Summary
I dette papir give vi oplysninger om metoder til produktion og kontrol med kvaliteten af en IL4-10 rekombinant fusion protein. Vi viser også hvordan du kan teste effektiviteten af dette protein til at løse smerte i en musemodel af inflammatorisk smerte.
Abstract
Kroniske smerter er vanskelige at behandle og nye tilgange til at løse vedvarende smerter er tvingende nødvendigt. Anti-inflammatoriske cytokiner er lovende kandidater til behandling af invaliderende smerte betingelser på grund af deres evne til at regulere afvigende neuro-immune interaktioner. Men de arbejder fysiologisk i et netværk af forskellige cytokiner, og derfor deres terapeutiske virkning kan ikke være optimalt, når det bruges som stand-alone narkotika. For at overvinde denne begrænsning har udviklet vi en fusion protein af den anti-inflammatoriske cytokiner IL4 og IL10. Her, vi beskriver metoder til produktion og kvalitetskontrol af IL4-10 rekombinant fusion protein og vi teste effektiviteten af IL4-10 fusion protein til at løse smerte i en musemodel af vedvarende inflammatorisk smerte.
Introduction
Kroniske smerter er fortsat en af de mest invaliderende og under-behandlede medicinske problemer af 21, der påvirker > 20% af den voksne befolkning1,2. Dog, behandlinger til at give lindring fra kroniske smerter er ofte ineffektive eller skal afbrydes på grund af alvorlige bivirkninger3. Vigtigere, i øjeblikket tilgængelige lægemidler kun giver symptomlindring, men ikke i væsentlig grad ændre eller helbrede kroniske smerter. Selv om kroniske smerter synes at være en neurologisk lidelse, tyder inddragelse af immunsystemet i kroniske smerter udvikling4,5. Derudover immun-baserede tilgange til behandling af smerter er ved at opstå. For eksempel, hæmmer anti-inflammatoriske cytokiner smerte i flere modeller af kroniske smerter6,7,8. Dog, anti-inflammatoriske cytokiner har en kort halveringstid, mindske deres smerte-hæmmende virkninger. Desuden, anti-inflammatoriske cytokiner fungerer mest optimalt i koncert med hinanden. For at overvinde disse begrænsninger, smeltet vi for nylig anti-inflammatoriske cytokiner interleukin-4 (IL4) og interleukin-10 (IL10) ind i et molekyle. IL4-10 fusion protein viser overlegne effektivitet i at hæmme kroniske inflammatoriske og neuropatiske smerter i forhold til den enkelte cytokiner9. Vi beskrive her hvordan sådan fusion protein er produceret, renset, og hvordan dens kvalitet er kontrolleret.
IL4-10 fusion protein er produceret i humane celler af forbigående Transfektion af HEK293-F celler med en pUPE udtryk vektor transporterer cDNA sekvensen kodning IL4-10 fusion protein. HEK293-F celler er valgt at tillade posttranslationel modifikation af protein, noget, der ikke forekommer i bakteriel udtryk systemer. For at optimere glycan loft med sialic syre, cDNA kodning beta-galactoside-2, er 3-sialyl-transferase indarbejdet i vektoren som en anden transgenet. Fusion protein er renset ved hjælp af affinitet protein oprensning af supernatanten kultur, fordi det er mere kraftfuld end rensning af andre metoder f.eks. størrelse-udelukkelse eller ionbytning kromatografi10,11. For at rense IL4-10 fusion protein, brugte vi in-house lavet monoklonale antistoffer mod IL4. Vurdering af renhed og bioactivity af renset IL4-10 fusion protein er udført som en del af kvalitetskontrol. Renheden af fremstillede batcher er evalueret af Sodium Dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og høj pres størrelse udstødelse kromatografi (HP-sek). Bioactivity af IL4-10 fusion protein vurderes ved at måle dens evne til at hæmme LPS (LPS)-induceret tumor nekrose faktor-alfa (TNFα) produktionen i fuldblod kulturer, og sammenligne det til kombinationen af enkelt cytokiner.
