Summary
במאמר זה אנו מספקים פרטים עבור שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון רקומביננטי פיוז'ן IL4-10. אנו גם מראים כיצד לבחון את היעילות של חלבון זה כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאבים דלקתיים.
Abstract
כאב כרוני קשה לטיפול, גישות חדשות כדי לפתור כאב מתמשך נחוצים בדחיפות. ציטוקינים אנטי דלקתיות הם מועמדים מבטיחים לטיפול במצבים מתישה כאב בשל יכולת שלהם להסדיר אינטראקציות נוירו-החיסון חריגה. עם זאת, מבחינה פיזיולוגית הם עובדים ברשת של ציטוקינים שונים, ולכן האפקט הטיפולי שלהם לא יכול להיות אופטימלית בשימוש כטיפול עצמאי סמים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו חלבון פיוז'ן של ציטוקינים אנטי דלקתיות IL4 ו IL10. כאן, אנו מתארים את שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון כימרי רקומביננטי IL4-10, נוכל לבחון את היעילות של החלבון פיוז'ן IL4-10 כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאב דלקתי מתמשך.
Introduction
כאב כרוני נותרה אחד ביותר מתישה, שטופלו תחת בעיות רפואיות של המאה ה-21, המשפיעים על > 20% של אוכלוסיית הבוגרים1,2. עם זאת, טיפולים כדי לספק הקלה מכאב כרוני לעיתים קרובות אינם יעילים או צריך להיות הופסק בשל תופעות לוואי חמורות3. חשוב, כיום סמים זמינים רק לספק הקלה סימפטומטי, אבל לא באופן משמעותי לשנות או לרפא כאב כרוני. למרות כאב כרוני נראה הפרעה נוירולוגית, הראיות עולה מעורבות של מערכת החיסון כאב כרוני פיתוח4,5. יתר על כן, מתגלים גישות החיסון לטיפול בכאב. לדוגמה, לעכב ציטוקינים אנטי דלקתיות כאבים במספר דגמים של כאב כרוני-6,-7,-8. אולם, ציטוקינים אנטי דלקתיות יש תוחלת חיים קצרה, הפחתת תופעות כאב עיכוב האפשריות שלהם. יתר על כן, ציטוקינים אנטי דלקתי עובדים ביותר בצורה אופטימלית בתיאום אחד עם השני. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנחנו לאחרונה התמזגו ציטוקינים אנטי דלקתיות אינטרלוקין-4 (IL4) של אינטרלוקין-10 (IL10) לתוך מולקולה אחת. חלבון כימרי IL4-10 מראה יעילות מעולה עיכוב כאב דלקתיות, נוירופטי כרוני לעומת ציטוקינים בודדים9. כאן נתאר כיצד מופק חלבון כימרי כזה, מטוהרים, ונשלט איך האיכות שלה.
חלבון כימרי IL4-10 מיוצר בתאי אדם על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK293-F עם וקטור ביטוי pUPE נושאת את רצף cDNA קידוד החלבון פיוז'ן IL4-10. HEK293-F תאים נבחרים כדי לאפשר שינוי post-translational של החלבון, משהו אינה מתרחשת במערכות חיידקי הביטוי. כדי למטב את glycan מיצוי בחומצה sialic, cDNA קידוד בטא-galactoside-2, 3-sialyl-טרנספראז משולב וקטור כמו transgene השני. החלבון פיוז'ן מטוהר באמצעות זיקה טיהור חלבון של התרבות supernatant כי זה חזק יותר טיהור על ידי שיטות למשל גודל-הדרה או יונים כרומטוגרפיה10,11אחרים. לטהר את חלבון כימרי IL4-10, השתמשנו נוגדנים חד-שבטיים תוצרת הבית נגד IL4. הערכה של טוהר, bioactivity של חלבון כימרי IL4-10 מטוהרים מבוצעת כחלק של בקרת איכות. הטוהר של אצוות המיוצר מוערך על-ידי נתרן Dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) ו גבוהה בלחץ גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (HP-שניות). Bioactivity של החלבון פיוז'ן IL4-10 מוערך על-ידי מדידת את יכולתו לעכב ליפופוליסכריד (LPS)-induced הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNFα) ייצור בתרבויות דם מלא, והשוואה בין שהיא השילוב של הפרט ציטוקינים.
