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Medicine

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57071
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,3
1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Summary

Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.

Abstract

Dor crônica é difícil de tratar e novas abordagens para resolver a dor persistente são urgentemente necessárias. Citocinas anti-inflamatórias são candidatos promissores para tratar condições de dor debilitante devido à sua capacidade de regular as interações de neuro-imune aberrantes. No entanto, fisiologicamente, eles trabalham em uma rede de várias citocinas, e consequentemente o seu efeito terapêutico não pode ser ideal quando usado como stand-alone drogas. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma proteína de fusão das citocinas anti-inflamatórias, IL4 e IL10. Aqui, descrevemos os métodos de produção e controle de qualidade da proteína de fusão recombinante IL4-10 e testamos a eficácia da proteína de fusão do IL4-10, para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória persistente.

Introduction

Dor crônica continua sendo um dos problemas médicos mais debilitantes e sob-Tratado do século XXI, afetando > 20% da população adulta1,2. No entanto, tratamentos para proporcionar alívio da dor crônica, muitas vezes são ineficazes ou devem ser descontinuados devido a efeitos colaterais graves3. Importante, atualmente drogas disponíveis apenas fornecer alívio sintomático, mas não significativamente modificar ou curar dor crônica. Embora a dor crônica parece ser um distúrbio neurológico, a evidência sugere envolvimento do sistema imunológico em dor crônica desenvolvimento4,5. Além disso, a imune-abordagens para tratar a dor estão surgindo. Por exemplo, citocinas anti-inflamatórias inibem a dor em diversos modelos de dor crônica6,7,8. No entanto, citocinas anti-inflamatórias tem uma meia-vida curta, reduzindo seus potenciais efeitos de inibição de dor. Além disso, a citocinas anti-inflamatórias mais otimamente trabalham em conjunto com o outro. Para superar essas limitações, nós recentemente fundiu as citocinas anti-inflamatórias interleucina-4 (IL4) e interleucina-10 (IL10) em uma molécula. A proteína de fusão de IL4-10 mostra eficácia superior na inibição crônica dor inflamatória e neuropática, comparado com o de citocinas individuais9. Aqui descrevemos como tal proteína da fusão é produzida, purificado, e como sua qualidade é controlada.

Proteína de fusão de IL4-10 é produzida em células humanas por transfecção transiente de células HEK293-F com um vetor de expressão pUPE carregando a sequência de cDNA codificação da proteína de fusão de IL4-10. Células HEK293-F são escolhidas para permitir a modificação borne-translational da proteína, algo que não ocorre em sistemas de expressão bacteriana. Para otimizar glicano tampando com ácido siálico, cDNA codificação beta-galactoside-2, 3-sialyl-transferase é incorporada no vetor como um segundo transgene. A proteína de fusão purified usando a purificação da proteína de afinidade do sobrenadante da cultura porque é mais poderoso do que a purificação por cromatografia de troca iônica10,11ou outros métodos , por exemplo, tamanho-exclusão. Para purificar a proteína de fusão de IL4-10, usamos in-house feitas os anticorpos monoclonais contra IL4. Avaliação da pureza e bioatividade de purificado da proteína de fusão de IL4-10 são realizadas como parte do controle de qualidade. A pureza dos lotes produzidos é avaliada por sódio Dodecil sulfato de eletroforese em Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e alta pressão cromatografia de exclusão (HP-SEC). A bioatividade da proteína de fusão do IL4-10 é avaliada pela sua capacidade de inibir o lipopolissacarídeo (LPS) de medição-induzido por produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNFa) em culturas de sangue total e comparando com a combinação do indivíduo citocinas.

Finalmente, para testar a capacidade das proteínas de fusão IL4-10 para inibir a dor crônica, descrevemos como a proteína de fusão pode ser testada como analgésico em modelos do rato amplamente utilizado de dor inflamatória persistente12,13,14 . Aqui descrevemos os métodos de um modelo de dor inflamatória. No entanto, é importante notar que outros modelos de dor pode ser usado (por exemplo, modelos de dor neuropática), dependendo da pesquisa perguntas que precisam ser respondidas. Para avaliar a dor nesses modelos, é importante o uso de uma variedade de medidas comportamentais que incluem evocadas e não evocava dor. Aqui, descrevemos os métodos de avaliação de mudanças na mecânica e termicamente evocadas respostas comportamentais. Sensibilidade mecânica a estímulos inócuos é avaliada através do teste de Von Frey, enquanto a sensibilidade térmica é avaliada utilizando o teste de Hargreaves. Importante, hiperalgesia/alodinia evocada não é medida através do teste de rolamento de peso dinâmico. Estas medidas são amplamente aceitos como medidas de dor e produzem informações importantes sobre os limiares de dor e potencial dor experimentada pelos animais15,16,17. Outras medidas para avaliar a dor não evocados (por exemplo, independentes de estímulo), tais como o teste de preferência de lugar condicionado, pode ser valioso18. Para avaliar o potencial da droga para inibir a dor, realizamos a administração intratecal da proteína de fusão, como com esta via de administração menos dose de proteína é necessário para alcançar áreas relacionados à dor e evitar sistêmica (lado) efeitos19, 20.

