Summary
Dans cet article nous fournir des détails pour les méthodes de production et de contrôle de la qualité d’une protéine de fusion recombinantes IL4-10. Nous montrons aussi comment tester l’efficacité de cette protéine afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire.
Abstract
La douleur chronique est difficile à traiter et de nouvelles approches pour résoudre la douleur persistante sont urgent. Cytokines anti-inflammatoires sont prometteurs pour le traitement débilitantes de douleur en raison de leur capacité à réguler les interactions neuro-immunitaire aberrantes. Cependant, physiologiquement, ils travaillent en réseau de diverses cytokines, et donc leur effet thérapeutique est peut-être pas optimale lorsqu’il est utilisé comme drogue autonome. Pour contourner cette limitation, nous avons mis au point une protéine de fusion des cytokines anti-inflammatoires IL4 et IL10. Ici, nous décrivons les méthodes de production et de contrôle de la qualité de la protéine de fusion recombinantes IL4-10 et nous avons testé l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire persistante.
Introduction
La douleur chronique demeure l’un des problèmes médicaux les plus débilitantes et mal traitée du XXIe siècle, affectant > 20 % de la population adulte1,2. Cependant, les traitements pour fournir le soulagement de la douleur chronique sont souvent inefficaces ou doivent être interrompues en raison des effets secondaires graves3. Ce qui est important, actuellement médicaments disponibles seulement apporter un soulagement symptomatique, mais ne pas sensiblement modifier ou guérir la douleur chronique. Bien que la douleur chronique semble être un trouble neurologique, preuves suggère l’implication du système immunitaire dans la douleur chronique développement4,5. En outre, les approches axées sur les immunitaire pour traiter la douleur font leur apparition. Par exemple, des cytokines anti-inflammatoires empêchent la douleur en plusieurs modèles de douleur chronique6,7,8. Cependant, les cytokines anti-inflammatoires ont une demi-vie courte, en réduisant leurs effets potentiels inhibant la douleur. Par ailleurs, des cytokines anti-inflammatoires fonctionne de manière plus optimale de concert avec les autres. Pour surmonter ces limitations, nous avons fusionné récemment l’interleukine-4 de cytokines anti-inflammatoires (IL4) et l’interleukine-10 (IL10) dans une molécule. La protéine de fusion IL4-10 montre une efficacité supérieure dans l’inhibition de la douleur inflammatoire et neuropathique chronique par rapport à l' individuel cytokines9. Ici nous décrivons comment ces protéines de fusion est produit, purifié, et comment sa qualité est contrôlée.
Protéine de fusion IL4-10 est produite dans les cellules humaines par transfection transitoire des cellules HEK293-F avec un vecteur d’expression de pUPE transportant la séquence d’ADNc codant la protéine de fusion IL4-10. Les cellules HEK293-F sont choisis pour permettre une modification post-traductionnelle de la protéine, quelque chose qui ne se produit pas dans les systèmes d’expression bactérienne. Afin d’optimiser le glycane couvrant avec l’acide sialique, ADNc codant la beta-galactoside-2, 3-sialyl-transférase est incorporée dans le vecteur comme un transgène deuxième. La protéine de fusion est purifiée à l’aide de purification de protéines d’affinité de surnageant de la culture, parce qu’il est plus puissant que la purification par d’autres méthodes par exemple exclusion stérique ou l’échange d’ions chromatographie10,11. Pour purifier la protéine de fusion IL4-10, nous avons utilisé des anticorps monoclonaux en interne contre IL4. Évaluation de la pureté et la bioactivité de la protéine de fusion purifiée IL4-10 sont effectuées dans le cadre de contrôle de la qualité. La pureté des produits lots est évaluée sur Gel de Polyacrylamide de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE) et la chromatographie d’Exclusion taille haute pression (HP-SEC). La bioactivité de la protéine de fusion IL4-10 est évaluée en mesurant sa capacité à inhiber les lipopolysaccharides (LPS)-induit la production de facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα) dans les cultures de sang total et en le comparant à la combinaison de l’individu cytokines.