לבסוף, על מנת לבדוק את היכולת של IL4-10 היתוך חלבונים כדי לעכב כאב כרוני, נתאר איך ניתן לבחון את חלבון כימרי כמו כאבים במודלים של העכבר בשימוש נרחב של כאב דלקתי מתמשך12,13,14 . כאן נתאר את השיטות של מודל כאבים דלקתיים. עם זאת, חשוב לציין כי מודלים אחרים הכאב יכול להיות משומש (למשל, כאב נוירופתי מודלים), בהתאם למחקר שאלות שצריך לענות. כדי להעריך קוץ מודלים אלה, חשוב להשתמש במגוון אמצעים התנהגותיים הכוללים עורר ואמצעים שאינם עורר הכאב. כאן, אנחנו תיאר שיטות הערכה לקראת שינויים באופן מכני, תרמית עורר תגובות התנהגותיות. מכני רגישות לגירויים לא מזיק מוערך באמצעות מבחן פון פריי, תוך רגישות תרמית מוערך באמצעות מבחן הארגריבס. חשוב, hyperalgesia/allodynia-עורר נמדד באמצעות מבחן נושאת משקל דינמי. אמצעים אלה מקובל כמידות כאב, תשואות מידע חשוב על סף כאב וכאב פוטנציאליים מנוסים על ידי בעלי חיים15,16,17. השני מודד להערכת שאינם עורר הכאב (למשל, גירוי עצמאית), כגון הבחינה העדפה המקום ממוזגים, יכול להיות בעל ערך18. כדי להעריך את הפוטנציאל של הסם כדי לעכב את הכאב, ביצענו במחלה הניהול של החלבון פיוז'ן, עם מסלול מינהל פחות חלבון במינון הדרוש כדי להגיע לאזורים הקשורות כאב ולהימנע מערכתית (לוואי) אפקטים19, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומיות ואישור מראש של הוועדה המקומית אתית ניסיוני. דם הושג משירות התורם מיני (מיני התורם שירות, MDD)-אוניברסיטת רפואי למרכז אוטרכט (UMCU) בהולנד. MDD קיבלה אישור חיובי של ועדת האתיקה הרפואית של UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) עבור פרוטוקול מספר 07-125/ג
1. חלבון הפקה ואפיון
- תרבית תאים
הערה: ראה את הטבלה של חומרים בינונית תרבות בשימוש.- להפשיר את התאים HEK293-F ב 37 ° C עד שיש גוש קטן של קרח. העבר את התאים המופשרים מיד 10 מ"ל של מדיום קר כקרח (4 ° C), centrifuge התליה תא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 4 דקות (דקות) ב 500 x g.
- הסר את המדיום, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל בינוני טריים-RT, ואחריו צנטריפוגה ב 500 x g למשך 4 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 5 מ של בינוני-RT. הוסף התליה תא ישירות לתוך בקבוקון 125 מ ל המכיל 25 מיליליטר מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס). התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 8% CO2ו- 95% לחות על תפקודי לב / מסתובב במהירות של 125 סל ד.
- תת-תרבות התאים פעמיים בשבוע. השתמש תא אוטומטיות מונה (ראה טבלה של חומרים) כדי להעריך את מספר הטלפון ואת הכדאיות תא. הזרע התאים קיימא-ריכוז של 3 x 105 תאים למ"ל לתוך מבחנות Erlenmeyer. שמור הנפח הכולל של המדיום התרבות ב- 1/5 מהנפח הכולל של תרבות Erlenmeyer המבחנות בכל עת לשמור על אוורור אופטימלית.
- תרביות תאים
הערה: תת-תרבות התאים שלוש עד ארבע פעמים לפני תרביות תאים, transfect אותם כאשר הכדאיות תא > 90%. תא הכדאיות מוערך על ידי ממוכנת (שדה חשמלי רב ערוצית) cellcounting מערכת המבוססת על התקינות של קרום פלזמה. ראה את הטבלה של חומרים הכימית תרביות תאים.- Centrifuge את התאים ב RT עבור 4 דקות ב 500 x g; resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של תרבות מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס), לדלל התליה תא ~1.0 x 106 תאים/מ בהנפח הכולל של ל' 1 Aliquot התליה תא ב 10 aliquots של 100 מ ב- 500 מ"ל Erlenmeyer המבחנות.
- למהול 1 מ ג של פלסמיד DNA במדיום חיוני מינימלי מופחתת-סרום 33 mL (גברתי, ראה טבלה של חומרים) על ידי ערבוב עדין. בשפופרת נפרדים, לדלל 1,330 µL של תרביות תאים ריאגנט ב MEM על ידי ערבוב עדין. דגירה שני פתרונות ב- RT 5 דק הוספה, לערבב את ה-DNA מעורבבת עם הגברת כדי הכימית תרביות תאים, גברתי, דגירה לערבב למשך 30 דקות ב- RT.
- להוסיף את התמהיל ריאגנט DNA-תרביות תאים לתאים (תרבותי בסעיף 1); להוסיף 6.6 מיליליטר לערבב כל 500 מ"ל המכיל 100 מ של תאים תרבות בינוני את הבקבוק Erlenmeyer. לשמור את התאים בתנאים כאמור תרבות. לקצור את תגובת שיקוע תרבות המכיל חלבון כימרי IL4-10 על ידי שלושה ימים לאחר תרביות תאים.
- לקבוע את הריכוז של חלבון כימרי IL4-10 בתרבות supernatant על ידי ביצוע של אליסה IL10 לפי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים).
הערה: בתנאים אופטימליים תרבות, ריכוז החלבון פיוז'ן צפויים להיות בין 2.5, 5 µg/mL.
