Summary
أننا في هذه الورقة تقديم تفاصيل لأساليب الإنتاج ومراقبة الجودة البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10. نعرض أيضا كيفية اختبار فعالية هذا البروتين لحل الألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية.
Abstract
من الصعب علاج الألم المزمن، وهناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لحل الألم المستمر. السيتوكينات المضادة للالتهابات هي المرشحين الواعدين لعلاج الحالات ألم المنهكة بسبب قدرتها على تنظيم التفاعلات المناعية العصبية الشاذة. بيد أن الناحية الفسيولوجية وهي تعمل في شبكة السيتوكينات المختلفة وذلك قد لا يكون تأثيرها العلاجي الأمثل عند استخدامها كالمخدرات ذاتها. للتغلب على هذا التحديد، قمنا بتطوير بروتين انصهار السيتوكينات المضادة للالتهابات IL4 و IL10. هنا، يمكننا وصف الأساليب للإنتاج ومراقبة الجودة من البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10 ونقوم باختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 لحل ألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية المستمرة.
Introduction
الألم المزمن لا تزال واحدة من المشاكل الطبية الأكثر المنهكة والمعالجة بموجب القرن الحادي والعشرين، التي تمس > 20 في المائة من السكان البالغين1،2. ومع ذلك، علاجات لتقديم الإغاثة من الألم المزمن غالباً ما تكون غير فعالة أو يجب أن توقف بسبب الآثار الجانبية الحادة3. الأهم من ذلك، حاليا الأدوية المتاحة فقط توفير تخفيف الأعراض، ولكن ليس إلى حد كبير تعديل أو علاج الألم المزمن. على الرغم من أن الألم المزمن، على ما يبدو، اضطراب عصبي، تشير الأدلة إلى تورط الجهاز المناعي في الألم المزمن التنمية4،5. وعلاوة على ذلك، تبرز النهج المستندة إلى جهاز المناعة لعلاج الألم. على سبيل المثال، السيتوكينات المضادة للالتهابات تمنع الألم في عدة نماذج من الألم المزمن6،،من78. ومع ذلك، قد السيتوكينات المضادة للالتهابات نصف عمر قصيرة، الحد من آثارها المحتملة التي تحول دون الألم. وعلاوة على ذلك، تعمل السيتوكينات المضادة للالتهابات الأكثر على النحو الأمثل في تناسق مع بعضها البعض. للتغلب على هذه القيود، ونحن مؤخرا تنصهر السيتوكينات المضادة للالتهابات انترلوكين-4 (IL4) وانترلوكين-10 (IL10) في جزيء واحد. يظهر البروتين الانصهار IL4-10 كفاءة متفوقة في تثبيط الألم المزمن التحريضية والأعصاب مقارنة ب الفردية السيتوكينات9. هنا يصف لنا كيف يتم إنتاج هذا البروتين الانصهار، تنقية، وكيف يتم التحكم في الجودة.
وتنتج البروتين الانصهار IL4-10 في الخلايا البشرية عابر تعداء الخلايا و HEK293 مع ناقل تعبير بوب يحمل التسلسل كدنا ترميز البروتين الانصهار IL4-10. ويتم اختيار الخلايا و HEK293 لتسمح بتعديل بوستترانسلاشونال من البروتين، الأمر الذي لا يحدث في أنظمة تعبير البكتيرية. لتحسين وضع سقف جليكان مع حمض اللعابي، كدنا الترميز بيتا-جالاكتوسيدي-2، 3-سياليل-ترانسفيراز قد أدرج في الناقل التحوير ثاني. هو تنقية البروتين الانصهار باستخدام تنقية البروتين تقارب الثقافة طاف لأنها أقوى من تنقية بأساليب مثل حجم الاستبعاد أو التبادل الأيوني اللوني10،11أخرى. لتنقية البروتين الانصهار IL4-10، استخدمنا داخلية مونوكلونل الصنع ضد IL4. يتم إجراء تقييم لنقاء وبيواكتيفيتي لتنقية البروتين الانصهار IL4-10 كجزء من مراقبة الجودة. يتم تقييم نقاء دفعات المنتجة بالصوديوم دوديسيل كبريتات Polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وارتفاع ضغط حجم الاستبعاد اللوني (إتش بي-ثانية). يتم تقييم بيواكتيفيتي البروتين الانصهار IL4-10 بقياس قدرته على تمنع lipopolysaccharide (LPS)-التي يسببها إنتاج عامل نخر الورم-ألفا (TNFα) في الثقافات الدم كله، ومقارنتها بالجمع بين الفرد السيتوكينات.
