Summary
In deze paper we nadere bijzonderheden te geven voor de wijze van productie en kwaliteitscontrole van een IL4-10 recombinante fusieproteïne. Ook laten we zien hoe te testen van de effectiviteit van dit eiwit op te lossen in een muismodel van inflammatoire pijn pijn.
Abstract
Chronische pijn is moeilijk te behandelen en nieuwe benaderingen voor het oplossen van aanhoudende pijn zijn dringend noodzakelijk. Anti-inflammatoire cytokines zijn veelbelovende kandidaten voor de behandeling van invaliderende pijn omstandigheden als gevolg van hun capaciteit voor het regelen van afwijkende neuro-immuun-interacties. Echter fysiologisch ze werken in een netwerk van verschillende cytokines en hun therapeutisch effect kan niet dus optimaal wanneer gebruikt als zelfstandige drugs. Om deze beperking ondervangen, ontwikkelden we een fusieproteïne van de anti-inflammatoire cytokinen, IL4 en IL10. Hier beschrijven we de methoden voor productie en kwaliteitscontrole van IL4-10 recombinante fusieproteïne en testen we de doeltreffendheid van de IL4-10 fusieproteïne te lossen pijn in een muismodel van aanhoudende inflammatoire pijn.
Introduction
Chronische pijn blijft een van de meest slopende en onder behandelde medische problemen van de 21e eeuw, beïnvloeden > 20% van de volwassen bevolking1,2. Echter behandelingen te verstrekken verlichting van chronische pijn zijn vaak ineffectief of moeten worden stopgezet vanwege ernstige bijwerkingen3. Nog belangrijker is, momenteel beschikbaar drugs alleen symptomatische verlichting, maar niet aanzienlijk wijzigen of genezen van chronische pijn. Hoewel chronische pijn lijkt te zijn van een neurologische stoornis, blijkt betrokkenheid van het immuunsysteem in chronische pijn ontwikkeling4,5. Bovendien ontstaan er immuun-gebaseerde benaderingen voor de behandeling van pijn. Anti-inflammatoire cytokinen remmen bijvoorbeeld pijn in verschillende modellen van chronische pijn6,7,8. Anti-inflammatoire cytokines hebben echter een korte halveringstijd, verminderen van hun potentiële pijn-remmende effecten. Bovendien werken anti-inflammatoire cytokines meest optimaal in concert met elkaar. Deze beperkingen wilt opheffen, gesmolten we onlangs de anti-inflammatoire cytokines Interleukine-4 (IL4) en interleukine-10 (IL10) in een molecuul. De IL4-10-fusieproteïne toont superieure werkzaamheid in het remmen van chronische inflammatoire en neuropathische pijn ten opzichte van de individuele cytokines9. Hier beschrijven we hoe dergelijke fusieproteïne wordt geproduceerd, gezuiverd, en hoe de kwaliteit wordt gecontroleerd.
IL4-10 fusieproteïne is geproduceerd in menselijke cellen door voorbijgaande transfectie van HEK293-F cellen met een pUPE meningsuiting vector die de volgorde van de cDNA codering van de IL4-10-fusieproteïne. HEK293-F cellen worden gekozen dat voor de posttranslationele wijziging van het eiwit, iets dat niet in bacteriële expressiesystemen gebeurt. Voor het optimaliseren van glycan aftopping met sialic zuur, cDNA codering van bèta-galactoside-2, wordt 3-sialyl-transferase opgenomen in de vector als een tweede transgenic. De fusieproteïne wordt gezuiverd gebruik eiwitreiniging affiniteit van het supernatant cultuur aangezien het is krachtiger dan zuivering door andere methoden zoals grootte-uitsluiting of ionenwisseling chromatografie10,11. We gebruikten om te zuiveren van de IL4-10-fusieproteïne, in-house gemaakte monoklonale antistoffen tegen IL4. Evaluatie van de zuiverheid en topicale van gezuiverde IL4-10 fusieproteïne wordt uitgevoerd als onderdeel van de kwaliteitscontrole. De zuiverheid van de geproduceerde partijen wordt geëvalueerd door elektroforese natrium Dodecyl Sulfaat polyacrylamidegel (SDS-PAGE) en hoge druk-Size-Exclusion Chromatography (HP-SEC). De topicale van de IL4-10-fusieproteïne wordt geëvalueerd door het meten van haar vermogen om te remmen lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde Tumornecrosefactor-alfa (TNFα) productie in volbloed culturen, en vergelijken de combinatie van het individu cytokines.