- חלבון טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה
הערה: כרומטוגרפיית זיקה מתבצע בטמפרטורת החדר. עם זאת, כל שברים (תרבות תגובת שיקוע, עומס, הזרימה ו • תנאי-שברים) נשמרים בקירור במהלך ההליך.- זוג תוצרת הבית in נוגדנים חד שבטיים כנגד IL4 עד 1g של ברומיד - 10 מ ג הופעל sepharose 4B, על-פי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים). שופכים 2.5 מ של sepharose בשילוב חרוזים לאט לתוך העמודה כרומטוגרפיה זכוכית (30 ס מ אורך וקוטר פנימי 1.5 ס מ, ראה טבלה של חומרים).
- לחסום מחייב אתרים של החרוזים על-ידי העברת 50 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) המכיל 1% הנותרים שור אלבומין דרך העמודה. לשטוף את העמודה עם 25 מ של PBS (ה-pH = 7.4) ואחריו מ"ל של 0.1 M גליצין מאגר (pH = 2.5), 25 מ של PBS (pH = 7.4).
- עוברים 100 מ של תרבית תאים HEK293 מרוכז 10-fold supernatant באמצעות המדור בספיקה של 1 מ"ל לדקה לשטוף את העמודה עם 50 מ של PBS.
- Elute של חלבון כימרי IL4-10 מאוגד עם מ"ל של 0.1 M גליצין מאגר (ה-pH = 2.5) בספיקה של 1 mL/min ולאסוף שברי 2.5 מ ל. להוסיף 350 µL מאגר טריס 1 מ' (ה-pH = 9) את כל השבר כדי להביא את ה-pH 7. Dialyze שברים ינוטרלו בן לילה נגד 2 ל' ל- PBS (ה-pH = 7.4).
- השתמש דיאליזה אבובים עם 16 מ"מ קוטר יבש, ניתוק משקל מולקולרי של 3.5 K. סטרילי לסנן שברים dialyzed באמצעות מסננים חד פעמיות בקוטר 0.45 נקבובית מיקרומטר. לאחסן פתרון סטרילי של חלבון פיוז'ן IL4-10 ב- aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
- להעריך את טוהר eluted חלבון כימרי IL4-10 על ידי שהוכתמו Coomassie ג'ל מרחביות-דף 12% ו- HP-סק (עמודה 3 מיקרומטר שניה-2000). לניתוח HP-SEC, טען µL 40 של חלבון-הריכוז ~ 1 מ"ג/מ"ל על העמודה. השתמש 100 מ מ סודיום פוספט מאגר עם 150 מ מ נתרן כלורי (ה-pH = 6.8) בתור שלב ניידים. לקבוע את קצב הזרימה 1 mL/min.
- לקבוע את הריכוז של כל אצווה מטוהרים חלבון כימרי IL4-10 מאת אליסה IL10 ואת וזמינותו חלבון חומצה Bicinchoninic (BCA חלבון Assay קיט, ראה טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקולים של היצרן.
- השתמש רקומביננטי IL10 האנושי ליצור עיקול רגיל ב- ELISA וזמינותו. כדי לתקן את ההבדל בגודל בין IL10 רקומביננטי (18 kDA) חלבון כימרי IL4-10 (34 kDa), להכפיל את הריכוז שהושג בפקטור של 1.8.
- Bioactivity של חלבון כימרי IL4-10
הערה: וזמינותו דם מלא מתבצעת עבור כל אצווה של חלבון כימרי IL4-10 הפיק, הפעילות של קבוצות שונות מושווה כחלק של בקרת איכות. וזמינותו דם מתבצע על דם טרי שנאספו ביום וזמינותו צינורות הפארין. דם הושג של מתנדבים בריאים בשירות שלנו ללא צורך במיקור חוץ התורם. דוגמאות צריך להיות מטופל כמו סיכון ביולוגי פוטנציאלי.- להכין 3-fold דילולים קדם טורי של החלבון פיוז'ן IL4-10 מטוהרים RPMI בינוני (ראה טבלה של חומרים) על פני ריכוז טווח 5-1,215 ng/mL.
- להכין מראש דילולים של LPS (100 ng/mL) והדם האנושי כי הוא מדולל 4 פעמים RPMI בינוני.
- Pipette של דילולים מראש של חלבון כימרי IL4-10, תקליטונים, דם אנושי לתוך צלחת 48-. טוב. כל טוב, כדי להוסיף חלבון כימרי IL4-10 µL 50 (ריכוז סופי 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI בינוני, µL 25 LPS (הריכוז הסופי 10 ng/mL) ו דם אנושי 100 µL (סוף מדולל).
הערה: הנפח הכולל לכל טוב הוא 250 µL. - דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס, 8% CO2ו- 95% לחות עבור 18 h.
- להעריך את ריכוז TNFα ב תרבות supernatants באמצעות של אליסה TNFα, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
- לחשב עיכוב של התגובה דלקתיות על-ידי IL4-10 חלבון כימרי לפי הנוסחה: עיכוב % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
הערה: כאן A = TNFα רמות בתרבויות מגורה LPS מטופלים עם חלבון כימרי IL4-10, B = רמות TNFα תרבות unstimulated, ו- C = TNFα רמות בתרבות מגורה LPS.