وأخيراً، من أجل اختبار قدرة IL4-10 الانصهار البروتينات تمنع الألم المزمن، يمكننا وصف كيف يمكن اختبار البروتين الانصهار كمسكن في نماذج الماوس المستخدمة على نطاق واسع من الألم التحريضية المستمرة12،13،14 . هنا يصف لنا أساليب نموذج الألم التحريضية. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن نماذج الألم أخرى يمكن استخدامها (مثلنماذج الأم الأعصاب)، اعتماداً على البحث الأسئلة التي تحتاج إلى إجابة. لتقييم الألم في هذه النماذج، من المهم أن استخدام مجموعة متنوعة من التدابير السلوكية التي تشمل آثار والتدابير غير أثارت الألم. هنا، يمكننا وصف أساليب التقييم للتغيرات في الاستجابة السلوكية مقولة ميكانيكيا وحراريا. يتم تقييم حساسية الميكانيكية للمحفزات حميدة باستخدام اختبار فراي فون، في حين يتم تقييم حساسية الحرارية باستخدام اختبار هارجريفز. الأهم من ذلك، يتم قياس غير أثارت هايبرالجيسيا/اللودينيا باستخدام اختبار "تحمل الوزن الحيوي". هذه التدابير مقبولة على نطاق واسع كتدابير الألم وتسفر عن معلومات هامة عن عتبات الألم والألم محتملة تتعرض لها الحيوانات15،،من1617. أخرى تدابير لتقييم الألم غير أثارت (مثلاً، حافزا مستقلة)، مثل اختبار تفضيل المكان المكيفة، قد تكون قيمة18. لتقييم إمكانات المخدرات لتمنع الألم، أجرينا الإدارة إينتراثيكال من البروتين الانصهار، كما مع هذا الطريق من الإدارة أقل جرعة البروتين ضروري للوصول إلى المناطق ذات الصلة بالألم وتجنب الجهازية (الجانب) آثار19، 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية، والحصول على موافقة مسبقة من اللجنة الأخلاقية التجريبية المحلية. تم الحصول على الدم كله من "دائرة المانحين مصغرة" (ميني المانحة الطبوغرافيا، MDD) في أوتريخت المركز الطبي الجامعي (أومكو) في هولندا. MDD تلقت موافقة إيجابية من "لجنة الأخلاقيات الطبية" أومكو (ميديش إتش توتسكوميسي) للبروتوكول رقم 07-125/C.
1-البروتين إنتاج وتوصيف
- خلية ثقافة
ملاحظة: انظر الجدول للمواد اللازمة لثقافة الوسيلة المستخدمة.- ذوبان الجليد الخلايا HEK293-F عند 37 درجة مئوية حتى يكون هناك أجمة صغيرة من الجليد. نقل الخلايا المذابة فورا إلى 10 مل من المثلج المتوسطة (4 درجة مئوية) والطرد المركزي بتعليق خلية في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 4 دقائق (دقيقة) في 500 x ز.
- إزالة المتوسطة وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة جديدة في الرايت، متبوعاً بالطرد المركزي في ز 500 x لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل متوسطة في الرايت إضافة تعليق خلية مباشرة في قارورة 125 مل التي تحتوي على 25 مل من قبل حرارة متوسطة (37 درجة مئوية). ثقافة الخلايا في 8% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% على شاكر مداري التناوب بسرعة 125 لفة في الدقيقة.
- ثقافة فرعية الخلايا مرتين في أسبوع. استخدام خلية الآلي مواجهة (انظر الجدول للمواد) لتقدير عدد الخلايا وبقاء الخلية. خلايا قابلة للحياة البذور بتركيز 3 × 105 خلايا/مل في قوارير ارلينمييير. الحفاظ على الحجم الإجمالي للمتوسط الثقافة في 1/5 الحجم الإجمالي لقوارير Erlenmeyer الثقافة في جميع الأوقات للحفاظ على تهوية أفضل.
- تعداء
ملاحظة: ثقافة فرعية الخلايا ثلاث إلى أربع مرات قبل تعداء وترانسفيكت لهم عندما يكون بقاء الخلية > 90%. يتم تقييم جدوى خلية من الآلي (المجال الكهربائي متعدد القنوات) سيلكونتينج نظام يستند إلى سلامة غشاء البلازما. انظر الجدول للمواد اللازمة للكاشف تعداء.- الطرد المركزي الخلايا في RT لمدة 4 دقائق في 500 x ز؛ ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة (37 درجة مئوية)، وتمييع تعليق الخلية إلى ~1.0 x 106 خلايا/مل في إجمالي حجم 1 ل. قاسمة تعليق خلية في مختبرين 10 من 100 مل في قوارير Erlenmeyer 500 مل.
- تمييع 1 مغ بلازميد الحمض النووي في 33 مل المصل خفض الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM، انظر الجدول للمواد) بمزج لطيف. في أنبوب منفصل، تضعف 1,330 ميليلتر من تعداء الكاشف في MEM بخلط لطيف. احتضان كل الحلول على RT لأدنى 5 إضافة ومزيج الحمض النووي تضعف في MEM للكاشف تعداء في MEM واحتضان هذا المزيج لمدة 30 دقيقة في الرايت
- إضافة خليط كاشف تعداء الحمض النووي للخلايا (مثقف في القسم 1)؛ إضافة 6.6 مل المزيج لكل 500 مل قارورة Erlenmeyer تحتوي على 100 مل خلايا في الثقافة المتوسطة. الحفاظ على الخلايا في ظروف الثقافة المذكورة سابقا. حصاد الثقافة المادة طافية يحتوي على بروتين الانصهار IL4-10 يفرز ثلاثة أيام بعد تعداء.
- تحديد تركيز البروتين IL4-10 الانصهار في ثقافة طافية بأداء أليسا IL10 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: في ظروف الثقافة المثلى، وتركيز البروتين الانصهار يمكن أن يتوقع أن يكون بين 2.5 و 5 ميكروغرام/مل.