Tot slot, om te testen van de capaciteit van IL4-10 fusion eiwitten voor de remming van chronische pijn, beschrijven we hoe de fusieproteïne kan worden getest als pijnstiller in gebruikte Muismodellen van aanhoudende inflammatoire pijn12,13,14 . Hier beschrijven we de methoden van een inflammatoire pijn-model. Het is echter belangrijk op te merken dat andere pijn modellen kan worden gebruikt (bijvoorbeeldneuropatische pijn modellen), afhankelijk van het onderzoek vragen die moeten worden beantwoord. Om te beoordelen pijn in deze modellen, is het belangrijk om allerlei gedrags waarin opgeroepen en niet-opgeroepen pijn maatregelen gebruiken. We beschreven hier, de methoden voor de beoordeling van wijzigingen in mechanisch en thermisch evoked gedrags reacties. Mechanische gevoeligheid op onschadelijke stimuli wordt beoordeeld met behulp van detest Von Frey, terwijl de thermische gevoeligheid wordt beoordeeld met behulp van de test Hargreaves. Nog belangrijker is, is niet-opgeroepen hyperalgesia/allodynia gemeten met behulp van de Dynamic gewicht Bearing test. Deze maatregelen zijn algemeen aanvaard als pijn maatregelen en opbrengst van belangrijke informatie over pijn drempels en potentiële pijn ervaren door de dieren15,16,17. Andere kan maatregelen voor de beoordeling van de niet-opgeroepen pijn (b.v., stimulans onafhankelijke), zoals de geconditioneerde plaats voorkeur test, waardevolle18. Om te beoordelen van het potentieel van de drug voor de remming van de pijn, we intrathecale toediening van de fusieproteïne, uitgevoerd als met deze wijze van toediening minder eiwit dosis nodig is om de pijn-gerelateerde gebieden bereiken en vermijden van systemische (kant-) effecten19, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens internationale richtlijnen en de voorafgaande goedkeuring van de lokale experimentele ethische commissie. Volbloed is verkregen uit de Mini Donor Service (Mini Donor Dienst, MDD) op de Universiteit medisch centrum Utrecht (UMCU) in Nederland. De MDD heeft positieve goedkeuring gekregen van de medische Commissie van de ethiek van het UMCU (Medisch Ethical Toetscommissie) voor het protocol nummer 07-125/C.
1. de eiwitproductie en karakterisering
- Celcultuur
Opmerking: Zie de Tabel van materialen voor kweekmedium gebruikt.- Ontdooi de cellen van de HEK293-F bij 37 ° C tot er een klein groepje van ijs. De ontdooide cellen onmiddellijk overbrengen in 10 mL ijskoud voedingsbodem (4 ° C) en de celsuspensie bij kamertemperatuur (RT) gedurende 4 minuten (min) bij 500 x g centrifugeren.
- Verwijder het medium en resuspendeer de pellet cel in 10 mL verse medium bij RT, gevolgd door centrifugatie bij 500 x g gedurende 4 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL medium bij RT. toevoegen de celsuspensie rechtstreeks in een maatkolf van de 125 mL met 25 mL van voorverwarmde medium (37 ° C). Cultuur van de cellen bij luchtvochtigheid van 95% op een roteerschudapparaat draaien met een snelheid van 125 rpm, 37 ° C en 8% CO2.
- Subcultuur de cellen tweemaal per week. Gebruik een geautomatiseerde cel counter (Zie Tabel van materialen) om te beoordelen celaantal en levensvatbaarheid van de cellen. Zaad levensvatbare cellen bij een concentratie van 3 x 105 cellen/mL in conische kolven. Het totale volume van het kweekmedium op 1/5 van de totale hoeveelheid cultuur conische kolven te allen tijde te houden beluchting optimaal te houden.
- Transfectie
Opmerking: Subcultuur de cellen drie tot vier keer vóór transfectie en transfect hen toen de levensvatbaarheid van de cellen is > 90%. Levensvatbaarheid van de cellen wordt beoordeeld door een automatische (elektrisch veld meerkanaals) cellcounting systeem op basis van de integriteit van het plasma membraan. Zie de Tabel van materialen voor de transfectiereagens.- Centrifugeer de cellen bij RT gedurende 4 minuten bij 500 x g; resuspendeer de pellet cel in 10 mL voorverwarmde kweekmedium (37 ° C) en Verdun de celsuspensie tot ~1.0 x 106 cellen/mL in een totaal volume van 1 L. Aliquot de celsuspensie in 10 porties van 100 mL in conische kolven van 500 mL.
- Verdunnen 1 mg plasmide DNA in 33 mL verminderd-serum minimaal essentiële medium (MEM, Zie Tabel van materialen) door het zacht mengen. Verdun in een aparte buis, 1330 µL van transfectiereagens in MEM door zacht mengen. Incubeer beide oplossingen op RT voor 5 min. toevoegen en mengen van het DNA in MEM verdund tot de transfectiereagens in MEM en Incubeer de mix voor 30 min op RT.
- De DNA-transfectie reagens mix toevoegen aan de cellen (gekweekt in sectie 1); 6,6 mL van het mengsel aan elke 500 mL erlenmeyer van 100 mL van cellen in een kweekvloeistof met toevoegen. Het handhaven van de cellen in de eerder genoemde cultuuromstandigheden. Oogst het supernatant van cultuur met secreted IL4-10 fusieproteïne drie dagen na de transfectie.
