Summary
In diesem Papier bieten wir Informationen für die Methoden der Produktion und Qualitätskontrolle von einem rekombinanten Fusionsprotein IL4-10. Wir zeigen auch, wie Test die Wirksamkeit dieses Proteins, Schmerzen in einem Mausmodell der entzündlichen Schmerz zu lösen.
Abstract
Chronische Schmerzen sind schwer zu behandeln und neue Ansätze für die anhaltende Schmerzen zu beheben werden dringend benötigt. Anti-inflammatorische Zytokine sind viel versprechende Kandidaten für die Behandlung von schwächenden Schmerzzuständen aufgrund ihrer Kapazität, aberrante Neuro-immunen Interaktionen zu regulieren. Jedoch physiologisch arbeiten sie in einem Netzwerk von verschiedenen Zytokinen und daher ihre therapeutische Wirkung möglicherweise nicht optimal bei Verwendung als Stand-Alone-Drogen. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben wir ein Fusionsprotein von entzündungshemmenden Zytokinen IL4 und IL10 entwickelt. Hier beschreiben wir die Methoden zur Herstellung und Qualitätskontrolle von rekombinanten Fusionsprotein IL4-10 und wir testen die Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10, Schmerzen in einem Mausmodell der anhaltende entzündliche Schmerzen zu lösen.
Introduction
Chronischer Schmerzen bleibt eine der schwächenden und behandelt medizinische Probleme des 21. Jahrhunderts beeinflussen > 20 % der erwachsenen Bevölkerung1,2. Allerdings Behandlungen zur Linderung von chronischen Schmerzen sind oft wirkungslos oder müssen aufgrund der schweren Nebenwirkungen3eingestellt werden. Wichtig ist, derzeit verfügbaren Medikamente nur symptomatische Linderung, aber nicht wesentlich ändern oder chronischen Schmerzen zu heilen. Chronischer Schmerzen scheint, zwar eine neurologische Störung sein deutet Beteiligung des Immunsystems bei chronischen Schmerzen Entwicklung4,5. Darüber hinaus entstehen immun-basierte Ansätze zur Behandlung von Schmerzen. Anti-inflammatorische Zytokine hemmen z. B. Schmerzen in mehreren Modellen von chronischen Schmerzen6,7,8. Anti-inflammatorische Zytokine haben jedoch eine kurze Halbwertszeit, reduzieren ihre potentiellen schmerzhemmenden Wirkungen. Darüber hinaus arbeiten optimal Anti-inflammatorische Zytokine mit einander. Um diese Einschränkungen zu überwinden, verschmolzen wir vor kurzem die Anti-inflammatorische Zytokine Interleukin-4 (IL4) und Interleukin-10 (IL10) in einem Molekül. IL4-10 Fusionsproteins zeigt überlegene Wirksamkeit bei der Hemmung von chronischen entzündlichen und neuropathischen Schmerzen im Vergleich zu den einzelnen Zytokine-9. Hier beschreiben wir wie solche Schmelzverfahren Protein produziert wird, gereinigt, und wie wird die Qualität kontrolliert.
IL4-10 Schmelzverfahren Protein entsteht in menschlichen Zellen durch Transiente Transfektion von Zellen HEK293-F mit einer pUPE Expressionsvektor tragen die cDNA-Sequenz Fusionsproteins IL4-10-Codierung. HEK293-F Zellen werden ausgewählt, um für Post-translationale Modifikation des Proteins, etwas zuzulassen, die nicht in bakterieller Expressionssysteme auftritt. Zur Optimierung Glycan verschließen mit Sialinsäure Säure, cDNA Kodierung Beta-Galactoside-2, ist 3-Sialyl-Transferase im Vektor als eine zweite Transgen eingebunden. Fusionsproteins wird gereinigt mit Affinität Proteinreinigung der Kultur überstand, weil es mächtiger als Reinigung ist durch andere Methoden z.B. Größe-Ausschluss oder Ionenaustausch-Chromatographie-10,-11. IL4-10 Schmelzverfahren Protein zu reinigen, haben wir im Haus gemacht monoklonale Antikörper gegen IL4 verwendet. Beurteilung der Reinheit und Bioaktivität der gereinigten IL4-10 Schmelzverfahren Protein wird als Teil der Qualitätskontrolle durchgeführt. Die Reinheit des produzierten Chargen ist von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und hohem Druck Größe Ausgrenzung Chromatographie (HP-SEC) bewertet. Die Bioaktivität des Fusionsproteins IL4-10 wird ausgewertet, indem Sie messen ihre Handlungsfähigkeit Lipopolysaccharid (LPS) hemmen-induzierten Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF) Produktion in Vollblut Kulturen, und vergleicht sie die Kombination der einzelnen Zytokine.
