Summary
本文为 IL4-10 重组融合蛋白的生产方法和质量控制提供了详细的资料。我们还展示了如何测试这种蛋白质的有效性, 以解决疼痛的老鼠模型的炎症疼痛。
Abstract
慢性疼痛难以治疗, 迫切需要新的方法来解决持久性疼痛。抗炎性细胞因子是有希望的候选者, 以治疗虚弱的疼痛状况, 因为他们的能力, 调节异常的神经免疫相互作用。然而, 生理上他们在一个不同的细胞因子的网络工作, 因此他们的治疗作用可能不是最佳的当被使用作为独立药物。为了克服这一局限性, 我们开发了抗炎细胞因子 IL4 和 IL10 的融合蛋白。本文介绍了 IL4-10 重组蛋白的生产和质量控制方法, 并对 IL4-10 融合蛋白在小鼠持续炎症性疼痛模型中的镇痛效果进行了试验研究。
Introduction
慢性疼痛仍然是第二十一世纪最虚弱和未受治疗的医疗问题之一, 影响 > 20% 的成人人口1,2。然而, 提供缓解慢性疼痛的治疗往往无效或必须停止, 因为严重的副作用3。重要的是, 目前可用的药物只提供症状缓解, 但不显着改变或治疗慢性疼痛。虽然慢性疼痛似乎是神经紊乱, 证据表明免疫系统参与慢性疼痛发展4,5。此外, 以免疫为基础的治疗疼痛的方法正在出现。例如, 抗炎细胞因子能抑制几种慢性疼痛模型中的疼痛6,7,8。然而, 抗炎细胞因子有短半衰期, 减少其潜在的止痛效果。此外, 抗炎细胞因子最优化的工作, 以配合。为了克服这些局限性, 我们最近将抗炎细胞因子 interleukin-4 (IL4) 和 interleukin-10 (IL10) 融合成一个分子。与单个细胞因子9相比, IL4-10 融合蛋白在抑制慢性炎症和神经病理性疼痛方面具有优异的疗效。这里我们描述了这种融合蛋白是如何产生、纯化以及如何控制其质量的。
IL4-10 融合蛋白是通过对 HEK293-F 细胞进行瞬态转染, pUPE 表达载体进行 IL4-10 融合蛋白的 cDNA 序列编码, 在人体细胞中产生的。HEK293-F 细胞被选择允许对蛋白质的后转化修饰, 在细菌表达系统中不会发生的东西。为了优化糖盖与唾液酸, cDNA 编码 beta-galactoside-2, 3-唾液酸化酶转移酶被纳入在载体作为第二种转基因。融合蛋白的纯化使用亲和蛋白纯化的文化上清, 因为它比纯化更强大的其他方法例如大小排除或离子交换层析10,11。为了纯化 IL4-10 融合蛋白, 我们用自制的单克隆抗体对 IL4。对纯化 IL4-10 融合蛋白的纯度和生物活性进行了评价, 作为质量控制的一部分。用月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 和高压尺寸排除色谱 (HP SEC) 对生产批次纯度进行了评价。通过测量其在全血培养中抑制脂多糖 (LPS) 诱导的肿瘤坏死因子α (TNFα) 生产的能力, 对 IL4-10 融合蛋白的生物活性进行评价, 并将其与个体的组合进行比较。细胞 因子。
最后, 为了测试 IL4-10 融合蛋白抑制慢性疼痛的能力, 我们描述了如何在广泛使用的持久性炎症疼痛的小鼠模型中测试融合蛋白的镇痛作用12,13,14.在这里, 我们描述了炎症疼痛模型的方法。然而, 重要的是要注意, 其他疼痛模型可以使用 (例如, 神经病理性疼痛模型), 取决于需要回答的研究问题。为了评估这些模型的疼痛, 重要的是要使用各种行为措施, 包括诱发和非诱发疼痛的措施。在这里, 我们描述了对机械和热诱发行为反应变化的评估方法。对无害刺激的机械敏感性是用弗雷测试来评估的, 而热敏度则使用哈格里夫斯测试进行评估。重要的是, 用动态负重试验测量非诱发痛觉/痛觉。这些措施被广泛接受作为疼痛措施和产生的重要信息的疼痛阈值和潜在的疼痛经历的动物15,16,17。评估非诱发疼痛的其他措施 (例如, 刺激独立), 如条件位置首选项测试, 可能是有价值的18。为了评估药物抑制疼痛的潜能, 我们对融合蛋白进行鞘内管理, 因为这一管理途径需要较少的蛋白质剂量来达到与疼痛相关的区域, 避免系统性 (副作用)19, 20。