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Protocol

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as diretrizes internacionais e aprovação prévia do Comitê de ética local experimental. Sangue total foi obtida do serviço de doador do Mini (Mini doador Dienst, MDD) na Universidade Medical Center Utrecht (UMCU) nos Países Baixos. O MDD recebeu aprovação positiva do Comitê de ética médica do UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) para a protocolo número 07-125/C.

1. caracterização e produção de proteínas

  1. Cultura celular
    Nota: Consulte a Tabela de materiais por meio de cultura utilizado.
    1. Descongele as células HEK293-F a 37 ° C até que haja uma pequena moita de gelo. Transferir as células descongeladas imediatamente para 10 mL de meio gelado (4 ° C) e centrifugar a suspensão de eritrócitos em temperatura ambiente (RT) por 4 minutos (min) a 500 x g.
    2. Remover o meio e ressuspender as células em 10 mL de meio fresco no RT, seguido por centrifugação a 500 x g durante 4 minutos.
    3. Remover o sobrenadante e ressuspender o celular em 5 mL de meio na RT. Add a suspensão de células diretamente para um balão de 125 mL contendo 25 mL de meio pré-aquecido (37 ° C). Cultura de células em 37 ° C e 8% CO2, 95% de umidade em um agitador orbital, girando a uma velocidade de 125 rpm.
    4. Subcultura das células duas vezes por semana. Usar uma célula automatizada contador (ver Tabela de materiais) para avaliar o número de telemóvel e viabilidade celular. Células viáveis de sementes em uma concentração de 3 x 105 células/mL em Erlenmeyers. Mantenha o volume total do meio de cultura em 1/5 do volume total de Erlenmeyers de cultura em todos os momentos para manter a aeração ideal.
  2. Transfecção
    Nota: Subcultura das células de três a quatro vezes antes do transfection e transfect-los quando a viabilidade celular é > 90%. Viabilidade celular é avaliada por um automatizado (campo elétrico multi canal) cellcounting sistema baseado na integridade da membrana plasmática. Consulte a Tabela de materiais para o reagente de transfeccao.
    1. Centrifugar as células em RT para min 4 a 500 x g; Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) e diluir a suspensão de células ~1.0 x 106 células/ml em um volume total de 1 L. alíquota a suspensão de eritrócitos em 10 partes alíquota de 100 mL em frascos de Erlenmeyer de 500 mL.
    2. Diluir 1 mg de plasmídeo em meio essencial mínimo de 33 mL soro reduzido (MEM, consulte Tabela de materiais) pela mistura suave. Em um tubo separado, dilua 1.330 µ l de reagente de transfeccao em MEM misturando suave. Incubar as duas soluções em RT 5 min. adicionar e misturar o DNA diluído em MEM para o reagente de transfeccao em MEM e incubar a mistura durante 30 min à RT
    3. Adicione a mistura de reagente de Transfeccao de DNA às células (cultivadas na secção 1); Adicione 6,6 mL da mistura a cada 500 mL frasco de Erlenmeyer contendo 100 mL de células em meio de cultura. Manter as células das condições de cultura mencionado anteriormente. Recolher o sobrenadante de cultura contendo secretada proteína de fusão de IL4-10 três dias depois do transfection.
    4. Determinar a concentração da proteína de fusão do IL4-10 no sobrenadante da cultura através da realização de um ELISA IL10, de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais).
      Nota: Em condições ideais de cultura, a concentração da proteína de fusão pode ser deve estar entre 2,5 e 5 µ g/mL.
  3. Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade
    Nota: Cromatografia de afinidade é realizada à temperatura ambiente. No entanto, todas as frações (frações sobrenadante, carga, fluxo e eluição cultura) são mantidas no gelo durante o procedimento.
    1. Casal 10 mg de um feita internamente monoclonal anticorpo contra IL4 1G de CNBr - ativado sepharose 4B, de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). 2,5 mL de grânulos sepharose acoplado lentamente despeje a coluna de cromatografia de vidro (30 cm de comprimento e 1,5 cm de diâmetro interno, consulte Tabela de materiais).
