Summary
本稿で生産の方法と IL4 10 融合組換えタンパク質の品質管理のための詳細を提供します。また炎症性疼痛モデルマウスの痛みを解決するには、このタンパク質の有効性をテストする方法を示します。
Abstract
慢性的な痛みは治療が困難、持続的な痛みを解決への新しいアプローチが急務します。抗炎症性サイトカインは、衰弱させる痛みの原因異常神経免疫の相互作用を調整するための能力を扱う有望な候補です。生理学的、彼らは様々 なサイトカインのネットワークで動作し、したがってその治療効果がスタンドアロンの薬として使用する場合に最適なできない場合があります。この制限を克服する、抗炎症性サイトカイン IL4、IL10 の融合タンパク質を開発しました。ここでは、生産と IL4 10 融合組換えタンパク質の品質管理法について述べるし、我々 は永続的な炎症性疼痛モデルマウスの痛みを解決する IL4 10 融合タンパク質の有効性をテストします。
Introduction
慢性的な痛みのまま最も衰弱や下処理、21 世紀医療の問題の 1 つに影響を与える > 成人1,2の 20%。しかし、慢性的な痛みからの救済を提供するために治療はしばしば効果がないまたは重篤な副作用3を中止する必要があります。重要なは、現在使用可能な薬品だけ徴候の救助を提供するが、大幅変更か慢性的な痛みを治します。慢性的な痛みは、神経疾患に見えますが、慢性的な痛み開発4,5における免疫系の関与が示唆されました。また、痛みを治療する免疫ベースのアプローチを浮上しています。たとえば、抗炎症性サイトカインは慢性的な痛み6,7,8のいくつかのモデルで痛みを抑制します。しかし、抗炎症性サイトカインは半減期が短い、その潜在的な痛み抑制効果を減らすことにあります。さらに、抗炎症性サイトカインは互いに連携で最も最適に動作します。これらの制限を克服するために我々 最近に融合させた抗炎症性サイトカイン インターロイキン 4 (IL4) およびインターロイキン-10 (IL10) 1 つの分子。IL4 10 融合タンパク質は、個々 サイトカイン9と比較して慢性の炎症や神経因性疼痛を抑制することで優れた効果を示しています。ここで述べるような融合蛋白質の生成方法精製し、その品質を制御する方法。
IL4 10 融合タンパク質細胞 HEK293 F 細胞のトランスフェクション IL4 10 融合蛋白質を符号化する cDNA シーケンスを運ぶ pUPE 発現ベクターと生産されています。F HEK293 細胞は細菌の表現システムでは発生しません何か蛋白質の翻訳後修飾を許可するように選択されます。糖鎖のシアル酸、β-ガラクトシド-2 を符号化する cDNA の上限を最適化するには、3-シアリル-トランスフェラーゼは 2 番目の遺伝子としてベクターに組み込まれます。融合タンパク質精製精製よりも強力であるために、培養上清中の親和性蛋白質の浄化を使用他の方法例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィー10,11。IL4 10 融合蛋白質を浄化するには、IL4 に対する社内の作ったモノクローナル抗体を使用しました。純度の評価と精製 IL4 10 融合タンパク質の活性は、品質管理の一部として実行されます。生産バッチの純度は、ナトリウム Dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と高圧サイズ排除クロマトグラフィー (HP 秒) によって評価されます。IL4 10 融合タンパク質の活性がリポ多糖 (LPS) を阻害する能力を測定することによって評価される-全血文化、腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) 生産誘発効果し、比較して個々 の組み合わせにサイトカイン。