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Protocol
所有动物实验都是按照国际准则进行的, 并事先得到当地实验伦理委员会的批准。全血是从小型捐助者服务 (迷你捐助者 Dienst, MDD) 在大学医学中心乌得勒支 (UMCU) 在荷兰。MDD 得到了 UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) 的医学伦理学委员会的积极批准, 其编号为 07-125/C 号议定书。
1. 蛋白质的生产和表征
- 细胞培养
注意: 请参阅所用培养基的材料表。- 将 HEK293-F 细胞解冻37摄氏度, 直到有一小块冰块。将解冻后的细胞立即转移至10毫升的冰冷介质 (4 °c), 并将细胞悬浮在室温下 (RT), 在 500 x g 处进行4分钟 (分钟)。
- 去除培养基和并用重悬在10毫升的新鲜培养基在 RT, 其次是离心 500 x 克4分钟。
- 取出上清液, 并用重悬5毫升培养基中的细胞颗粒. 将细胞悬浮液直接添加到含有25毫升预热培养基 (37 °c) 的125毫升烧瓶中。将单元格在37°c、8% CO2和95% 湿度的轨道振动筛上以 125 rpm 的速度旋转。
- 每周两次亚文化细胞。使用自动单元格计数器 (请参阅材料表) 来评估细胞数量和细胞活力。种子存活细胞在浓度为 3 x 105细胞/毫升成锥形烧瓶。保持培养基总容积在锥形瓶总容积的 1/5, 保持曝气最佳。
- 转 染
注: 在细胞活力为 > 90% 时, 在转染和染细胞的三到四倍前亚文化。基于等离子膜完整性的自动 (电场多通道) cellcounting 系统对细胞生存能力进行评估。请参阅转染试剂的材料表。- 在 500 x g 上离心细胞在 RT 4 分钟;并用重悬细胞颗粒在10毫升预热培养基 (37 °c) 和稀释细胞悬浮到 ~ 1.0 x10 6 细胞/毫升在总容量 1 l 整除细胞悬浮在10毫升整除数 100 ml 锥形烧瓶。
- 稀释1毫克的质粒 DNA 在33毫升减少血清最低基本培养基 (记忆, 参见材料表) 通过温和的混合。在一个单独的管, 稀释1330µL 的转染试剂在内存中通过温和的混合。孵育两个解决方案在 rt 5 分钟添加和混合的 DNA 稀释在内存中的转染试剂, 并孵化的混合30分钟的 rt。
- 将 DNA 转染试剂组合添加到细胞中 (在1节中培养);添加6.6 毫升的混合到每500毫升锥形瓶含有100毫升细胞在培养基中。维护先前提到的文化条件中的细胞。在转染后三天收获含有分泌 IL4-10 融合蛋白的培养基上清液。
- 根据制造商的协议执行 IL10 ELISA, 确定 IL4-10 融合蛋白在培养中清液中的浓度 (请参阅材料表)。
注: 在最佳培养条件下, 融合蛋白的浓度可预计为2.5 至5µg/毫升。
- 亲和层析法纯化蛋白质
注意: 亲和层析是在室温下进行的。然而, 所有的分数 (文化上清, 负荷, 流动, 和洗脱分数) 是保存在冰过程中。- 根据制造商的协议 (参见材料表), 10 毫克的内部制作的单克隆抗体抗 IL4 到1克 CNBr 激活琼脂糖4B。将2.5 毫升的耦合琼脂糖珠慢慢倒入玻璃色谱柱 (30 厘米长和1.5 厘米内径, 请参阅材料表)。
- 通过将含有1% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 通过柱状体, 阻断珠的剩余结合部位。用25毫升的 pbs (ph = 7.4) 冲洗柱子, 后跟12.5 毫升的0.1 米甘氨酸缓冲液 (ph = 2.5) 和25毫升的 pbs (ph = 7.4)。
- 将100毫升的10倍浓缩 HEK293 细胞培养液通过柱, 流速为1毫升/分钟. 用50毫升 PBS 冲洗柱。