Enfin, afin de tester la capacité des protéines de fusion IL4-10 pour inhiber la douleur chronique, nous décrivons comment la protéine de fusion peut être testée comme analgésique dans les modèles murins largement utilisé de la douleur inflammatoire persistante12,13,14 . Nous décrivons ici les méthodes d’un modèle de douleur inflammatoire. Cependant, il est important de noter que les autres modèles de la douleur peut être utilisé (par exemple, les modèles de douleur neuropathique), selon les recherches des questions qui doivent recevoir une réponse. Pour évaluer la douleur dans ces modèles, il est important d’utiliser une variété de mesures comportementales qui incluent évoquées et non évoquée par la douleur. Ici, nous avons décrit les méthodes d’évaluation des changements dans les réponses comportementales induites mécaniquement et thermiquement. Mécanique sensibilité aux stimuli inoffensifs est évaluée en utilisant le critère de Von Frey, tandis que la sensibilité thermique est évaluée au moyen de l’essai de Hargreaves. Ce qui est important, non évoquée par hyperalgésie/allodynie est mesuré par le test dynamique portant le poids. Ces mesures sont largement considérées comme des mesures de la douleur et donnent des informations importantes sur les seuils de douleur et de douleur potentielle subis par les animaux15,16,17. D’autres mesures visant à évaluer non évoquée par la douleur (par exemple, stimulation indépendante), tels que le test de préférence de place conditionnée, peut être précieuse18. Pour évaluer le potentiel de la drogue pour inhiber la douleur, nous avons effectué l’administration intrathécale de la protéine de fusion, comme avec cette voie d’administration moins dose de protéine est nécessaire pour atteindre les zones liées à la douleur et éviter les effets systémiques (côté-)19, 20.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices internationales et l’approbation préalable du Comité local d’éthique expérimentale. Sang a été obtenue auprès du Service de donneur de Mini (Mini donneur Dienst, MDD) à l’University Medical Center Utrecht (UMCU) aux Pays-Bas. La MDD a été positive approuvée par le Comité d’éthique médicale de la UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) pour le protocole numéro 07-125/v.
1. caractérisation et Production de protéines
- Culture cellulaire
Remarque : Consultez la Table des matières pour le milieu de culture utilisé.- Décongeler les cellules HEK293-F à 37 ° C jusqu'à ce qu’il y a un petit bouquet de glace. Transférer les cellules dégelées immédiatement dans 10 mL de milieu glacé (4 ° C) et centrifuger la suspension de cellules à température ambiante (RT) pendant 4 minutes (min) à 500 x g.
- Retirez le support et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu frais à ta, suivi par centrifugation à 500 g pendant 4 min.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu à RT. ajouter la suspension cellulaire directement dans un flacon de 125 mL contenant 25 mL de milieu préchauffé (37 ° C). La culture des cellules à 37 ° C, 8 % CO2et 95 % d’humidité dans un agitateur orbital tourne à une vitesse de 125 tr/min.
- Repiquer les cellules deux fois par semaine. Utilisez une cellule automatisée contre (voir Table des matières) pour évaluer le nombre de cellules et de la viabilité cellulaire. Cellules viables de semences à une concentration de 3 x 105 cellules/mL dans des fioles d’Erlenmeyer. Gardez le volume total du milieu de culture à 1/5 du volume total des Erlenmeyers de culture en permanence pour maintenir l’aération optimale.
- Transfection
Remarque : Repiquer les cellules de trois à quatre fois avant la transfection et transfecter eux quand la viabilité cellulaire est > 90 %. La viabilité des cellules est évaluée par un automatisé (champ électrique multi-canal) cellcounting système basé sur l’intégrité de la membrane plasmique. Voir la Table des matières pour le réactif de transfection.- Centrifuger les cellules à ta pendant 4 min à 500 x g ; Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) et diluer la suspension cellulaire à ~1.0 x 106 cellules/mL dans un volume total de 1 L. aliquote la suspension cellulaire dans 10 parties aliquotes de 100 mL en flacons Erlenmeyer de 500 mL.
- Diluer 1 mg de l’ADN de plasmide dans un milieu essentiel minimal 33 mL sérum réduit (MEM, voir Table des matières) en mélangeant doucement. Dans une éprouvette, diluer 1 330 µL de réactif de transfection dans MEM en mélangeant doucement. Incuber les deux solutions à ta pendant 5 min. Ajouter et mélanger l’ADN dilué dans MEM pour le réactif de transfection dans MEM et incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange réactif d’ADN-transfection pour les cellules (cultivés dans la section 1) ; Ajouter 6,6 mL du mélange à chaque 500 mL fiole Erlenmeyer contenant 100 mL de cellules dans un milieu de culture. Maintenir les cellules dans les conditions de culture mentionné précédemment. Récolter le surnageant de culture contenant des protéines de fusion IL4-10 sécrètent trois jours après la transfection.
