Summary
이 문서에서 우리는 생산 방법과 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 세부 정보를 제공합니다. 우리는 또한 마우스 모델 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해이 단백질의 효과 테스트 하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
만성 통증은 치료 하기 어려운 고 지속적인 통증을 해결 하기 위해 새로운 접근은 급하다. 항 염증 성 cytokines 탈 신경-면역 상호 작용을 규제 하는 그들의 능력 때문에 쇠 약하게 고통을 조건 치료를 위한 유망한 후보자 이다. 그러나, 그들은 다양 한 cytokines의 네트워크에서 작동 하는 순수 하 고 따라서 그들의 치료 효과가 독립 실행형 약물으로 사용 될 때 최적의 않을 수 있습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 우리 IL4와 IL10 항 염증 성 cytokines의 융해 단백질을 개발 했다. 여기, 우리는 생산 및 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 방법을 설명 하 고 우리 마우스 모델 지속적인 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 효과 테스트.
Introduction
만성 통증 중 가장 쇠 약하게 하 고 아래 취급 의료 문제는 21 세기의 유지에 영향을 미치는 > 성인 인구1,2의 20%. 그러나, 만성 통증에서 구호를 제공 하는 치료는 종종 효과적인 또는 심각한 부작용3때문에 중단 해야 합니다. 중요 한 것은, 현재 사용 가능한 약물만 징후 기복을 제공 하지만 하지 크게 수정 하거나 만성 통증 치료. 비록 만성 통증 신경 장애로 나타납니다, 증거의 만성 통증 개발4,5의 면역 체계의 참여를 제안 합니다. 또한, 통증 치료에 면역-기반 접근 등장 하고있다. 예를 들어 항 염증 성 cytokines 만성 통증6,,78의 여러 모델에 통증 억제. 그러나, 항 염증 성 cytokines 짧은 반감기, 그들의 잠재적인 통증 억제 효과 줄이고 있다. 또한, 항 염증 성 cytokines 서로 콘서트에서 가장 최적으로 작동합니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 최근에 융합 항 염증 성 cytokines 인터 루 킨-4 (IL4)와 인터 루 킨-10 (IL10) 한 분자에. IL4-10 퓨전 단백질 개별 cytokines9에 비해 만성 염증 및 neuropathic 고통 억제에 탁월한 효능을 보여줍니다. 여기 우리가 이러한 융합 단백질을 생산 하는 방법 정화, 및 기술의 품질을 제어 하는 방법은.
IL4-10 퓨전 단백질 운반 IL4-10 융해 단백질을 코딩 하는 cDNA 순서 pUPE 식 벡터와 F HEK293 세포의 과도 transfection에 의해 인간의 세포에서 생산 됩니다. F HEK293 세포 단백질, 세균성 식 시스템에서 발생 하지 않습니다 뭔가의 포스트 번역 상 수정에 대 한 수를 선택 합니다. Glycan sialic 산, 베타-galactoside-2, 코딩 하는 cDNA 상한 최적화 3 sialyl 전이 효소는 두 번째 transgene로 벡터에 통합 됩니다. 융해 단백질 다른 방법 예: 크기-배제 또는 이온 교환 크로마토그래피10,11정화 보다 더 강력 하기 때문에 표면에 뜨는 문화의 선호도 단백질 정화를 사용 하 여을 정화 이다. IL4-10 퓨전 단백질 정화, 우리는 사내 만든된 IL4에 대 한 단일 클론 항 체를 사용 합니다. 순도의 평가 및 정화 IL4-10 융해 단백질의 bioactivity 품질 관리의 일환으로 수행 됩니다. 생산된 배치의 순도 나트륨 라우릴 황산 염의 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 높은 압력 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 평가 됩니다. IL4-10 융해 단백질의 bioactivity lipopolysaccharide (LPS)를 억제 하는 능력을 측정 하 여 평가-전체 혈액 문화에서 종양 괴 사 인자-알파 (TNFα) 생산을 유도 하 고 개인의 조합에 그것을 비교 하는 것은 cytokines입니다.