Schließlich, um zu testen, die Kapazität von Fusionsproteinen IL4-10, chronischen Schmerzen zu hemmen, beschreiben wir, wie die Schmelzverfahren Protein als Analgetikum in weit verbreiteten Mausmodellen entzündliche Dauerschmerzen12,13,14 getestet werden können . Hier beschreiben wir die Methoden eines entzündlichen Schmerz-Modells. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere Schmerzen Modelle verwendet (z. B.neuropathischen Schmerzen Modelle), abhängig von der Forschung Fragen, die beantwortet werden müssen. Um Schmerzen in diesen Modellen zu beurteilen, ist es wichtig, eine Vielzahl von Verhaltensmaßnahmen, die enthalten hervorgerufen und nicht-evozierten Schmerzen Maßnahmen verwenden. Hier beschrieben wir die Methoden der Bewertung für Änderungen in mechanisch und thermisch evozierten Verhaltensreaktionen. Mechanische Empfindlichkeit auf harmlose Reize ist anhand des Von Frey-Tests während thermische Empfindlichkeit mit dem Hargreaves Test bewertet wird. Wichtig ist, wird mit der dynamischen Gewicht tragen Test-evozierten Hyperalgesie/Allodynie gemessen. Diese Maßnahmen sind als Schmerzen Maßnahmen angenommen und liefern wichtige Hinweise zur Schmerzschwellen und mögliche Schmerzen bei Tieren15,16,17. Andere Maßnahmen zur-evozierten Schmerzen (z.B. Reiz unabhängig), z. B. die konditionierten Ort Präferenz Test beurteilen, möglicherweise wertvolle18. Um das Potenzial des Medikaments zur Hemmung von Schmerzen zu beurteilen, führten wir intrathekale Verabreichung des Fusionsproteins, wie mit dieser Art der Verabreichung weniger Protein-Dosis erforderlich ist, um Schmerzen zusammenhängende Bereiche zu erreichen und zu vermeiden systemische (Seiten-) Effekte19, 20.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden im Einklang mit internationalen Richtlinien und vorheriger Genehmigung durch die lokalen experimentelle Ethikkommission durchgeführt. Vollblut wurde aus dem Mini-Spender-Service (Mini Spender Dienst, MDD) am University Medical Center Utrecht (UMCU) in den Niederlanden erhalten. Die MDD erhielt positive Zustimmung von der medizinischen Ethik-Kommission der UMCU (Medisch ethischen Toetscommissie) für das Protokoll Nummer 07-125/C.
1. die Proteinproduktion und Charakterisierung
- Zellkultur
Hinweis: Siehe die Tabelle der Materialien für Nährmedium verwendet.- Tauen Sie die HEK293-F-Zellen bei 37 ° C bis gibt es eine kleine Klumpen des Eises. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen sofort auf 10 mL eiskaltes Medium (4 ° C) und Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur (RT) für 4 Minuten (min) bei 500 X g.
- Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL frisches Medium bei RT, gefolgt von Zentrifugation bei 500 X g für 4 min.
- Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Medium bei RT Add die Zellsuspension direkt in einer 125 mL Flasche mit 25 mL vorgewärmten Medium (37 ° C). Kultur der Zellen bei 37 ° C, 8 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit auf einem Orbitalschüttler mit einer Geschwindigkeit von 125 u/min drehen.
- Subkultur der Zellen zweimal in der Woche. Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler (siehe Tabelle der Materialien), um Handynummer und Zellviabilität zu bewerten. Lebensfähigen Samenzellen in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/mL in Erlenmeyerkolben. Halten Sie das Gesamtvolumen des Kulturmediums mit 1/5 des Gesamtvolumens des Kultur-Erlenmeyerkolben jederzeit optimale Belüftung zu.
- Transfektion
Hinweis: Subkultur der Zellen drei bis vier Mal vor Transfektion und transfizieren sie wenn die Zellviabilität ist > 90 %. Zellviabilität wird bewertet durch eine automatisierte (elektrisches Feld Mehrkanal) Cellcounting System basierend auf die Integrität der Plasmamembran. Sehen Sie die Tabelle der Materialien für die Transfektion Reagenz.- Zentrifugieren Sie die Zellen bei RT für 4 min. bei 500 X g; Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL vorgewärmten Kulturmedium (37 ° C) und verdünnen die Zellsuspension auf ~1.0 X 106 Zellen/mL in einem Gesamtvolumen von 1 L. aliquoten die Zellsuspension in 10 Aliquote von 100 mL in 500 mL-Erlenmeyerkolben.
- Verdünnen Sie 1 mg Plasmid DNA in 33 mL reduziert Serum minimal wesentliche Medium (MEM, siehe Tabelle der Materialien) durch schonendes mischen. In einem separaten Rohr verdünnter 1.330 µL Transfection Reagens in MEM durch schonendes mischen. Inkubieren Sie beide Lösungen bei RT 5 min hinzufügen und mischen Sie die DNA verdünnt in MEM, die Transfection Reagens in MEM und inkubieren die Mischung für 30 min bei RT
- Fügen Sie die DNA-Transfektion Reagenz mischen auf die Zellen (kultiviert im Abschnitt 1); je 500 mL Erlenmeyerkolben, 100 mL von Zellen im Nährmedium enthält fügen Sie 6,6 mL der Mischung hinzu. Pflegen Sie die Zellen in die zuvor genannten Kulturbedingungen. Ernte des Kultur Überstands mit sekretierten IL4-10-Fusionsprotein drei Tage nach Transfektion.
- Bestimmen Sie die Konzentration des Fusionsproteins IL4-10 in der Kultur Überstand durch Ausführen eines IL10 ELISA laut Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Bei optimalen Kulturbedingungen kann die Konzentration des Fusionsproteins voraussichtlich zwischen 2,5 und 5 µg/mL liegen.
- Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie
Hinweis: Affinitätschromatographie erfolgt bei Raumtemperatur. Jedoch sind alle Fraktionen (Kultur überstand, Belastung, Durchströmung und Elution Fraktionen) während des Verfahrens auf Eis gehalten.- Paar 10 mg einen house gemacht monoklonale Antikörper gegen IL4 bis 1 g der CNBr - Sepharose 4 b, gemäß des Herstellers Protokoll aktiviert (siehe Tabelle der Materialien). Gießen Sie 2,5 mL gekoppelten Sepharose-Kügelchen langsam in das Glas Chromatographiesäule (30 cm Länge und 1,5 cm Innendurchmesser, siehe Tabelle of Materials).
- Blockieren die verbleibenden Bindungsstellen der Perlen indem man 50 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Rinderserumalbumin durch die Säule. Waschen Sie die Spalte mit 25 mL PBS (pH = 7,4) gefolgt von 12,5 mL 0,1 M Glycin Puffer (pH = 2.5) und 25 mL PBS (pH = 7,4).
- Pass 100 mL 10-divisibel konzentrierte HEK293 Zellkultur Überstand durch die Säule mit einer Durchflussrate von 1 mL/min waschen die Spalte mit 50 mL PBS.
- Eluieren gebundene IL4-10-Fusionsprotein mit 12,5 mL 0,1 M Glycin Puffer (pH = 2,5) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min und sammeln Bruchteile von 2,5 mL. Fügen Sie 350 µL 1 M Tris-Puffer (pH = 9) für jede Fraktion, den pH-Wert auf 7 zu bringen. Dialyse neutralisierte Fraktionen über Nacht gegen 2 L PBS (pH = 7,4).
- Verwenden Sie mit trocken 16 mm Durchmesser und einem 3,5 K Molekulargewicht Cut-Off Dialyse Schläuche. Steril Filtern der dialysierten Fraktionen mit Einwegfilter mit 0,45 µM Porendurchmesser. Sterile IL4-10 Fusion Proteinlösung in Aliquote bei-80 ° c aufbewahren
- Bewerten Sie die Reinheit der eluierten IL4-10 Schmelzverfahren Protein von Coomassie gefärbt 12 % SDS-PAGE Gel und HP-SEC (Spalte 3 µm SEC-2000). Laden Sie für HP-SEC Analyse 40 µL des Proteins bei der Konzentration von ~ 1 mg/mL in der Spalte. 100 mM Natriumphosphat Puffer mit 150 mM Natriumchlorid verwenden (pH = 6,8) als mobile Phase. Die Durchflussmenge bei 1 mL/min eingestellt.
- Bestimmen die Konzentration von jeder Charge eines gereinigten IL4-10-Fusionsprotein IL10 ELISA und Bicinchoninic Säure Protein Assay (BCA Protein Assay Kit, siehe Tabelle of Materials) entsprechend des Herstellers Protokollen.
- Verwenden Sie rekombinante menschliche IL10, erstelle ich eine Standardkurve in der ELISA-Test. Der Größenunterschied zwischen rekombinante IL10 korrigieren (18 kDA) und IL4-10 Schmelzverfahren Protein (34 kDa), Multiplizieren Sie die erhaltenen Konzentration um den Faktor 1,8.
- Bioaktivität des Fusionsproteins IL4-10
Hinweis: Der Vollblut-Test erfolgt für jede Charge von IL4-10 Schmelzverfahren Protein produziert und die Aktivität verschiedener Chargen wird als Teil der Qualitätskontrolle verglichen. Der Vollblut-Test erfolgt in frischem Menschenblut gesammelt am Tag des Tests in Heparin-Röhrchen. Gesunden Freiwilligen in unserem hauseigenen Spender-Service wurde Blut entnommen. Proben sollten als potentiell biologische Gefahren behandelt werden.- 3-fold Pre-Verdünnungsreihen des gereinigten IL4-10 Fusionsproteins in RPMI Medium vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) über eine Konzentration reichen 5-1.215 ng/mL.
- Bereiten Sie vor Verdünnungen von LPS (100 ng/mL) und menschlichem Blut, die 4 Mal in RPMI Medium verdünnt wird.
- Pipette die Pre-Verdünnungen der IL4-10 Schmelzverfahren Protein, LPS und menschliches Blut in einem 48-Well-Platte. In jede Vertiefung 50 µL IL4-10 Fusionsprotein (Endkonzentration 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI Medium, 25 µL LPS (Endkonzentration 10 ng/mL) und 100 µL Menschenblut hinzufügen (Final verdünnt).
Hinweis: Gesamtvolumen pro Bohrloch ist 250 µL. - Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 8 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für 18 h.
- Werten Sie die Konzentration von TNF in Kultur Überstände mit einem TNFα ELISA gemäß des Herstellers Protokoll aus.
- Die Hemmung der Entzündungsreaktion durch IL4-10 Schmelzverfahren Protein nach folgender Formel berechnen: % Hemmung = (1-(A-B)/(C-B)) X 100
Hinweis: Hier eine TNF Ebenen in LPS stimulierte Kulturen behandelt mit IL4-10 Schmelzverfahren Protein, B = = TNF Ebenen unstimulierte Kultur, und C = TNF Ebenen in LPS stimulierte Kultur.