- Déterminer la concentration de la protéine de fusion IL4-10 dans le surnageant de culture en effectuant un ELISA IL10 selon le protocole du fabricant (voir Table des matières).
NOTE : Dans des conditions de culture optimales, la concentration de la protéine de fusion peut être devrait se situer entre 2,5 et 5 µg/mL.
- Purification par chromatographie d’affinité des protéines
Remarque : La chromatographie d’affinité est réalisée à température ambiante. Cependant, toutes les fractions (fractions de surnageant, charge, traversent et élution de culture) sont conservées sur la glace lors de la procédure.- Couple 10 mg d’un in-house-made anticorps monoclonal dirigé contre IL4 à 1 g de CNBr - activé Sépharose 4 b, selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Versez 2,5 mL de Sépharose couplés perles lentement dans la colonne chromatographique de verre (30 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre interne, voir la Table des matières).
- Bloquer les autres sites de perles de fixation en passant 50 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % d’albumine sérique Bovine par le biais de la colonne. Laver la colonne avec 25 mL de PBS (pH = 7,4) suivie de 12,5 mL de tampon Glycine 0,1 M (pH = 2,5) et 25 mL de PBS (pH = 7,4).
- Passez surnageant à travers la colonne 100 mL de 10 fois la culture de cellules HEK293 concentrée à un débit de 1 mL/min. laver la colonne avec 50 mL de PBS.
- Éluer la protéine de fusion IL4-10 liée avec 12,5 mL de tampon Glycine 0,1 M (pH = 2,5) à un débit de 1 mL/min et virées fractions de 2,5 mL. Ajouter 350 µL de tampon Tris 1 M (pH = 9) à chacune des fractions pour amener le pH à 7. Dialyser fractions neutralisées pendant la nuit contre 2 L de PBS (pH = 7,4).
- Utiliser de tubes de dialyse avec sec 16 mm de diamètre et un seuil de poids moléculaire de 3,5 K. STERILE filtrer les fractions dialysées utilisant des filtres jetables avec 0,45 µM de diamètre de pore. Stocker la solution stérile de la protéine du fusion IL4-10 en aliquotes à-80 ° C.
- Évaluer la pureté de la protéine de fusion IL4-10 éluée par teinté bleu de Coomassie 12 % gel de SDS-PAGE et HP-SEC (colonne 3 µm SEC-2000). Pour l’analyse des HP-SEC, charger 40 µL de protéine à une concentration de 1 mg/mL sur la colonne. Utiliser 100 mM tampon Phosphate de Sodium avec 150 mM de chlorure de Sodium (pH = 6,8) comme une phase mobile. Régler le débit à 1 mL/min.
- Déterminer la concentration de chaque lot de protéine purifiée de fusion IL4-10 par ELISA IL10 et Bicinchoninic acide Protein Assay (BCA Protein Assay Kit, voir Table des matières) selon des protocoles par le fabricant.
- IL10 humaine recombinante permet de créer une courbe d’étalonnage du test ELISA. Pour corriger la différence de taille entre IL10 recombinante (18 kDA) et la protéine de fusion IL4-10 (34 kDa), multipliez la concentration obtenue par un facteur de 1,8.
- Bioactivité de la protéine de fusion IL4-10
Remarque : L’analyse de sang est réalisée pour chaque lot de protéine de fusion IL4-10 produit et l’activité des différents lots est comparée dans le cadre de contrôle de la qualité. L’analyse de sang est effectuée dans le sang humain frais prélevé le jour de l’essai sur des tubes héparine. Sang provenant des volontaires sains dans notre service donateur interne. Les échantillons doivent être manipulés comme les risques potentiellement biologiques.- Préparer 3 voies des dilutions successives avant de la protéine de fusion IL4-10 purifiée dans un milieu RPMI (voir Table des matières) au-delà d’une concentration de la gamme 5-1 215 ng/mL.
- Préparer des dilutions de LPS (100 ng/mL) et de sang humain qui est diluée 4 fois dans un milieu RPMI.
- Pipetter les dilutions avant de la protéine de fusion IL4-10, LPS et le sang humain dans une plaque de 48 puits. Dans chaque puits, ajouter 50 protéine de fusion IL4-10 µL (concentration finale 1-243 ng/mL), 75 µL de milieu RPMI, 25 µL LPS (concentration finale 10 ng/mL) et le sang humain 100 µL (final dilué).
Remarque : Le volume Total par puits est 250 µL. - Incuber les plaques à 37 ° C, 8 % CO2et 95 % d’humidité pendant 18 h.