- تنقية البروتين بالتقارب اللوني
ملاحظة: يتم التقارب اللوني في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ كافة الكسور (ثقافة المادة طافية والتحميل والتدفق من خلال وشطف الكسور) على الجليد أثناء الإجراء.- تنشيط الزوجين 10 مغ من الصنع إلى منزل في جسم [مونوكلونل] ضد IL4 إلى 1 غرام من كنبر-سيفاروسي 4B، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). صب 2.5 مل خرز سيفاروسي المقرونة ببطء في العمود اللوني للزجاج (طولها 30 سم وقطرها 1.5 سم الداخلية، انظر الجدول للمواد).
- حظر مواقع الخرز الربط عن طريق تمرير 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يحتوي على 1% المتبقية "ألبومين المصل البقري" من خلال العمود. أغسل العمود مع 25 مل من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4) تليها 12.5 مل م 0.1 جليكاين المخزن المؤقت ل (الأس الهيدروجيني = 2.5) و 25 مل من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4).
- اجتياز 100 مل من HEK293 إذ تتركز خلية ثقافة طافية عبر العمود بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة أغسل العمود مع 50 مل من برنامج تلفزيوني.
- الوت البروتين الانصهار IL4-10 ملزمة مع 12.5 مل م 0.1 جليكاين المخزن المؤقت (pH = 2.5) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة وكسور جمع 2.5 مل. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس م 1 (pH = 9) لكل جزء لتحقيق درجة الحموضة إلى 7. دياليزي الكسور معادلتها بين عشية وضحاها ضد ل 2 من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4).
- استخدام أنابيب الغسيل الكلوي مع 16 مم الجافة ووقف وزن الجزيئي 3.5 ك. عقيمة تصفية الكسور دياليزيد استخدام المرشحات المتاح مع 0.45 ميكرومتر المسامية القطر. تخزين العقيمة IL4-10 الانصهار البروتين الحل في مختبرين في-80 درجة مئوية.
- تقييم نقاء التيد IL4-10 الانصهار البروتين الملطخة بأخذ جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% وحصان-ثانية (العمود 3 ميكرومتر في الثانية-2000). لتحليل إتش-ثانية، تحميل 40 ميليلتر من البروتين في التركيز ~ 1 ملغ/مل في العمود. استخدام 100 ملم العازلة فوسفات الصوديوم مع كلوريد الصوديوم 150 مم (pH = 6.8) كمرحلة متنقلة. تعيين معدل التدفق في 1 مل/دقيقة.
- تحديد تركيز كل دفعة من IL4-10 الانصهار البروتين المنقي من أليسا IL10 ومقايسة البروتين حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي البروتين المقايسة كيت، انظر الجدول للمواد) وفقا للبروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
- استخدم المؤتلف IL10 البشرية لإنشاء منحنى قياسي في مقايسة أليسا. لتصحيح حجم الاختلاف بين IL10 المؤتلف (18 كاتشين) و IL4-10 الانصهار البروتين (كاتشين 34)، تضاعف تركيز تم الحصول عليها بعامل 1.8.
- بيواكتيفيتي IL4-10 الانصهار البروتين
ملاحظة: يتم فحص الدم الكامل لكل دفعة من IL4-10 الانصهار البروتين المنتجة وهو مقارنة نشاط دفعات مختلفة كجزء من مراقبة الجودة. يتم إجراء فحص الدم كله في الدم البشري الطازج المجمعة يوم المقايسة في أنابيب الهيبارين. تم الحصول على الدم من المتطوعين صحية في خدمتنا المانحين داخل المنظمة. ينبغي معالجة العينات كالمخاطر البيولوجية المحتملة.- إعداد 3-fold تخفيف قبل المسلسل المنقي IL4-10 الانصهار البروتين في المتوسط ربمي (انظر الجدول للمواد) على مدى تركيز تتراوح 5-1,215 نانوغرام/مليلتر.
- إعداد ما قبل تخفيف لبس (100 نانوغرام/مل) والدم البشري هو المخفف 4 مرات في المتوسط ربمي.
- "الماصة؛" تخفيف قبل البروتين الانصهار IL4-10 ولبس، والدم البشري إلى لوحة 48-جيدا. لكل بئر، إضافة 50 ميليلتر IL4-10 الانصهار البروتين (التركيز النهائي 1 243 نانوغرام/ملليلتر)، 75 المتوسطة ربمي ميليلتر، 25 ميليلتر لبس (تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل)، والدم البشري 100 ميليلتر (النهائي المخفف).
ملاحظة: الحجم الإجمالي للبئر الواحد هو 250 ميليلتر. - احتضان اللوحة في 8% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ح 18.
- تقييم تركيز TNFα في supernatants ثقافة استخدام أليسا TNFα، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- حساب تثبيط الاستجابة الالتهابية من IL4-10 الانصهار البروتين وفقا للصيغة: تثبيط % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
ملاحظة: A هنا = مستويات TNFα في الثقافات حفز لبس تعامل مع IL4-10 الانصهار البروتين، ب = مستويات TNFα في ثقافة أونستيمولاتيد، وج = مستويات TNFα في حفز ثقافة لبس.