- Bepaal de concentratie van de IL4-10 fusieproteïne in het supernatant cultuur door het uitvoeren van een ELISA IL10 volgens protocol van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: In optimale kweekomstandigheden, de concentratie van het fusie-eiwit kan worden naar verwachting tussen 2,5 en 5 µg/mL.
- Eiwitreiniging door chromatografie van de affiniteit
Opmerking: De chromatografie van de affiniteit wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur. Echter zijn alle breuken (cultuur supernatant, lading en stroom door elutie breuken) gehouden op het ijs tijdens de procedure.- Paar 10 mg voor een in-huis-en-klare monoklonaal antilichaam tegen IL4 à 1 g van CNBr - geactiveerd sepharose 4B, volgens de fabrikant protocol (Zie Tabel van materialen). Giet 2,5 mL gekoppelde sepharose kralen langzaam in de chromatografie van glazen kolom (lengte van 30 cm en inwendige diameter van 1.5 cm, Zie Tabel van materialen).
- Blokkeren de resterende bindend sites van de kralen door het passeren van 50 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% bovien serumalbumine door de kolom. Was de kolom met 25 mL PBS (pH = 7.4) gevolgd door 12,5 mL 0,1 M Glycine buffer (pH = 2.5) en 25 mL PBS (pH = 7.4).
- Pas 100 mL 10-fold geconcentreerde HEK293 celkweek bezinken door de kolom op een debiet van 1 mL/min. Wash de kolom met 50 mL PBS.
- Elueer de afhankelijke IL4-10 fusieproteïne met 12,5 mL 0,1 M Glycine buffer (pH = 2.5) op een debiet van 1 mL/min en verzamelen breuken van 2.5 mL. Voeg 350 µL van 1 M Tris buffer (pH = 9) naar elke breuk te brengen van de pH tot en met 7. Dialyze geneutraliseerde breuken 's nachts tegen 2 L van PBS (pH = 7.4).
- Dialyse buis met droge diameter van 16 mm en een 3, 5 K molecuulgewicht cut-off gebruiken. Steriel filter de dialyzed fracties met behulp van beschikbare filters met een diameter van de porie 0,45 µM. Steriele IL4-10 fusion eiwit oplossing opslaan in aliquots bij-80 ° C.
- Evalueren van de zuiverheid van IL4-10 fusieproteïne geëlueerd door Coomassie gebeitste 12% SDS-pagina gel en HP-SEC (kolom 3 µm SEC-2000). Voor de analyse van de HP-SEC, laden 40 µL van eiwit in de concentratie van ~ 1 mg/mL op de kolom. 100 mM natriumfosfaat Buffer gebruiken met 150 mM natriumchloride (pH 6.8 =) als een mobiele fase. Het debiet vastgesteldop 1 mL/min.
- Bepaal de concentratie van elke batch van het gezuiverde IL4-10 fusieproteïne door IL10 ELISA en Bicinchoninic zuur eiwit Assay (BCA eiwit Assay Kit, Zie Tabel van materialen) volgens de protocollen van de fabrikant.
- Recombinante menselijke IL10 gebruik te maken van een standaard curve in de ELISA-test. Om te corrigeren voor de grootte verschil tussen recombinant IL10 (18 kDA) en IL4-10 fusieproteïne (34 kDa), vermenigvuldig de verkregen concentratie met een factor 1.8.
- Topicale van IL4-10 fusieproteïne
Opmerking: De volbloed-test wordt uitgevoerd voor elke batch van het IL4-10 fusieproteïne geproduceerd en de activiteiten van verschillende batches instellen als een deel van de kwaliteitscontrole wordt vergeleken. De volbloed-test wordt uitgevoerd in vers bloed verzamelde de dag van de bepaling in heparine buizen. Bloed is verkregen uit gezonde vrijwilligers in onze in-house donor-service. Monsters moeten worden behandeld als potentieel biologische gevaren.- Maak 3-voudig seriële pre verdunningen van het gezuiverde IL4-10 fusieproteïne in RPMI medium (Zie Tabel van materialen) over een concentratie bereik 5-1,215 ng/mL.
- Maak vooraf verdunningen van LPS (100 ng/mL) en menselijk bloed dat 4 keer in RPMI medium wordt verdund.
- Pipetteer de pre verdunningen van het IL4-10 fusieproteïne, LPS en menselijk bloed in een 48-well-plaat. Voeg aan elk putje, 50 µL IL4-10 fusieproteïne (eindconcentratie 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI medium 25 µL LPS (eindconcentratie 10 ng/mL) en 100 µL bloed (final verdund).
Opmerking: Totale volume per putje is 250 µL. - Incubeer de plaat op 95% vochtigheid voor 18u, 37 ° C en 8% CO2.