Endelig, for at teste IL4-10 fusion proteiner evne til at hæmme kroniske smerter, beskriver vi, hvordan fusion protein kan testes som smertestillende i udbredte musemodeller af vedvarende inflammatorisk smerte12,13,14 . Her beskriver vi metoderne af en inflammatorisk smerte model. Det er dog vigtigt at bemærke, at andre smerte modeller kan være brugt (fxneuropatiske smerter modeller), afhængigt af forskningen spørgsmål der skal besvares. For at vurdere smerte i disse modeller, er det vigtigt at bruge en række adfærdsmæssige foranstaltninger, der omfatter fremkaldt og ikke-fremkaldte smerter. Her, beskrev vi metoderne til vurdering af ændringer i mekanisk og termisk evoked adfærdsmæssige reaktioner. Mekanisk følsomhed til uskadelige stimuli er vurderet ved hjælp af Von Frey test, mens termisk følsomhed vurderes ved hjælp af Hargreaves test. Vigtigere, er ikke-fremkaldte hyperalgesia/allodyni målt ved hjælp af dynamisk vægt leje test. Disse foranstaltninger er bredt accepteret som smerte foranstaltninger og give vigtige oplysninger om smertegrænser og potentielle smerter opleves af dyr15,16,17. Andre foranstaltninger for at vurdere ikke fremkaldte smerter (fx, stimulus uafhængige), såsom konditioneret sted præference test, kan være værdifulde18. For at vurdere potentialet af stoffet til at hæmme smerte, udførte vi Intratekal administration af fusion protein, som med denne administrationsvej mindre protein dosis er nødvendig for at nå smerte-relaterede områder og undgå systemiske (side-) effekt19, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med internationale retningslinjer og forudgående godkendelse fra den lokale eksperimentelle etiske udvalg. Fuldblod blev indhentet fra Mini Donor Service (Mini Donor Dienst, MDD) på University Medical Center Utrecht (UMCU) i Nederlandene. MDD har modtaget positiv godkendelse fra medicinsk etik Udvalget af UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) for protokol-nummer 07-125/C.
1. protein produktion og karakterisering
- Cellekultur
Bemærk: Se Tabel af materialer til dyrkningsmediet anvendes.- Optø HEK293-F celler ved 37 ° C, indtil der er en lille klump af is. Overføre de optøede celler straks 10 ml iskold medium (4 ° C) og centrifugeres cellesuspension ved stuetemperatur (RT) for 4 minutter (min.) på 500 x g.
- Fjern mediet og celle resuspenderes i 10 mL frisk medium på RT, efterfulgt af centrifugering ved 500 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 5 mL medium på RT. Tilføj cellesuspension direkte i en 125 mL målekolbe indeholdende 25 mL af pre varmede medium (37 ° C). Kultur celler ved 37 ° C, 8% CO2og 95% luftfugtighed på en orbitalryster roterende ved en hastighed på 125 rpm.
- Subkultur celler to gange om ugen. Bruge en automatiseret celle counter (Se Tabel af materialer) for at vurdere celle nummer og cellernes levedygtighed. Frø levedygtige celler i en koncentration på 3 x 105 celler/mL i Erlenmeyerkolben målekolber. Holde den samlede mængde af næringssubstratet på 1/5 af den samlede mængde af kultur Erlenmeyerkolben kolber til enhver tid for at holde beluftning optimal.
- Transfektion
Bemærk: Subkultur celler tre til fire gange før Transfektion og transfect dem når cellernes levedygtighed er > 90%. Cellernes levedygtighed er vurderet af en automatiseret (elektrisk felt multi channel) cellcounting system baseret på plasma membran integritet. Se Tabel af materialer til Transfektion reagens.- Centrifugeres celler på RT for 4 min. 500 x g; celle resuspenderes i 10 mL af pre varmede næringssubstratet (37 ° C) og fortyndet cellesuspension til ~1.0 x 106 celler/mL i en samlet maengde paa 1 L. alikvot cellesuspension i 10 delprøver på 100 mL i 500 mL Erlenmeyerkolbe kolber.
- Fortyndes 1 mg af plasmid DNA i 33 mL reduceret serum minimal afgørende medium (MEM, se Tabel af materialer) af blide blanding. I en separat rør, fortyndes 1.330 µL Transfektion reagens i MEM ved skånsom blanding. Inkuber begge løsninger på RT for 5 min. Tilføj og blandes DNA fortyndet i MEM til Transfektion reagens i MEM og inkuberes mix for 30 min på RT.
- Tilføj DNA-Transfektion reagens mix til cellerne (kulturperler i afsnit 1); tilføje 6,6 mL af blandingen til hver 500 mL Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 mL af celler i dyrkningsmediet. Opretholde cellerne i de tidligere nævnte dyrkningsbetingelserne. Høste cellekultur supernatant indeholdende udskilles IL4-10 fusion protein tre dage efter Transfektion.