마지막으로, 만성 통증을 억제 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 용량을 테스트 하려면 우리 설명 어떻게 융합 단백질 지속적인 염증 성 통증12,13,14의 널리 사용된 마우스 모델에서 진통제로 시험 될 수 있다 . 여기는 염증 성 통증 모델의 방법에 설명합니다. 그러나, 그것은 다른 통증 모델 사용 (예를 들어, neuropathic 고통 모델) 수, 연구에 따라 답변 필요 질문 중요. 이러한 모델에 통증을 평가 하기 위해 다양 한 행동을 포함 하는 갖는 측정값과 갖는 비 통증 측정을 사용 하 여 중요 하다. 여기, 우리 기계적 및 열적으로 갖는 행동 응답에 변화에 대 한 평가의 방법을 설명합니다. 무해 한 자극에 기계적 감도 열 감도 하 그 리브스 테스트를 사용 하 여 평가 하는 동안에 폰 Frey 테스트를 사용 하 여 평가 됩니다. 중요 한 것은, 비 갖는 통/용어인 동적 체중 베어링 테스트를 사용 하 여 측정 됩니다. 이 이러한은 고통 측정값으로 널리 받아들여진다 고 통증 임계값 및 잠재적인 통증 동물15,,1617경험된에 중요 한 정보를 얻을. 다른 비 살려 통증 (예를 들면, 독립적인 자극), 바른된 장소 설정 테스트 등을 평가 하기 위해 측정, 귀중 한18을 수 있습니다. 하기 위해 통증을 억제 하는 약물의 잠재력을 평가, 수행 했습니다 융해 단백질의 intrathecal 관리 관리의이 경로와 적은 단백질 복용량 통증 관련 영역에 도달 하 여 피하 조직 (사이드-) 효과19, 필요 20.
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Protocol
모든 동물 실험 국제 지침 및 로컬 실험 윤리 위원회의 사전 승인을 수행 했다. 전 혈에는 대학 의료 센터 위트레흐트 (UMCU)는 네덜란드에서 미니 기증자 서비스 (미니 기증자 Dienst, MDD)에서 얻은 했다. MDD는 프로토콜 번호 07-125/c.에 대 한 UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie)의 의료 윤리 위원회에서 긍정적인 승인을 받았습니다.
1. 단백질 생산 및 특성화
- 세포 배양
주: 문화 매체 사용에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.- 때까지 얼음의 작은 덩어리는 37 ° C에서 F HEK293 세포를 녹여. 얼음 처럼 차가운 매체 (4 ° C)의 10 mL를 즉시 해 동된 세포를 전송 하 고 x 500g에 4 분 (분) 동안 실 온 (RT)에서 세포 현 탁 액을 원심.
- 매체를 제거 하 고 10 mL 신선한 매체 RT, 뒤에 4 분 동안 500 x g에서 원심에서의에서 셀 펠 릿 resuspend.
- 상쾌한을 제거 하 고 미리 예 열된 매체 (37 ° C)의 25 mL를 포함 하는 125 mL 플라스 크에 직접 실시간 추가 셀 서 스 펜 션에서 매체의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 37 ° C, 8%의 CO2, 125 rpm의 속도로 회전 하는 궤도 셰이 커에 95% 습도에서 세포 문화.
- Subculture 셀 일주일에 두 번. 자동화 된 셀을 사용 하 여 세포 수와 세포 생존 능력 평가 ( 재료의 표참조) 카운터. 삼각 플라스 크에 3 x 105 셀/mL의 농도에서 종자 가능한 셀. 문화 삼각 플라스 크의 총 볼륨의 1/5에서 문화 매체의 전체 볼륨을 항상 최적의 통 기 통풍을 유지 하는 유지 합니다.