- Évaluer la concentration de TNFα dans les surnageants de culture à l’aide d’un ELISA TNFα, selon le protocole du fabricant.
- Calculer l’inhibition de la réponse inflammatoire de la protéine de fusion IL4-10 selon la formule : % d’inhibition = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
NOTE : Ici A = taux TNFα dans les cultures stimulées LPS traités avec la protéine de fusion IL4-10, B = taux de TNFα dans la culture non stimulée et C = taux TNFα dans culture stimulée LPS.
2. souris modèle pour douleur inflammatoire persistante
Remarque : Il est important d’utiliser des souris mâles et femelles (C57Bl/6), parce que cela permettra l’identification des effets dépendants de sexe. En général, les souris utilisées sont entre 8 à 16 semaines. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires, les calculs de puissance doivent être effectuées. Outils Web pour effectuer ces calculs se trouvent facilement sur internet (par exemple, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
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Induction de la douleur inflammatoire chronique
NOTE : Induire une douleur inflammatoire persistante chez la souris adulte, avec des injections intraplantaires de carraghénane ou Adjuvant complet de Freud (CFA). Les différents tests n’interfèrent pas entre eux.- Préparer le carraghénane (2 % p/v) en dissolvant les λ-carraghénane (voir Table des matières) à 0,9 % NaCl en passant la solution par une aiguille de calibre 23 pour s’assurer que le carraghénane est bien dissous. Préparer une nouvelle solution directement avant l’injection est effectuée.
- Sinon, si le CFA est utilisé, mélanger la solution CFA correctement avant de l’injecter intraplantarly, parce que le CFA est une émulsion eau-dans-huile contenant 1 mg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) chaleur tués et séché, huile de paraffine 0,85 mL, et 0,15 mL mannide monooléate (voir Table des matières).
Remarque : Seringues de verre Hamilton avec pistons métalliques sont recommandés pour injecter ce composé parce que les plongeurs en caoutchouc peuvent réagir avec l’huile dans l’adjuvant. -
Injection intraplantaire
- Maintenir le composé (étapes 2.1.1 ou 2.1.2) dans la seringue à ta pendant au moins 15 minutes avant l’injection pour permettre un réglage à RT. injecter 20 µL du composé (ou dissolvant comme témoin) par voie sous-cutanée dans la patte arrière de la souris non anesthésiés à l’aide d’un calibre 30 aiguille.
- Insérer l’aiguille à la base de la mise en scène pouce jusqu’au talon et injecter le composé lorsque l’aiguille est insérée environ 0,5 cm. Après l’injection, rétracter lentement l’aiguille en tournant légèrement la seringue pour éviter toute fuite de solution hors du site d’injection.
3. douleur Mensurations
Remarque : Veiller à ce que les chercheurs effectuent des expériences comportementales sont aveugles pour le traitement de souris. Il est important de s’y acclimater les animaux destinés à l’environnement de test avant d’effectuer toute mesure. De préférence, la semaine avant de commencer les expériences, animaux est placées 1 à 2 fois pendant 15-30 min dans chacun des différents dispositifs employés pour exécuter les tests. Lors de la manipulation des mâles et des femelles dans la même expérience, évaluer les hommes indépendamment de femelles. Cages propres et surfaces largement entre les différents groupes pour éviter d’éventuels effets indésirables sur le comportement des différents sexes. Mesurer les latences de retrait planifié ou seuils mécaniques deux à trois fois avec précision de déterminer les seuils de référence et déterminer si ceux-ci sont stables avant l’injection intraplantaire de tous les composés.
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Test de von Frey : sensibilité mécanique aux stimuli inoffensifs
- Placez les animaux individuellement dans des cages acryliques sur un support de maille de fil et laisser les souris s’acclimater pendant au moins 15 minutes avant la mesure.
- Évaluer la sensibilité mécanique en mesurant le seuil de retrait de patte en réponse à une série calibrée de poils von Frey allant de 0,02 à 4 g. envisager tout mouvement de la patte des cheveux appliquée comme une réponse positive de retrait. Appliquer les filaments perpendiculairement à la surface de la patte avec une force suffisante pour provoquer une flexion légère sur la peau pendant ~ 3 s. Assurez-vous bien sûr les cheveux tournez pas lors de l’application à la patte.
- Calculer le seuil de patte-retrait de 50 % à l’aide de la méthode va-et-vient15,21.