2. העכבר מודל עבור כאב דלקתי מתמשך
הערה: חשוב להשתמש גם זכר וגם נקבה עכברים (C57Bl/6) כי זה יאפשר זיהוי תופעות תלוית מין. באופן כללי, העכברים השתמשו הם בין 8-16 שבועות. כדי לקבוע את מספר בעלי החיים הנדרשים, צריך לבצע חישוב כוח. הכלים המבוססים על האינטרנט כדי לבצע חישובים כאלה מצויים בקלות באינטרנט (למשל, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
אינדוקציה של כאבים דלקתיים כרוניים
הערה: לגרום כאב דלקתי מתמשך בעכברים מבוגרים עם זריקות intraplantar של קרגינאן או של פרויד מלאה אדג'וונט (CFA). הבדיקות שונה לא יפריעו אחד לשני.- הכנת קרגינאן (2% w/v) על ידי המסת λ-קרגינאן (ראה טבלה של חומרים) ב- 0.9% NaCl ע י העברת הפתרון באמצעות מחט 23-מד כדי להבטיח כי קרגינאן מחוסלת כראוי. להכין פתרון טרי ישירות לפני ההזרקה מבוצעת.
- לחלופין, אם פרנק, לערבב את הפתרון פרנק כראוי לפני הזרקת זה intraplantarly, כי פרנק אמולסיה מים בתוך שמן המכיל 1 מ ג של Mycobacterium חום שחפת (H37Ra) נהרג, מיובש, שמן פראפין 0.85 mL 0.15 מ ל mannide monooleate (ראה טבלה של חומרים).
הערה: מומלץ עבור הזרקת תרכובת זו כי גומי בוכנות עשוי להגיב עם השמן אדג'וונט מזרקים המילטון זכוכית עם מתכת בוכנות. -
הזרקת intraplantar
- לשמור על המתחם (שלבים 2.1.1 או 2.1.2) במזרק-RT למשך לפחות 15 דקות לפני הזרקת כדי לאפשר התאמה 20 להזריק RT. µL של המתחם (או dissolvent כפקד) subcutaneously לתוך הכפה האחוריות של העכבר שאינם מרדימים באמצעות מד-30 מחט.
- בבסיס האגודל הבימוי לעקב את המחט ולהזריק את המתחם כאשר המחט מוחדרת כ 0.5 ס מ. לאחר ההזרקה, לאט תמשוך את המחט בזמן סיבוב מעט את המזרק כדי למנוע דליפה של פתרון מחוץ ההזרקה.
3. כאב מדידות
הערה: ודא כי החוקרים ביצוע ניסויים התנהגותיים עיוורים לטיפול העכבר. חשוב להתאקלם, לחיות סביבת הבדיקות לפני ביצוע לכל מידה. רצוי, השבוע לפני תחילת הניסויים, חיות ממוקמים 1 - 2 פעמים למשך 15-30 דקות בכל אחד המכשירים שונים המשמש עבור ביצוע הבדיקות. בעת טיפול זכרים ונקבות זהה לניסוי, להעריך זכרים ללא תלות נקבות. כלובים נקי ומשטחים בהרחבה בין הקבוצות השונות כדי למנוע תופעות לא רצויות האפשריות על התנהגות של המינים השונים. למדוד בסיסית נסיגה השהיות או מכני ספי שתיים עד שלוש פעמים כדי לקבוע סף בסיסית ולזהות באופן מדויק באם הן יציב לפני הזרקת intraplantar של כל המתחם.
-
מבחן פריי פון: מכני רגישות לגירויים לא מזיק
- למקם את החיות בנפרד הכלובים אקריליק על דוכן רשת שינוי חוט ולאפשר העכברים להתאקלם למשך לפחות 15 דקות לפני מדידות.
- להעריך את רגישות מכני על ידי מדידת סף נסיגה כפת בתגובה לסדרת מכוילת פון פריי שערות ועד 0.02 4 ג'י לשקול כל תנועה של הכפה מן השיער יישומית כתגובה נסיגה חיובי. להחיל את חוטים בניצב השטח פאו עם מספיק כוח כדי לגרום כפיפה קלה על העור והחזק נקצה ס' ~ 3 בטח השיער לא מעוות במהלך היישום הכפה.
- לחשב את הסף כפת-גמילה 50% באמצעות שיטת שיהיה15,21.
הערה: הסיב הראשונה ליישם היא 0.4 g (עשוי לשמש אחרים חוטים המוצא בהתאם הסף אלו עכברים להציג בנקודת ההתחלה). חוסר תגובה פילמנט מציין כי הסיב עבה הבא משמש הגירוי הבאות, בעוד לתגובה חיובית מציין את השימוש פילמנט דק יותר הבא. מספר מצגות השיער נקבע לפי ההפרש התגובה הראשונה; לאחר מכן, מבוצעות 5 יישומים נוספים. לחשב שסף 50% לפי השיטות שתוארו בעבר15,21.