(2) Maus-Modell für anhaltende entzündliche Schmerzen
Hinweis: Es ist wichtig, sowohl weibliche als auch männliche Mäuse (C57Bl/6) zu verwenden, weil dies die Identifizierung des Geschlechts-abhängige Effekte zu ermöglichen. Im Allgemeinen sind die Mäuse verwendet zwischen 8-16 Wochen alt. Zur Ermittlung der Anzahl der Tiere sollte macht Berechnungen durchgeführt werden. Web-basierte Tools für solche Berechnungen sind leicht über das Internet (z.B. Http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net) zu finden.
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Induktion von chronischen entzündlichen Schmerzen
Hinweis: Induzieren Sie anhaltende entzündliche Schmerzen bei Erwachsenen Mäusen mit intraplantar Injektionen von Carrageen oder komplette Freuds Adjuvans (CFA). Die verschiedenen Tests stören einander nicht.- Carrageen (2 % w/V) durch Auflösen der λ-Carrageen vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) in 0,9 % NaCl indem man die Lösung durch ein 23-Gauge-Nadel zu gewährleisten, dass das Carrageen richtig aufgelöst wird. Bereiten Sie eine frische Lösung direkt vor die Injektion durchgeführt wird.
- Alternativ, wenn CFA verwendet wird, mischen Sie die CFA Lösung richtig vor der Injektion es intraplantarly, weil die CFA ist eine Wasser-in-Öl-Emulsion mit 1 mg der Mycobacterium-Tuberkulose (H37Ra) Hitze getötet und getrocknet, 0,85 mL Paraffin-Öl und 0,15 mL mannide Monooleate (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Glas Hamilton Spritzen mit metallischen Kolben sind empfohlen, für die Injektion dieser Verbindung, weil Kautschuk Kolben mit dem Öl in der adjuvanten reagieren können. -
Intraplantar Injektion
- Aufrechterhalten der Verbindung (Schritte 2.1.1 oder 2.1.2) in der Spritze bei RT für mindestens 15 Minuten vor der Injektion ermöglicht Anpassung an RT. injizieren 20 µL der Verbindung (oder Lösungsmittel als Kontrolle) subkutan in der Hinterpfote der nicht narkotisierten Maus mit einer 30-Lehre Nadel.
- Stechen Sie die Nadel an der Basis der Daumen Leitung bis zur Ferse und die Verbindung zu injizieren, wenn die Nadel eingeführt wird ca. 0,5 cm. Nach der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs während die Spritze zur Vermeidung von Leckagen der Lösung aus der Injektionsstelle leicht drehen.
3. Schmerz Messungen
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Forscher, die Durchführung der Verhaltensexperimente blind für die Maus-Behandlung sind. Es ist wichtig, die Tiere an die Testumgebung akklimatisieren vor der Durchführung einer Messung. Vorzugsweise liegen die Woche vor Beginn der Experimente Tiere 1-2 Mal für 15-30 min in jedem der verschiedenen Geräte, die für die Durchführung der Tests verwendet. Beim Umgang mit Männern und Frauen im gleichen Experiment bewerten Sie Männer unabhängig von Weibchen. Saubere Käfige und Oberflächen ausgiebig zwischen den verschiedenen Gruppen, um mögliche unerwünschte Wirkungen auf das Verhalten der verschiedenen Geschlechter zu vermeiden. Messen Sie Grundlinie Rückzug Latenzen oder mechanische Schwellenwerte zwei bis dreimal genau Grundlinie Schwellenwerte zu bestimmen und festzustellen, ob diese vor intraplantar Injektion von eine Verbindung stabil sind.
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Von Frey Test: mechanische Empfindlichkeit auf harmlose Reize
- Legen Sie die Tiere einzeln in Acryl Käfige auf einem Draht Gitter Stand und lassen Sie die Mäuse für mindestens 15 Minuten vor der Messung zu akklimatisieren.
- Bewerten Sie mechanische Empfindlichkeit durch die Messung der Pfote Rückzug Schwellenwerts als Reaktion auf eine kalibrierte Reihe von Frey Haare von 0,02 bis hin zu 4 g. betrachten jede Bewegung die Pfote vom angewandten Haar als positive Rückzug Antwort. Gelten Sie die Filamente, die senkrecht auf die Pfote mit ausreichender Kraft zu verursachen leichte Biegung auf der Haut und halten Sie für ~ 3 S. stellen sicher, dass das Haar während der Anwendung auf die Pfote nicht verdreht.
- Berechnen Sie die Schwelle von 50 % Pfote-Entzug mit der wechselvollen Methode15,21.
Hinweis: Die erste Filament anzuwenden ist 0,4 g (andere ab Filamente verwendet werden abhängig von den Schwellen diese Mäuse zu Studienbeginn anzeigen). Ein Ausbleiben einer Reaktion auf einen Heizfaden zeigt, dass der nächste dickere Faden in die folgenden Stimulation verwendet wird, während eine positive Reaktion die Verwendung von der nächsten dünner Faden zeigt. Die Anzahl der Haare Präsentationen richtet sich nach der ersten differenzierte Antwort; Danach werden 5 weitere Anwendungen durchgeführt. Berechnen Sie die Schwelle von 50 % nach den Methoden bereits15,21beschrieben.