最後に、慢性的な痛みを抑制する IL4 10 融合蛋白質の能力をテストするために持続的な炎症性の痛み12,13,14 の広く使用されているマウス ・ モデルには鎮痛剤としての融合蛋白質のテスト方法について述べる.ここで我々 は、炎症性疼痛モデルの方法を説明します。ただし、痛みの他のモデルに使用される (例えば、神経因性疼痛モデル) することができます研究によって質問に回答する必要があることに注意することが重要です。これらのモデルの痛みを評価するために誘発を含む行動対策や非誘発疼痛対策のさまざまな使用することが重要です。ここでは、機械的および熱的誘発行動応答の変化のための評価方法について述べる。無害な刺激への機械的感度は、ハーグリーブス テストを使用して温度感受性を評価しながら Von Frey テストを使用して評価されます。重要なは、非誘発痛覚過敏/アロディニアは、動的重量軸受テストを使用して測定されます。これらの措置の疼痛対策として広く受け入れられて、痛みのしきい値と動物15,16,17によって経験される潜在的な疼痛に関する重要な情報をもたらします。他の非誘発などの痛み (例えば、独立した刺激)、エアコンの場所の好みテストを評価するための措置、貴重な18があります。痛みを抑制する薬の可能性を評価するためには痛みの領域に到達し、全身 (サイド) 効果19を避けるために必要な以下の蛋白量管理のこのルート融合タンパク質の髄腔内投与を我々 実行 20。
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Protocol
国際ガイドラインとローカルの実験の倫理委員会の事前の承認に従ってすべての動物実験を行った。全血はで、大学医療センター ユトレヒト (UMCU) オランダのミニ ドナー サービス (ミニ ドナー意匠、MDD) から得られました。MDD は、プロトコル番号 07-125/c UMCU (Medisch マリアンネ ・ Toetscommissie) の医療倫理委員会から肯定的な承認を受けています。
1. タンパク質の作製と解析
- 細胞培養
注: は、培地使用のための材料表を参照してください。- 氷の小さな塊があるまでは、37 ° C で F HEK293 細胞を解凍します。冷たい媒体 (4 ° C) 10 mL に融解細胞をすぐに転送、常温 (RT) 細胞懸濁液を遠心分離 (500 g) x 4 分 (分)。
- メディアを取り出して、新鮮な培地で 4 分の 500 × g で遠心分離後、RT の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 上澄みを除去し、培地で追加した細胞懸濁液 5 mL で予め温めておいた媒体 (37 ° C) の 25 mL を含む 125 mL フラスコに直接細胞ペレットを再懸濁します。125 rpm の速度で回転軌道のシェーカーに湿度 95%、8% CO2、37 ° C で培養します。
- サブカルチャー細胞週 2 回。自動化された細胞を使用して細胞数と細胞生存率を評価する (材料の表を参照してください) に対抗します。種子のエルレンマイヤー フラスコに 3 × 105セル/mL の濃度で実行可能なセル。最適な通気を保つためにすべての回で文化のエルレンマイヤー フラスコの容量の 5 分の 1 で培養液の容量を保つ。
- トランスフェクション
注: サブカルチャー 4 セル 3 トランスフェクション前回し、細胞生存率がそれらを transfect > 90%。セル実行可能性の評価によって自動化 (電界マルチ チャネル) 膜の整合性に基づく cellcounting システム。トランスフェクション試薬のための材料の表を参照してください。- 500 x g で 4 分間常温細胞を遠心分離します。予め温めておいた培 (37 ° C) の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します、~1.0 x 106セル/ml 1 l. 因数 500 mL エルレンマイヤー フラスコ 100 mL の 10 の因数で細胞懸濁液の総量に細胞懸濁液を希釈します。
- 33 mL 減少血清最小必須培地のプラスミッド DNA の 1 mg を希釈 (MEM、材料表を参照してください) 穏やかな混合することによって。別のチューブで穏やかな混合によって MEM のトランスフェクション試薬の 1,330 μ L を希釈します。5 分追加 RT で両方のソリューションを孵化させなさいし、MEM で MEM のトランスフェクション試薬を希釈した DNA をミックス ミックス室温 30 分間インキュベート
- (セクション 1 で培養増殖); 細胞に DNA トランスフェクション試薬ミックスを追加します。各 500 ml 三角フラスコ 100 mL の培養液中の細胞を含むミックスの 6.6 mL を追加します。前述のように培養条件のセルを維持します。トランスフェクション後 3 日間分泌 IL4 10 融合タンパク質を含む培養上清を収穫します。