-
רגישות תרמית: מבחן הרגריבס
- להכניס את בעלי החיים בתוך הכלובים על צלחת זכוכית ומחוממת מראש (30 ° C) ולאפשר העכברים להתאקלם למשך לפחות 15 דקות לפני מדידות, המתנה עד החיות לשבת בשקט.
- לקבוע חום נסיגה השהיה פעמים על ידי חימום הכפה של בעלי החיים ע י קרן אור ממוקדת גלוי באמצעות מנגנון הרגריבס (ראה טבלה של חומרים).
הערה: עוצמת הקרן מוגדר כ 12%, כי עם הגדרה זו בעוצמה השפעול נחוש, אלומת האור מעורר תגובת הנסיגה של תקופה ממוצעת של 8 s בנקודת ההתחלה על עכברים C57Bl/6. הגדרת עוצמת צריך להיקבע לכל מכשיר בודדים, המתח העכבר. שעות איסוף מקסימלי של 20 s או יותר משמשים כדי למנוע פציעה של בעלי החיים. - למדוד טיימס השהיית הגמילה ~ 4 פעמים לכל חיה. ממוצע כל התגובות נמדד. למדוד את כל כף היד באופן עצמאי, לפחות 1 דקות המרווחים בין מדידות עוקבות באותה כף.
-
גירעונות אלה: מבחן הנושאת משקל דינמי
- מודדים את משקל הגוף של כל בעל חיים לפני המבחן, מאז ניתוח נושאת משקל דורש את משקל הגוף של כל בעל חיים בודדים כמו כפרמטר קלט.
- מקם את החיות בנפרד קומה-מעקב מערכת נושאת משקל דינמי המורכבים על כיסוי תמיכה מצלמה אשר יתעד את תנועות העכבר. תן את החיה ואקלום של 0.5-1 דקות לפני הקלטה למשך 5 דקות.
הערה: במבחן הזה, חיה נעה בחופשיות אחת בלבד ניתן להעריך בכל פעם. - להתאים את ההגדרות כדי לבצע נשיאת משקל ולנתח את הנתונים.
הערה: בניסויים אלה, אנו משתמשים בפרמטרים הבאים: (i) נמוך משקל סף של ז': 0.6 זה המשקל המינימלי הדרוש להפעיל את אחד התאים של החיישן. (ii) משקל סף ז' 1: מספר זה מציין את המשקל הדרוש להפעלת מלא תא אחד. (iii) הסף משטח של תאים 2: מספר זה מציין את מספר תאים סמוכים זה לזה, כי צריך להיות מופעל כדי להילקח בחשבון. (iv) מספר תמונות המינימלי הוא 5: זה לוקח 0.1 s כדי ללכוד את כל תמונה. המספר מציין את מספר מינימלי של מסגרות שבו העכבר לא זז. ככזה, ערך של 5 פירושו העכבר תנוחה צריך להיות יציב עבור > 0.5 s כדי להשיג מידה זה נלקחת בחשבון לצורך ניתוח. - לבצע הניתוח של כל קליפ הוידאו נוסף ולהבטיח כי כל איבר מוכר כראוי על ידי התוכנה מסגרת הזמן שצוין על-ידי התוכנה.
הערה: מינימום של 1 דקות מהזמן מוקלטות צריך לאמת. משקל דינמי הנושאת התוכנה מחשבת ומספק את הפרמטרים הבאים: (i) המשקל על ידי כל כפת בודדים גרמים, כאחוז של משקל הגוף כולו. (ii) משקל על ידי הכפה קבלה משולב או את הכפות האחורי משולב גרמים, כאחוז של משקל הגוף כולו. (iii) היחס בין שמאלה/ימינה הכפות משקל הנושאת או קדמי/אחורי נשיאת משקל. (iv) את פני השטח של כל כף הרגל או כפות קדמי/אחורי משולב הופעלה משטח רגיש ללחץ. (v) סטייה אכזרי ולא רגיל עבור כל פרמטר. (vi) משך בתנוחות שונות (גידול, כפות 3 או 4 כפות רגליים) במהלך הניסוי כולו. (vii) זמן (s) בכל כף הרגל נושאת משקל במהלך הניסוי כולו.
4. במחלה הזרקה של IL4-10 חלבון כימרי על שיכוך כאבים
הערה: ודא כי האיוורור לחדר פתוח כדי להבטיח זרימת אוויר נאותה. כדי לבדוק את היעילות של חלבון כימרי IL4-10 (µg 1/עכבר; 5 µL הזרקת סה כ נפח) זה צריך להיבדק נגד הרכב זריקות, זריקות של שילוב ציטוקינים בודדים (IL4 + IL10, 0.5 µg + 0.5 µg/עכבר, 5 µL הזרקת סה כ נפח).