- Het evalueren van de concentratie van TNFα in supernatant van cultuur met behulp van een TNFα ELISA, volgens protocol van de fabrikant.
- Berekenen van de remming van de ontstekingsreactie door IL4-10 fusieproteïne volgens de formule: % remming (1-(A-B)/(C-B)) x 100 =
Nota: Hier A = TNFα niveaus in LPS gestimuleerd culturen behandeld met IL4-10 fusieproteïne, B = TNFα niveaus in ongestimuleerde cultuur, en C = TNFα niveaus in LPS gestimuleerd cultuur.
2. muismodel voor aanhoudende inflammatoire pijn
Opmerking: Het is belangrijk dat zowel vrouwelijke als mannelijke muizen (C57Bl/6) gebruiken omdat hierdoor de identificatie van sekse-afhankelijke effecten. In het algemeen, de muizen gebruikt worden tussen 8-16 weken oud. Om te bepalen van het aantal dieren vereist, moeten de macht berekeningen worden uitgevoerd. Web-gebaseerde tools voor het uitvoeren van dergelijke berekeningen zijn gemakkelijk te vinden op het internet (bijvoorbeeld, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
Inductie van chronische inflammatoire pijn
Opmerking: Induceren aanhoudende inflammatoire pijn in volwassen muizen met intraplantar injecties van carrageen of Complete Freuds adjuvans (CFA). De verschillende testen interfereert niet met elkaar.- Carrageen (2% w/v) voor te bereiden door het oplossen van λ-carrageen (Zie Tabel van materialen) in 0.9% NaCl door de oplossing door een 23-meter naald om ervoor te zorgen dat de carrageen goed is opgelost. Bereid een verse oplossing direct voordat de injectie wordt uitgevoerd.
- Als alternatief, als CFA wordt gebruikt, meng de CFA-oplossing goed vóór het injecteren van het intraplantarly, omdat de CFA is een water-in-olie emulsie met 1 mg van Mycobacterium tuberculose (H37Ra) warmte gedood en gedroogd, 0,85 mL paraffineolie en 0,15 mL mannide Propyleenglycolmonooleaat (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Glas Hamilton spuiten met metalen plunjers worden aanbevolen voor het injecteren van deze compound omdat rubber plunjers met de olie in de adjuvans reageren kunnen. -
Intraplantar injectie
- De compound (stappen 2.1.1 of 2.1.2) in de spuit op RT gedurende ten minste 15 minuten vóór injectie om aanpassing aan RT. injecteren 20 µL van de verbinding (of dissolvent als een besturingselement) subcutaan te handhaven in de achterste poot van de niet-verdoofd muis met behulp van een 30-meter naald.
- Plaats de naald aan de voet van de duim leiden naar de hiel en Injecteer het samengestelde wanneer de naald wordt ingevoegd ongeveer 0.5 cm. Na injectie, intrekken langzaam de naald terwijl iets draaien de spuit om te voorkomen lekkage van oplossing uit de injectieplaats.
3. pijn metingen
Opmerking: Zorg ervoor dat onderzoekers de gedrags experimenten uitvoeren blind voor de behandeling van de muis zijn. Het is belangrijk om de dieren naar de testomgeving acclimatiseren voordat u de meting uitvoert. Bij voorkeur, de week voordat de experimenten, de dieren zijn geplaatst 1 - 2 keer voor 15-30 min in elk van de verschillende apparaten die worden gebruikt voor het uitvoeren van de tests. Bij de behandeling van mannen en vrouwen in hetzelfde experiment, evalueren mannetjes onafhankelijk van de vrouwtjes. Schone kooien en oppervlakken uitgebreid tussen de verschillende groepen om te voorkomen dat potentiële ongewenste effecten op het gedrag van de verschillende geslachten. Meten basislijn terugtrekking latenties of mechanische drempels twee tot drie keer te nauwkeurig bepalen van de basislijn drempels en of dit stabiele vóór intraplantar injectie van een verbinding zijn.
-
Von Frey test: mechanische gevoeligheid op onschadelijke stimuli
- Plaats van de dieren individueel in acryl kooien op een wire mesh staan en laat de muizen te acclimatiseren gedurende ten minste 15 minuten vóór de metingen.
- Beoordelen van mechanische gevoeligheid door het meten van de poot terugtrekking drempel in reactie op een geijkte reeks von Frey haren variërend van 0.02 tot 4 g. overwegen elke beweging van de poot uit de buurt van toegepaste haar als een terugtrekking van de positieve reactie. Toepassing van de gloeidraden loodrecht op het oppervlak van de poot met voldoende kracht te veroorzaken lichte buiging tegen de huid en houd gedurende ~ 3 s. maken zeker het haar niet tijdens de toepassing aan de poot verdraaien doet.
- Berekening van de drempel voor het poot-intrekking van 50% met behulp van de methode en neergaande15,21.