- 洗脱 IL4-10 融合蛋白与12.5 毫升的0.1 米甘氨酸缓冲 (pH = 2.5) 的流速为1毫升/分, 并收集2.5 毫升的分数。添加350µL 1 米三缓冲 (pH = 9) 的每一个分数, 使 pH 值为7。透析中和的分数过夜对2升的 PBS (pH = 7.4)。
- 使用16毫米干径和 3.5 K 分子量切断的透析油管。无菌过滤器透析馏分使用0.45 µM 孔径的一次性过滤器。贮存无菌 IL4-10 融合蛋白溶液在整除数-80 摄氏度。
- 用考马斯染色的12% 页凝胶和 HP 秒 (3 µm SEC-2000 柱) 评价洗脱 IL4-10 融合蛋白的纯度。对于 HP SEC 分析, 在柱上的浓度为1毫克/毫升的蛋白质中加载40µL。使用100毫米磷酸钠缓冲液, 150 毫米氯化钠 (pH = 6.8) 作为流动相。将流速设置为1毫升/分钟。
- 根据制造商的协议, 确定每批纯化 IL4-10 融合蛋白的浓度, IL10 ELISA 法和二辛可宁酸蛋白检测试剂盒 (蛋白检测套件, 参见材料表)。
- 使用重组人 IL10 在 ELISA 检测中创建标准曲线。为了纠正重组 IL10 (18 kDA) 和 IL4-10 融合蛋白 (34 kDA) 之间的大小差异, 将获得的浓度乘以1.8 的因子。
- IL4-10 融合蛋白的生物活性研究
注: 对每批 IL4-10 融合蛋白进行全血检测, 并将不同批次的活性作为质量控制的一部分进行比较。全血化验是在新的人类血液中收集的一天的检测肝素管。血液是在我们的内部捐助者服务的健康志愿者获得的。样品应作为潜在的生物危害处理。- 在浓度范围 5-1215 ng/毫升的 RPMI 培养基上制备3倍稀释的纯化 IL4-10 融合蛋白 (参见材料表)。
- 制备脂多糖 (100 稀释/毫升) 和人血液稀释4次 RPMI 培养基。
- 将 IL4-10 融合蛋白、LPS 和人血的预稀释为48井板。对每个井, 添加50µL IL4-10 融合蛋白 (最终浓度 1-243 ng/毫升), 75 µL RPMI 培养基, 25 µL LPS (最终浓度 10 ng/毫升), 100 µL 人类血液 (最后稀释)。
注: 每井总容积为250µL。 - 在37°c、8% CO2和95% 湿度为 18 h 孵化板材。
- 根据制造商的协议, 用 TNFα ELISA 法评价 TNFα在培养上清液中的浓度。
- 根据公式计算 IL4-10 融合蛋白对炎症反应的抑制作用:% 抑制 = (1-(A-b)/(C b)) x 100
注: A = TNFα水平在 lps 被刺激的文化用 IL4-10 融合蛋白质处理, B = TNFα水平在静态文化和 C = TNFα水平在 lps 刺激的文化。
2. 小鼠持续炎症性疼痛模型
注意: 使用雄性和雌性小鼠 (C57Bl/6) 是很重要的, 因为这将有助于识别性依赖的效果。一般来说, 使用的老鼠是在 8-16 周的年龄之间。要确定所需的动物数量, 应执行功率计算。在因特网上可以很容易地找到用于执行此类计算的基于 Web 的工具 (例如、http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net)。
-
慢性炎症性疼痛的诱导
注: intraplantar 注射卡拉胶或完整的弗洛伊德佐剂 (CFA), 诱导成年小鼠持续炎症性疼痛。不同的测试不会相互干扰。- 在0.9% 氯化钠中通过溶液通过23口径的针, 以确保卡拉胶被正确溶解, 通过溶解λ-卡拉胶 (参见材料表) 来制备卡拉胶 (2% 瓦特/v)。在执行注入之前, 直接准备一个新的解决方案。
- 或者, 如果使用 cfa, 在注入 intraplantarly 之前适当地混合 cfa 解决方案, 因为 cfa 是含1毫克结核分枝杆菌 (H37Ra) 热杀死和干、0.85 毫升石蜡油和0.15 毫升 mannide 的含油乳液。油酸酯 (请参阅材料表)。