- עזים ומתנגד את העכבר עם 3-4% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 2 ל'/min בבית הבליעה אינדוקציה. בדוק כי העכבר כראוי ומורדמת באמצעות צביטות הכפה כדי להבטיח כי החיה אינה מגיבה.
- המקום העכבר על השולחן עם הראש שלו להציב האף חרוט המנגנון ולתחזק את העכבר הרגעה עם 1.5-2% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 2 ל'/min בזמן ביצוע הזריקה במחלה.
- מילוי חוזר תרכובות להזרקה לתוך כוס נקי 25 µL המילטון המזרק מחובר מחט 27-מד.
- להחזיק את העכבר בחוזקה על ידי עמוד השדרה האחורי לצלעות ולהרים מעט את העכבר. מקם את המחט אנכית בין חוליות מותני L5 ו L6 ולהוסיפו בזהירות דרך העור ממש באמצע של חוליות המותניים. מקם את המחט לתוך מרחב בין-חולייתי.
הערה: למצוא את שטח בין-חולייתי עשויים לדרוש כמה 'חיפוש' על-ידי להזיז את המחט לאורך ציר הגחון rostral, בקלילות הקשה על המחט עד לאובדן של ההתנגדות של רקמת העצם מורגשת.- אשר המיקוד הנכון על-ידי אימות כי התרחשה תנועה הזנב. מזריקים µL 5 של המתחם לאט, לחכות כמה שניות, ואז לאט לאט. משכי את המחט. אם רק נצפית תנועה כפת יחיד, המחט סביר אינם ממוקמים כראוי.
- לאחר ההזרקה, בדוק את העכבר מקרוב הראשון 30 דקות לאחר ההתאוששות מן ההרדמה כדי לוודא העדר כל ליקוי/שיתוק מוטורי.
הערה: התנהגויות הכאב יכול להיות נמדד (כפי שמתואר בסעיף 3) 15 דקות לאחר השחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונה ייצוגית ג'ל מרחביות עמודים המכילים שברים שונים שהתקבל במהלך טיהור כרומטוגרפיה זיקה מוצג איור 1א'. עומס (L), זרימה דרך שברים (FT), נוכח תגובת שיקוע HEK293 כל החלבונים הם נצפו. אין חלבונים הוא ציין את השבר לשטוף (W). ב השבר • תנאי (E), שתי להקות של 35, 37 kDa שנצפו המייצגים שני glycoforms שונים של חלבון כימרי IL4-10 (חיצים). איור 1B, עוצמת נציג assay בדם כל וזמינותו של שני שונים IL4-10 היתוך חלבון אצוות מוצג. עיכוב למינון של LPS-induced TNFα שחרור הוא ציין, מציג אתריים דומות עבור אצוות חלבון היתוך שני IL4-10.
בשלב הבא, דוגמה של תוצאות הבדיקה של ניסויים נציג שבו נבדק חלבון כימרי IL4-10 כדי לעכב כאב דלקתי מתמשך מוצג (איור 2). כאב דלקתי מתמשך היה המושרה על ידי הזרקת intraplantar של 2% קרגינאן. מכני (איור 2א) כמו גם התרמי hyperalgesia (איור 2B) עקבו במשך הזמן. יום 6 לאחר אינדוקציה של כאבים דלקתיים, עכברים היו מוזרק לתוך חוט השדרה עם חלבון כימרי IL4-10 או הרכב כפקד. IL4-10 באופן משמעותי נפתרה מכני (איור 2א) והן התרמי hyperalgesia (איור 2B), וניתן להגיע אל האפקט המקסימלי שלו לאחר 24 שעות לאחר ההזרקה. באופן אידיאלי, היעילות של החלבון פיוז'ן של עיכוב כאב צריך גם להיבדק נגד ריכוזי equimolar ציטוקינים בודדים כדי לבדוק אם את יכולתו לעכב את הכאב הוא יותר מסכום ציטוקינים בודדים. נתונים אלה אינם מוצגים כאן, אבל אנו מתייחסים לפרסום לאחרונה המציגה נתונים זה9.
היעילות של החלבון פיוז'ן IL4-10 לאחרונה נבדקה ב מודל פרנק-induced כאבים דלקתיים9. בניסוי זה, היו מספר זריקות של החלבון פיוז'ן IL4-10 מנוהל לתוך חוט השדרה. זריקות מרובות לפתור לחלוטין פרנק-induced מתמיד דלקתיים hyperalgesia, נמדד באמצעות פון פריי ובדיקות הארגריבס, הממחיש את הפוטנציאל של החלבון פיוז'ן IL4-10 כמו טיפול להרגעה9. הנה אנחנו מראים כי הזרקת פרנק intraplantar גם המושרה על הפחתת נשיאת משקל של הכפה המושפע (איור 3A-B). הזרקה במחלה של חלבון כימרי IL4-10 ביום 7 לאחר הזרקת פרנק intraplantar attenuated הקטנת נשיאת משקל של הכפה המושפעת בהשוואה לעכברים המוזרק הרכב 2 ימים לאחר IL4-10 היתוך חלבון המינהל (איור 3B ).