- 製造元のプロトコルに従って IL10 ELISA を行うことによって培養上清中に IL4 10 融合タンパク質の濃度を決定する (表の資料を参照してください)。
注: 最適な培養条件の融合タンパク質の濃度は 2.5 〜 5 μ g/mL の間で期待できます。
- アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の浄化
メモ: アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは室温で実行されます。ただし、すべての画分 (文化上澄み、負荷、流れ、および溶出画分) は、プロシージャの間に氷で保たれます。- 自社製のモノクローナル抗体 IL4 エポキシの 1 g に数 10 mg 製造元のプロトコルに従ってセファローズ 4 b を活性化 (材料の表を参照してください)。ガラスのカラム (全長 30 cm と 1.5 cm 内径、材料表を参照してください) に結合セファローズ 4 b ビーズの 2.5 mL をゆっくり注ぐ。
- ブロック残りのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 含有 1 %50 mL を渡すことによって、ビーズの結合列を介してウシ血清アルブミン。25 mL の PBS を洗い流す (pH 7.4 を =) 12.5 mL の 0.1 M グリシン バッファーが続く (pH = 2.5) と 25 mL の PBS (pH 7.4 を =)。
- 渡す 100 mL 10 倍濃縮 HEK293 細胞培養の列を介して上清 1 mL/分洗浄流量で 50 mL の PBS の列。
- 12.5 mL の 0.1 M グリシン バッファーにバインドされた IL4 10 融合タンパク質を溶出 (pH = 2.5) 1 mL/分、2.5 mL の収集分数の流量で。1 M トリス緩衝の 350 μ L を追加 (pH = 9) 7 の pH をもたらすに各分画します。PBS の 2 L に対して一晩中和画分を dialyze (pH 7.4 を =)。
- 乾燥直径 16 mm と 3.5 K 分子量カットオフ透析チューブを使用します。無菌フィルター 0.45 μ M 孔径使い捨てのフィルターを使用して透析の分数です。滅菌 IL4 10 融合タンパク質溶液を因数-80 ° C で保存します。
- 12 %sds ページのゲルの Coomassie ステンドと HP 秒 (3 μ SEC 2000 列) による溶出 IL4 10 融合タンパク質の純度を評価します。HP SEC 分析カラム 〜 1 mg/mL の濃度でタンパク質の 40 μ L を読み込みます。100 mM リン酸ナトリウム バッファーを使用し 150 mM 塩化ナトリウム (pH = 6.8) 移動相として。1 mL/分の流量を設定します。
- IL10 elisa 法による精製 IL4 10 融合タンパク質とビシンコニン酸蛋白質の試金の各バッチの濃度を決定する (BCA タンパク質アッセイ キット、材料表を参照してください) 製造元のプロトコルによると。
- ELISA の試金の標準曲線を作成するのに組換えひと IL10 を使用します。組換え IL10 の大きさの違いを補正するため (18 kDA) IL4 10 融合蛋白質 (34 kDa) を乗算 1.8 倍得られた濃度とします。
- IL4 10 融合蛋白質の生物活性
メモ: 全血アッセイは IL4 10 融合タンパク質生産の各バッチに対して実行されます、異なるバッチの活動が品質管理の一環として比較されます。全血アッセイは、ヘパリン管試金曜日収集した新鮮な人間の血で実行されます。血液は、私たちの社内ドナー サービスの健康なボランティアから得られました。サンプルは、潜在的生物学的危険として処理する必要があります。- RPMI 培地で精製 IL4 10 融合蛋白質の 3 倍シリアル前希釈液を準備 (材料の表を参照してください)、濃度を 5 1,215 ng/mL の範囲します。
- 準備組合の前希釈液 (100 ng/mL) とヒトの血液 RPMI 培地で 4 倍で希釈されています。