注: 建议使用金属活塞的玻璃哈密尔顿注射器注射此化合物, 因为橡胶活塞可能与佐剂中的油反应。 -
Intraplantar 注射液
- 在注射前至少15分钟维持2.1.1 或2.1.2 的混合物, 以允许对 rt 进行调整. 注射20µL 的化合物 (或溶剂作为一个控制) 皮下到后爪的非麻醉鼠标使用30口径针。
- 插入针在拇指的底部指导到脚跟和注射的化合物时, 针插入约0.5 厘米。注射后, 慢慢地收回针头, 同时略微旋转注射器, 避免从注射部位漏出溶液。
3. 疼痛测量
注意: 确保从事行为实验的研究人员对老鼠的治疗视而不见。在进行任何测量之前, 将动物与测试环境进行适应是很重要的。最好是在开始实验前的一周, 在每个用于执行测试的不同设备中, 动物被放置 1-2 倍于 15-30 分钟。在同一个实验中处理男性和女性时, 要独立地评价雄性和雌性。在不同的群体之间广泛清洁笼子和表面, 以避免对不同性别的行为产生潜在的有害影响。测量基线撤退潜伏期或机械阈值三倍, 以准确确定基线阈值, 并确定这些是否在 intraplantar 注入任何化合物之前是稳定的。
-
冯弗雷试验: 对无害刺激的机械敏感性
- 将动物单独放置在网架上的亚克力笼中, 并允许老鼠在测量之前至少15分钟的适应。
- 通过测量从0.02 到4克的一组校准的冯弗雷毛发, 来评估机械灵敏度. 考虑到爪子的任何运动, 从应用的头发作为积极的撤退反应。将花丝垂直于足爪表面, 施加足够的力, 对皮肤产生轻微的弯曲, 并保持 3 s. 确保头发在应用到爪子时不会扭曲。
- 使用上下方法15、21计算50% 爪提取阈值。
注: 第一个应用的灯丝是0.4 克 (其他起动灯丝可能会根据这些小鼠在基线显示的阈值来使用)。缺乏对灯丝的反应表明, 下一个较厚的灯丝用于以下刺激, 而积极的反应表明使用下一个较薄的灯丝。头发呈现的数量是由第一个差异反应决定的;此后, 还将执行5个应用程序。根据前面15、21中描述的方法计算50% 阈值。
-
热敏性: 哈格里夫斯测试
- 将动物放在预热 (30 摄氏度) 的玻璃板上, 让老鼠在测量之前至少15分钟适应, 等待动物们静静地坐着。
- 通过使用哈格里夫斯设备的聚焦可见光束加热动物的爪子来确定热提取延迟时间 (请参阅材料表)。
注: 光束的强度设置为 12%, 因为通过实验确定的强度设置, 光束唤起了在 C57Bl/6 小鼠基线上平均时间为8秒的撤退响应。强度设置应根据个别机器和鼠标应变确定。最大的截止时间为二十年代或更多的是用来避免伤害动物。 - 测量每只动物4次的撤退延迟时间。测量所有响应的平均值。独立测量每只爪子, 并在同一爪的后续测量之间至少有1分钟的间隔。
-
体位缺陷: 动态负重试验
- 测试前测量每种动物的体重, 因为负重分析要求每个动物的体重作为输入参数。
- 将动物单独放置在地板上的动态重量轴承系统中, 组装到一个覆盖物上, 以支持将记录鼠标移动的摄像机。在录制5分钟之前, 让动物适应0.5 到1分钟。
注意: 在这个测试中, 一次只能评估一个自由运动的动物。 - 调整设置以执行负重和分析数据。
注: 在这些实验中, 我们使用以下参数: (i) 低权重阈值为0.6 克: 这是激活传感器的一个细胞所必需的最小重量。(ii) 高权重阈值1克: 这个数字表示完全激活一个细胞所需的重量。(三) 2 个细胞的表面阈值: 这个数字表示需要被激活才能考虑的相邻单元格的数量。(iv) 图像的最小数目为 5: 捕获每张图像需要0.1 秒。该数字指示鼠标不移动的最小帧数。因此, 值为5意味着鼠标姿态需要保持稳定, > 0.5 秒才能获得用于分析的测量。 - 通过重播视频, 对每段视频进行分析, 确保软件在显示的时间框架内正确识别每一个肢体。