- Bestemme koncentrationen af IL4-10 fusion protein i kultur supernatanten ved at udføre en IL10 ELISA efter producentens protokol (Se Tabel af materialer).
Bemærk: I optimal dyrkningsbetingelser, koncentrationen af fusion protein kan forventes at blive mellem 2,5 og 5 µg/mL.
- Protein oprensning af affinitet kromatografi
Bemærk: Affinitet kromatografi udføres ved stuetemperatur. Men alle fraktioner (kultur supernatanten, belastning, flow gennem og eluering brøker) holdes på is under proceduren.- Par 10 mg en in-House lavet monoklonalt antistof mod IL4 til 1 g af CNBr - aktiveret sepharose 4B, efter producentens protokol (Se Tabel af materialer). Hæld 2,5 mL af koblede sepharose perler langsomt i kromatografi glaskolonne (30 cm længde og 1,5 cm indvendig diameter, se Tabel af materialer).
- Blokere de resterende bindende lokaliteter af perlerne af passerer 50 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 1% bovint serumalbumin gennem kolonnen. Kolonnen udvaskes med 25 mL PBS (pH = 7.4) efterfulgt af 12,5 mL af 0,1 M Glycin buffer (pH = 2,5) og 25 mL PBS (pH = 7.4).
- Passere 100 mL 10-fold koncentreret HEK293 cellekultur supernatanten gennem kolonnen med en væskehastighed på 1 mL/min. vask kolonnen med 50 mL PBS.
- Elueres den bundne IL4-10 fusion protein med 12,5 mL af 0,1 M Glycin buffer (pH = 2,5) med en væskehastighed på 1 mL/min og indsamle brøkdele af 2,5 mL. Tilføje 350 µL 1 M Tris buffer (pH = 9) til hver fraktion at bringe pH på 7. Dialyze neutraliseret fraktioner natten mod 2 L af PBS (pH = 7.4).
- Brug dialyse slanger med 16 mm tør diameter og en 3.5 K molekylvægt cut-off. Sterilt filtrere dialyzed fraktioner ved hjælp af engangs filtre med 0,45 µM pore diameter. Gemme sterile IL4-10 fusion protein løsning i alikvoter ved-80 ° C.
- Evaluere renheden af elueret IL4-10 fusion protein af Coomassie farvede 12% SDS-PAGE gel og HP-SEC (3 µm sek-2000 kolonne). HP-SEC analyse, indlæse 40 µL af protein på ~ 1 mg/mL koncentration på kolonnen. Bruge 100 mM natrium fosfat Buffer med 150 mM natriumchlorid (pH = 6,8) som en mobil fase. Indstille strømningshastighed på 1 mL/min.
- Bestemmes koncentrationen af hver batch af renset IL4-10 fusion protein af IL10 ELISA og Bicinchoninic syre Protein Assay (BCA Protein Assay Kit, se Tabel af materialer) ifølge producentens protokoller.
- Bruge rekombinant humant IL10 til at oprette en standardkurve i ELISA assay. At korrigere for den størrelse forskellen mellem rekombinant IL10 (18 kDA) og IL4-10 fusion protein (34 kDa), multipliceres den opnåede koncentration med en faktor på 1,8.
- Bioactivity af IL4-10 fusion protein
Bemærk: Fuldblod analysen udføres for hvert parti af IL4-10 fusion protein produceret og aktiviteten af forskellige partier er forhold som en del af kvalitetskontrol. Fuldblod analysen udføres i frisk blod indsamlet dagen for analysen i heparin rør. Blodet blev indhentet fra raske frivillige i vores in-house donor service. Prøver skal håndteres som potentielt biologiske farer.- Forberede 3-fold seriel pre fortyndinger af det rensede IL4-10 fusion protein i RPMI medium (Se Tabel af materialer) over en koncentration spænder 5-1,215 ng/mL.
- Forberede før fortyndinger af LP'ER (100 ng/mL) og humant blod, der er fortyndet 4 gange i RPMI medium.
- Med pipette udtages før Fortyndingerne af IL4-10 fusion protein, LP'ER og humant blod ind i en 48-godt plade. Til hver brønd, tilsæt 50 µL IL4-10 fusion protein (slutkoncentration 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI medium, 25 µL LP'ER (slutkoncentration 10 ng/mL) og 100 µL humant blod (endelig fortyndet).