- Transfection
참고: 하위 4 셀 3 transfection 이전 시간과 때 세포 생존 능력은 그들을 transfect > 90%. 세포 생존 능력 평가 자동으로 (전기 분야 다중 채널) 원형질 막의 무결성을 기반으로 cellcounting 시스템. Transfection 시 약에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.- 500 x g;에서 4 분에 대 한 실시간에 세포를 원심 미리 데워 진된 문화 매체 (37 ° C)의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend 그리고 ~1.0 x 106 셀/ml 1 나 약 수 100 ml 500 mL 삼각 플라스 크에 10 aliquots에 세포 현 탁 액의 총 볼륨에서 세포 현 탁 액을 희석.
- 33 mL 감소-혈 청 최소한의 필수적인 중간에 플라스 미드 DNA의 1 밀리 그램 희석 (MEM, 재료의 표참조) 부드러운 혼합 하 여. 별도 튜브에 부드러운 혼합 하 여 transfection 시 MEM에의 1,330 µ L를 희석. 5 분 추가 대 한 RT에서 두 솔루션을 품 어 MEM에 MEM에 transfection 시 약 희석 DNA를 혼합 하 고 실시간에 30 분 혼합 품 어
- (제 1 양식); 세포에 DNA transfection 시 믹스를 추가 각 500 ml 삼각 플라스 크 배양 세포의 100 mL를 포함 하는 혼합의 6.6 mL를 추가 합니다. 앞서 언급 한 문화 조건에 있는 세포를 유지 합니다. 문화 상쾌한 포함 IL4-10 퓨전 단백질 분 비 transfection 후 3 일 수확.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 IL10 ELISA를 수행 하 여 표면에 뜨는 문화 IL4-10 융해 단백질의 농도 결정 ( 재료의 표참조).
참고: 최적의 문화 조건에 융해 단백질의 농도 2.5 및 5 µ g/mL 사이 예상 될 수 있다.
- 친화성 크로마토그래피에서 단백질 정화
참고: 친화성 크로마토그래피는 상 온에서 수행 됩니다. 그러나, 모든 분수 (문화 상쾌한, 부하, 흐름, 그리고 차입 분수) 절차 동안 얼음에 보관 됩니다.- 몇 10 mg에 집을 만든 단일 클론 항 체 IL4에 대 한 CNBr-1 g의 제조 업체의 프로토콜에 따라 sepharose 4B, 활성화 ( 재료의 표참조). 유리 착 색 인쇄기 열 (30 cm 길이 1.5 c m 내부 직경, 재료의 표참조)에 결합 된 sepharose 구슬의 2.5 mL를 천천히 붓는 다.
- 나머지 50 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1%를 포함 하 여 구슬의 사이트 바인딩 차단 열 통해 소 혈 청 알 부 민. 씻어 25 mL PBS의 열 (pH = 7.4) 12.5 mL 0.1 M 글리신 버퍼의 다음 (pH 2.5 =) 25 ml의 PBS (pH 7.4 =).
- 전달 100 mL 10 집중된 HEK293 세포 배양의 열을 통해 표면에 뜨는 세척 1 mL/분의 유량에 50 mL의 PBS로 열.
- 12.5 mL의 0.1 M 글리신 버퍼와 바운드 IL4-10 융해 단백질을 elute (pH = 2.5) 1 mL/min와 2.5 mL의 수집 분수의 흐름 율에. 1 M Tris 버퍼의 350 µ L 추가 (pH = 9) pH 7을가지고 각 분수. 하룻밤에 대 한 PBS의 2 L 무력화 분수 dialyze (pH = 7.4).
