terreno completo il giorno prima di trasduzione. Eseguire la trasduzione quando le cellule hanno raggiunto confluency di 50-80%.
- Scongelare il lentivirus su ghiaccio e rendere le aliquote degli stock virali per evitare cicli di gelo-disgelo. Rotazione verso il basso il materiale a 200 x g per 30 s, nei tubi prima di aprire per evitare fuoriuscita di sopra.
- Aggiungere bromuro di hexadimethrine le cellule ad una concentrazione finale di 8 µ g/mL.
Nota: Il bromuro di Hexadimethrine aiuta l'efficienza di trasduzione, tuttavia in alcuni casi potrebbe essere tossico per le cellule. Pertanto, la concentrazione ottima deve essere determinata eseguendo una curva di uccisione prima la trasduzione. - Agitare la piastra delicatamente per mescolare. Aggiungere la quantità appropriata di particelle virali (tra 0,5-2 x 106 particelle) ad una molteplicità di adatta di infezione (MOI) e agitare la piastra delicatamente per 30 s a mescolare.
- Centrifugare il mix di particella virale delle cellule nella centrifuga a RT per 45 min a 300 x g per aumentare l'efficienza di trasduzione. Incubare la miscela di particella virale delle cellule a 37 ° C durante la notte.
- Rimuovere con attenzione il mezzo che contengono particelle virale e scartare in modo appropriato. Sostituirlo con terreno di coltura completo fresco, pre-riscaldato.
- Avviare la selezione con con puromicina il secondo giorno: rimuovere il mezzo e sostituirlo con medium fresco contenente la concentrazione corretta di con puromicina come determinato in precedenza nella sezione 4 (Figura 3).
- Raccogliere le cellule dopo selezione con puromicina e isolare RNA usando un RNA isolando kit seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire la sintesi del cDNA con il selezionato Mirna utilizzando una trascrizione inversa kit (vedere la Tabella materiali).
- Impostare la reazione di qPCR secondo il citato protocollo13.
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Representative Results
Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo un filtro a membrana in cima alla quale si sviluppa un monostrato di cellule endoteliali. Rodamina B isotiocianato-destrano è applicato sulla camera superiore della membrana del filtro e quindi la permeabilità del monostrato endoteliale è misurata monitorando il trasferimento del destrano fluorescente nella camera inferiore (Figura 2A). In genere, la permeabilità delle cellule endoteliali è interessata sopra incubazione con una crescente quantità di EVs (Figura 2B). È importante crescere le cellule per diversi giorni per assicurarsi che essi formano un monostrato, altrimenti che il colorante si diffonderà rapidamente attraverso i pozzi. È importante notare che anche senza trattamento, il destrano si diffonderà lentamente attraverso il monostrato cellulare.
I microRNA sono componenti chiave del SVE e dopo il trasferimento di cellule del destinatario, regolano l'espressione genica. Al fine di studiare in particolare il ruolo dei miRNA, è molto utile per loro dei overexpress nella linea cellulare del destinatario. Qui descriviamo come trasduce Mirna in cellule endoteliali. Il primo passo consiste nel determinare la concentrazione di con puromicina che uccide le cellule endoteliali al fine di selezionare cellule trasdotte stabile (Figura 4A). Infine, il livello di espressione dei miRNA possa essere controllato e convalidato da qPCR (Figura 4B).
Figura 1: EVs sono presi dalle cellule endoteliali. EVs purificati sono stati etichettati in verde con PKH67 e incubate per 4 h con un monostrato di cellule endoteliali. Le cellule endoteliali non trattate sono utilizzate come controllo negativo. Dopo il vasto lavaggio per rimuovere il server virtuale di Exchange non associato, le cellule sono state macchiate con falloidina a macchiare l'actina (rosso) e Hoechst 33342 a macchiare il nucleo (blu). Le cellule sono state osservate al microscopio confocale. Immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale laser e un obiettivo di olio NA 63 x 1.3. Hoechst 33342 è eccitato a 405 nm e con emissioni raccolte a 450-470 nm (blu); PKH67 è eccitato a 488 nm, emissioni raccolte a 505-530 nm (verde); e falloidina-594 è eccitato a 543 nm, emissioni raccolte a 620 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: effetto dell'assorbimento di EV sulla barriera endoteliale. (A) schema della diffusione della rodamina-labeled destrano: le cellule endoteliali sono coltivate a confluenza sulla cima di un filtro a membrana, il destrano fluorescente viene applicato alla camera superiore e diffonde nel corso del tempo attraverso la membrana. L'effetto di EVs sulla permeabilità è valutata dopo l'aggiunta di server virtuale di Exchange alla camera superiore misurando il tasso di diffusione di destrano alla camera inferiore. (B) una crescente quantità di EVs vengono incubati con le cellule endoteliali. Il trasferimento di destrano rodamina-identificati attraverso una membrana di trans-pozzo nel tempo consente misure di permeabilità. Permeabilità attraverso lo strato endoteliale è aumentato significativamente dopo 2 h di incubazione con 50 e 100 µ g/mL di EVs. I dati rappresentano la media (± s.e.m.) da 3 esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: titolazione di con puromicina. La soluzione madre di con puromicina (10 mg/mL) è diluita in RPMI 1640 completato con glutamina 2mm, siero 10% inattivati (56 ° C, 30 min) fetale di vitello, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM. Verrà aggiunto un totale di 15 µ l a 10 mL di medium in tubo A. Poi, 7,5 mL di soluzione da tubo A sono mescolati a 2,5 mL di RPMI al tubo B. Infine, vengono aggiunti 100 µ l della diluizione a 100 µ l di cellule per ottenere una concentrazione finale di 7,5 µ l/mL, 5,62 µ l/mL e così via. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: generazione delle cellule endoteliali che overexpressing miR451a. (A) determinazione della curva di uccisione di con puromicina sulle cellule endoteliali. Le cellule endoteliali sono state incubate con con puromicina alle dosi aumentanti. La redditività è stata misurata dall'analisi di MTS dopo 72 h. I dati rappresentano la media (± s.e.m.) di un esperimento rappresentativo. (B) RNA derivato da cellule endoteliali che overexpressing miR451a o un controllo negativo sono state raccolte e la trascrizione di miR451a è stata quantificata mediante Real-Time PCR. qPCR risultati sono normalizzati dal metodo 2-Ct usando U6 come un gene di governante ed espressi come media (± s.e.m.) (n = 3 esperimenti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti6. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione da Plasmodium . Per esempio, l'assorbimento del SVE da cellule recettive in vivo può essere monitorata in modo efficiente da etichettarli con il colorante fluorescente PKH67. Diversi controlli devono essere eseguiti al fine di garantire la specificità dell'etichettatura. È importante notare che una volta miscelato con il DILUENTE C, la tintura di PKH67 tende a formare aggregati, e pertanto è necessario includere un controllo con la tintura da solo senza EVs per determinare la colorazione aspecifica. La microscopia confocale è il metodo di scelta per differenziare tra vescicole associato alla superficie e veramente interiorizzato dalle cellule del destinatario. Inoltre, fornisce un ottimo strumento per tenere traccia e monitorare il numero di vescicole preso dalle cellule. Tuttavia, rimane poco chiaro come EVs vengono elaborati nelle cellule recettive14; Pertanto, eseguire un corso di tempo utilizzando intervalli di tempo di 2, 4 e 8 h, può essere molto utile al fine di determinare le condizioni ottimali per l'assorbimento. L'aggiunta di marcatori subcellulare vano può essere utilizzato per tenere traccia del server virtuale all'interno delle cellule mediante microscopia confocale. L'assorbimento EV è stato indicato per verificarsi tramite fusione della membrana o endocitosi15. La fusione può essere monitorata da etichettatura SVE con octadecyl Rodamina B (R18). La fusione di EVs con i risultati di membrane cellulari nella diluizione di R18, che porta ad un aumento nella fluorescenza16. L'assorbimento del SVE tramite endocitosi possa essere studiato utilizzando inibitori specifici di actina, microtubuli e dinamina10.
Per studiare la fisiologia dello SVE, è possibile aggiungere etichette iRBCs direttamente con i coloranti PKH e co-cultura iRBCs con le cellule endoteliali. Il problema qui è che le cellule richiedono supporti diversi e composizioni di gas e la quantità di EV trasferimento potrebbe essere bassi. Inoltre, proteine vescicolari fusi con un tag fluorescente possono essere espresso nel donatore cellule in vitro e in vivo. Tuttavia, finora non è stato testato con iRBCs
Globuli rossi infetti sono cytoadherent a microvasculature del cervello, in un processo probabilmente responsabile di causare malaria cerebrale17. Di conseguenza, il trasferimento del materiale parassita tramite EVs è suscettibile di influenzare le cellule endoteliali e la funzione vascolare quindi18. Il dosaggio in vitro descritto qui, fornisce un modo semplice per indagare alcune delle proprietà di base delle cellule endoteliali, come per esempio la permeabilità19. Ulteriori test quali TEER o immunostaining con ZO-1 può fornire ulteriori informazioni sulla giunzione stretta integrità10.
Inoltre, il modello in vitro risulta per essere un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dietro la comunicazione cellulare tra parassiti e cellule ospiti. Oltre l'assorbimento, questa configurazione permette lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti in questo processo. Ad esempio, abbiamo monitorato il trasferimento di miR451a per le cellule di accettore di Real-Time PCR e l'ibridazione fluorescente in situ . Inoltre, descriviamo come generare linee di cellule che overexpressing una particolare miRNA, per affrontare direttamente il ruolo di questi piccoli RNA a funzione vascolare10. Tuttavia, dovrebbero essere eseguiti diversi controlli tra cui test cellule non trasdotte, poiché la trasduzione stessa potrebbe influenzare la funzione cellulare. Inoltre, miRNA inibitori possono essere utilizzati per neutralizzare l'effetto dei miRNA.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente in parte dalla Fondazione Novartis per medical - ricerca biologica (a PYM), il Gottfried e Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW e PYM) e la piscina di ricerca dell'Università di Friburgo (a PYM). Ulteriori contributi comprendono le borse di eccellenza della Confederazione Svizzera per studiosi stranieri (di KAB e SM). Ringraziamo Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess per supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