- 48 ウェル プレートに IL4 10 融合タンパク質、LPS と人間の血液の前希釈液をピペットします。各ウェルに 50 μ L IL4 10 融合蛋白質 (最終濃度 1 243 ng/mL)、75 μ l 添加 RPMI 培地、25 μ L LPS (最終濃度 10 ng/mL)、および 100 μ L の血液を追加 (最終希釈)。
注: ウェルあたり容量は、250 μ L です。 - 18 h の湿度 95%、8% CO2、37 ° C でプレートを孵化させなさい。
- 製造元のプロトコルによると、tnf α の elisa 法を用いた培養上清中の tnf α の濃度を評価します。
- 数式によると IL4 10 融合タンパク質による炎症反応の抑制を計算: 阻害率 = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
注: ここでは LPS 刺激培養 IL4 10 融合タンパク質、B で治療の tnf α レベルを = = 物質文化は、C の tnf α レベル = LPS 刺激文化の tnf α レベル。
2. 持続性の炎症性疼痛のマウスモデル
注: これはセックス依存性効果の識別を有効にするために男性と女性の両方のマウス (C57Bl/6) を使用することが重要です。一般的には、使用マウスは 8-16 週齢の間です。必要な動物の数を調べるには、検出力の計算を実行してください。このような計算を実行する web ベースのツールは、インターネット (例えば、http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net) で容易に発見されます。
-
慢性の炎症性疼痛の誘導
注: は、カラギーナンまたは完全なフロイトのアジュバント (CFA) のベルガモットの注射で成体マウスの持続的な炎症性疼痛を誘発します。別のテストはお互い干渉しません。- Λ カラギーナンを溶解することによりカラギーナン (2 %w/v) を準備 (材料表参照) 0.9% で 23 ゲージの針を通して解決策を渡すことによって塩化ナトリウム、カラギーナン、溶解正しくことを確認します。注射を行う前に直接新鮮なソリューションを準備します。
- また、CFA を使用している場合ソリューションをミックス CFA 正しく intraplantarly、それを注射する前にため、CFA は結核菌結核 (菌 H37Ra) 熱が死亡し、乾燥・ 0.85 mL パラフィン油・ 0.15 mL mannide 1 mg を含有水-油エマルションモノオレート (材料の表を参照してください)。
注: 金属のプランジャーとハミルトン ガラス注射器がゴム製プランジャー、アジェバントの油と反応するので、この化合物を注入するためお勧めします。 -
ベルガモットの注入
- 30 ゲージを使用して非麻酔下マウスの後肢に皮下化合物のルート注入 20 μ L (またはコントロールとしてセラミックファイバー) に調整できるように注入する前に、少なくとも 15 分間常温シリンジの化合物 (2.1.1 または 2.1.2 の手順) を維持します。針。
- かかとに導く親指の付け根に針を挿入し、針が挿入されるときに混合物を注入約 0.5 cm。注入後、注射部位から液漏れを避けるために注射器を少し回転しながらゆっくりと針を撤回します。
3. 疼痛測定法
注: は、行動実験を行う研究者がマウス治療が盲検を確認します。どのような測定を実行する前にテスト環境に動物を慣らすことが重要です。好ましくは、動物実験を開始する前に週は 1-2 回のテストを実行するために使用する別のデバイスのそれぞれで 15-30 分配置されます。同じ実験で男女を処理する女性とは別の男性を評価します。きれいなケージと男女別の挙動に関する潜在的な悪影響を避けるために異なるグループ間広範囲の表面。測定基準撤退の待ち時間または機械しきい値 2 3 回正確にベースラインのしきい値を判断し、これらがすべての化合物のベルガモットの注入前に安定しているかどうかを識別します。
-
Von Frey テスト: 無害な刺激への機械的感度
- ワイヤー メッシュ スタンド アクリル ケージに動物を個別に配置でき、測定前に少なくとも 15 分慣らすマウス。