Remarque : Le premier filament à appliquer est de 0,4 g (les autres filaments de départ peuvent être utilisés selon les seuils de ces souris affichent au départ). Une absence de réponse à un filament indique que le filament épais suivant est utilisé dans l’après la stimulation, tandis qu’une réponse positive indique l’utilisation du prochain plus mince filament. Le nombre de présentations des cheveux est déterminé par la première réponse différentielle ; Après cela, plus de 5 demandes sont effectuées. Calculer que le seuil de 50 % selon les méthodes décrites précédemment15,21.
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Sensibilité thermique : test de Hargreaves
- Placer les animaux dans des cages sur une plaque de verre préalablement chauffée (30 ° C) et laisser les souris s’acclimater pendant au moins 15 minutes avant les mesures, d’attendre que les animaux s’asseoir encore.
- Déterminer les temps de latence pour le retrait thermique en chauffant la patte des animaux par un faisceau concentré de lumière visible à l’aide d’un appareil de Hargreaves (voir Table des matières).
Remarque : L’intensité du faisceau est fixée à 12 %, car ce paramètre intensité déterminées expérimentalement, le faisceau lumineux évoque une réponse de retrait d’une durée moyenne de 8 s au départ sur des souris C57Bl/6. Le réglage de l’intensité doit être déterminé par la machine individuelle et la souche de souris. Temps de coupure maximal de 20 s ou plus sont utilisés pour éviter toute blessure aux animaux. - Mesurer les temps de latence de retrait ~ 4 fois par animal. Moyenne de toutes les réponses mesurées. Mesurer chaque patte indépendamment et avec au moins 1 min d’intervalle entre les mesures ultérieures de la même patte.
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Les déficits posturaux : test de roulement de poids dynamique
- Mesurer le poids de chaque animal avant l’essai, car poids portant analyse nécessite le poids de chaque animal comme paramètre d’entrée.
- Placer les animaux individuellement dans un système de poids-roulement en dynamique d’instrumentation sol assemblé sur un couvercle supportant une caméra qui enregistre les mouvements de souris. Laisser l’animal s’acclimater pendant 0,5 à 1 min avant l’enregistrement pendant 5 min.
Remarque : Dans cet essai, seul animal librement mobile peut être évalué à la fois. - Effectuez les réglages pour effectuer le roulement de poids et d’analyser les données.
Remarque : Dans ces expériences, nous utilisons les paramètres suivants : seuil de poids (i) faible de 0,6 g : c’est le poids minimum nécessaire d’activer une des cellules du capteur. (ii) seuil haut poids de 1 g : ce chiffre indique le poids nécessaire pour activer complètement une seule cellule. (iii) la surface seuil de 2 cellules : ce chiffre indique le nombre de cellules adjacentes à l’autre qui a besoin d’être activé pour être pris en considération. (iv) le nombre d’images est 5 : il faut 0,1 s pour capturer chaque image. Le nombre indique le nombre minimal d’images dans lequel la souris ne bouge pas. Par conséquent, une valeur de 5 signifie que la souris posture doit être stable pour > 0,5 s pour obtenir une mesure qui est prise en compte pour l’analyse. - Effectuer l’analyse de chaque vidéo en relisant la vidéo et faire en sorte que chaque membre est reconnu correctement par le logiciel dans les délais indiqués par le logiciel.
NOTE : Un minimum de 1 min du temps enregistré doit être validé. La masse dynamique portant le logiciel calcule et fournit les paramètres suivants : (i) le poids supporté par chaque patte individuel en grammes et en pourcentage du poids du corps entier. (ii) le poids supporté par la combiné patte avant ou arrière combiné les pattes en grammes et en pourcentage du poids du corps entier. (iii) le rapport entre la droite/gauche pattes roulement de poids ou avant/arrière roulement de poids. (iv) la superficie de chaque patte ou des pattes avant/arrière combinés qui a activé le tampon de pression sensible. (v) moyenne et écart-type pour chaque paramètre. (vi) la durée des différentes postures (élevage, 3 pattes ou 4 pattes) pendant l’expérience entière. (vii) heure (s) de chaque patte a poids pendant l’expérience entière.
4. protéine de fusion intrathécale Injection IL4-10 pour l’analgésie
NOTE : Confirmer que la ventilation de la salle est ouverte pour assurer un débit d’air appropriée. Pour tester l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 (1 µg/souris ; 5 µL injection total volume), il devrait être testé contre les injections de véhicule et des injections de la combinaison des cytokines individuels (IL10, 0,5 µg, IL4 + 0,5 µg/souris, volume de fonds totale de 5 µL).