2-نموذج الماوس لألم التهابات مستمرة
ملاحظة: من المهم استخدام الفئران الذكور والإناث على حد سواء (C57Bl/6) لأن هذا سيمكن تحديد الآثار تعتمد على الجنس. وبصفة عامة، الفئران المستخدمة بين 8-16 أسبوعا القديمة. لتحديد عدد الحيوانات المطلوب، ينبغي إجراء حسابات السلطة. هي سهولة العثور على الأدوات المستندة إلى ويب للقيام بهذه الحسابات على شبكة الإنترنت (مثلاً، http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
تحريض الألم التهاب مزمن
ملاحظة: حمل الألم التحريضية المستمرة في الفئران الكبار مع حقن إينترابلانتار الكاراجينان أو Adjuvant (CFA فرويد كاملة). الاختبارات المختلفة لا تتداخل مع بعضها البعض.- تحضير الكاراجينان (2% w/v) بتذويب الكاراجينان λ (انظر الجدول للمواد) في 0.9% كلوريد الصوديوم بتمرير الحل عن طريق إبرة 23-قياس التأكد من أن الكاراجينان حل بشكل صحيح. تعد حلاً طازجة مباشرة قبل إجراء الحقن.
- بدلاً من ذلك، إذا تم استخدام فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، مزيج الحل فرنكات الجماعة المالية الأفريقية بشكل صحيح قبل الحقن من إينترابلانتارلي، لأن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية مستحلب الماء في النفط الذي يحتوي على 1 ملغ من الحرارة السل (H37Ra) قتل والمجففة وزيت البارافين مل 0.85 ماندي 0.15 مل متفطره مونوليتي (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يوصي المحاقن هاملتون زجاج مع بلونجيرس معدنية حقن هذا المركب نظراً لأن بلونجيرس المطاط قد تتفاعل مع الزيت في adjuvant. -
حقن إينترابلانتار
- المحافظة على المجمع (الخطوات 2.1.1 أو 2.1.2) في المحاقن في RT لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن للسماح بتعديل الرايت ضخ 20 ميليلتر من المجمع (أو ديسولفينت كعنصر تحكم) تحت الجلد في مخلب هند الماوس تخديره من غير استخدام مقياس 30 إبرة.
- أدخل الإبرة في قاعدة توجيه الإبهام الكعب وحقن المجمع عندما يتم إدخال الإبرة 0.5 سم تقريبا. بعد الحقن، تتراجع ببطء الإبرة بينما قليلاً بالتناوب حقنه لتجنب تسرب للحل من موقع الحقن.
3-ألم القياسات
ملاحظة: ضمان أن الباحثين إجراء التجارب السلوكية الأعمى لمعاملة الماوس. من المهم أن التأقلم الحيوانات إلى بيئة الاختبار قبل تنفيذ أي قياس. ويفضل الأسبوع قبل بدء التجارب، توضع الحيوانات 1-2 مرات عن 15-30 دقيقة في كل من الأجهزة المختلفة المستخدمة لإجراء الاختبارات. عند التعامل مع الذكور والإناث في نفس التجربة، تقييم الذكور مستقلة عن الإناث. تنظيف الأقفاص والسطوح على نطاق واسع بين المجموعات المختلفة لتجنب الآثار غير المرغوب فيها المحتملة على سلوك جنسين مختلفين. قياس خط الانسحاب الاختفاء أو عتبات الميكانيكية اثنين إلى ثلاثة إضعاف دقة تحديد عتبات الأساس وتحديد ما إذا كانت هذه مستقرة قبل الحقن إينترابلانتار أي مركب.
-
اختبار فون فري: حساسية الميكانيكية للمحفزات حميدة
- ضع الحيوانات فردياً في أقفاص اﻷكريليك على الوقوف شبكة أسلاك والسماح للفئران التأقلم لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل القياسات.
- تقييم حساسية الميكانيكية عن طريق قياس عتبة انسحاب مخلب ردا على سلسلة معايرة للشعر فري فون تتراوح بين 0.02 إلى 4 غ. النظر في أي حركة مخلب بعيداً عن الشعر التطبيقية كاستجابة إيجابية انسحاب. تطبيق خيوط لا تطور عمودي على السطح مخلب بقوة كافية تسبب الانحناء الطفيف ضد الجلد وعقد لجعل س. ~ 3 تأكد من الشعر أثناء التطبيق مخلب.
- حساب عتبة مخلب-انسحاب 50% باستخدام أسلوب صعودا ونزولاً15،21.
ملاحظة: الشعيرة الأولى لتطبيق ز 0.4 (يمكن استخدام خيوط انطلاق أخرى اعتماداً على عتبات عرض هذه الفئران في الأساس). عدم الاستجابة خيوط تشير إلى أن يستخدم خيوط سمكا القادم في تحفيز التالية، بينما استجابة إيجابية تشير إلى استخدام خيوط أرق القادم. يتم تحديد العدد عروض الشعر بأول استجابة التفاضلية؛ وبعد ذلك، يتم تنفيذ 5 المزيد من التطبيقات. حساب عتبة 50% وفقا للأساليب الموصوفة سابقا15،21.