- Von Frey 毛 0.02 から 4 に至るまでの校正シリーズに応えて足撤退閾値を測定することにより機械の感度を評価する g. 肯定的な撤退の応答として応用の髪から足の動きを検討してください。肌にわずかな曲げが発生し、〜 3 s. 確認のため必ず髪をホールドに十分な力で足の表面に垂直時に足にひねり操作ができないフィラメントを適用します。
- 上下法15,21を使用して 50% 足撤退のしきい値を計算します。
注: を適用する最初のフィラメントは 0.4 g (他の開始のフィラメントは、ベースラインにこれらのマウスを表示しきい値によって使用されるかもしれない)。フィラメントに反応の欠如は、肯定的な反応を示します次の薄いフィラメントの使用中、次の刺激の次の厚いフィラメントを使用することを示します。髪のプレゼンテーションの数最初差動応答によって決定されます。その後、5 より多くのアプリケーションが実行されます。前15,21に説明した方法に従って 50% のしきい値を計算します。
-
温度感受性: ハーグリーヴス テスト
- 予め温めておいた (30 ° C) ガラス板上の檻に動物を置き、動物はじっと座って待って、測定前に少なくとも 15 分を慣らすにマウスを許可します。
- ハーグリーヴス装置 (材料の表を参照) を使用して焦点を当て可視光線によって動物の前足を加熱による熱回収遅延時間を決定します。
注: この実験強度設定で光のビームは、8 の平均時間の撤退の応答を呼び起こすためビームの強度、12% に設定されます c57bl/6 マウスにベースラインで s。強度設定は、個々 のマシンとマウス緊張あたり決定する必要があります。最大遮断時間が 20 秒以上は、動物への損傷を避けるために使用されます。 - 動物 1 ~ 4 回撤退待機時間を測定します。測定されたすべての応答を平均します。独立して、各足を測定し、足の同じ単位のそれに続く間、少なくとも 1 分間隔で。
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姿勢赤字: 動的重量軸受テスト
- 荷重解析は、入力パラメーターとして各の個々 の動物の体重を必要とするので、テストの前にそれぞれの動物の体重を測定します。
- マウスの動きを記録するカメラを支えるカバーの上に組み立てられる床計装動的荷重システムに動物を個別に配置します。5 分間録音の前に 0.5 を 1 分慣れる動物をしましょう。
注: このテストでは、1 つだけ自由に移動する動物は同時に評価できます。 - 荷重を実行し、データを分析するための設定を調整します。
注: これらの実験で、次のパラメーターを使用: (i) 低重量閾値 0.6 g: これはセンサーのセルの 1 つをアクティブにする必要の最小重量。(ii) 高重量 1 g: のしきい値この番号は、完全に 1 つのセルをアクティブにするために必要な重量を示します。(2 セルの iii) 表面のしきい値: この数を考慮する必要があります互いに隣接するセルの数を示します。(iv) 最小枚数が 5: 0.1 がかかるすべての画像をキャプチャする s。数は、マウスが動かないフレームの最小数を示します。マウス姿勢 5 という値が安定する必要があるなど、> 0.5 s 分析の考慮されている測定値を取得します。 - 各ビデオの解析を行う、ビデオを再生して各肢がソフトウェアによって示される時間枠でソフトウェアによって正しく認識されていることを確認します。
注: 1 分の記録時間の最小値を検証する必要があります。ソフトウェアの動的荷重を計算し、次のパラメーターを提供します: (i) グラム、そして全身の重量の割合として各個々 の足の負担重量。(ii) 全身の重量の割合として組み合わせた前足または複合のリアの足グラムで、負担重量。(iii) 左/右の比足に荷重またはフロント/リア重量軸受。(iv) それぞれの足または圧力敏感なパッドを活性化複合のフロント/リアの足の表面積。(各パラメーターの v) 平均値と標準偏差。(vi) 全体の実験中に別のポーズ (飼育、3 足または 4 足) の期間です。(vii) 時間 (秒) の各足は全体の実験中の重量を運ぶ。
4. 鎮痛のため髄腔内注入の IL4-10 融合タンパク質