Bemærk: Samlede volumen pr. brønd er 250 µL. - Inkuber plade ved 37 ° C, 8% CO2og 95% luftfugtighed til 18 h.
- Evaluere TNFα koncentrationen i kultur analysere ved hjælp af en TNFα ELISA, efter producentens protokol.
- Beregne hæmning af det inflammatoriske respons ved IL4-10 fusion protein efter formlen: % hæmning = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
Bemærk: Her en = TNFα niveauer i LPS stimuleret kulturer behandlet med IL4-10 fusion protein, B = TNFα niveauer i unstimulated kultur og C = TNFα niveauer i LPS stimuleret kultur.
2. musemodel for vedvarende inflammatorisk smerte
Bemærk: Det er vigtigt at bruge både mandlige og kvindelige mus (C57Bl/6), fordi dette vil gøre det muligt for identifikation af sex-afhængige effekter. I almindelighed, er musene brugt mellem 8-16 uger gammel. Bestem antallet af dyr kræves ved skal magt beregninger udføres. Web-baserede værktøjer til at foretage sådanne beregninger er let fundet på internettet (f.eks., http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
Induktion af kronisk inflammatorisk smerte
Bemærk: Fremkalde persistente inflammatorisk smerte i voksen mus med intraplantar injektioner af carrageenan eller komplet Freud adjuvans (CFA). De forskellige test forstyrrer ikke hinanden.- Forberede carrageenan (2% w/v) ved at opløse λ-carrageenan (Se Tabel af materialer) i 0,9% NaCl ved at passere løsningen gennem en 23-gauge kanyle til at sikre, at carrageenan korrekt opløses. Forberede en frisk løsning direkte før injektionen udføres.
- Alternativt, hvis CFA bruges, bland CFA løsning ordentligt før injektion det intraplantarly, fordi CFA er en vand-i-olie emulsion indeholdende 1 mg af Mycobacterium tuberkulose (H37Ra) varme dræbt og tørret, 0.85 mL paraffinolie og 0,15 mL mannide monooleate (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Glas Hamilton sprøjter med metal udstikkere anbefales til injektion dette stof, fordi gummi stempler kan reagere med olien i adjuvans. -
Intraplantar injektion
- Opretholde sammensat (trin 2.1.1 eller 2.1.2) i sprøjten på RT for mindst 15 min før injektion til at give mulighed for justering af RT. indsprøjtes 20 µL af sammensat (eller vedtægtsændringerne som kontrol) subkutant i ikke-bedøvede musen ved hjælp af en 30-gauge bagben pote nål.
- Indsætte nålen i bunden af tommelfingeren lede til hælen og injicere sammensat når nålen er sat ca 0,5 cm. Efter injektion, langsomt trække nålen, mens lidt roterende sprøjte for at undgå udsivning af løsning ud af injektionsstedet.
3. smerter målinger
Bemærk: Sikre, at forskere udfører de adfærdsmæssige eksperimenter er blinde for musen behandling. Det er vigtigt at akklimatisere dyr til det testmiljø før du udfører nogen måling. Helst, ugen før start eksperimenter, dyr er placeret 1 - 2 gange i 15-30 min i hver af de forskellige enheder bruges til at udføre testene. Når du håndterer hanner og hunner i den samme eksperiment, evaluere hanner uafhængigt af hunner. Ren bure og overflader grundigt mellem de forskellige grupper for at undgå potentielle uønskede virkninger for opførsel af forskelligt køn. Måle baseline tilbagetrækning ventetid eller mekaniske tærskler to til tre gange til præcist bestemme baseline tærskler og fastslå, om disse er stabil før intraplantar injektion af enhver sammensatte.
-
Von Frey test: mekanisk følsomhed til uskadelige stimuli
- Placer dyrene individuelt i akryl bure på en wire mesh stå og lad mus til at akklimatisere i mindst 15 min. før målinger.
- Vurdere mekaniske følsomhed ved at måle pote tilbagetrækning tærskel som svar på en kalibreret række von Frey hår lige fra 0,02 til 4 g. overveje enhver bevægelse af paw fra anvendt hår som en positiv tilbagetrækning svar. Anvende filamenter vinkelret på pote overfladen med tilstrækkelig kraft til at forårsage svag bøjning mod huden og holde for ~ 3 s. gør sikker på, at håret ikke vride under ansøgning til pote.