注: 至少1分钟的记录时间需要验证。动态重量轴承软件计算并提供以下参数: (一) 每只爪在克中的重量, 以及整个身体重量的百分比。(ii) 由组合前爪或组合后爪在克内的重量和整个身体重量的百分比承担。(iii) 左/右爪子负重或前/后负重的比例。(iv) 激活压力敏感垫的每只爪子或组合前/后爪的表面积。(v) 每个参数的平均值和标准偏差。(六) 整个实验期间不同体位 (饲养、3爪或4爪) 的持续时间。(七) 每只爪子在整个实验过程中的重量。
4. 鞘内注射 IL4-10 融合蛋白镇痛
注: 确认房间内的通风是开放的, 以确保适当的空气流通。检测 IL4-10 融合蛋白 (1 µg/小鼠的功效; 5 µL 总注射量) 应对照不同细胞因子 (IL4 + IL10、0.5 µg + 0.5 µg/小鼠、5µL 总注射量) 组合的车辆注射和注射进行试验。
- 麻醉 3-4% 异氟醚, 在感应腔内氧流速为2升/分的小鼠。通过捏爪子来检查鼠标是否被适当的麻醉, 以确保动物没有反应。
- 把鼠标放在桌子上, 头放在仪器的鼻锥上, 用 1.5-2% 异氟醚保持鼠标镇静, 在进行鞘内注射时, 氧流速为2升/分。
- 背部填充注射化合物成一个干净的25µL 玻璃汉密尔顿注射器连接到27口径针。
- 按住鼠标的脊柱后, 肋骨和轻微地举起鼠标。将针垂直放置在腰椎 L5 和 L6 之间, 并小心地将其插入腰部中部的皮肤。把针放到椎间隙。
注意: 发现椎间隙可能需要一些 ' 搜索 ' 通过移动针沿延髓腹轴, 轻轻按压针, 直到失去了骨组织的抵抗力。- 通过验证是否发生尾弹来确认正确的目标定位。慢慢地注入5µL 的化合物, 等待几秒钟, 然后慢慢地收回针。如果只观察到单爪弹, 针可能无法正确放置。
- 注射后, 检查鼠标密切的第一30分钟后, 从麻醉恢复, 以确保没有任何运动损伤/瘫痪。
注意: 疼痛行为可以测量 (如第3节所述) 恢复后15分钟。
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Representative Results
在图 1a中显示了含有不同分数的 SDS 页凝胶在亲和层析纯化过程中的代表性图片。在负载 (L) 和流经 (FT) 馏分中, 所有在 HEK293 上清液中存在的蛋白质都被观察到。在洗涤 (W) 分数中没有发现蛋白质。在洗脱 (E) 分数, 观察两个带35和 37 kDa 的两个不同 glycoforms 的 IL4-10 融合蛋白 (箭)。在图 1B中, 显示了两种不同 IL4-10 融合蛋白批次的全血检测中的代表性效力检测。观察了脂多糖诱导的 TNFα释放的剂量依赖性抑制, 显示了两种 IL4-10 融合蛋白批次的可比生物活性。
接下来, IL4-10 融合蛋白测试以抑制持久性炎症疼痛的代表性实验的一个例子显示 (图 2)。intraplantar 注射2% 卡拉胶引起持续性炎症疼痛。机械 (图 2A) 以及热 (图 2B) 痛觉随时间推移。6天后, 炎症性疼痛诱导, 小鼠注射鞘内与 IL4-10 融合蛋白或车辆作为控制。IL4-10 显著地解决了机械 (图 2A) 和热 (图 2B) 痛觉, 并在注射后24小时后达到了最大效果。理想的情况下, 融合蛋白在止痛抑制中的功效也应与个体细胞因子的摩尔浓度进行测试, 以检验其抑制疼痛的能力是否优于单个细胞因子的总和。此处不显示这些数据, 但我们引用了显示此数据9的最近发布。
IL4-10 融合蛋白的有效性最近在 CFA 诱导的炎症疼痛模型9中进行了测试。本实验鞘内了 IL4-10 融合蛋白的多项注射。多次注射完全解决了 CFA 诱导的持续性炎症痛觉, 用弗雷和哈格里夫斯测试, 表明 IL4-10 融合蛋白作为镇痛治疗的潜力9。在这里, 我们表明, intraplantar CFA 注射也诱发了减轻受影响的爪子的重量轴承 (图 3a B)。鞘内注射 IL4-10 融合蛋白7天后 intraplantar CFA 注射液减少了受影响的爪子的重量轴承的下降相比, 车注射小鼠2天后 IL4-10 融合蛋白管理 (图 3B).