- Anesthésier la souris à l’isoflurane 3-4 % avec un débit d’oxygène de 2 L/min dans la chambre de l’induction. Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant la patte pour s’assurer que l’animal n’est pas recevable.
- Place la souris sur la table avec sa tête placé dans le cône de nez de l’appareil et de maintenir la sédation de souris à l’isoflurane de 1,5 à 2 % avec un débit d’oxygène de 2 L/min, tout en effectuant l’injection intrathécale.
- Remblayer les composés injectables dans un verre propre 25 µL seringue Hamilton relié à une aiguille de calibre 27.
- Maintenez la souris fermement par la colonne vertébrale postérieure aux nervures et soulevez légèrement la souris. Placez l’aiguille verticalement entre la vertèbre lombaire L5 et L6 et insérez-la délicatement à travers la peau dès le milieu des vertèbres lombaires. Placer l’aiguille dans l’espace intervertébral.
NOTE : Trouver l’espace intervertébral peut exiger certains « recherche » de déplacer l’aiguille le long de l’axe ventrale rostral, en pressant légèrement l’aiguille jusqu'à ce qu’une perte de résistance du tissu osseux se fait sentir.- Confirmer un ciblage correct en vérifiant qu’un coup de queue s’est produite. Injecter lentement les 5 µL du composé, attendre quelques secondes et puis rétracter lentement l’aiguille. Si seulement un coup de patte unique est observé, l’aiguille est probablement ne pas correctement placée.
- Après l’injection, vérifier la souris étroitement pendant les 30 premières minutes après de l’anesthésie pour s’assurer de l’absence de toute déficience moteur/paralysie.
Remarque : Les comportements de douleur peuvent être mesurées (comme décrit dans la section 3) 15 minutes après la reprise.
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Representative Results
Une image représentative d’un gel SDS-PAGE contenant différentes fractions obtenues au cours de la purification par chromatographie d’affinité est montrée dans la Figure 1A. Dans la charge (L) et le débit par le biais de fractions (FT), toutes les protéines présentes dans le surnageant HEK293 sont observées. Aucune protéine n’est observée dans la fraction de lavage (W). Dans la fraction d’élution (E), deux bandes de 35 et 37 kDa sont observées correspondent à deux différentes glycoformes de protéine de fusion IL4-10 (flèches). Dans la Figure 1B, un test de puissance représentative dans un sang dosage de deux lots différents de protéines de fusion IL4-10 s’affiche. On observe une inhibition dose-dépendante de la libération TNFα induite par LPS, montrant une bioactivité comparable pour les deux lots de protéines de fusion IL4-10.
Ensuite, un exemple de résultats d’expériences représentatives dans lequel la protéine de fusion IL4-10 est testée pour inhiber la douleur inflammatoire persistante apparaît (Figure 2). La douleur inflammatoire persistante a été induite par injection intraplantaire de carraghénane de 2 %. Mécanique (Figure 2A) ainsi que de l’hyperalgésie thermique de (Figure 2B) a été suivi au fil du temps. Au jour 6 après l’induction de la douleur inflammatoire, les souris ont été injectées intrathécale avec la protéine de fusion IL4-10 ou le véhicule comme un contrôle. IL4-10 sensiblement résolu tant mécaniques (Figure 2A) et thermique (Figure 2B) hyperalgésie et atteint son effet maximal après 24 h après l’injection. Idéalement, l’efficacité de la protéine de fusion dans l’inhibition de la douleur devrait être aussi testée contre des concentrations équimolaires de cytokines individuels afin de vérifier si sa capacité d’inhiber la douleur est mieux que la somme des cytokines individuels. Ces données ne sont pas affichées ici, mais nous nous référons à une publication récente qui affiche cette données9.
L’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 a été récemment testée dans la douleur inflammatoire induite par le CFA modèle9. Dans cette expérience, plusieurs injections de la protéine de fusion IL4-10 ont été administrée intrathécale. Les injections multiples complètement résolu hyperalgésie inflammatoire persistante induite par le CFA, mesurée à l’aide de von Frey et des essais de Hargreaves, démontrant le potentiel de la protéine de fusion IL4-10 comme un traitement analgésique9. Nous montrons ici qu’intraplantaire CFA injection a également provoqué une réduction de poids de la patte touchée (Figure 3A-B). Injection intrathécale de protéine de fusion IL4-10 à jour 7 après que injection intraplantaire de CFA a atténué la réduction de poids de la patte touchée par rapport à des souris injectées véhicule 2 jours après l’administration de protéines de fusion IL4-10 (Figure 3B ).