-
الحساسية الحرارية: اختبار هارجريفز
- ضع الحيوانات في أقفاص على لوح زجاج المعالجون مسبقاً (30 درجة مئوية) والسماح للفئران التأقلم لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل القياسات، والانتظار حتى الحيوانات تقف مكتوفة.
- تحديد أوقات الكمون سحب الحرارة بتسخين مخلب الحيوانات بشعاع ضوء مرئية مركزة باستخدام جهاز هارجريفز (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يتم تعيين كثافة الشعاع نظراً لأن هذا الإعداد كثافة تصميماً تجريبيا، يستحضر شعاع ضوء استجابة انسحاب من وقت متوسط من 8 إلى 12%، s في الأساس على الفئران C57Bl/6. وينبغي تحديد الإعداد كثافة كل الجهاز الفردي وضغط الماوس. أوقات التوقف القصوى من 20 ثانية أو أكثر يتم استخدامها لتجنب الإصابة بالحيوانات. - قياس مرات الكمون انسحاب ~ 4 مرات للحيوان الواحد. متوسط كافة الاستجابات قياسه. قياس كل مخلب بشكل مستقل، ومع فترات دقيقة على الأقل 1 بين القياسات اللاحقة في نفس مخلب.
-
العجز الوضعي: اختبار تأثير الوزن الحيوي
- قياس وزن الجسم كل حيوان قبل الاختبار، حيث يتطلب تحمل تحليل الوزن وزن الجسم كل حيوان الفردية كمعلمة إدخال.
- ضع الحيوانات فردياً في تجهيزها الكلمة تحمل الوزن نظام ديناميكي تجميعها على غطاء دعم كاميرا التي سيقوم بتسجيل حركات الماوس. واسمحوا الحيوانات التأقلم ل 0.5 إلى 1 دقيقة قبل أن يسجل لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: في هذا الاختبار، يمكن تقييم الحيوانات تتحرك بحرية واحدة فقط في كل مرة. - ضبط الإعدادات لإجراء تأثير الوزن وتحليل البيانات.
ملاحظة: في هذه التجارب، ونحن استخدام المعلمات التالية: (ط) منخفض الوزن عتبة من 0.6 g: هذا هو وزن الحد الأدنى اللازم لتنشيط إحدى الخلايا من أجهزة الاستشعار. (ثانيا) الوزن ارتفاع عتبة 1 g: يشير هذا العدد إلى الوزن اللازم لتنشيط خلية واحدة بالكامل. (ثالثا) عتبة السطحية من الخلايا 2: يشير هذا العدد إلى العدد الخلايا المجاورة لبعضها البعض التي تحتاج إلى تنشيط لتؤخذ في الاعتبار. (رابعا) الحد الأدنى لعدد الصور هو 5: يستغرق 0.1 s لالتقاط كل صورة. يشير الرقم أقل عدد ممكن من الإطارات التي لا يتحرك الماوس. على هذا النحو، قيمة 5 يعني أن الموقف الماوس يجب أن يكون مستقرا > 0.5 s للحصول على قياس التي يتم أخذها في الاعتبار للتحليل. - إجراء التحليل لكل الفيديو التي تعيد الفيديو، وضمان الاعتراف بكل أطرافه بشكل صحيح قبل البرنامج في الإطار الزمني الذي يحدده البرنامج.
ملاحظة: الحد أدنى من 1 دقيقة من الوقت المسجل يحتاج إلى التحقق من صحتها. يحسب الوزن الحيوي إذ تضع برامج وتوفر المعلمات التالية: (ط) الوزن الذي يتحمله كل مخلب الفردية في غرام، كنسبة مئوية من وزن الجسم كله. (ثانيا) وزن تتحملها مخلب الجبهة الموحدة أو الكفوف الخلفي مجتمعة في غرام كنسبة مئوية من وزن الجسم كله. الكفوف (ثالثا) نسبة يسار/يمين الوزن تأثير أو تأثير الوزن أمامي/خلفي. (رابعا) المساحة السطحية لكل مخلب أو الجمع بين آثار أقدام أمامي/خلفي بتنشيط لوحة المفاتيح الضغط الحساسة. (ت) يعني ومعيار الانحراف لكل معلمة. (سادسا) المدة للمواقف المختلفة (تربية أو آثار أقدام 3 أو 4 آثار أقدام) خلال التجربة بأكملها. (سابعا) الوقت (s) كل مخلب يحمل وزنا خلال التجربة بأكملها.
4-إينتراثيكال حقن من IL4-10 الانصهار البروتين للتسكين
ملاحظة: التأكد من أن التهوية في غرفة مفتوحة لضمان تدفق الهواء السليم. لاختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 (1 ميكروغرام/الماوس؛ 5 حجم مجموع الحقن ميليلتر) فإنه ينبغي اختبار ضد المركبات الحقن والحقن من مزيج السيتوكينات الفردية (IL10, IL4 + 0.5 ميكروغرام/الماوس، 5 ميليلتر حقن إجمالي حجم، 0.5 ميكروغرام).
- تخدير الماوس مع إيسوفلوراني 3-4% بمعدل 2 لتر في الدقيقة في قاعة التعريفي تدفق الأوكسجين. تحقق من أن الماوس يتم تخديره بشكل صحيح معسر مخلب التأكد من أنه لا توجد استجابة للحيوان.