Opmerking: De eerste gloeidraad toe te passen is 0,4 g (andere startende filamenten kunnen afhankelijk van de drempels die deze muizen op basislijn weergeven worden gebruikt). Een gebrek aan respons op een gloeidraad geeft aan dat de volgende dikker gloeidraad wordt gebruikt in de volgende stimulatie, terwijl een positief antwoord geeft aan het gebruik van de volgende dunner gloeidraad. Het aantal van haar presentaties wordt bepaald door de eerste differentiële reactie; na dat, worden 5 meer toepassingen uitgevoerd. Berekening van dat de drempel van 50% volgens de methodes beschreven eerder15,21.
-
Thermische gevoeligheid: Hargreaves test
- Plaats van de dieren in kooien op een glasplaat voorverwarmde (30 ° C) en laat de muizen te acclimatiseren gedurende ten minste 15 minuten vóór metingen, te wachten totdat de dieren stil zitten.
- Bepalen terugtrekkingstijden latency warmte door verwarming van de poot van de dieren door een gerichte zichtbaar lichtbundel met behulp van een apparaat van de Hargreaves (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: De intensiteit van een bundel is ingesteld op 12%, omdat met deze instelling experimenteel bepaalde intensiteit de lichtbundel een reactie van de intrekking van een gemiddelde tijd van 8 roept s bij basislijn op C57Bl/6 muizen. De instelling van de intensiteit moet worden bepaald per afzonderlijke machine en muis stam. Maximale cut-off tijden van 20 s of meer worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren verwondingen oplopen. - Het meten van de wachttijden voor de latency ~ 4 keer per dier. Het gemiddelde van alle reacties gemeten. Meten van elke poot onafhankelijk, en met ten minste 1 min. intervallen tussen opeenvolgende metingen in dezelfde paw.
-
Posturale tekorten: dynamische gewicht dragende test
- Meet het lichaamsgewicht van elk dier vóór de proef, omdat het gewicht dragen van analyse vereist het lichaamsgewicht van ieder dier afzonderlijk als invoerparameter.
- Plaats de dieren individueel in een vloer-geïnstrumenteerd dynamisch gewicht dragende systeem gemonteerd op een cover ter ondersteuning van een camera die bewegingen van de muis registreert. Laat het dier acclimatiseren voor 0,5 tot 1 min voordat u gaat opnemen voor 5 min.
Opmerking: In deze test, slechts één vrij bewegend dier kan worden geëvalueerd op een moment. - Instellingen aanpassen zodat de gewicht-dragende uitvoeren en analyseren van gegevens.
Opmerking: In deze experimenten, gebruiken we de volgende parameters: (i) laag gewicht drempel van 0,6 g: dit is het minimum gewicht moet een van de cellen van de sensor te activeren. (ii) hoge gewicht drempel van 1 g: die dit cijfer geeft het gewicht moest volledig activeren één cel. (iii) oppervlakte drempel van 2 cellen: dit getal geeft het aantal cellen naast elkaar worden geactiveerd moeten om rekening worden gehouden. (iv) minimum aantal beelden is 5: duurt 0.1 s elke opname. Het getal geeft het minimale aantal frames waarin de muis niet wordt verplaatst. Als zodanig, een waarde van 5 betekent dat de muis houding moet stabiel voor > 0,5 s tot het verkrijgen van een meting die wordt rekening gehouden met voor analyse. - Uitvoeren van de analyse van elke video door het herhalen van de video, en ervoor te zorgen dat elke ledemaat correct wordt herkend door de software bij de tijd-frame aangegeven door de software.
Opmerking: Minimaal 1 min van de opgenomen tijd dient te worden gevalideerd. Het dynamische gewicht dragen van software berekent en levert de volgende parameters: (i) het gewicht gedragen door elke afzonderlijke poot in gram, en als een percentage van het gewicht van het hele lichaam. (ii) het gewicht gedragen door de gecombineerde front poot of de gecombineerde achterste poten in gram en als een percentage van het gewicht van het hele lichaam. (iii) de verhouding tussen de links/rechts poten gewicht dragende of voor/achter gewicht lager. (iv) de oppervlakte van elke poot of gecombineerde voor/achter poten die de druk gevoelige pad geactiveerd. (v) gemiddelde en standaard afwijking voor elke parameter. (vi) de duur van verschillende houdingen (kweek, 3 poten, of 4 poten) tijdens het hele experiment. (vii) tijd (s) elke poot draagt gewicht tijdens het hele experiment.
4. intrathecale injectie van IL4-10 fusieproteïne voor analgesie
Opmerking: Bevestigen dat de ventilatie in de kamer geopend is om goede luchtstroom. Als u wilt testen van de werkzaamheid van de IL4-10-fusieproteïne (1 µg/muis; 5 µL totale geïnjecteerde volume) moet het worden getoetst aan voertuig injecties en injecties van de combinatie van de afzonderlijke cytokines (IL4 IL10, 0,5 µg + 0,5 µg/muis, 5 µL totale geïnjecteerde volume).