- Beregne den 50% pote-tilbagetrækning tærskel ved hjælp af up-and-down metode15,21.
Bemærk: Den første glødetrådens gælde er 0,4 g (andre start filamenter kan anvendes tærskler disse mus vises på baseline). En mangel på svar på en glødetråd angiver, at næste tykkere glødetråden bruges i følgende stimulering, mens et positivt svar angiver brugen af næste tyndere glødetråden. Antallet af hår præsentationer bestemmes af den første differentieret svar; efter dette udføres 5 flere applikationer. Beregning af tærsklen på 50% efter metoderne beskrevet tidligere15,21.
-
Termisk følsomhed: Hargreaves test
- Placer dyr i bur på en pre varmede (30 ° C) glasplade og lad mus til at akklimatisere i mindst 15 min. før målinger, venter indtil dyrene sidde stille.
- Bestemme varme udbetalingstider ventetid ved opvarmning pote af dyrene af et fokuseret synlige lysstråle med en Hargreaves apparatur (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Intensiteten af strålen er indstillet til 12%, fordi med denne eksperimentelt bestemte intensitetsindstilling lysstrålen fremkalder en tilbagetrækning svar af en gennemsnitlig tid 8 s ved baseline på C57Bl/6 mus. En intensitetsindstilling bør fastsættes pr. enkelte maskine og mus stamme. Maksimal cut-off tidspunkter af 20 s eller mere er brugt til at undgå skade på dyrene. - Måle latency udbetalingstider ~ 4 gange pr. dyr. Gennemsnittet af alle svar målt. Måler hver pote uafhængigt, og med mindst 1 min. mellemrum mellem efterfølgende målinger i samme pote.
-
Postural underskud: dynamisk vægt bærende test
- Måle kropsvægt for hvert dyr før prøven, da vægtbærende analyse kræver kropsvægt af hvert enkelt dyr som inputparameter.
- Placer dyrene individuelt i en sal-instrumenteret dynamisk vægtbærende systemet samles på et dække støtte til et kamera, der vil registrere bevægelser med musen. Lad dyret akklimatisere i 0,5 til 1 min før optagelse i 5 min.
Bemærk: I denne test, kun én frit bevægelige dyr kan evalueres på et tidspunkt. - Justere indstillingerne for at udføre vægtbærende og analysere dataene.
Bemærk: I disse eksperimenter, bruger vi følgende parametre: (i) lav vægt tærsklen af 0,6 g: det er nødvendigt at aktivere en af cellerne i sensoren mindstevægt. (ii) høj vægt grænse på 1 g: tallet angiver vægten skulle fuldt aktivere én celle. (iii) overflade tærsklen på 2 celler: dette tal angiver antallet af celler ved siden af hinanden, skal være aktiveret for at tages i betragtning. (iv) mindste antal billeder er 5: det tager 0,1 s at fange hvert billede. Tallet angiver det minimale antal rammer hvor musen ikke bevæger sig. Som sådan er en værdi af 5 betyder, at musen kropsholdning skal være stabil i > 0,5 s for at opnå en måling, der er taget hensyn til analyse. - Udføre analyse af hver video ved afspilning af videoen, og sikre, at hver legemsdel genkendes korrekt af software på den tidsramme, der er angivet af softwaren.
Bemærk: Et minimum af 1 min af den registrerede tid skal valideres. Den dynamiske vægtbærende softwaren beregner og giver følgende parametre: (i) Vægten bæres af hver individuel pote i gram, og som en procentdel af hele kroppens vægt. (ii) Vægten bæres af den kombinerede front pote eller de kombinerede bagerste poter i gram og som en procentdel af hele kroppens vægt. (iii) forholdet mellem venstre/højre poter vægt bærende eller bag vægtbærende. (iv) overflade hver pote eller kombinerede bag poter, aktiveres tryk følsomme pad. (v) mean og standard afvigelse for hver parameter. (vi) varigheden af forskellige arbejdsstillinger (opdræt, 3 poter eller 4 poter) under hele forsøget. (vii) tid (s) hver pote bærer vægt under hele forsøget.
4. Intratekal injektion af IL4-10 fusion protein for analgesi
NOTE: Bekræfte, at ventilation til rummet er åbent at sikre ordentlig luft flow. For at teste effekten af IL4-10 fusion protein (1 µg/mus; 5 µL samlede Injektionsvolumen) bør det testes mod køretøjet injektioner og injektioner af kombinationen af den enkelte cytokiner (IL4 + IL10, 0,5 µg + 0,5 µg/mus, 5 µL samlede Injektionsvolumen).