Figure 1 : Purification et caractérisation de la protéine de fusion IL4-10. (A) teinté bleu de Coomassie SDS-PAGE analyse les fractions de chromatographie d’affinité : L: charge, FT : accréditives, w : lavage, E: d’élution. Test fonctionnel (B) : IL4-10 doses de protéines fusion dépendante inhibe la production de TNFα dans la culture de sang stimulées LPS (exprimée en pourcentage d’inhibition par rapport aux cultures stimulées avec LPS seuls). Les données sont représentées comme moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Inhibition de l’hyperalgésie inflammatoire de la protéine de fusion IL4-10. La douleur inflammatoire est induite par une injection intraplantaire de 20 µL de carraghénane 2 % (voiture). Six jours après l’injection intraplantaire souris ont reçu une injection intrathécale (flèche) de la protéine de fusion IL4-10 µg 1 ou d’un véhicule (PBS). (A) mécanique hypersensibilité (seuil de 50 % de Log (g)) a été mesurée au fil du temps en utilisant le critère de Von Frey et sensibilité thermique (B) (temps de latence (s)) a été mesurée à l’aide du test de Hargreaves. Données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. astérisques représentent des différences importantes analysées par ANOVA bidirectionnelle, entre véhicules et animaux IL4-10 injecté. **, *** = p < 0,01 et p < 0,001, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Changements induits par l’inflammation poids roulement. La douleur inflammatoire est induite par une injection intraplantaire de 20 µL de l’Adjuvant complet de Freud (FCA). Poids portant sur chaque patte a été mesurée avec le dispositif de roulement de poids dynamique. Roulement de poids en grammes de la patte touchée (patte arrière ipsilatéral) et le roulement de poids total des pattes non touché (pattes avant et la patte controlatéral) s’affiche, ainsi que le taux de roulement de poids de la patte ipsilatérale par rapport aux 3 autres pattes. (A) cours d’appui au cours de l’inflammation induite par le CFA (n = 10). (B) au 7e jour après intraplantaire CFA, les souris ont reçu une injection intrathécale de 1 µg IL4-10 protéine de fusion ou d’un véhicule (PBS). Roulement de poids a été mesuré à 0 et 7 jours après intraplantaire CFA et 2 jours après l’administration de la protéine de fusion IL4-10. Roulement de poids de la patte ipsilatérale par rapport aux 3 autres pattes est représentée (n = 3-4). Les données sont représentées comme moyenne ± SEM. *** = p < 0,001 ; ** = p < 0,01 ; * = p < 0,05 par rapport au niveau de référence (jour 0). # = p < 0,05 par rapport aux animaux de véhicule considéré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce manuscrit décrit des méthodes pour la production et la caractérisation d’une recombinaison protéine de fusion IL4-10 et les méthodes pour tester son efficacité pour inhiber l’hyperalgésie inflammatoire dans des modèles murins de la douleur inflammatoire persistante. La production et la purification de la protéine de fusion IL4-10 s’effectue à petite échelle. Les cellules HEK293 sont sélectionnés comme un système d’expression pour la production de protéines car elles permettent des modifications post-traductionnelles ne peuvent être réalisées dans des systèmes d’expression procaryote. Les modifications post-traductionnelles sont pertinentes pour la fonction de protéine, et l’absence de telles modifications puisse nuire à l’efficacité thérapeutique de la protéine de fusion IL4-10. La protéine est purifiée de surnageant de culture par chromatographie d’affinité. Nous avons choisi d’utiliser interne fait un anticorps monoclonal contre IL4 pour purification d’affinité et de ne pas produire une protéine de fusion IL4-10 contenant une balise permettant la purification avec un système de balise d’affinité. La raison était d’éviter la possibilité de changements axés sur la balise dans le repliement des protéines et la fonction. Néanmoins, si un anticorps monoclonal hautement sélectif fait défaut, une protéine avec une étiquette doit être développée, par exemple un son tag. Dans ce cas, il sera important de déterminer si l’extrémité C - ou N-terminale de la protéine est mieux adapté pour l’étiquette de ne pas affecter la fonction de protéine.