- Anesthetize de muis met 3-4% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 2 L/min bij de kamer van de inductie. Controleer dat de muis is goed verdoofd door knijpen de poot om ervoor te zorgen dat het dier niet ontvankelijk is.
- Plaats de muis op de tabel met haar hoofd in de neus van het apparaat geplaatst en onderhouden van de muis sedatie met 1,5-2% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 2 L/min terwijl de intrathecale injectie uitvoeren.
- Back-fill de Injecteerbare verbindingen in een schone 25 µL glas Hamilton spuit verbonden met een 27-gauge naald.
- Houd de muis stevig door de wervelkolom posterieure aan de ribben en iets til de muis. Plaats de naald verticaal tussen de lendenwervels L5 en L6 en steek het voorzichtig door de huid recht in het midden van de lendenwervels. Plaats de naald in de lat. ruimte.
Opmerking: De lat. ruimte vinden kan vereisen sommige 'zoeken' door verplaatsen de naald langs de rostraal ventrale as, licht indrukken van de naald tot een verlies van weerstand van botweefsel wordt gevoeld.- Bevestigen juiste targeting door te verifiëren dat een flick van de staart is opgetreden. Injecteren van 5 µL van de stof langzaam, wacht een paar seconden en dan langzaam het intrekken van de naald. Als er slechts een enkele poot flick wordt waargenomen, is de naald waarschijnlijk niet correct geplaatst.
- Na injectie, controleren de muis nauw samen voor de eerste 30 min na herstel van de verdoving om ervoor te zorgen het ontbreken van elke motor bijzondere waardeverminderingen/verlamming.
Opmerking: Gedrag van de pijn kunnen worden gemeten (zoals beschreven in sectie 3) 15 minuten na herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief beeld van een SDS-pagina gel met verschillende fracties verkregen tijdens affinity chromatografie zuivering is afgebeeld in Figuur 1A. In de laden (L) en de stroom door de breuken (FT), alle aanwezige in het supernatant van HEK293 eiwitten in acht worden genomen. Geen eiwit wordt waargenomen in de Fractie wassen (W). In de Fractie van de elutie (E), zijn de twee bands van 35 en 37 kDa waargenomen overeenkomt met twee verschillende glycoforms van IL4-10 fusieproteïne (pijlen). In Figuur 1B, een bepaling van de representatieve potentie in een volbloed wordt kwantitatieve analyse van twee verschillende IL4-10 fusion eiwit batches instellen weergegeven. Een dosis-afhankelijke remming van LPS-geïnduceerde TNFα release wordt waargenomen, tonen vergelijkbare topicale voor de twee IL4-10 fusion eiwit batches.
Vervolgens wordt een voorbeeld van de testresultaten van representatieve experimenten waarin de IL4-10-fusieproteïne is getest om te remmen aanhoudende inflammatoire pijn weergegeven (Figuur 2). Aanhoudende inflammatoire pijn werd veroorzaakt door intraplantar injectie van 2% carrageen. Mechanische(Figuur 2), alsmede thermische (Figuur 2B) hyperalgesia volgde na verloop van tijd. Op dag 6 na inductie van inflammatoire pijn, waren muizen geïnjecteerd intrathecally met de IL4-10 fusieproteïne of voertuig als een besturingselement. IL4-10 aanzienlijk opgelost zowel mechanische(Figuur 2)en thermische (Figuur 2B) hyperalgesia, en zijn maximale effect bereikt na 24 uur na de injectie. Idealiter moet de werkzaamheid van de fusieproteïne in pijninhibitie tevens worden getoetst aan mengsel concentraties van de afzonderlijke cytokines om te testen of de capaciteit voor de remming van de pijn beter dan de som van de individuele cytokines is. Deze gegevens worden hier niet weergegeven, maar verwijzen we door naar een recente publicatie waarin deze gegevens9.
De doeltreffendheid van de IL4-10-fusieproteïne werd onlangs getest in de inflammatoire pijn CFA-geïnduceerde model9. In dit experiment werden meerdere injecties van de IL4-10-fusieproteïne door de overheid gereguleerde intrathecally. De meerdere injecties volledig opgelost CFA-geïnduceerde persistente inflammatoire hyperalgesia, gemeten met behulp van von Frey en Hargreaves proeven, waarmee het potentieel van de IL4-10 fusieproteïne als een pijnstillend behandeling9is aangetoond. Hier laten we zien dat intraplantar CFA-injectie ook een daling van het gewicht lager voor de getroffen paw (Figuur 3A-B veroorzaakt). Intrathecale injectie van IL4-10 fusieproteïne op dag 7 na intraplantar CFA-injectie de afname van het gewicht lager voor de getroffen paw t.o.v. van voertuig-geïnjecteerd muizen 2 dagen na IL4-10 fusion eiwit toediening (Figuur 3B verzwakt ).