注: は、部屋に換気が適切な空気の流れを確保するために開いていることを確認します。IL4 10 融合蛋白質 (1 μ g/マウス; 5 μ L 総注入量) の有効性をテスト車両注射と個々 のサイトカイン (IL4 + IL10、0.5 μ g + 0.5 μ g/マウス、5 μ L 総注入量) の組み合わせの注射に対する検証すべきです。
- 誘導室で 2 L/分の酸素流量で 3-4% イソフルランとマウスを麻酔します。マウスは動物が反応しないように足をつまんで麻酔正しくことを確認します。
- 場所その頭をテーブルの上にマウスは、装置の鼻の円錐形に置かれ、髄腔内注入を実行しながら、2 L/分の酸素流量で 1.5-2% イソフルランとマウス鎮静を維持します。
- 埋戻しきれい 25 μ L グラス ハミルトン シリンジに注射化合物は、27 g 針に接続されています。
- マウスを押したまま、しっかりと脊柱と肋骨の後方、マウスを少し持ち上げます。腰椎 L5 と L6 の間に垂直に針を置き、慎重に右腰椎の中間に皮膚を通して挿入します。椎間腔に針を配置します。
注: 椎間のスペースを見つけるいくつかの '検索' 移動による骨組織の抵抗の損失が感じられるまで針を軽く押すと、吻側腹側軸に沿って針を必要があります。- 尾フリックが発生したことを確認することによって正しいターゲットの設定を確認します。ゆっくりと化合物の 5 μ L を注入、秒のカップルを待つ、針をゆっくりと上げます。単一の足のフリックを観察すると、場合にのみ針が正しく配置されていない可能性があります。
- 注入後、任意の運動障害・麻痺のないことを保証するため麻酔からの回復後最初の 30 分間密接にマウスを確認してください。
注: 痛み行動は、回復後 15 分間 (セクション 3) として測定をすることができます。
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Representative Results
アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー精製時に得られる異なる分数を含んでいる SDS ページのゲルの代表的な画像を図 1に示します。負荷 (L)、(フィート) 分数流れる HEK293 培養上清中に存在するすべての蛋白質が観察されます。洗浄 (W) 画分タンパク質が観測されません。(E) 溶出画分に IL4 10 融合蛋白質 (矢印) の 2 つの異なる従ってに対応する 35 および 37 kDa の 2 つのバンドが観察されます。図 1B全血での代表的な力価試験 2 つ異なる IL4 10 融合タンパク質バッチの分析が表示されます。LPS 誘導性 tnf α リリースの用量依存性の抑制が観察される、2 つ IL4 10 融合タンパク質のバッチの同等の生理活性を示します。
次に、持続的な炎症性疼痛を抑制する IL4 10 融合タンパク質のテストの代表的な実験結果の例を示します (図 2)。ベルガモット 2% カラギーナン投与による持続性の炎症性の痛み。機械 (図 2A) だけでなく、時間の経過と共に熱 (図 2B) 痛覚過敏が続いた。炎症性疼痛の誘発後 6 日でを注入したマウス脊髄 IL4 10 融合蛋白質または車両コントロールとして。IL4 10 大幅に機械 (図 2A) および熱性痛覚過敏反応 (図 2B)、解決し、注射後 24 時間後その最大効果に達した。理想的には、痛みの抑制の融合タンパク質の有効性は痛みを抑制するその能力は個々 のサイトカインの合計よりも優れているかどうかをテストするのには個々 のサイトカインのモル濃度に対してもテストすべき。ここでは、これらのデータは表示されませんが、我々 はこのデータ9を表示する最近の出版物を参照してください。
IL4 10 融合タンパク質の有効性は、CFA 誘発炎症性疼痛モデル9最近調べた。この実験では、IL4 10 融合蛋白質の複数の注射は髄腔内投与しました。複数の注射は、CFA による永続的な炎症性痛覚過敏、von Frey ハーグリーブス テスト、鎮痛治療9として IL4 10 融合タンパク質の可能性を用いて測定を完全に解決。ベルガモットの CFA 注入も (図 3A B) の影響を受ける足の荷重の減少を誘発したことを示します。ベルガモットの CFA 注入弱毒 IL4 10 融合タンパク質投与 (図 3B 2 日後車両を注入したマウスと比較して影響を受ける足の体重負荷の削減後の 7 日目で IL4 10 融合タンパク質の髄腔内注射).