- 투 석 튜브를 사용 하 여 건조 직경 16 m m와 3.5 K 분자량 컷오프. 멸 균 일회용 필터를 사용 하 여 0.45 μ M 기 공 직경 dialyzed 분수를 필터링 합니다. Aliquots-80 ° c.에 있는 살 균 IL4-10 퓨전 단백질 솔루션 저장
- Coomassie 스테인드 12 %SDS 페이지 젤 및 HP-초 (3 µ SEC-2000 m 열)에 의해 eluted IL4-10 융해 단백질의 순도 평가 합니다. HP-초 분석, 열에 ~ 1 mg/mL의 농도에 단백질의 40 µ L 로드. 100 mM 나트륨 인산 염 버퍼를 사용 하 여 150 m 염화 나트륨 (pH 6.8 =) 모바일 상으로. 1 mL/min에서 흐름 속도 설정 합니다.
- IL10 일 라에 의해 순화 IL4-10 퓨전 단백질 및 Bicinchoninic 산 단백질 분석 실험의 각 배치의 농도 결정 (BCA 단백질 분석 실험 키트, 참조 테이블의 재료) 제조업체의 프로토콜에 따라.
- 재조합 인간 IL10를 사용 하 여 ELISA 분석 결과에서 표준 곡선을 만들기. 재조합 IL10의 크기 차이 대 한 수정 (18 kDA) IL4-10 융합 단백질 (34 kDa), 1.8의 요인에 의해 얻은 농도 곱하면.
- IL4-10 융해 단백질의 bioactivity
참고: 전체 혈액 분석 결과 IL4-10 융합 단백질 생산의 각 일괄 처리에 대 한 수행 되 고 다른 일괄 처리의 작업 품질 관리의 일환으로 비교 됩니다. 전체 혈액 분석 결과 덤플링 튜브에 분석 결과의 날 신선한 인간의 피 수집된에 수행 됩니다. 혈액은 우리의 사내 기증자 서비스에서 건강 한 지원자에서 얻은 했다. 샘플은 잠재적으로 생물학 위험으로 처리 되어야 합니다.- 3 직렬 사전 희석 RPMI 매체에 순화 IL4-10 융해 단백질의 준비 ( 재료의 표참조) 농도 범위가 5-1215 ng/mL.
- LPS의 사전 희석 준비 (100 ng/mL)와 RPMI 매체에 4 배 희석은 인간의 혈액.
- 48-잘 접시에 IL4-10 퓨전 단백질, LPS, 및 인간 혈액의 사전 희석 플라스틱 각 잘 추가 50 µ L IL4-10 융합 단백질 (최종 농도 1-243 ng/mL), 75 µ L RPMI 매체, 25 µ L LPS (최종 농도 10 ng/mL), 및 인간의 피를 100 µ L (최종 희석).
참고: 잘 당 총 볼륨은 250 µ L. - 37 ° C, 8%의 CO2, 그리고 18 h에 대 한 95% 습도에서 접시를 품 어.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 문화 supernatants TNFα ELISA를 사용 하 여 TNFα의 농도 평가 합니다.
- 계산 하는 수식에 따라 IL4-10 융합 단백질에 의해 염증 반응의 억제: % 억제 (1-(A-B)/(C-B)) x 100 =
참고: 여기 A LPS 자극된 문화 IL4-10 퓨전 단백질, B로 치료에서 TNFα 수준 = unstimulated 문화, 그리고 C에서 TNFα 수준 = = LPS 자극된 문화에서 TNFα 수준.
2. 마우스 모델 지속적인 염증 성 통증에 대 한
참고: 그것은 이렇게 섹스 의존 효과의 식별 하면 때문에 남성과 여성 모두 마우스 (C57Bl/6)를 사용 하는 것이 중요. 일반적으로 사용 하는 마우스 오래 된 8-16 주 사이 있다. 필요한 동물의 수를 확인 하려면 전력 계산 수행 되어야 한다. 이러한 계산을 수행 하는 웹 기반 도구 (예를 들어, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net)는 인터넷에서 쉽게 찾을 수 있습니다.