    2. Bloquear o restante ligação sites dos grânulos, passando a 50 mL de solução salina tamponada fosfato (PBS) contendo 1% albumina de soro bovino através da coluna. Lavar a coluna com 25 mL de PBS (pH = 7,4) seguido de 12,5 mL de tampão de glicina 0,1 M (pH = 2,5) e 25 mL de PBS (pH = 7,4).
    3. Passe 100 mL de 10 vezes concentrada cultura de células HEK293 sobrenadante através da coluna em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. lavar a coluna com 50 mL de PBS.
    4. Eluir a proteína de fusão IL4-10 acoplada com 12,5 mL de tampão de glicina 0,1 M (pH = 2,5) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min e coletamos frações de 2,5 mL. Adicione 350 µ l de tampão Tris de 1 M (pH = 9) para cada fração de trazer o pH para 7. Dialize frações neutralizadas durante a noite contra 2 L de PBS (pH = 7,4).
      1. Use a tubulação da diálise com 16 mm de diâmetro seco e um corte de peso molecular de 3,5 K. Estéril filtrar as frações dializadas usando filtros descartáveis com 0,45 µM de diâmetro de poro. Armazenar a solução estéril de proteína de fusão IL4-10 em alíquotas a-80 ° C.
    5. Avalie a pureza da proteína de fusão eluted IL4-10 por gel de SDS-PAGE 12% manchadas de Coomassie e HP-SEC (coluna 3 µm SEC-2000). Para análise de HP-SEC, carrega 40 µ l de proteína, na concentração de ~ 1 mg/mL na coluna. Usar o tampão fosfato de sódio de 100 mM com 150 mM de cloreto de sódio (pH = 6,8) como uma fase móvel. Defina a taxa de fluxo em 1 mL/min.
    6. Determinar a concentração de cada lote de proteína de fusão IL4-10 purified por ELISA IL10 e ensaio de Bicinchoninic ácido da proteína (Kit de ensaio de proteína BCA, consulte Tabela de materiais) de acordo com os protocolos do fabricante.
    7. Use IL10 humana recombinante para criar uma curva padrão no ensaio de ELISA. Para corrigir a diferença de tamanho entre IL10 recombinante (18 kDA) e proteína de fusão de IL4-10 (34 kDa), multiplicar a concentração obtida por um fator de 1.8.
  4. Bioatividade de proteína de fusão de IL4-10
    Nota: O ensaio de sangue total é executado para cada lote de proteína de fusão de IL4-10 produzida e a atividade de diferentes lotes é comparada como uma parte do controle de qualidade. O ensaio de sangue total é realizado em sangue humano fresco coletado no dia do ensaio em tubos de heparina. Sangue foi obtido de voluntários saudáveis em nosso serviço de doador in-house. As amostras devem ser tratadas como riscos biológicos potencialmente.
    1. Preparar pre-diluições de série 3 vezes da proteína purificada fusão IL4-10 em meio RPMI (ver Tabela de materiais) sobre uma concentração variar 5-1.215 ng/mL.
    2. Preparar pre-diluições de LPS (100 ng/mL) e o sangue humano que é diluído 4 vezes em meio RPMI.
    3. Pipete as pre-diluições da proteína de fusão de IL4-10, LPS e sangue humano em uma placa de 48. Para cada poço, adicionar 50 µ l IL4-10 proteína da fusão (concentração final 1-243 ng/mL), 75 µ l RPMI médios, 25 µ l LPS (concentração final de 10 ng/mL) e o sangue humano de 100 µ l (final diluído).
      Nota: O volume Total por bem é 250 µ l.
    4. Incube a placa a 37 ° C e 8% CO2, 95% de umidade para 18 h.
    5. Avalie a concentração de TNFa em sobrenadantes de cultura usando uma TNFα ELISA, de acordo com o protocolo do fabricante.
    6. Calcular a inibição da resposta inflamatória pela proteína de fusão IL4-10 de acordo com a fórmula: % de inibição = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
      Nota: Aqui A = níveis de TNFa em culturas estimuladas LPS, tratados com a proteína de fusão de IL4-10, B = níveis de TNFa em cultura unstimulated e C = níveis de TNFa em cultura estimulada de LPS.

2. Mouse modelo para dor inflamatória persistente

Nota: É importante usar ratos machos e fêmeas (C57Bl/6), porque isso permitirá a identificação dos efeitos do sexo-dependente. Em geral, os ratos usados são entre 8-16 semanas de idade. Para determinar o número de animais necessários, cálculos de energia devem ser executados. Ferramentas baseadas na Web para realizar tais cálculos são encontradas facilmente na internet (por exemplo, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).