- وضعت في مخروط الآنف الجهاز مكان الماوس على الجدول مع رئيسها والحفاظ على التخدير الماوس مع إيسوفلوراني 1.5-2 في المائة مع معدل تدفق الأوكسجين 2 لتر في الدقيقة أثناء حقن intrathecal.
- مرة أخرى في ملء المركبات القابلة للحقن في زجاجة نظيفة 25 ميليلتر هاملتون حقنه متصلة بإبرة قياس 27.
- أمسك الماوس بقوة بالعمود الفقري الخلفي للاضلاع ورفع الماوس قليلاً. ضع الإبرة عمودياً بين الفقرات القطنية L5 و L6 وإدراجه بعناية عن طريق الجلد الحق في منتصف الفقرات القطنية. ضع الإبرة في الفضاء الفقرية.
ملاحظة: إيجاد مساحة الفقرية قد تتطلب بعض 'البحث' بتحرك الإبرة على طول المحور البطني روسترال، طفيفة الضغط الإبرة حتى تشعر بفقدان مقاومة أنسجة العظام.- تأكيد تستهدف الصحيح عن طريق التحقق من حدوث نفض ذيل. حقن 5 ميليلتر من المجمع ببطء، انتظر بضع ثوان، ومن ثم تسحب الإبرة ببطء. إلا إذا كان من الملاحظ نفض مخلب واحد، يرجح الإبرة لا توضع بشكل صحيح.
- بعد الحقن، تحقق الماوس عن كثب للأولى و 30 دقيقة بعد التعافي من التخدير ضمان عدم وجود أي إعاقة السيارات/الشلل.
ملاحظة: يمكن أن سلوكيات الألم يقاس (كما هو موضح في القسم 3) 15 دقيقة بعد الشفاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1ألفصورة تمثيلية جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها خلال التقارب اللوني لتنقية. ولوحظت في تحميل (ل) والتدفق من خلال كسور (قدم)، جميع البروتينات الموجودة في المادة طافية HEK293. ويلاحظ لا البروتين في الكسر يغسل (W). في الكسر شطف (ه)، لوحظت شريطين من كاتشين 35 و 37 المقابلة لاثنين جليكوفورمس مختلفة من IL4-10 الانصهار البروتين (الأسهم). ويرد في الشكل 1ب، مقايسة قوتها تمثيلية في دم كل المقايسة للانصهار IL4-10 مختلفة البروتين دفعتين. ويلاحظ تثبيط الجرعة تعتمد على الإصدار TNFα المستحثة بلبس، عرض بيواكتيفيتي قابلة للمقارنة لدفعتين البروتين الانصهار IL4-10.
بعد ذلك، يظهر مثال لاختبار نتائج التجارب التمثيلية التي يتم اختبار البروتين الانصهار IL4-10 لتحول دون استمرار الألم التحريضية (الشكل 2). كان الألم التحريضية المستمرة الناجمة عن إينترابلانتار حقن الكاراجينان 2%. الميكانيكية (الشكل 2أ) كذلك أعقب الحرارية (الشكل 2ب) هايبرالجيسيا على مر الزمن. في اليوم السادس بعد تحريض الألم التحريضية، تم حقن الفئران إينتراثيكالي مع البروتين الانصهار IL4-10 أو مركبة كعنصر تحكم. IL4-10 كثيرا حل الميكانيكية (الشكل 2أ) والحرارية (الشكل 2ب) هايبرالجيسيا، والذي تم التوصل إليه أثر القصوى بعد 24 ساعة بعد الحقن. ومن الناحية المثالية، ينبغي اختبار فعالية البروتين الانصهار في تثبيط الألم أيضا ضد اكويمولار تركيزات السيتوكينات الفردية اختبار ما إذا كانت قدرتها على منع الألم أفضل من مجموع السيتوكينات الفردية. لا يتم عرض هذه البيانات هنا، ولكن نود أن نشير إلى منشور صدر مؤخرا أن يعرض هذه البيانات9.
تم اختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 مؤخرا في نموذج الألم التحريضية التي يسببها فرنكات الجماعة المالية الأفريقية9. في هذه التجربة، كانت حقنات متعددة من البروتين الانصهار IL4-10 إينتراثيكالي تدار. حقن متعددة حلها تماما المستحثة بفرنكات الجماعة المالية الأفريقية هايبرالجيسيا التحريضية المستمرة، يتم قياسها باستخدام فراي فون واختبارات هارجريفز، مما يدل على إمكانيات البروتين الانصهار IL4-10 ك علاج مسكن9. هنا نظهر أن حقن فرنك إينترابلانتار أيضا الناجم عن انخفاض في الوزن إذ تضع مخلب المتأثرة (الشكل 3أ-ب). حقن Intrathecal IL4-10 الانصهار البروتين في اليوم السابع بعد إينترابلانتار فرنكات الجماعة المالية الأفريقية حقن يخفف عن تقليص تأثير الوزن مخلب المتضررة مقارنة بالمركبات حقن الفئران بعد IL4-10 الانصهار البروتين الإدارة (الشكل 3ب 2 أيام ).