Figuur 1 : Zuivering en karakterisering van IL4-10 fusieproteïne. (A) Coomassie gebeitste SDS-pagina analyse van de affinity chromatografie breuken: L: belasting, FT: stroom door, b: wassen, E: elutie. (B) functionele test: IL4-10 fusion eiwit dosis dependently remt TNFα productie in LPS gestimuleerd volbloed cultuur (uitgedrukt als percentage remming in vergelijking met culturen gestimuleerd met alleen LPS). Gegevens wordt vertegenwoordigd als gemiddelde ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Remming van inflammatoire hyperalgesia door de IL4-10-fusieproteïne. Inflammatoire pijn werd veroorzaakt door een intraplantar injectie van 20 µL van 2% carrageen (CAR). Zes dagen na intraplantar injectie muizen ontvangen een intrathecale injectie (pijl) of 1 µg IL4-10 fusieproteïne voertuig (PBS). (A) mechanische overgevoeligheid (Log 50% drempel (g)) werd gemeten na verloop van tijd met behulp van Von Frey test en (B) thermische gevoeligheid (latency (s)) werd gemeten met behulp van Hargreaves test. Gegevens wordt vertegenwoordigd als gemiddelde ± SEM. sterretjes aanzienlijke verschillen geanalyseerd door two-way ANOVA, tussen voertuig en IL4-10 geïnjecteerd dieren vertegenwoordigen. **, *** = p < 0,01 en p < 0.001, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Ontsteking-geïnduceerde veranderingen in gewicht dragende. Inflammatoire pijn werd veroorzaakt door een intraplantar injectie van 20 µL van Complete Freuds adjuvans (CFA). Gewicht op elke poot werd gemeten met behulp van het dynamische gewicht dragende apparaat. Gewicht in gram van de getroffen paw (ipsilaterale hind paw) houdend en het totale gewicht dragen van de niet-getroffen poten (voorste poten en contralaterale paw) wordt weergegeven, evenals de verhouding van gewicht lager voor de ipsilaterale paw in vergelijking met de andere 3 poten. (A) natuurlijk gewicht dragen tijdens CFA-geïnduceerde ontsteking (n = 10). (B) op dag 7 na intraplantar CFA, muizen ontvangen een intrathecale injectie of 1 µg IL4-10 fusieproteïne voertuig (PBS). Gewicht dragende werd gemeten op 0 en 7 dagen na intraplantar CFA en 2 dagen na toediening van IL4-10 fusieproteïne. Gewicht dragen van de ipsilaterale paw in vergelijking met de andere 3 poten is vertegenwoordigd (n = 3-4). Gegevens wordt vertegenwoordigd als gemiddelde ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0.05 t.o.v. baseline (dag 0). # = p < 0.05 t.o.v. voertuig behandelde dieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript wordt beschreven methoden voor de productie en de karakterisering van een recombinant IL4-10 fusieproteïne, en methoden voor het testen van de werkzaamheid in het remmen van inflammatoire hyperalgesia in muismodellen van aanhoudende inflammatoire pijn. De productie en de zuivering van de IL4-10-fusieproteïne wordt uitgevoerd op een kleine schaal. HEK293 cellen worden geselecteerd als een expressie systeem voor eiwitproductie omdat hierdoor posttranslationele modificaties die niet kunnen worden bereikt in prokaryotische expressiesystemen. Posttranslationele modificaties zijn relevant voor de eiwitfunctie en de afwezigheid van dergelijke wijzigingen mogelijk invloed kan zijn op de therapeutische werking van het IL4-10 fusie-eiwit. Het eiwit wordt gezuiverd van cultuur bezinken door chromatografie van de affiniteit. Wij verkozen om te gebruiken in eigen huis gemaakt monoklonaal antilichaam tegen IL4 voor de zuivering van de affiniteit en niet te produceren van een IL4-10 fusieproteïne met een tag te voorzien in zuiveren met een affiniteit Label system. De reden hiervoor was om te voorkomen dat de mogelijkheid van label-gerelateerde veranderingen in de vouwing van eiwitten en functie. Niettemin, als een zeer selectieve monoklonaal antilichaam ontbreekt, een eiwit met een tag moet worden ontwikkeld, bijvoorbeeld een zijn label. In dat geval, is het belangrijk om te bepalen of de C - of N-terminus van het eiwit is het meest geschikt voor de tag te vermijden dat eiwitfunctie.