איור 1 : טיהור ואפיון של חלבון כימרי IL4-10- (א) שהוכתמו Coomassie מרחביות-דף ניתוח של שברים כרומטוגרפיה זיקה: l: עומס, מטרים: לזרום, w: שטיפה, ה': • תנאי. Assay פונקציונלי (B): IL4-10 היתוך חלבון במינון dependently מעכב ייצור TNFα בתרבות מגורה דם LPS (המבוטא עיכוב אחוז לעומת תרבויות מגורה עם LPS לבד). נתונים מיוצג כזאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : עיכוב של דלקתיות hyperalgesia על ידי חלבון כימרי IL4-10- כאבים דלקתיים היה המושרה על ידי זריקה intraplantar של 20 µL של 2% קרגינאן (מכונית). שישה ימים לאחר הזרקת intraplantar עכברים קיבל זריקה במחלה (חץ) של 1 חלבון כימרי IL4-10 µg או רכב (PBS). רגישות יתר מכנית (A) (יומן 50% מפתן (g)) נמדד לאורך זמן באמצעות מבחן פון פריי, רגישות תרמית (B) (חביון (s)) נמדדה באמצעות מבחן הארגריבס. נתונים מיוצג אומר ± ב- SEM כוכביות מייצגים הבדלים משמעותיים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני, בין רכב ובעלי IL4-10 מוזרק. * *, * * * = p < 0.01 ו- p < 0.001, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : דלקת-induced לשינויים נשיאת משקל. כאבים דלקתיים היה המושרה על ידי זריקה intraplantar של 20 µL של פרויד מלאה אדג'וונט (CFA). משקל הנושאת על כל כף הרגל נמדדה באמצעות המכשיר הנושאת משקל דינמי. נשיאת משקל גרמים של הכפה המושפע (חולשת האחוריות כף הרגל), נשיאת המשקל הכולל של הידיים שאינן מושפעות (השלג, פאו contralateral) מוצגת, כמו גם היחס של נשיאת משקל של חולשת הכפה לעומת 3 הכפות אחרים. (א) מסלול של משקל הנושאת בעת דלקת הנגרמת פרנק (n = 10). (B)-יום 7 לאחר פרנק intraplantar, עכברים קיבל זריקה במחלה של 1 חלבון כימרי µg IL4-10 או רכב (PBS). נשיאת משקל נמדדה ב 0 7 ימים לאחר intraplantar פרנק ואת 2 ימים לאחר מתן של חלבון כימרי IL4-10. נשיאת משקל של חולשת הכפה לעומת אחרים 3 הכפות מיוצג (n = 3-4). נתונים מיוצג כזאת אומרת ± ב- SEM. * * * = p < 0.001; * * = p < 0.01; * = p < 0.05 בהשוואה בסיסית (יום 0). # = p < 0.05 בהשוואה לבעלי הרכב מטופל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטות ייצור, אפיון של חלבון חלבון כימרי IL4-10, ושיטות לבדיקת יעילותה של עיכוב hyperalgesia דלקתיות במודלים של העכבר של כאב דלקתי מתמשך. הייצור ואת טיהור של החלבון פיוז'ן IL4-10 מתבצע בקנה מידה קטן. HEK293 תאים נבחרים כמערכת ביטוי לייצור חלבון כי הם מאפשרים שינויים post-translational זה אינה יכולה להיות מושגת במערכות ביטוי prokaryotic. שינויים post-translational רלוונטי עבור פונקציה של חלבונים, העדר של שינויים אלה יכולים להשפיע על יעילות טיפולית של החלבון פיוז'ן IL4-10. החלבון מטוהרים מתרבות supernatant על ידי כרומטוגרפיית זיקה. בחרנו להשתמש בארגון עשוי נוגדנים חד שבטיים כנגד IL4 לטיהור זיקה ולא לייצר חלבון כימרי של IL4-10 המכיל תגית כדי לאפשר טיהור עם מערכת תג קירבה. הסיבה לכך הייתה כדי למנוע אפשרות של שינויים הקשורים תג קיפול חלבונים ומתפקדים. עם זאת, אם נוגדן חד שבטי סלקטיבי מאוד לוקה בחסר, חלבון עם תג צריך להיות מפותח, למשל את התג שלו. במקרה הזה, זה יהיה חשוב לקבוע אם או N-קצה קרבוקסילי של החלבון היא המתאימה ביותר עבור התג לא להשפיע על תפקוד החלבון.