الشكل 1 : تنقية وتوصيف البروتين الانصهار IL4-10- (أ) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ملطخة بأخذ تحليل الكسور اللوني تقارب: l: تحميل، قدم: التدفق من خلال، w: المياه والصرف الصحي، وهاء: شطف. (ب) التحليل الوظيفي: الجرعة بروتين الانصهار IL4-10 [دبندنتلي] يمنع إنتاج TNFα في ثقافة تحفز الدم كله لبس (معبراً عنها بتثبيط النسبة المئوية مقارنة بالثقافات حفزت مع لبس وحدها). يتم تمثيل البيانات يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تثبيط هايبرالجيسيا الملتهبة بالبروتين الانصهار IL4-10- حملت الألم الملتهبة بحقن إينترابلانتار 20 ميليلتر من 2% الكاراجينان (السيارات). وتلقى ستة أيام بعد الحقن إينترابلانتار الفئران حقن intrathecal (السهم) 1 ميكروغرام IL4-10 الانصهار البروتين أو مركبة (PBS). (أ) فرط الحساسية الميكانيكية (سجل عتبة 50% (ز)) وتم قياس على مر الزمن باستخدام اختبار فراي فون وتم قياس الحساسية الحرارية (ب) (الكمون (s)) باستخدام اختبار هارجريفز. يتم تمثيل البيانات يعني ± "sem. العلامات النجمية" تمثل الفروق الهامة تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه بين المركبات والحيوانات IL4-10 حقن. * *، * * * ف = < 0.01 وف < 0.001، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التغيرات المستحثة بالتهاب في تأثير الوزن. حملت الألم الملتهبة بحقن إينترابلانتار 20 ميليلتر من Adjuvant (CFA فرويد كاملة). وتم قياس الوزن تؤثر على كل مخلب استخدام الجهاز تأثير الوزن الحيوي. يتم عرض تأثير الوزن في غرام من مخلب المتأثرة (الكف عن هند) وحمل الوزن الكلي لآثار أقدام غير المتأثرة (آثار أقدام الجبهة ومخلب كونترالاتيرال)، فضلا عن نسبة الوزن حملها الكف عن الكفوف 3 الأخرى بالمقارنة. (أ) مسار تحمل أثناء الالتهابات الناجمة عن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية الوزن (n = 10). (ب) في اليوم السابع بعد إينترابلانتار فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، تلقت الفئران حقن intrathecal 1 ميكروغرام IL4-10 الانصهار البروتين أو مركبة (PBS). وتم قياس تأثير الوزن في 0 و 7 أيام بعد إينترابلانتار فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، وبعد إقامة البروتين الانصهار IL4-10 أيام 2. ويمثل تأثير الوزن للكف عن آثار أقدام 3 الأخرى بالمقارنة مع (n = 3-4). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± sem. * * * ف = < 0.001؛ * * ف = < 0.01؛ * ف = < 0.05 مقارنة بخط الأساس (يوم 0). # ف = < 0.05 مقارنة بالمركبات معاملة الحيوانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذه المخطوطة أساليب للإنتاج وتوصيف المؤتلف IL4-10 الانصهار البروتين، وأساليب لاختبار فعاليته في منع التهاب هايبرالجيسيا في نماذج الماوس من الألم التحريضية المستمرة. إنتاج وتنقية البروتين الانصهار IL4-10 يتم على نطاق صغير. يتم تحديد الخلايا HEK293 كنظام لتعبير لإنتاج البروتين لأنها تمكن التعديلات بوستترانسلاشونال لا يمكن أن تتحقق في أنظمة تعبير بدائية. بوستترانسلاشونال التعديلات ذات الصلة لوظيفة البروتين، وغياب مثل هذه التعديلات المحتملة يمكن أن تؤثر على الفعالية العلاجية للبروتين الانصهار IL4-10. البروتين هو تنقيته من الثقافة طافية بالتقارب اللوني. لقد اخترنا لاستخدام داخليا وأدلى [مونوكلونل] جسم ضد IL4 لتنقية تقارب وليس لإنتاج بروتين انصهار IL4-10 التي تحتوي على علامة للسماح لتنقية مع نظام الوسم تقارب. وكان السبب في ذلك لتجنب إمكانية إجراء تغييرات تتعلق بالوسم في طي البروتين ووظيفته. على الرغم من ذلك، إذا كانت تفتقر إلى جسم [مونوكلونل] انتقائية للغاية، بروتين مع علامة يحتاج إلى التطوير، مثلاً له علامة. وفي هذه الحالة، سيكون من المهم تحديد ما إذا كان ج-أو N-محطة البروتين الأنسب للعلامة لتجنب التأثير على وظيفة البروتين.
من 1 لتر من HEK293 المادة طافية، يتم الحصول على حوالي 3 ملغ بروتين المنقي من الانصهار IL4-10، ولكن هذا قد تختلف من دفعة لدفعة. يمكن استخدام العمود لانجذاب تطهير لعدة دورات تنقية قبل تجاهل. أن الخطوة الأكثر حساسية في عملية تنقية أنه شطف IL4-10 الانصهار البروتين من العمود بانخفاض درجة الحموضة، درجة الحموضة المنخفضة قد حمل تمسخ البروتين الذي لا رجعة فيه، وترسيب البروتين. وهكذا، أن الحفاظ على بنية البروتين الأصلي وعدم وجود المجاميع البروتين ضروري لدفعات ذات نوعية جيدة. تحقيقا لهذه الغاية، يلزم تقييم بيواكتيفيتي البروتين الانصهار يمكن اختبارها في المختبر قبل وبعد تنقية مع شطف مختلف المخازن المؤقتة. بعد تنقية البروتين الانصهار IL4-10، عدم خفض بيواكتيفيتي مقارنة بغير تنقية البروتين. وعلاوة على ذلك، تم تشكيل إجمالي غائبة عندما أنجزت خطوة شطف مع المخزن المؤقت جليكاين 0.1 M (pH = 2.5)، وتم تحييد الرقم الهيدروجيني للكسور شطف فورا مع 1 م تريس المخزن المؤقت (pH = 9).