- Bedøver mus med 3-4% isofluran med en ilt flow på 2 L/min i salen, induktion. Kontroller, at musen er korrekt bedøvede ved at klemme pote for at sikre, at dyret ikke er lydhør.
- Sted musen på tabellen med hovedet placeret i næsen kegle af apparatet og holde musen sedation med 1.5-2% isofluran med en ilt flow på 2 L/min, mens der udfører Intratekal injektion.
- Back-fyld de injicerbare forbindelser i en ren 25 µL glas Hamilton sprøjte tilsluttet en 27-gauge kanyle.
- Hold musen fast af rygsøjlen posterior til ribbenene og lidt løfte musen. Placer nålen lodret mellem lændehvirvlerne L5 og L6 og forsigtigt indsætte det gennem huden lige på midten af lændehvirvlerne. Placer nålen i den intervertebrale plads.
Bemærk: At finde den intervertebrale plads kan kræve nogle 'søgning' ved at flytte nålen langs den rostralt ventrale akse, let at trykke på nålen, før et tab af modstand af knoglevæv kan mærkes.- Bekræfte korrekte målretning ved at kontrollere, at en hale flick opstod. Indsprøjtes 5 µL af sammensat langsomt, vent et par sekunder, og derefter langsomt trække nålen. Hvis kun en enkelt pote svirp er observeret, sandsynligvis nålen ikke placeret korrekt.
- Efter injektion, skal du kontrollere musen tæt for de første 30 min efter genopretning fra anæstesi til at sikre, at fraværet af enhver motor værdiforringelse/lammelse.
Bemærk: Smerte adfærd kan være målte (som beskrevet i afsnit 3) 15 minutter efter helbredelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt billede af en SDS-PAGE gel indeholder forskellige fraktioner opnået under affinitet kromatografi rensningen er vist i figur 1A. I belastning (L) og flow gennem (FT) fraktioner, er alle proteiner i HEK293 supernatanten observeret. Ingen protein er observeret i vask (W)-fraktionen. Eluering (E) brøkdel observeres to bands af 35 og 37 kDa svarende til to forskellige glycoforms af IL4-10 fusion protein (pile). I figur 1B, et repræsentativt potens assay i en fuldblod er analyse af to forskellige IL4-10 fusion protein batcher vist. En dosisafhængig hæmning af LPS-induceret TNFα frigivelse er observeret, viser sammenlignelige bioactivity for de to IL4-10 fusion protein batchnumre.
Næste, vist et eksempel af testresultater af repræsentative eksperimenter, hvor IL4-10 fusion protein er testet til at hæmme vedvarende inflammatorisk smerte (figur 2). Vedvarende inflammatorisk smerte var foranlediget af intraplantar injektion af 2% carrageenan. Mekanisk (fig. 2A) såvel som termisk (figur 2B) hyperalgesia blev fulgt med tiden. På dag 6 efter induktion af inflammatorisk smerte, blev musene injiceret intrathecally med IL4-10 fusion protein eller køretøjet som en kontrol. IL4-10 betydeligt løst både mekanisk (fig. 2A) og termisk (figur 2B) hyperalgesia, og nåede sin maksimal effekt efter 24 timer efter injektion. Ideelt set bør effekten af fusion protein i smerte hæmning testes også mod equimolar koncentrationer af de enkelte cytokiner at teste, om dens evne til at hæmme smerte er bedre end summen af de individuelle cytokiner. Disse data vises ikke her, men vi henvise til en nylig publikation, der viser denne data9.
Effektiviteten af IL4-10 fusion protein blev for nylig testet i CFA-induceret inflammatorisk smerte model9. I dette eksperiment var flere injektioner af IL4-10 fusion protein administrerede intrathecally. De flere injektioner løst helt CFA-induceret vedvarende inflammatoriske hyperalgesia, målt ved hjælp af von Frey og Hargreaves tests, demonstrerer potentialet i IL4-10 fusion protein som en smertestillende behandling9. Her viser vi, at intraplantar CFA injektion også inducerede en reduktion i vægtbærende på den berørte pote (fig. 3A-B). Intratekal injektion af IL4-10 fusion protein på dag 7 efter intraplantar CFA injektion svækket vægtbærende nedsættelse af berørte pote i forhold til køretøjets-indsprøjtning mus 2 dage efter IL4-10 fusion protein administration (figur 3B ).