図 1: IL4 10 融合タンパク質の精製と性質。親和性クロマトグラフィー分数の (A) Coomassie ステンド SDS-PAGE 解析: l: ロード、FT: 流れ、w: 洗浄、e: 溶出。(B) 機能試金: IL4 10 融合蛋白量が独立して tnf α 産生 LPS 刺激の全血文化 (lps 単独で刺激の文化と比較してパーセント抑制として表される) を抑制します。データは、平均 ± SD. として表されるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: IL4 10 融合タンパク質による炎症性痛覚抑制します。炎症性疼痛は、ベルガモット 2% カラギーナン (車) の 20 μ L 注入によって誘起されました。ベルガモット注入後 6 日マウスは、1 μ g IL4 10 融合蛋白質または車両 (PBS) の髄腔内注入 (矢印) を受け取った。(A) 機械的過敏症 (ログの 50% のしきい値 (g)) Von Frey テストを使用して時間をかけて測定し、(B) 温熱感受性 (待機時間 (秒)) は、ハーグリーブス テストを用いて測定しました。データは、平均 ± SEM. アスタリスクを表す車両と IL4 10 注入された動物の間の双方向の分散を用いて有意差として表されます。* *, * * * p = < 0.01、 p < 0.001、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 荷重の炎症誘起変化します。20 μ L の完全なフロイトのアジュバント (CFA) のベルガモット注入による炎症性疼痛を惹起されました。各足への荷重負荷は、動的重量ベアリング装置を用いて測定しました。他の 3 足と比較して同側の足の荷重の比率だけでなく、影響を受ける足 (同側後肢) のグラム重量軸受と受けないの足 (前足と対側の足) の総重量軸受が表示されます。(A) もちろん CFA 誘発炎症荷重 (n = 10)。(B) ベルガモット CFA 後 7 日、マウス受信 1 μ g IL4 10 融合蛋白質または車両 (PBS) の髄腔内注入。荷重は 0 とベルガモット CFA 後 7 日と IL4 10 融合タンパク質の投与 2 日後で測定しました。他の 3 足と比較して同側の足の荷重で表される (n = 3-4)。データは、平均 ± SEM. として表されます * * * p = < 0.001;* * p = < 0.01;* p = < 0.05 (0 日目) のベースラインと比較します。# p = < 0.05 車両扱われる動物と比較して。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この原稿では、生産及び組換え IL4 10 融合タンパク質のキャラクタリゼーションの方法と永続的な炎症性疼痛のマウス ・ モデルにおける炎症性痛覚過敏を抑制することでその有効性をテストする方法について説明します。生産と IL4 10 融合タンパク質の精製は、小規模で実行されます。HEK293 細胞は、原核生物の発現系で達成することはできませんポスト翻訳の修正ができるので生産タンパク質発現系として選択されます。翻訳後修飾、タンパク質の機能に関連する、そのような変更の不在は潜在的 IL4 10 融合タンパク質の治療効果を影響可能性があります。タンパク質は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって培養上清より精製しました。内製の IL4 に対するモノクローナル抗体の親和性の浄化と親和性タグ システムで浄化できるようにタグを含む IL4 10 融合タンパク質の生産をしない使用にしました。これの理由は、タンパク質の折り畳みと機能のタグ関連の変化の可能性を避けるためにだった。それにもかかわらず、高選択的抗体が欠けている場合、タグ付きタンパク質など、開発する必要があります。 を彼のタグ。その場合は、タンパク質の C 末端または N - がタンパク質の機能に影響しないようにタグに最適かどうかを判断することが重要ででしょう。