يقدر تركيز البروتين المنقي من الانصهار IL4-10 على أساس البشرية أليسا IL10 النتائج. يتم استخدام مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي لتأكيد تركيزات البروتين. استرداد البروتين بعد تنقية يتم تقييمها استناداً إلى التركيزات تقاس أليسا IL10 في التحميل، التدفق من خلال غسل وشطف الكسور. ويمكن تقييم اتفاق التعاون الأساسي تحديد تركيز البروتين البروتين الانصهار IL4-10 فقط في شطف دياليزيد الكسور. دياليزيد عدم شطف الكسور تتضمن ايميدازول، مركب الذي يؤثر على قياس اتفاق التعاون الأساسي. كسور تنقية عدم احتواء البروتينات الأخرى من المتوسط الثقافة HEK293.
يتم تحديد بيواكتيفيتي البروتين الانصهار IL4-10 في فحص دم كله. وينبغي تقييم بيواكتيفيتي IL4-10 الانصهار البروتين في الدم كله من عدة جهات مانحة لتحديد ما إذا كان يتم الاحتفاظ بنشاط وظيفي. العديد من الجهات المانحة المطلوبة بسبب وجود مانح إلى التباين في قدرات IL10 و IL4 تحول دون الإفراج عن TNFα المستحثة بلبس. وعلاوة على ذلك، قد يختلف التعبير عن IL4R و IL10R بين الجهات المانحة، والتي تؤثر على قدرة IL4-10 الانصهار بروتين تمنع إنتاج TNFα المستحثة بلبس.
في الأساليب المذكورة، نحن مفصلة نماذج الماوس 2 ألم التحريضية المستمرة تقييم الفعالية من IL4-10 الانصهار البروتين لحل الألم في فيفو. ومع ذلك، للحصول على تقييم كامل لإمكانيات مسكن من البروتينات الانصهار المؤتلف، ينبغي اختبار الجزيئات في نماذج أخرى من الألم المزمن، وكذلك. وتشمل هذه النماذج، ولكن لا تقتصر على، نماذج من إصابة العصب والأم الأعصاب الناجمة عن العلاج الكيميائي9،22. على الرغم من هارجريفز واختبار فراي فون تستخدم عادة لاختبار المخدرات مسكن، أصبح من الواضح أنه ينبغي إدراج إجراء اختبار إضافي (مثل اختبار تأثير الوزن الحيوي) تقييم الآثار على بيهافيورساند الألم غير أثارت أيضا مع فحص ألم استثابي (مثل تكييف مكان التفضيل (حزب الشعب الكمبودي) التي تكشف عن الألم غير أثارت السلوكيات17،18). أداء حزب الشعب الكمبودي، ينبغي ظهور آثار الألم تثبيط البروتين الانصهار في الاعتبار، لأنه يتطلب تكييف الحيوانات بتخفيف الألم المسكنات النيابة السريع (التي تمارس تأثيرات في أقل من 15 دقيقة). على الرغم من ذلك، إذا كان الاختبار المجمع قد بطء مسكن، لكن من المرجح أن الحث على تثبيط الألم طويلة الأمد (أكثر من 4 أيام)، حزب الشعب الكمبودي لا يزال استخدامها لاختبار ما إذا كان المجمع تثبيط الألم. وفي هذه الحالة، أن الخسارة الناجمة عن مجمع تكييف مع المسكنات بالنيابة سريع يحتاج إلى تقييم.
ويتم اختيار حقن Intrathecal كطريق للإدارة، كما ستصل المجمع الألم المجالات ذات الصلة مثل العقد الجذرية الظهرية والحبل الشوكي. جدير بالذكر أن التسليم intrathecal المخدرات مسكن أصبحت ممارسة شائعة لعلاج المرضى الذين يعانون من الألم المزمن، كما يقلل جرعة المخدرات مسكن اللازمة من هذا النهج ويقلل السمية والآثار الجانبية الجهازية. ومع ذلك فهذا الطريق الإدارة لديه بعض القيود؛ أنه يتطلب موظفين مدربين تدريبا جيدا، ونظرا للمسافة تحت العنكبوتية الصغيرة، ينبغي أن يكون حجم الحقن محدودة إلى 5 ميليلتر في الفئران، تتطلب حلولاً مركزة للغاية من البروتين الانصهار. تقنية حقن intrathecal يتطلب التدريب. يمكن إجراء هذا التدريب على عدم استرداد تخديره من الحيوانات مع حقن صبغة للتحقق من حقن intrathecal الصحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
جزء من هذا العمل قد تم تمويلها "علوم الحياة" بجامعة أوتريخت منح
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