  1. Indução de dor inflamatória crônica
    Nota: Induzi dor inflamatória persistente em ratos adultos com Lumiracoxib injeções de carragenina ou adjuvante completo de Freud (CFA). Os diferentes testes não interferem uns com os outros.
    1. Preparar a carragenina (2% p/v) dissolvendo-se λ-carragenina (ver Tabela de materiais) em 0,9% NaCl, passando a solução através de uma agulha de calibre 23 para garantir que a carragenina é dissolvida corretamente. Prepare uma solução fresca diretamente antes que a injeção é realizada.
    2. Como alternativa, se CFA é usado, misture a solução CFA corretamente antes de injetá-lo intraplantarly, porque o CFA é uma emulsão de água em óleo que contém 1 mg de Mycobacterium tuberculose (H37Ra) calor matou e secas, 0,85 mL de óleo de parafina e 0,15 mL mannide monooleato (ver Tabela de materiais).
      Nota: Seringas de vidro Hamilton com êmbolos metálicos são recomendadas para injectar este composto por êmbolos de borracha podem reagir com o óleo no adjuvante.
    3. Lumiracoxib injeção
      1. Manter o composto (etapas 2.1.1 ou 2.1.2) na seringa na RT durante pelo menos 15 minutos antes da injeção para permitir o ajuste para RT. injetar 20 µ l do composto (ou dissolvente, como um controle) por via subcutânea para a pata traseira do mouse não-anestesiados usando um calibre 30 agulha.
      2. Introduza a agulha na base do polegar em direção ao calcanhar e injetar o composto quando a agulha é inserida cerca de 0,5 cm. Após a injeção, retraia lentamente a agulha enquanto girar ligeiramente a seringa para evitar vazamento de solução fora do local da injeção.

3. dor medições

Nota: Certifique-se que pesquisadores realizando os experimentos comportamentais são cegos para o tratamento de rato. É importante se adapte os animais para o ambiente de teste antes de executar qualquer medição. De preferência, na semana antes de iniciar os experimentos, os animais são colocados 1 - 2 vezes por 15-30 min em cada um dos diferentes dispositivos utilizados para realizar os testes. Ao manusear os machos e fêmeas no mesmo experimento, avalie os machos independentemente de fêmeas. Gaiolas limpas e superfícies extensivamente entre os diferentes grupos para evitar possíveis efeitos indesejáveis sobre o comportamento dos sexos diferentes. Medir latências de retirada de linha de base ou mecânicos limiares de duas a três vezes a precisão determinar limites de linha de base e identificar se estas são estáveis antes Lumiracoxib injeção de qualquer composto.