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Thermische Empfindlichkeit: Hargreaves Test
- Setzen Sie die Tiere in Käfigen auf einer Glasplatte vorgewärmt (30 ° C) und lassen Sie die Mäuse zu akklimatisieren für mindestens 15 Minuten vor Messungen, warten, bis die Tiere still zu sitzen.
- Bestimmen Sie Hitze Rückzug Latenzzeiten durch Erhitzen die Pfote der Tiere durch eine fokussierte sichtbaren Lichtstrahl mit einem Hargreaves-Apparat (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Die Intensität des Strahls ist standardmäßig mit 12 %, da mit dieser Intensitätseinstellung experimentell ermittelten des Lichtstrahls Rückzug Antwort von einer durchschnittlichen Zeit von 8 evoziert s bei Studienbeginn an C57Bl/6 Mäusen. Die Intensitätseinstellung sollte pro Einzelmaschinen und Maus Belastung ermittelt werden. Maximale Annahmeschlusszeiten 20 s oder mehr werden verwendet, um Verletzungen der Tiere zu vermeiden. - Messen Sie die Rücknahme Latenzzeiten ~ 4 mal pro Tier. Durchschnitt aller Antworten gemessen. Jede Pfote unabhängig zu messen, und mit mindestens 1 min Intervalle zwischen den nachfolgenden Messungen im selben Pfote.
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Posturalen Defiziten: Dynamisches Gewicht tragenden Test
- Messen Sie das Körpergewicht des Tieres vor dem Test, da tragende Analyse das Körpergewicht jedes einzelnen Tieres als Eingabeparameter benötigt.
- Legen Sie die Tiere einzeln in einem Stock instrumentiert dynamischen Belastung System auf ein Cover unterstützt eine Kamera, die Mausbewegungen aufzeichnen wird montiert. Lassen Sie das Tier für 0,5 bis 1 min vor der Aufnahme für 5 min zu akklimatisieren.
Hinweis: In diesem Test kann nur einen frei beweglichen Tieren gleichzeitig ausgewertet werden. - Passen Sie Einstellungen an, um Belastung durchführen und die Daten zu analysieren.
Hinweis: In diesen Experimenten, verwenden wir die folgenden Parameter: (i) Low Gewichtsgrenze von 0,6 g: Dies ist das Mindestgewicht erforderlich, eine der Zellen des Sensors zu aktivieren. (Ii) hohe Gewichtsgrenze von 1 g: Diese Zahl das Gewicht benötigt gibt, um eine Zelle voll zu aktivieren. (Iii) Oberfläche Schwelle von 2 Zellen: Diese Zahl gibt die Anzahl der Zellen nebeneinander, die aktiviert werden, um in Betracht gezogen werden müssen. (iv) die minimale Anzahl von Bildern ist 5: es dauert 0,1 s, jedes Bild zu erfassen. Die Zahl gibt die minimale Anzahl der Frames in denen die Maus nicht bewegt. Der Wert 5 bedeutet, die Haltung die Maus muss stabil sein > 0,5 s, um eine Messung zu erhalten, die für die Analyse berücksichtigt wird. - Die Analyse jedes Video indem Sie das Video wiedergeben, und sicherzustellen Sie, dass jedes Glied richtig von der Software an den Zeitrahmen angegeben von der Software erkannt wird.
Hinweis: Ein Minimum von 1 min die Aufnahmezeit muss validiert werden. Die dynamische Belastung Software berechnet und liefert die folgenden Parameter: (i) das Gewicht jedes einzelnen Pfote in Gramm und als Prozentsatz des gesamten Körpergewichts Lasten. (Ii) das Gewicht von der kombinierten Vorderpfote oder die kombinierte hinteren Pfoten in Gramm und als prozentualer Anteil der gesamten Körpergewicht getragen. (Iii) das Verhältnis der linken/rechten Pfoten Gewicht Lager oder vorne/hinten Gewichtsbelastung. (iv) die Fläche der einzelnen Pfote oder kombinierte vorderen/hinteren Pfoten, die das sensible Druckpolster aktiviert. (V) Mittelwert und Standardabweichung für jeden Parameter. (vi) Dauer der verschiedenen Körperhaltungen (Aufzucht, 3 Pfoten oder 4 Pfoten) während des gesamten Experiments. (Vii) Zeit (s) jede Pfote Gewicht während des gesamten Experiments.
4. intrathekale Injektion von IL4-10 Schmelzverfahren Protein für Analgesie
Hinweis: Bestätigen Sie, dass die Lüftung in den Raum offen für richtige Luftstrom zu gewährleisten. Gegen Fahrzeug-Injektionen und Injektionen von der Kombination der einzelnen Zytokine (IL4, 0,5 µg + IL10 0,5 µg/Maus, 5 µL Gesamt Injektionsvolumen) sollte getestet werden, um die Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10 (1 µg/Maus; 5 µL Gesamt Injektionsvolumen) zu testen.
- Die Maus mit 3-4 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Flussrate von 2 L/min in der Induktion-Kammer zu betäuben. Überprüfen Sie, dass die Maus richtig betäubt ist, durch Kneifen die Pfote um sicherzustellen, dass das Tier nicht reagiert.