HEK293 培養上清の 1 L から精製 IL4 10 融合タンパク質の約 3 mg が得られるが、これはバッチごとに異なる場合があります。破棄する前にいくつかの浄化サイクルの親和性の浄化の列を使用できます。浄化の手順で最も重要なステップです低 pH による列から IL4 10 融合タンパク質の溶出低 pH は、不可逆的なタンパク質変性と蛋白質の沈殿物を引き起こす可能性がありますのでしたがって、ネイティブ蛋白質構造の維持とタンパク質凝集体の不在は、質の良いバッチは欠かせません。そのため、融合タンパク質の生物活性の評価は前に、と異なる溶出バッファーと精製後の in vitroテストする必要があります。IL4 10 融合タンパク質の精製後、生理活性は非精製タンパク質と比較して減らない。また、粒の形成も 0.1 M グリシン バッファーで溶出のステップに行ったとき欠席 (pH = 2.5)、溶出画分の pH 1 M トリス緩衝すぐに中和されると (pH = 9)。
精製 IL4 10 融合タンパク質の濃度は、人間 IL10 ELISA の結果に基づいて推定されます。BCA 蛋白質の試金を使用して、タンパク質の濃度を確認します。タンパク質精製を評価した後の回復は、IL10 elisa 法により負荷、流れ、洗うと溶出画分の測定濃度に基づいています。IL4 10 融合タンパク質の BCA タンパク質濃度は、透析溶出画分にのみ評価できます。非透析溶出画分には、イミダゾール、BCA の測定に影響を与える化合物が含まれています。非精製の分数には、HEK293 培養培地から他の蛋白質が含まれています。
全血アッセイで IL4 10 融合タンパク質の生物活性の定量を行います。IL4 10 融合タンパク質の活性は、運動機能が保持されるかどうかを決定するいくつかのドナーの全血で評価されるべき。LPS 誘導性 tnf α リリースを抑制する IL10 と IL4 の容量でドナーにドナーの差異が存在するため、いくつかのドナーが必要です。さらに、ドナーは、LPS 誘導性 tnf α の産生を抑制する IL4 10 融合蛋白質の能力に影響を与える間 IL4R と IL10R の表現が異なる場合があります。
記載されている方法で痛みの生体を解決する IL4 10 融合タンパク質の有効性を評価するための永続的な炎症性疼痛の 2 マウス ・ モデルを詳しく説明します。それにもかかわらず、組換えの融合蛋白質の鎮痛の可能性の完全な評価の分子を慢性的な痛みだけでなく他のモデルでテストしてください。これらのモデルなどが、神経損傷や化学療法に伴う神経因性疼痛9,22のモデルに限定されません。また痛みの誘発非 behaviorsand に及ぼす影響を評価するために追加の試験(動的重量軸受テスト)を含める必要があるが明らかになってきた von Frey テストとハーグリーヴス テスト一般鎮痛薬をテストするために使用されがオペラント痛みの試金 (例えばエアコン場所選好 (CPP) 非誘発疼痛行動17,18を検出する)。CPP を実行するには、融合蛋白質の痛み抑制効果の発症べきである考慮し、痛みの軽減による動物のエアコン (これは 15 分以内で効果を発揮) クイック演技鎮痛剤が必要なため。それにもかかわらず、試験化合物が遅い鎮痛の発症には、長期的な痛みの抑制 (4 日以上) を誘発する可能性が場合、CPP を化合物は痛みを抑制するかどうかをテストする使用できます。この場合、即効鎮痛剤でエアコンの化合物による損失は評価される必要があります。
髄腔内注射は、化合物が後根神経節と脊髄など関連分野の痛みに達するので、管理のルートとして選択されます。とりわけ、鎮痛薬の髄腔内デリバリーは慢性疼痛患者の治療薬として一般的になっているこのアプローチは、必要な鎮痛薬の投与量を減らすのと同様、毒性および全身の副作用を減少させます。それにもかかわらず、この投与経路はいくつか制限があります。それは訓練された人員を必要とし、による小さなくも膜下腔注入量は融合タンパク質の高濃度の溶液が必要なマウスの 5 μ L に限定すべき。髄腔内注射の技術には、トレーニングが必要です。このようなトレーニングは、正しい髄腔内注入を確認するための染料の注入の麻酔下の動物の非回復で実行できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品の一部は、ユトレヒト大学生命科学によって賄われている付与
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
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