  1. Teste de von Frey: mecânica sensibilidade a estímulos inócuos
    1. Coloque os animais individualmente em gaiolas de acrílico em um carrinho de malha de arame e permitir que os ratos aclimatar-se durante pelo menos 15 minutos antes da medição.
    2. Avaliar a sensibilidade mecânica medindo-se o limiar de retirada de pata em resposta a uma série calibrada de pelos de von Frey, variando de 0,02 a 4 g. considere qualquer movimento de pata longe do cabelo aplicada como uma resposta positiva de retirada. Aplicam-se os filamentos, perpendicular à superfície de pata com força suficiente para causar ligeira flexão contra a pele e segurar para fazer s. ~ 3 claro que o cabelo não torça durante a aplicação para a pata.
    3. Calcule o limiar de pata-retirada de 50% usando o método de altos e baixos de15,21.
      Nota: O primeiro filamento para aplicar é 0,4 g (outros filamentos de partida podem ser utilizados dependendo dos limiares estes ratos exibir na linha de base). A falta de resposta a um filamento indica que o próximo filamento mais grosso é usado na estimulação seguinte, enquanto uma resposta positiva indica o uso do próximo filamento mais fino. O número de apresentações do cabelo é determinado pela primeira resposta diferencial; Depois disso, mais 5 aplicações são executadas. Calcule que o limite de 50%, de acordo com os métodos descritos anteriormente15,21.
  2. Sensibilidade térmica: teste de Hargreaves
    1. Coloque os animais em gaiolas em uma placa de vidro previamente aquecido (30 ° C) e permitir que os ratos aclimatar-se durante pelo menos 15 minutos antes da medição, esperando até que os animais se sentar ainda.
    2. Determine os tempos de latência de retirada de calor aquecendo a pata dos animais por um feixe de luz focalizado visível usando um aparelho de Hargreaves (ver Tabela de materiais).
      Nota: A intensidade do feixe é definida como 12%, porque com essa configuração de intensidade determinado experimentalmente, o feixe de luz evoca uma resposta retirada do tempo médio de 8 s na linha de base em camundongos C57Bl/6. A configuração de intensidade deve ser determinada por máquina individual e cepa de rato. Tempos de corte máxima de 20 s ou mais são usados para evitar lesões aos animais.
    3. Medir os tempos de latência de retirada ~ 4 vezes por animal. Média de todas as respostas medidas. Medir cada pata de forma independente e com intervalos de pelo menos 1 min entre medições posteriores na mesma pata.
  3. Déficits posturais: teste do rolamento de peso dinâmico
    1. Medir o peso corporal de cada animal antes do ensaio, desde que a análise do rolamento de peso requer o peso corporal de cada animal como um parâmetro de entrada.
    2. Coloque os animais individualmente em um sistema de peso-rolamento dinâmico instrumentado andar montado em uma capa de apoiar uma câmera que vai gravar os movimentos do mouse. Deixe o animal aclimatar para 0,5 a 1 min antes da gravação por 5 min.
      Nota: Neste teste, apenas um animal livremente movente pode ser avaliado em uma hora.
    3. Ajuste as configurações para realizar o rolamento de peso e analisar os dados.
      Nota: Nestas experiências, utilizamos os seguintes parâmetros: limite de peso (i) baixa de 0,6 g: Este é o peso mínimo necessário para ativar uma das células do sensor. (ii) limite de peso elevada de 1 g: este número indica o peso necessário para ativar completamente uma célula. (iii) superfície limite de 2 células: este número indica o número de células adjacentes uns aos outros que precisam ser ativados para serem levados em conta. (iv) mínimo número de imagens é 5: demora 0,1 s para capturar cada imagem. O número indica o número mínimo de quadros em que o mouse não se move. Como tal, um valor de 5 significa que o mouse postura precisa ser estável para > 0,5 s para obter uma medida que é levada em conta para análise.
    4. Realizar a análise de cada vídeo por rever o vídeo e certifique-se de que cada membro é reconhecido corretamente pelo software para o período de tempo indicado pelo software.
      Nota: Precisa de um mínimo de 1 min do tempo gravado ser validado. O peso dinâmico rolamento software calcula e fornece os seguintes parâmetros: (i) o peso suportado por cada pata individual em gramas e em percentagem do peso do corpo todo. (ii) o peso, a cargo da pata dianteira combinada ou nas patas traseiras combinadas em gramas e em percentagem do peso do corpo todo. (iii) a relação da esquerda/direita patas rolamento de peso ou dianteiro/traseiro rolamento de peso. (iv) a área da superfície de cada pata ou combinadas patas dianteiro/traseiro que ativou o pad sensível de pressão. (v) e o desvio para cada parâmetro. (vi) a duração das diferentes posturas (criação, 3 patas ou 4 patas) durante todo o experimento. (vii) tempo (s) de que cada pata tem peso durante todo o experimento.

4. proteína de fusão intratecal injeção de IL4-10 para analgesia

Nota: Confirme que a ventilação para a sala está aberta para garantir o fluxo de ar adequado. Para testar a eficácia da proteína de fusão do IL4-10 (1 µ g/mouse; volume de injeção total 5 µ l) deve ser testado contra injeções de veículo e injeções da combinação das citocinas individuais (IL4 IL10, 0,5 µ g + 0,5 µ g/rato, volume de injeção total 5 µ l).

  1. Anestesia o mouse com isoflurano de 3-4% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min na câmara de indução. Verifica que o mouse é devidamente anestesiado por beliscar a pata para garantir que o animal não é responsivo.
  2. Lugar o mouse em cima da mesa com a cabeça colocada no nariz cone do aparelho e manter a sedação de rato com isoflurano 1,5 a 2% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min, enquanto realizando a injeção intratecal.
  3. Costas-preenchimento injetáveis compostos em um vidro limpo 25 µ l seringa Hamilton conectem a uma agulha de calibre 27.
  4. Segure o mouse pela coluna vertebral posterior nas costelas e levantar ligeiramente o mouse. Coloque a agulha na vertical entre as vértebras lombares L5 e L6 e inseri-lo cuidadosamente através da pele, bem no meio das vértebras lombares. Coloque a agulha no espaço intervertebral.
    Nota: Encontrar o espaço intervertebral pode exigir alguns 'pesquisa' ao mover a agulha ao longo do eixo ventral rostral, pressionando levemente a agulha até sente uma perda da resistência do tecido ósseo.
    1. Confirme o direcionamento correto, verificando-se que um movimento de cauda ocorreu. Injetar 5 µ l do composto lentamente, aguarde alguns segundos e em seguida puxar lentamente a agulha. Se apenas um único pata flick é observado, a agulha é provável não colocadas correctamente.
  5. Após a injeção, verifique o mouse perto para o primeiro 30 min após a recuperação da anestesia para garantir a ausência de qualquer deficiência/paralisia motora.
    Nota: Comportamentos de dor podem ser medidos (como descrito na seção 3) 15 minutos após a recuperação.