- Statt der Maus auf dem Tisch mit dem Kopf in die bugnase des Apparates und pflegen die Maus Sedierung mit 1,5-2 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Flussrate von 2 L/min, während die intrathekale Injektion durchführen.
- Rücken-Füllung mit injizierbaren Verbindungen in ein Glas sauber 25 µL Hamilton-Spritze eine 27-Gauge-Nadel verbunden.
- Halten Sie die Maustaste fest durch die Wirbelsäule posterior an den Rippen und heben Sie die Maus. Legen Sie die Nadel senkrecht zwischen den Lendenwirbeln L5 und L6 und legen Sie es durch die Haut direkt in der Mitte der Lendenwirbel. Legen Sie die Nadel in die Bandscheibe Raum.
Hinweis: Die Bandscheiben Raum finden möglicherweise einige 'Suche' durch die Bewegung der Nadel entlang der rostral ventralen Achse, die Nadel leicht drücken, bis ein Verlust des Widerstandes von Knochengewebe zu spüren ist.- Korrekte Ausrichtung durch überprüfen, ob eine Tail Flick kam zu bestätigen. 5 µL der Verbindung langsam zu injizieren, ein paar Sekunden warten und dann langsam zurückziehen der Nadelöhrs. Wenn nur eine einzelne Pfote Flick beobachtet wird, dürfte die Nadel nicht richtig platziert.
- Nach der Injektion Überprüfen der Maus eng für die ersten 30 min nach der Wiederherstellung aus der Narkose, das Fehlen jeder motor Beeinträchtigung/Lähmung zu gewährleisten.
Bemerkung: Schmerzen Verhalten kann (wie beschrieben in Abschnitt 3) gemessenen 15 Minuten nach der Wiederherstellung.
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Representative Results
Ein repräsentatives Bild von einem SDS-PAGE-Gel mit verschiedenen Fraktionen erhalten während Affinität Chromatographie Reinigung zeigt Abbildung 1A. In der Last (L) und die Durchströmung (FT) Brüche werden alle Proteine im HEK293 überstand beobachtet. Kein Protein wird in der Wäsche (W)-Fraktion beobachtet. In der Elution (E)-Fraktion sind zwei Bänder aus 35 und 37 kDa beobachtet, zwei verschiedene Glycoforms von IL4-10 Schmelzverfahren Protein (Pfeile) entspricht. In Abbildung 1B, einen repräsentativen Potenz-Assay in einem Vollblut ist Assay von zwei verschiedenen IL4-10 Fusion Protein Chargen dargestellt. Eine dosisabhängige Hemmung der LPS-induzierte TNF-Release wird beobachtet, zeigt vergleichbare Bioaktivität für die zwei IL4-10 Fusion Protein Chargen.
Als nächstes zeigt ein Beispiel der Testergebnisse repräsentative Experimente in denen IL4-10 Fusionsproteins getestet wird, um anhaltende entzündliche Schmerzen hemmen (Abbildung 2). Anhaltende entzündliche Schmerzen wurde durch intraplantar Injektion von 2 % Carrageen induziert. Mechanische (Abb. 2A) sowie thermischen Hyperalgesie (Abbildung 2B) im Laufe der Zeit folgten. Am 6. Tag nach Induktion der entzündlichen Schmerzen wurden Mäuse Intrathecally mit dem Fusionsprotein IL4-10 oder dem Träger als ein Steuerelement injiziert. IL4-10 deutlich gelöst, Maschinenbau (Abb. 2A) und thermischen Hyperalgesie (Abbildung 2B) und erreicht seine maximale Wirkung nach 24 Stunden nach der Injektion. Im Idealfall sollte die Wirksamkeit des Fusionsproteins in Schmerz Hemmung auch gegen äquimolaren Konzentrationen der einzelnen Zytokine zu testen, ob ihre Fähigkeit, Schmerzen zu verhindern besser als die Summe der einzelnen Zytokine ist getestet werden. Diese Daten werden hier nicht angezeigt, sondern verweisen wir auf einer kürzlich erschienenen Publikation, die diese Daten9anzeigt.
Die Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10 wurde vor kurzem in der CFA-induzierte entzündliche Schmerzen Modell9getestet. In diesem Experiment wurden mehrere Injektionen des Fusionsproteins IL4-10 verwalteten Intrathecally. Mehrere Injektionen aufgelöst vollständig CFA-induzierte anhaltende entzündliche Hyperalgesie, mit Hilfe von Frey und Hargreaves Tests, das Potential des Fusionsproteins IL4-10 als eine analgetische Behandlung9gemessen. Hier zeigen wir, dass intraplantar CFA Injektion auch einen Rückgang der Belastung der betroffenen Pfote (Abbildung 3A-B) induziert. Intrathekale Injektion von IL4-10 Schmelzverfahren Protein am Tag 7 nach intraplantar CFA Injektion, der Rückgang der Belastung der betroffenen Pfote im Vergleich zum Fahrzeug injiziert Mäuse 2 Tage nach IL4-10 Fusion Protein Verwaltung (Abbildung 3Bgedämpft ).