1 ליטר של תגובת שיקוע HEK293, כ- 3 מ"ג חלבון כימרי IL4-10 מטוהרים מתקבל, אך זו עשויה להשתנות אצווה כדי אצווה. העמודה עבור טיהור זיקה יכול לשמש לפני השלכת כמה מחזורים טיהור. שלב רגיש ביותר בהליך טיהור הוא • תנאי של IL4-10 חלבון כימרי מן העמודה על-ידי pH נמוך, כי ה-pH נמוך עשוי לגרום דנטורציה של חלבונים בלתי הפיך והמשקעים חלבון. לכן, שמירה על מבנה החלבון המקורי ואת העדר אגרגטים חלבון חיוני עבור אצוות באיכות טובה. לשם כך, הערכה של bioactivity של החלבון היתוך צריך להיות נבדק במבחנה לפני ואחרי טיהור עם מאגרים שונים • תנאי. לאחר טיהור של החלבון פיוז'ן IL4-10, bioactivity לא צומצם בהשוואה חלבונים שאינם מטוהרים. יתר על כן, היווצרות צבירה היה נעדר מתי השלב • תנאי בוצעה באמצעות מאגר גליצין 0.1 M (ה-pH = 2.5), ה-pH של השברים • תנאי היה וניטרל מיד עם מאגר טריס 1 מ' (ה-pH = 9).
הריכוז של חלבון כימרי IL4-10 מטוהרים מוערך על בסיס תוצאות IL10 אליסה אנושי. שיטת BCA משמש כדי לאשר את ריכוז חלבון. שחזור של החלבון לאחר טיהור מוערך מבוסס על ריכוזי נמדדת עומס, לזרום, שברים רוחצים את • תנאי אליסה IL10. קביעת ריכוז חלבון BCA חלבון כימרי IL4-10 שניתן להעריכו רק בחלקים • תנאי דיאליזה. שברים • תנאי דיאליזה שאינם מכילים imidazole, מתחם זה משפיע על המדד BCA. שברים שאינם מטוהרים מכילים חלבונים אחרים של המדיום תרבות HEK293.
הקביעה של bioactivity של החלבון פיוז'ן IL4-10 מתבצע ב וזמינותו דם מלא. צריך להעריך את bioactivity של חלבון כימרי IL4-10 בדם כל מספר תורמים כדי לקבוע אם פעילות פונקציונלית נשמר. מספר התורמים נדרשים מאחר השונות תורם את התורם קיימת הקיבולת של IL10 ו IL4 לעכב שחרור TNFα LPS-induced. יתר על כן, ביטוי של IL4R ו- IL10R עשויות להיות שונות בין תורמים, המשפיעים על הקיבולת של חלבון כימרי IL4-10 כדי לעכב את הייצור TNFα LPS-induced.
בשיטות המתואר, אנחנו מפורט העכבר 2, דגמי כאב דלקתי מתמשך כדי להעריך את היעילות של IL4-10 חלבון כימרי כדי לפתור כאבים בתוך vivo. יחד עם זאת, להערכת מלא של הפוטנציאל להרגעה של חלבונים פיוז'ן רקומביננטי, המולקולות צריך להיבדק במודלים אחרים של כאב כרוני כמו גם. מודלים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, מודלים של עצב-פציעה וכימותרפיה כאב נוירופתי9,22. למרות פון פריי לבדוק את וליצור המבחן הרגריבס משמשות לבדיקה ובתרופה, כבר ברור כי יש לכלול מבחן נוספים (למשל משקל דינמי מיסב. מבחן) כדי להעריך את ההשפעות על כאב שאינו עורר behaviorsand גם עם כאב operant assay (למשל ממוזגים המקום העדפה (CPP) לזהות כאב שאינו עורר התנהגויות17,18). כדי לבצע CPP, תחילתה של עיכוב כאב השפעות חלבון כימרי צריכה להילקח בחשבון, כי מיזוג של בעלי החיים על ידי הקלה בכאב דורש משחק מהיר משככי כאבים (אשר מפעילים אפקטים ב פחות מ 15 דקות). ובכל זאת, אם הבדיקה תרכובת כוללת של הופעת כאבים איטי, אך זה עלול לגרום עיכוב הכאב לטווח ארוך (יותר מ- 4 ימים), CPP עדיין ניתן להשתמש כדי לבדוק אם המתחם עכבות כאב. במקרה זה, תרכובת-induced אובדן מיזוג עם משככי כאבים מהירה הפועל צריך להיות מוערך.
זריקות במחלה נבחרים כמו מסלול מינהל, כפי המתחם יגיע כאב רלוונטי בתחומים כגון גרעיני הבסיס העזוב חוט השדרה. ראוי לציין, במחלה מסירת ובתרופה הפך מנהג נפוץ כטיפול בחולים עם כאב כרוני, כמו גישה זו מצמצמת את המינון של סם מאלחש הדרושים, מפחיתה רעילות ותופעות לוואי מערכתית. עם זאת, מסלול ניהול יש מספר מגבלות; זה דורש כוח אדם מיומן, בשל תת-עכבישי החלל קטן, הנפח של הזרקת צריך להיות מוגבל ל 5 µL בעכברים, הדורשים פתרונות מרוכז של החלבון פיוז'ן. הטכניקה של זריקות במחלה דורש אימון. אימון כזה יכול להתבצע על שאינו מחלים חיות מרדימים עם הזרקה של צבע כדי לוודא ההזרקה הנכון במחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
חלק מעבודה זו ממומן על ידי מדעי החיים אוניברסיטת אוטרכט הענק
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