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Representative Results

Uma imagem representativa de um gel de SDS-PAGE contendo diferentes frações obtidas durante a purificação de cromatografia de afinidade é mostrada na Figura 1A. Na carga (L) e o fluxo através de frações (FT), todas as proteínas presentes no sobrenadante HEK293 são observadas. Nenhuma proteína é observada na fração de lavagem (W). Na fração de eluição (E), observam-se duas bandas de 35 e 37 kDa correspondente a dois glycoforms diferentes da proteína de fusão de IL4-10 (setas). Na Figura 1B, um ensaio de potência representativa em um sangue total ensaio de dois diferentes IL4-10 lotes de proteína de fusão é mostrado. Observa-se uma inibição dose-dependente da liberação de TNFa induzida por LPS, mostrando a bioatividade comparável para os dois lotes de proteína de fusão de IL4-10.

A seguir, um exemplo de resultados de experimentos representativos, em que a proteína de fusão de IL4-10 é testada para inibir a dor inflamatória persistente é mostrado (Figura 2). Persistente dor inflamatória foi induzida por Lumiracoxib injeção de carragenina 2%. Mecânico(Figura 2), bem como térmica (Figura 2B) hiperalgesia foi seguida ao longo do tempo. No dia 6, após a indução da dor inflamatória, os ratos foram injetados intratecal com a proteína de fusão de IL4-10 ou o veículo como um controle. IL4-10 significativamente resolvido mecânico(Figura 2)e térmica (Figura 2B) hiperalgesia e atingiu o seu máximo efeito após 24 h após a injeção. Idealmente, a eficácia da proteína de fusão na inibição da dor deve ser também testada contra concentrações equimolar das citocinas individuais para testar se sua capacidade para inibir a dor é melhor do que a soma das citocinas individuais. Estes dados não são exibidos aqui, mas nos referimos a uma recente publicação que exibe este dados9.

A eficácia da proteína de fusão do IL4-10 foi recentemente testada na dor inflamatória induzida pelo CFA modelo9. Neste experimento, várias injeções da proteína de fusão de IL4-10 foram administrado intratecal. As injeções múltiplas completamente resolvidos induzida pelo CFA persistente inflamatória hiperalgesia, medida através de von Frey e testes de Hargreaves, demonstrando o potencial da proteína de fusão do IL4-10 como um tratamento analgésico9. Aqui nós mostramos que o Lumiracoxib injeção CFA também induziu uma redução na carga da pata afetada (Figura 3A-B). Injeção intratecal de proteína de fusão de IL4-10 no dia 7 após injeção de CFA Lumiracoxib atenuado a redução do peso rolamento da pata afetada em comparação com ratos injetados veículo 2 dias após a administração de proteína de fusão de IL4-10 (Figura 3B ).