1 L de liquide surnageant HEK293, environ 3 mg de protéine purifiée de fusion IL4-10 est obtenue, mais cela peut varier d’un lot à l’autre. La colonne pour la purification d’affinité peut être utilisée pour plusieurs cycles de purification avant de le jeter. L’étape la plus sensible dans la procédure de purification est l’élution de la protéine de fusion IL4-10 de la colonne par un pH faible, car le faible pH peut provoquer la dénaturation des protéines irréversible et précipitation de protéines. Ainsi, le maintien de la structure de la protéine native et l’absence d’agrégats de protéines sont essentiels pour les lots de bonne qualité. À cette fin, évaluation de la bioactivité de la protéine de fusion doit être testé in vitro avant et après la purification avec des tampons d’élution différents. Après la purification de la protéine de fusion IL4-10, la bioactivité n’a pas réduite par rapport à la protéine non purifié. En outre, une formation globale était absent lorsque l’étape d’élution a été réalisée avec un tampon glycine 0,1 M (pH = 2,5), et le pH des fractions d’élution est immédiatement neutralisé avec un tampon Tris 1 M (pH = 9).
La concentration de protéine purifiée de fusion IL4-10 est estimée sur la base des résultats d’IL10 ELISA humaines. Analyse de protéine de BCA est utilisée pour confirmer les concentrations de protéine. Récupération de la protéine après que purification est évaluée issu des concentrations mesurées dans la charge, écoulement à travers, les fractions de lavage et d’élution par IL10 ELISA. Détermination de la concentration des protéines de la BCA de protéine de fusion IL4-10 peut être évaluée seulement dans les fractions d’élution dialysée. Non-dialysée élution fractions contiennent imidazole, un composé qui influe sur la mesure de la BCA. Les fractions non purifié contiennent autres protéines HEK293 milieu de culture.
La détermination de la bioactivité de la protéine de fusion IL4-10 est exécutée dans un test de sang entier. La bioactivité de la protéine de fusion IL4-10 devrait être évaluée dans le sang de plusieurs donneurs afin de déterminer si l’activité fonctionnelle est conservée. Plusieurs bailleurs de fonds sont nécessaires parce que les donateurs aux donateurs variance existe en qualité d’IL10 et IL4 pour inhiber la libération TNFα induite par LPS. En outre, expression de IL4R et IL10R peut-être différer entre les donateurs, affectant la capacité de la protéine de fusion IL4-10 pour inhiber la production de TNFα induite par LPS.
Dans les méthodes décrites, nous avons détaillé 2 modèles murins de la douleur inflammatoire persistante pour évaluer l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 afin de résoudre la douleur in vivo. Néanmoins, pour une évaluation complète du potentiel analgésique des protéines de fusion recombinantes, les molécules doivent être testées dans d’autres modèles de la douleur chronique ainsi. Ces modèles incluent, mais ne se limitent pas aux modèles de lésion nerveuse et douleur neuropathique chimiothérapie9,22. Bien que le critère de von Frey et l’épreuve de Hargreaves sont couramment utilisés pour les essais de médicaments analgésiques, il est devenu clair qu’il figurerait un essai supplémentaire (p. ex. essai poids dynamique) pour évaluer les effets sur la douleur évoquée par des behaviorsand aussi avec le dosage de la douleur opérante (p. ex. conditionné lieu préférence (CPP) qui détecte la douleur évoquée par des comportements17,18). Pour effectuer des PPC, l’apparition des effets de la protéine de fusion inhibant la douleur doit être tenue compte, parce que le conditionnement des animaux par le soulagement de la douleur nécessite des antalgiques d’action rapide (qui exercent des effets en moins de 15 min). Néanmoins, si la substance d’essai a une installation lente analgésique, mais est susceptible d’induire l’inhibition de la douleur de longue durée (plus de 4 jours), RPC peut toujours servir pour tester si le composé inhibe la douleur. Dans ce cas, provoquée par la perte de conditionnement avec des analgésiques à action rapide doit être évaluée.
Des injections intrathécales sont sélectionnées comme une voie d’administration, comme le composé atteindra douleur domaines pertinents tels que les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Notamment, intrathécale de médicaments analgésiques est devenu pratique courante comme traitement des patients souffrant de douleur chronique, car cette approche réduit la dose d’analgésique médicament nécessaire et diminue la toxicité et les effets secondaires systémiques. Néanmoins, cette voie d’administration comporte quelques limitations ; Il faut un personnel bien formé et, en raison de l’espace sous-arachnoïdien petite, le volume d’injection devrait être limité à 5 µL chez les souris, qui nécessitent des solutions très concentrées de la protéine de fusion. La technique des injections intrathécales nécessite une formation. Cette formation peut être effectuée sur la non-récupération des animaux anesthésiés avec injection d’un colorant pour vérifier une injection intrathécale correct.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Partie de ce travail a été financé par un Utrecht University Life Sciences accorder
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