Abbildung 1 : Aufreinigung und Charakterisierung des Fusionsproteins IL4-10. (A) Coomassie gefärbt SDS-PAGE-Analyse der Affinität Chromatographie Fraktionen: L: Last, FT: Durchströmung, W: Waschen, E: Elution. (B) funktionelle Assay: IL4-10 Fusion Protein Dosierung hemmt Abhängigkeit TNF-Produktion in der LPS stimulierte Vollblut Kultur (ausgedrückt als prozentuale Hemmung gegenüber Kulturen angeregt mit LPS allein). Daten werden dargestellt als Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Hemmung der entzündlichen Hyperalgesie durch IL4-10 Fusionsproteins. Entzündlichen Schmerz wurde durch eine intraplantar Injektion von 20 µL 2 % Carrageen (Auto) induziert. Sechs Tage nach intraplantar Injektion erhalten Mäuse eine intrathekale Injektion (Pfeil) von 1 µg IL4-10 Schmelzverfahren Protein oder Fahrzeug (PBS). (A) mechanische Überempfindlichkeit (Log Schwelle von 50 % (g)) wurde im Laufe der Zeit mit Hilfe Von Frey-Test gemessen und (B) thermische Empfindlichkeit (Latenz (s)) wurde mit Hargreaves Test gemessen. Als Mittelwert ± SEM Sternchen signifikante Unterschiede von zwei-Wege-ANOVA, zwischen Fahrzeug und IL4-10 injiziert Tiere analysiert repräsentieren Daten dargestellt. **, *** = p < 0,01 und p < 0,001, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Entzündung-induzierten Veränderungen in Gewichtsbelastung. Entzündlichen Schmerz wurde durch eine intraplantar Injektion von 20 µL des kompletten Freuds Adjuvans (CFA) induziert. Belastung auf jede Pfote wurde mittels der dynamischen Gewicht lagervorrichtung gemessen. Gewichtsbelastung in Gramm die betroffene Pfote (ipsilateral Hinterpfote) und das Gesamtgewicht Lager der nicht betroffenen Pfoten (Vorderpfoten und kontralateralen Pfote) wird angezeigt, sowie das Verhältnis der Belastung der ipsilateralen Pfote im Vergleich zu den anderen 3 Pfoten. (A) Verlauf der Belastung während der CFA-induzierte Entzündung (n = 10). (B) am 7. Tag nach intraplantar CFA, Mäuse erhielt eine intrathekale Injektion von 1 µg IL4-10 Schmelzverfahren Protein oder Fahrzeug (PBS). Gewichtsbelastung wurde auf 0 und 7 Tage nach intraplantar CFA und 2 Tage nach Verabreichung des Fusionsproteins IL4-10 gemessen. Gewichtsbelastung der ipsilateralen Pfote im Vergleich zu den anderen 3 Pfoten vertreten (n = 3-4). Daten werden dargestellt als Mittelwert ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0,05 im Vergleich zum Ausgangswert (Tag 0). # = p < 0,05 im Vergleich zu Tieren Fahrzeug behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt Methoden für die Herstellung und Charakterisierung von einem rekombinanten Fusionsprotein IL4-10 und Methoden, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Hemmung von entzündlichen Hyperalgesie in Mausmodellen der entzündlichen Dauerschmerzen. Die Herstellung und Reinigung des Fusionsproteins IL4-10 wird in kleinem Maßstab durchgeführt. HEK293 Zellen werden als Ausdruck System für die Proteinproduktion ausgewählt, weil sie Post-translationalen Modifikationen ermöglichen, die in prokaryotischen Expressionssysteme nicht erreicht werden kann. Post-translationalen Modifikationen für Proteinfunktion relevant sind, und das Fehlen solcher Änderungen könnte betreffen die therapeutische Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10. Das Protein wird von Kultur Überstand durch Affinitätschromatographie gereinigt. Wir haben im eigenen Haus gemacht monoklonaler Antikörper gegen IL4 für Affinitätsreinigung und nicht auf eine IL4-10 Schmelzverfahren Protein mit einer Beschriftung für Reinigung mit einer Affinität-Tag-System ermöglichen zu produzieren. Der Grund dafür war, Vermeidung von Tag-im Zusammenhang mit Veränderungen in der Proteinfaltung und Funktion. Dennoch, wenn ein hochselektiver monoklonaler Antikörper fehlt, ein Protein mit einem Tag entwickelt werden, z. B. muss ein seinen Tag. In diesem Fall wird es wichtig sein, festzustellen, ob die C oder N-Terminus des Proteins am besten geeignet für die Beschriftung ist zu vermeiden, Proteinfunktion beeinträchtigen.