Figure 1
Figura 1 : Purificação e caracterização da proteína de fusão de IL4-10. (A) manchadas de Coomassie SDS-PAGE análise das frações de cromatografia de afinidade: l: carga, FT: fluir, lavagem de w:, e: eluição. (B) ensaio funcional: IL4-10 dose de proteína de fusão dependente inibe a produção de TNFa em cultura de sangue estimulada LPS (expressada como inibição por cento em comparação com as culturas estimulados com LPS sozinhos). Os dados são representados como média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Inibição da hiperalgesia inflamatória pela proteína de fusão de IL4-10. Dor inflamatória foi induzida por uma Lumiracoxib injeção de 20 µ l de 2% de carragenina (carro). Seis dias após a injeção Lumiracoxib ratos receberam uma injeção intratecal (seta) de 1 proteína de fusão de IL4-10 µ g ou veículo (PBS). (A) mecânico hipersensibilidade (limite de 50% de Log (g)) foi medida ao longo do tempo usando o teste de Von Frey e (B) sensibilidade térmica (latência (s)) foi medida utilizando o teste de Hargreaves. Dados são representados como média ± SEM. asteriscos representam diferenças significativas, analisadas por ANOVA de duas vias, entre o veículo e injetado IL4-10 animais. * *, * * * = p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Inflamação induzida por alterações no rolamento de peso. Dor inflamatória foi induzida por uma Lumiracoxib injeção de 20 µ l de adjuvante completo de Freud (CFA). Apoio em cada pata foi medido utilizando o dispositivo de rolamento de peso dinâmico. Rolamento de peso em gramas da pata afetada (pata traseira ipsilateral) e o rolamento de peso total das patas não afetados (patas dianteiras e pata contralateral) é exibido, bem como a relação do rolamento de peso a pata ipsilateral em comparação com as outras 3 patas. (A) curso do peso-rolamento durante a inflamação induzida pelo CFA (n = 10). (B) no 7º dia após Lumiracoxib CFA, ratos receberam uma injeção intratecal de 1 µ g IL4-10 proteína de fusão ou veículo (PBS). Rolamento de peso foi medido em 0 e 7 dias após o Lumiracoxib CFA e 2 dias após a administração de proteína de fusão de IL4-10. Rolamento de peso a pata ipsilateral em comparação com as outras 3 patas é representado (n = 3-4). Os dados são representados como média ± SEM. * * * = p < 0,001; * * = p < 0,01; * = p < 0,05 em relação à linha de base (dia 0). # = p < 0,05 em relação ao veículo Tratado animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este manuscrito descreve métodos para a produção e caracterização de um recombinante da proteína de fusão de IL4-10 e métodos para testar a sua eficácia na inibição de hiperalgesia inflamatória em modelos do rato da dor inflamatória persistente. A produção e purificação da proteína de fusão do IL4-10 é realizada em pequena escala. Células HEK293 são Selecionadodas como um sistema de expressão para produção de proteína, porque eles permitem modificações borne-translational que não podem ser realizadas em sistemas de expressão procarióticos. Modificações borne-translational são relevantes para a função da proteína, e a ausência de tais modificações potencialmente poderia afetar a eficácia terapêutica da proteína de fusão do IL4-10. A proteína é purificada do sobrenadante de cultura por cromatografia de afinidade. Nós escolhemos usar feita internamente anticorpo monoclonal contra IL4 para purificação da afinidade e não para produzir uma proteína de fusão de IL4-10 que contém uma marca para permitir a purificação com um sistema de tag de afinidade. A razão para isto foi para evitar a possibilidade de mudanças relacionadas à marca no enrolamento de proteínas e função. No entanto, se está faltando um anticorpo monoclonal altamente seletivo, uma proteína com uma tag precisa ser desenvolvido, por exemplo, a sua marca. Nesse caso, será importante determinar se o C ou N-terminal da proteína é mais adequado para a tag para não afectar a função da proteína.

De 1 L de sobrenadante HEK293, cerca de 3 mg de proteína de fusão de IL4-10 purificada é obtida, mas pode variar de lote para lote. A coluna para a purificação da afinidade pode ser usada por vários ciclos de purificação antes de descartar. O passo mais sensível no processo de purificação é a eluição da proteína de fusão IL4-10 da coluna por baixo pH, pois o baixo pH pode induzir a proteína irreversível desnaturação e precipitação de proteínas. Assim, a manutenção da estrutura da proteína nativa e a ausência de agregados de proteínas são essenciais para lotes de boa qualidade. Para esse fim, avaliação da Bioatividade da proteína de fusão precisa ser testado em vitro , antes e após a purificação com buffers de eluição diferentes. Após a purificação da proteína de fusão do IL4-10, a bioatividade não foi reduzida em comparação com não-purificado da proteína. Além disso, a formação de agregados era ausente quando a etapa de eluição foi executada com tampão de glicina 0,1 M (pH = 2,5), e o pH das frações eluição foi imediatamente neutralizado com tampão Tris de 1 M (pH = 9).

A concentração da proteína de fusão purified IL4-10 é estimada com base nos resultados de ELISA IL10 humanos. Ensaio da proteína BCA é usado para confirmar as concentrações de proteína. Recuperação da proteína após purificação é avaliada com base em concentrações medidas em carga, fluir, lavagem e eluição frações por IL10 ELISA. A determinação da concentração da proteína BCA da proteína de fusão de IL4-10 pode ser avaliada apenas em frações de eluição dializados. Fracções de eluição non-diálise contêm imidazol, um composto que afeta a medição do BCA. Non-purificado frações contêm outras proteínas HEK293 meio de cultura.

A determinação da Bioatividade da proteína de fusão do IL4-10 é realizada em um ensaio de sangue total. A bioatividade da proteína de fusão de IL4-10 deve ser avaliada no sangue inteiro de vários doadores para determinar se a atividade funcional é mantida. Vários doadores são necessários porque o doador ao doador variância existe na capacidade de IL10 e IL4 para inibir a liberação de TNFa induzida por LPS. Além disso, a expressão de IL4R e IL10R pode diferir entre os doadores, que afetam a capacidade da proteína de fusão de IL4-10 para inibir a produção de TNFa induzida por LPS.