Figur 1 : Oprensning og karakterisering af IL4-10 fusion protein. (A) Coomassie farvede SDS-PAGE analyse af affinitet kromatografi fraktioner: L: belastning, FT: flow gennem, W: vask, E: eluering. (B) funktionel analyse: IL4-10 fusion protein dosis-afhængigt hæmmer TNFα produktion i LPS stimuleret fuldblod kultur (udtrykt som procentvise hæmning i forhold til kulturer stimuleret med LP'ER alene). Data repræsenteres som gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Hæmning af inflammatorisk hyperalgesia af IL4-10 fusion protein. Inflammatorisk smerte er fremkaldt ved en intraplantar indsprøjtning af 20 µL af 2% carrageenan (bil). Seks dage efter intraplantar injektion mus modtaget en Intratekal injektion (pil) 1 µg IL4-10 fusion protein eller køretøj (PBS). (A) mekanisk overfølsomhed (Log 50% tærskelværdi (g)) blev målt over tid ved hjælp af Von Frey test og (B) termisk følsomhed (latency (s)) blev målt ved hjælp af Hargreaves test. Data repræsenteres som gennemsnit ± SEM. stjerner repræsenterer betydelige forskelle analyseret af to-vejs ANOVA, mellem køretøj og IL4-10 injiceres dyr. **, *** = p < 0,01 og p < 0,001, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Betændelse-inducerede ændringer i vægtbærende. Inflammatorisk smerte er fremkaldt ved en intraplantar indsprøjtning af 20 µL af komplet Freud adjuvans (CFA). Vægtbærende på hver pote blev målt ved hjælp af dynamiske vægt bærende enhed. Vægtbærende i gram af den berørte pote (ipsilaterale bagben pote) og den samlede vægtbærende af ikke-berørt poterne (front poter og kontralaterale pote) vises, og forholdet mellem vægtbærende af ipsilaterale pote i forhold til de andre 3 poter. (A) kurset af vægtbærende under CFA-induceret inflammation (n = 10). (B) på dag 7 efter intraplantar CFA, mus modtaget en Intratekal injektion af 1 µg IL4-10 fusion protein eller køretøj (PBS). Vægtbærende blev målt til 0 og 7 dage efter intraplantar CFA og 2 dage efter administration af IL4-10 fusion protein. Vægtbærende af ipsilaterale pote i forhold til de andre 3 poter er repræsenteret (n = 3-4). Data repræsenteres som gennemsnit ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0,05 i forhold til baseline (dag 0). # = p < 0,05 i forhold til køretøjets behandlet dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver metoder til produktion og karakterisering af en rekombinant IL4-10 fusion protein, og metoder til at teste dens effektivitet i at hæmme inflammatorisk hyperalgesia i musemodeller af vedvarende inflammatorisk smerte. Produktion og oprensning af IL4-10 fusion protein er udført på en lille skala. HEK293 celler er valgt som et udtryk for protein produktion, fordi de aktiverer posttranslationelle modifikationer, der ikke kan opnås i prokaryote udtryk systemer. Posttranslationelle modifikationer er relevante for protein funktion, og fraværet af sådanne ændringer potentielt kan påvirke den terapeutiske effekt af IL4-10 fusion protein. Proteinet er renset fra kultur supernatanten ved affinitet kromatografi. Vi har valgt at bruge in-house lavet monoklonalt antistof mod IL4 for affinitet renseanlæg og ikke til at producere en IL4-10 fusion protein der indeholder en kode til at tillade rensning med en affinitet tag system. Grunden til dette var at undgå muligheden for tag-relaterede ændringer i proteinfoldning og funktion. Ikke desto mindre, hvis en yderst selektiv monoklonalt antistof mangler, et protein med et tag skal udvikles, fx en hans tag. I så fald vil det være vigtigt at afgøre, om C - eller N-terminalen af proteinet er bedst egnet til tag at undgå at påvirke protein funktion.