图 1: IL4-10 融合蛋白的纯化和表征.(A) 考马斯染色的 SDS 页分析的亲和层析分数: L: 负载, FT: 流经, W: 洗涤, E: 洗脱。(B) 功能性分析: IL4-10 融合蛋白剂量依赖抑制 lps 刺激全血培养的 TNFα生产 (与仅用 LPS 刺激的文化相比, 表达为抑制百分比)。数据以平均值表示.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: IL4-10 融合蛋白抑制炎症痛觉.炎性疼痛是由20µL 卡拉胶 (汽车) 的 intraplantar 注射液引起的。六天后, intraplantar 注射小鼠接受鞘内注射 (箭头) 的1µg IL4-10 融合蛋白或车辆 (PBS)。(A) 机械性超敏 (对数50% 阈值 (g)) 是用弗雷测试和 (B) 热灵敏度 (延迟) 测量的, 使用了哈格里夫斯测试。数据被表示为平均值 "电子扫描电镜". 星号代表了两种方差分析、车辆与 IL4-10 注射动物之间的显著差异。**, ** = p < 0.01 和p < 0.001 分别。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 炎症引起的负重变化.炎症性疼痛是由 intraplantar 注射20µL 完全弗洛伊德的佐剂 (CFA) 引起的。用动负重装置测量了各爪的负重。在受影响的爪 (同侧后爪) 的克和不受影响的爪子 (前爪和对侧爪) 的总重量轴承的重量轴承显示, 以及与其他3爪相比, 同侧爪的负重比例。(A) 在 CFA 引起的炎症期间的负重过程 (n = 10)。(B) 在 intraplantar CFA 7 天后, 小鼠接受鞘内注射1µg IL4-10 融合蛋白或车辆 (PBS)。intraplantar 后0和7天测量重量, IL4-10 融合蛋白的2天。与其他3爪相比, 同侧爪的重量轴承 (n = 3-4)。数据被表示为卑鄙的电子扫描电镜. ** = p < 0.001;** = p < 0.01;* = p < 0.05 与基线比较 (0 天)。# = p < 0.05 与车辆处理过的动物相比。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本手稿描述了一种重组 IL4-10 融合蛋白的生产和表征方法, 以及检测其在持续炎症性疼痛小鼠模型中抑制炎症痛觉的有效性的方法。IL4-10 融合蛋白的生产和纯化是在小尺度上进行的。HEK293 细胞被选作蛋白质生产的表达系统, 因为它们能够在原核表达系统中无法实现转化后的修饰。翻译后的修改与蛋白质功能有关, 缺乏这种修饰可能会影响 IL4-10 融合蛋白的治疗效果。用亲和层析法从培养中清液中纯化蛋白质。我们选择使用内部制作的抗 IL4 单克隆抗体亲和纯化, 而不是产生一个 IL4-10 融合蛋白含有标签, 以允许纯化与亲和标记系统。其原因是避免了与标记相关的蛋白质折叠和功能变化的可能性。然而, 如果缺乏高度选择性的单克隆抗体, 需要开发带有标记的蛋白质,例如他的标记。在这种情况下, 重要的是要确定蛋白质的 C 或 N 终点是否最适合标签, 以避免影响蛋白质功能。