Aus 1 L HEK293 überstand etwa 3 mg gereinigte IL4-10 Schmelzverfahren Protein erhalten, aber dies kann von Charge zu Charge variieren. Die Spalte für die Affinitätsreinigung kann für mehrere Zyklen der Reinigung vor der Entsorgung verwendet werden. Der heikelste Schritt in die Reinigungsprozedur ist die Elution von IL4-10 Schmelzverfahren Protein aus der Spalte durch niedrigen pH-Wert, weil der niedrige pH-Wert irreversible Protein-Denaturierung und Proteinfällung induzieren kann. Somit ist die Aufrechterhaltung der nativen Protein-Struktur und das Fehlen von proteinaggregaten unerlässlich für gute Qualität Chargen. Zu diesem Zweck muss Bewertung der Bioaktivität des Fusionsproteins getestet in Vitro vor und nach der Reinigung mit verschiedenen Elution Puffern. Nach der Reinigung des Fusionsproteins IL4-10 wurde die Bioaktivität nicht im Vergleich zu nicht-gereinigte Protein reduziert. Darüber hinaus Aggregatbildung war abwesend, der Elution Schritt mit 0,1 M Glycin Puffer durchgeführt wurde (pH = 2,5), und der pH-Wert der Elution Fraktionen wurde sofort neutralisiert, mit 1 M Tris-Puffer (pH = 9).
Die Konzentration des gereinigten IL4-10 Fusionsproteins wird auf der Grundlage der menschlichen IL10 ELISA-Ergebnisse geschätzt. BCA Protein Assay wird verwendet, um die proteinkonzentrationen bestätigen. Wiederherstellung des Proteins nach Reinigung ausgewertet wird basierend auf Konzentrationen in Last, Durchströmung, Wasch- und Elution Brüche durch IL10 ELISA gemessen. Die BCA-Protein-Konzentrationsbestimmung des Fusionsproteins IL4-10 kann nur in Bruchteilen dialysierten Elution ausgewertet werden. Non-dialysiert Elution Brüche enthalten Imidazol, eine Substanz, die die BCA-Messung auswirkt. Non-gereinigte Brüche enthalten andere Proteine aus dem Kulturmedium HEK293.
Die Bestimmung der Bioaktivität des Fusionsproteins IL4-10 wird in einem Vollblut-Assay durchgeführt. Die Bioaktivität des Fusionsproteins IL4-10 sollte bewertet werden, im Vollblut von mehreren Geldgebern zu bestimmen, ob funktionelle Aktivität beibehalten wird. Mehrere Spender sind erforderlich, da Spender, Spender Varianz in der Fähigkeit der IL10 und IL4, TNF LPS-induzierte Freisetzung hemmen vorhanden ist. Darüber hinaus kann Ausdruck von IL4R und IL10R zwischen den Gebern, beeinträchtigen die Fähigkeit des Fusionsproteins IL4-10, LPS-induzierte TNF-Produktion hemmen abweichen.
Die beschriebenen Methoden detailliert wir 2 Maus-Modellen der entzündlichen Dauerschmerzen zur Bewertung der Wirksamkeit des Fusionsproteins IL4-10, Schmerzen in Vivozu lösen. Dennoch sollte die Moleküle für vollständige Bewertung das analgetische Potenzial von rekombinanten Fusionsproteinen in anderen Modellen von chronischen Schmerzen sowie getestet werden. Diese Modelle beinhalten, aber beschränken sich nicht auf Modelle der Nervenverletzung und Chemotherapie-induzierte neuropathischen Schmerzen9,22. Obwohl die von Frey und Hargreaves Test häufig Analgetika zu Testzwecken verwendet werden, ist klar geworden, dass ein zusätzlicher Test (z.B. dynamische Gewicht tragenden Test) aufgenommen werden sollen, um die Auswirkungen auf nicht-evozierten Schmerzen Behaviorsand auch mit die operante Schmerzen Assay (z.B. Klimaanlage Platz Präferenz (CPP), die nicht-evozierten Schmerzen Verhaltensweisen17,18zu erkennen). Um CPP durchzuführen, sollte der Beginn der schmerzhemmenden Wirkungen des Fusionsproteins, berücksichtigt werden da Konditionierung der Tiere durch Schmerzlinderung schnell wirkende Analgetika erforderlich (die Effekte in weniger als 15 min ausüben). Dennoch, wenn die Testverbindung einen langsamen Wirkungseintritt analgetischen hat, aber wahrscheinlich ist zu lang anhaltende Schmerzen Hemmung (mehr als 4 Tage) induzieren, CPP noch lässt sich testen, ob die Verbindung Schmerz gehemmt. In diesem Fall muss Verbindung verursachten Verlust der Konditionierung mit schnell wirkenden Analgetika beurteilt werden.
Intrathekale Injektion sind als eine Art der Verabreichung, ausgewählt, da die Verbindung Schmerz relevante Bereichen wie Dorsal Root Ganglien und Rückenmark erreichen wird. Vor allem, intrathekale Lieferung von Analgetika ist gängige Praxis zur Behandlung von Patienten mit chronischen Schmerzen geworden, da dieser Ansatz die Dosis von Analgetikum benötigt reduziert und Toxizität und systemische Nebenwirkungen verringert. Dennoch hat diese Verwaltung Route einige Einschränkungen; Es erfordert gut ausgebildetes Personal und aufgrund der kleinen Subarachnoidalraum sollte das Volumen der Injektion auf 5 µL bei Mäusen, dass hochkonzentrierte Lösungen des Fusionsproteins begrenzt werden. Die Technik der intrathekalen Injektionen erfordert Training. Eine solche Ausbildung kann auf nicht erholt narkotisierten Tiere mit Injektion eines Farbstoffes zur Überprüfung der korrekten intrathekale Injektion durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Teil dieser Arbeit wurde gefördert durch eine Utrecht University Life Sciences gewähren
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
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