Nos métodos descritos, nós detalhados 2 modelos de rato de dor inflamatória persistente para avaliar a eficácia da proteína de fusão IL4-10 para resolver a dor em vivo. No entanto, para uma avaliação completa do potencial analgésico de proteínas recombinantes de fusão, as moléculas devem ser testadas em outros modelos de dor crônica também. Estes modelos incluem, mas não estão limitados a, modelos de lesão do nervo e dor neuropática induzida por quimioterapia9,22. Embora o teste de von Frey e teste de Hargreaves são comumente usados para testes de drogas analgésicas, é evidente que um ensaio adicional (por exemplo, teste do rolamento de peso dinâmico) deve ser incluído para avaliar os efeitos na dor não evocados behaviorsand também com o ensaio de dor operante (por exemplo, condicionado lugar preferência (CPP) que detectar comportamentos de dor não-evocada17,18). Para executar o CPP, o aparecimento dos efeitos dor inibindo a proteína de fusão deve ter em conta, porque o condicionamento dos animais pelo alívio da dor requer analgésicos de ação rápida (que exercem efeitos em menos de 15 min). No entanto, se o teste composto tem um início lento e analgésico, mas é susceptível de induzir a inibição da dor de longa duração (mais de 4 dias), CPP, ainda, pode ser usado para testar se o composto inibiu a dor. Neste caso, perda induzida por composto de condicionamento com analgésicos de ação rápida deve ser avaliada.

Injeções intratecal são selecionadas como uma via de administração, como o composto vai chegar dor áreas relevantes, tais como o gânglio da raiz dorsal e a medula espinhal. Notavelmente, intratecal entrega de drogas analgésicas tornou-se prática comum no tratamento de pacientes com dor crônica, como esta abordagem reduz a dose de drogas analgésicas necessárias e diminui a toxicidade e efeitos colaterais sistêmicos. No entanto, esta via de administração tem algumas limitações; exige pessoal bem treinado e, devido ao pequeno espaço subaracnoideo, o volume de injeção deve ser limitado a 5 µ l em ratos, que exigem soluções altamente concentradas da proteína de fusão. A técnica de injeções intratecal requer treinamento. Essa formação pode ser realizada em não-recuperação de animais anestesiados com injeção de um corante para verificar injeção intratecal correto.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Parte deste trabalho foi financiado por uma Universidade Utrecht Life Sciences conceder

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle 293-F cells Invitrogen R790-07 Human embryonic kidney cells 
GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium Life technologies 12338018 Culture medium
293fectin Reagent Invitrogen 12347019 Transfection reagent
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX Life technologies 51985026 Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections 
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) Life technologies 52400-025
CNBr-Activated Sepharose 4B GE Healthcare 17-0430-01 pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins
Hydrochloric acid fuming 37%  Merck 1003171000
Sodium chloride Sigma S7653-1kg
Sodium bicarbonate  Sigma 31437
Trizma hydrochloride Sigma T3253-500G TRIS hydrochloride 
Acetic Acid 100%                                Merck 1.00063.1000 
Glycin-HCl                                           Sigma G2879             
PBS                                                     Pharmacie, UMCU Phosphate-Buffered Saline
10X TGS BIO-RAD 161-0772 Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis
Mini-PROTEAN TGX Gels BIO-RAD 456-1046 12% SDS precast gels
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIO-RAD 170-4157 Western blot transfer packs
Yarra 3u SEC-2000 column Phenomenex
InstantBlue Protein Stain Expedeon ISB1L ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels
Human IL-10 DuoSet ELISA R&D DY217B
Human TNFα ELISA Set Diaclone 851570020
BCA Pierce Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Carrageenan Sigma-Aldrich 22049 plant mucopolysaccharide
CFA Sigma-Aldrich F5881 vaccine adjuvant
Hamilton syringe Sigma-Aldrich 20779 glass syringe
Animal Enclosure IITC Life Science 433 Animal Enclosure
Von Frey mesh stand IITC Life Science 410 Mesh Stand
von Frey hairs  Stoelting 58011 touch test sensory probes
Plantar Test (Hargreaves Method) IITC Life Science 390G plantar test with heated glass
Dynamic Weight Bearing test Bioseb BIO-DWB-AUTO-M postural deficit test
Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm BIO-RAD 7371532 glass chromatography column  
SnakeSkin Dialysis Tubing  Thermo Scientific 88242
Minisart NML Syringe Filter  Sartorius 16555-K single use filter unit, 0.45 μM
CASY Cell Counter and Analyzer Roche

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References

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Prado, J., Popov-Celeketic, J., Steen-Louws, C., Raoof, R., Hack, E., Eijkelkamp, N. Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain. J. Vis. Exp. (134), e57071, doi:10.3791/57071 (2018).

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