从 HEK293 上清液1升, 获得了约3毫克的纯化 IL4-10 融合蛋白, 但这可能是不同批次。用于亲和纯化的柱在丢弃前可用于几个纯化循环。纯化过程中最敏感的步骤是低 ph 值从柱上洗脱 IL4-10 融合蛋白, 因为低 ph 值可能导致不可逆转的蛋白质变性和蛋白质沉淀。因此, 维持原生蛋白结构和缺乏蛋白质聚集物对于质量好的批次是必不可少的。为此, 对融合蛋白生物活性的评价需要用不同的洗脱缓冲液进行纯化前后的体外检测。IL4-10 融合蛋白纯化后, 与非纯化蛋白相比, 其生物活性没有降低。此外, 当洗脱步骤与0.1 米甘氨酸缓冲液 (ph = 2.5) 进行分离时, 总成型不存在, 洗脱馏分的 pH 值立即中和1米三缓冲器 (ph = 9)。
以人体 IL10 ELISA 结果为基础, 估计纯化 IL4-10 融合蛋白的浓度。蛋白质检测用于确认蛋白质浓度。根据 IL10 ELISA 测定的负荷、流动、洗涤和洗脱分数的浓度, 对纯化后蛋白质的回收进行评价。只有在透析洗脱馏分中, 才能测定 IL4-10 融合蛋白的可评估蛋白浓度。非透析洗脱分数含有咪唑, 这是一种影响评估指标的化合物。非纯化分数包含 HEK293 培养基中的其他蛋白质。
对 IL4-10 融合蛋白的生物活性进行了全血测定。IL4-10 融合蛋白的生物活性应在几个捐献者的全血中进行评估, 以确定是否保留功能性活动。需要几个捐助者, 因为捐助者的差异存在于 IL10 和 IL4 抑制 LPS 诱导的 TNFα释放的能力。此外, IL4R 和 IL10R 的表达可能不同的捐赠者, 影响 IL4-10 融合蛋白的能力, 以抑制 LPS 诱导 TNFα生产。
在所描述的方法中, 我们详细介绍了2小鼠持续炎性疼痛模型, 以评估 IL4-10 融合蛋白在体内治疗疼痛的效果。然而, 为了充分评价重组融合蛋白的镇痛潜能, 分子也应在其他慢性疼痛模型中进行测试。这些模型包括, 但不限于, 神经损伤模型和化疗诱发的神经病理性疼痛9,22。尽管弗雷测试和哈格里夫斯测试通常用于测试镇痛药物, 但已经清楚的是, 应包括额外的测试 (例如动态负重测试), 以评估对非诱发疼痛的影响 behaviorsand 也与操作疼痛检测 (例如条件位置首选项 (CPP), 检测非诱发疼痛行为17,18)。要执行 CPP, 融合蛋白的止痛效果的开始应考虑到, 因为疼痛缓解的动物的调节需要快速的作用镇痛剂 (这在不到15分钟内施加作用)。然而, 如果测试化合物有一个缓慢的镇痛发作, 但可能导致持久的疼痛抑制 (超过4天), CPP 仍然可以用来测试是否该化合物抑制疼痛。在这种情况下, 需要对复合性镇痛剂的快速作用止痛药的损失进行评估。
鞘内注射被选择作为一种管理途径, 因为该化合物将达到疼痛相关领域, 如背根神经节和脊髓。值得注意的是, 鞘内分娩镇痛药物已成为常见的做法, 作为治疗慢性疼痛的病人, 因为这种方法减少剂量的镇痛药物所需的, 减少毒性和系统性副作用。然而, 这条行政路线有一定的局限性;它需要训练有素的人员, 由于蛛网膜下腔面积小, 注射量应限制在小鼠5µL, 需要高度浓缩的融合蛋白溶液。鞘内注射技术需要训练。此类训练可在未恢复麻醉动物注射染料的情况下进行, 以验证鞘内注射是否正确。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的一部分是由乌得勒支大学生命科学补助金资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
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