Fra 1 L af HEK293 supernatanten, ca. 3 mg renset IL4-10 fusion protein er fremstillet, men dette kan variere fra batch til batch. Kolonnen for affinitet rensning kan bruges til flere rensning cyklusser før udsmid. Den mest følsomme trin i proceduren rensning er eluering af IL4-10 fusion protein fra kolonnen ved lav pH, fordi den lave pH kan fremkalde uoprettelige protein denaturering og protein nedbør. Vedligeholdelse af nativt protein struktur og manglen på protein aggregater er således afgørende for god kvalitet partier. Med henblik herpå skal evaluering af bioactivity fusion protein være testet in vitro- før og efter rensning med forskellige eluering buffere. Efter rensning af IL4-10 fusion protein, blev bioactivity ikke reduceret i forhold til ikke-renset protein. Desuden samlede dannelse var fraværende Hvornår eluering skridt blev udført med 0,1 M Glycin buffer (pH = 2,5), og pH i eluering fraktioner var umiddelbart neutraliseret med 1 M Tris buffer (pH = 9).
Koncentrationen af renset IL4-10 fusion protein er anslået på grundlag af menneskelige IL10 ELISA resultater. BCA protein analysen bruges til at bekræfte protein koncentrationer. Inddrivelse af protein efter rensning er evalueret baseret på koncentrationer målt i belastning, flow gennem, vask og eluering fraktioner af IL10 ELISA. BCA protein koncentration bestemmelse af IL4-10 fusion protein kan vurderes kun i dialysebehandling eluering fraktioner. Non-dialysebehandling eluering fraktioner indeholder imidazol, et stof, der påvirker BCA måling. Non-renset fraktioner indeholder andre proteiner fra næringssubstratet HEK293.
Bestemmelse af bioactivity af IL4-10 fusion protein er udført i en fuldblod assay. Bioactivity af IL4-10 fusion protein bør evalueres i fuldblod fra flere donorer til at bestemme, om funktionel aktivitet bevares. Flere donorer er påkrævet, fordi donor til donor afvigelse findes i IL10 og IL4 evne til at hæmme LPS-induceret TNFα frigivelse. Desuden kan udtryk for IL4R og IL10R variere mellem donorer, der påvirker IL4-10 fusion protein evne til at hæmme LPS-induceret TNFα produktion.
I de beskrevne metoder detaljerede vi 2 musemodeller af vedvarende inflammatorisk smerte til at vurdere effekten af IL4-10 fusion protein til at løse pain in vivo. Ikke desto mindre for fuld evaluering af smertestillende potentialet af rekombinant fusion proteiner, skal molekyler testes i andre modeller af kroniske smerter samt. Disse modeller omfatter, men er ikke begrænset til modeller af nerveskade og kemoterapi-induceret neuropatiske smerter9,22. Selvom von Frey test og Hargreaves test er almindeligt anvendt til at teste smertestillende lægemidler, er det blevet klart, at en yderligere test (f.eks. dynamisk vægt bærende test) bør medtages for at vurdere virkningerne på ikke-fremkaldte smerter behaviorsand også med operant smerte assay (f.eks. aircondition sted præference (CPP) at registrere ikke-fremkaldte smerter adfærd17,18). For at udføre CPP, udbrud af smerte-hæmmende effekter af fusion protein, bør tages i betragtning, fordi konditionering af dyr af smertelindring kræver hurtig virkende analgetika (som udøver virkninger på mindre end 15 min). Ikke desto mindre, hvis testen sammensatte har en langsom smertestillende indsættende, men forventes at fremkalde langvarige smerter hæmning (mere end 4 dage), CPP kan stadig bruges til at teste, om sammensat hæmmede smerte. I dette tilfælde, skal stof-induceret tab af conditioning med hurtigt virkende analgetika vurderes.
Intratekal injektioner er valgt som en administrationsvej, som sammensat vil nå smerte relevante områder som dorsalrodsganglier og rygmarv. Navnlig, Intratekal levering af smertestillende lægemidler blevet almindelig praksis som en behandling af patienter med kroniske smerter, som denne fremgangsmåde reducerer dosis af smertestillende lægemiddel behov og mindsker toksicitet og systemiske bivirkninger. Ikke desto mindre, denne administration rute har nogle begrænsninger; Det kræver veluddannet personale, og på grund af den lille subarachnoidale rum, mængden af injektion bør begrænses til 5 µL i mus, der kræver meget koncentrerede opløsninger af fusion protein. Intratekal injektioner teknik kræver træning. Denne uddannelse kan udføres på ikke at inddrive bedøvede dyr med injektion af et farvestof at bekræfte korrekte Intratekal injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
En del af dette arbejde har været finansieret af et Utrecht Universitet Det Biovidenskabelige yde
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