Vanaf 1 liter HEK293 supernatant, ongeveer 3 mg van gezuiverde IL4-10 fusieproteïne is verkregen, maar dit kan variëren van charges. De kolom voor de zuivering van de affiniteit kan worden gebruikt voor meerdere zuivering cycli voor teruggooi. De meest gevoelige stap in de procedure van de zuivering is de elutie van IL4-10 fusieproteïne uit de kolom door lage pH, omdat de lage pH onomkeerbare eiwit denaturatie- en eiwit neerslag veroorzaken. Dus, het behoud van de structuur van het eiwit en de afwezigheid van eiwit-aggregaten is essentieel voor goede kwaliteit batches. Te dien einde moet evaluatie van de topicale van het fusie-eiwit getest in vitro vóór en na zuivering met verschillende elutie buffers. Na zuivering van de IL4-10-fusieproteïne, werd de topicale niet verminderd ten opzichte van niet-gezuiverd eiwit. Bovendien, statistische formatie was afwezig toen de elutie stap werd uitgevoerd met 0,1 M glycine buffer (pH = 2.5), en de pH van de elutie breuken werd meteen geneutraliseerd met 1 M Tris buffer (pH = 9).
De concentratie van gezuiverde IL4-10 fusieproteïne wordt geschat op basis van menselijke IL10 ELISA resultaten. BCA eiwit bepaling wordt gebruikt voor het bevestigen van de concentraties van eiwit. Herstel van het eiwit na zuivering wordt geëvalueerd op basis van concentraties gemeten in lading, stroom door, wassen en elutie breuken door IL10 ELISA. De BCA eiwit concentratie bepaling van IL4-10 fusieproteïne kan alleen in dialyzed elutie breuken worden geëvalueerd. Non-dialyzed elutie breuken bevatten imidazol, een stof die invloed op de BCA-meting. Niet-gezuiverd breuken bevatten andere eiwitten uit de HEK293-kweekmedium.
De bepaling van de topicale van de IL4-10-fusieproteïne wordt uitgevoerd in een volbloed assay. De topicale van IL4-10 fusieproteïne moet worden geëvalueerd in de volbloed van verschillende donoren om te bepalen of de functionele activiteit blijft behouden. Verschillende donoren zijn vereist omdat de afwijking van de donor te donor in de hoedanigheid van IL10 en IL4 bestaat voor de remming van de LPS-geïnduceerde TNFα release. Bovendien kan uitdrukking van IL4R en IL10R verschillen tussen donoren, waardoor de capaciteit van IL4-10 fusieproteïne te remmen LPS-geïnduceerde TNFα productie.
In de beschreven methoden gedetailleerde we 2 Muismodellen van aanhoudende inflammatoire pijn om te evalueren van de werkzaamheid van IL4-10 fusieproteïne te lossen pijn in vivo. Toch, voor volledige evaluatie van de pijnstillende potentieel van fusie van recombinante eiwitten, de moleculen moeten worden getest in andere modellen van chronische pijn ook. Deze modellen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, modellen van zenuw-blessure en chemotherapie geïnduceerde neuropatische pijn9,22. Hoewel de von Frey en Hargreaves test vaak gebruikt worden voor het testen van pijnstillende medicijnen, is duidelijk geworden dat een aanvullende proef (bijvoorbeeld dynamische gewicht dragende test) moet worden opgenomen om te beoordelen van de effecten op niet-opgeroepen pijn behaviorsand ook met de operante pijn assay (bijvoorbeeld geconditioneerd plaats voorkeur (CPP) dat sporen van niet-opgeroepen pijn gedrag17,18). Voor het uitvoeren van CPP, moet het begin van de pijn-remmende effecten van de fusie-eiwit worden rekening gehouden, omdat conditionering van de dieren door verlichting van pijn snel handelen pijnstillers vereist (die uitoefenen effecten in minder dan 15 min). Niettemin, als de teststof een langzame pijnstillende begin heeft, maar waarschijnlijk is voor het opwekken van duurzame pijninhibitie (meer dan 4 dagen), CPP kan nog steeds worden gebruikt om te testen of de compound geremd pijn. In dit geval dient compound-geïnduceerde verlies van conditionering met snel handelen analgetica te worden beoordeeld.
Intrathecale injecties worden geselecteerd als een wijze van toediening, aangezien de compound pijn relevante gebieden zoals de achterwortelganglia en het ruggenmerg bereiken zullen. Met name intrathecale levering van pijnstillende medicijnen gebruikelijk is geworden als een behandeling voor patiënten met chronische pijn, aangezien deze aanpak de dosis van pijnstillend medicijn nodig vermindert en vermindert toxiciteit en systemische bijwerkingen. Deze route administratie heeft echter enkele beperkingen; Het goedgetrainde personeel vereist en, als gevolg van de kleine subarachnoïdale ruimte, het volume van de injectie moet worden beperkt tot 5 µL in muizen, die een sterk geconcentreerde oplossing van de fusieproteïne vereisen. De techniek van intrathecale injecties nodig opleiding. Deze opleiding kan worden uitgevoerd op niet-terugvordering van narcose dieren met injectie van een kleurstof om te controleren of de juiste intrathecale injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderdeel van dit werk werd gefinancierd door een Life Sciences Utrecht Universiteit verlenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