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만성 염증 성 통증의 유도
참고: carrageenan 또는 완전 한 프로이트의 보조 (CFA)의 intraplantar 주사와 성인 쥐에 지속적인 염증 성 통증 유발. 다른 테스트 서로 방해 하지 않습니다.- Λ-carrageenan을 용 해 하 여 carrageenan (2 %w / v) 준비 ( 재료의 표참조) 0.9%에서는 carrageenan 제대로 해산 되도록 23 게이지 바늘을 통해 솔루션을 전달 하 여 NaCl. 주사를 수행 하기 전에 직접 신선한 솔루션을 준비 합니다.
- 또는, CFA, 사용 하는 경우 혼합 CFA 솔루션 제대로 intraplantarly, 그것을 주입 하기 전에 CFA 있기 때문에 진 균 결핵 (H37Ra) 열 사망 하 고 건조, 0.85 mL 파라핀 오일, 및 0.15 mL mannide의 1 마그네슘을 포함 하는 물에 오일 유제 monooleate ( 테이블의 자료를 참조).
참고: 금속 plungers와 유리 해밀턴 주사기 고무 plungers는 보조에 기름으로 반응할 수 있습니다 때문에이 화합물을 주입 권장 됩니다. -
Intraplantar 주입
- 피하 30 게이지를 사용 하 여 비 취 마우스의 뒷 발에는 화합물의 실시간 삽입 20 µ L (또는 컨트롤 dissolvent) 수 있도록 하는 주입 하기 전에 적어도 15 분 동안 RT에서 주사기에 화합물 (2.1.1 또는 2.1.2 단계)를 유지 바늘입니다.
- 발뒤꿈치에 지시 하는 손가락의 기지에서 바늘을 삽입 하 고 바늘이 삽입 될 때 화합물을 주입 약 0.5 c m. 주입 후 주입 사이트 솔루션의 누설을 피하기 위해 주사기를 약간 회전 하는 동안 천천히 바늘을 철회.
3. 통증 측정
참고: 행동 실험을 수행 하는 연구자 마우스 치료 장 님 인지 확인 합니다. 그것은 어떤 측정을 수행 하기 전에 테스트 환경에 동물을 순응 하는 것이 중요입니다. 가급적, 실험을 시작 하기 전에 주 동물 1-2 번 15-30 분 각 테스트를 수행 하는 데 사용 하는 다른 장치에 대 한 배치 됩니다. 처리 남성과 동일한 실험에서 여성, 남성 여성 별도로 평가 합니다. 깨끗 한 감 금 소 그리고 다른 남녀의 행동에 잠재적인 원치 않는 효과 방지 하려면 다른 그룹 사이의 광범위 하 게 표면. 측정 기준 철수 대기 시간 또는 기계적 임계값 2-3 번 정확 하 게 기준 임계값을 결정 하 고 이들은 어떤 화합물의 intraplantar 주입 전에 안정 여부를 식별 합니다.
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폰 Frey 테스트: 무해 한 자극에 기계적 감도
- 동물 개별적으로 와이어 메쉬 스탠드에 아크릴 케이지로 놓고 측정 전에 적어도 15 분에 대 한 순응을 마우스를 허용 합니다.
- 4 0.02에서 배열 하는 폰 Frey 머리카락의 보정된 시리즈에 대 한 응답에서 발 철수 임계값을 측정 하 여 평가 하는 기계적 감도 g. 긍정적인 철수 응답으로 적용 된 머리에서 발의 모든 움직임을 고려. 피부에 대 한 약간의 굴곡을 일으킬 누르고 ~ 3 미 확인 확실히 머리에 충분 한 힘을 가진 발 표면에 수직으로 발을 적용 하는 동안 트위스트 하지 않는 필 라 멘 트를 적용.
- 위아래 방법15,21을 사용 하 여 50% 발 철수 임계값을 계산 합니다.
참고: 적용할 첫 번째 필 라 멘 트는 0.4 g (다른 시작 필은 임계값이이 마우스 표시 기준에 따라 사용할 수 있습니다). 필 라 멘 트에 응답의 부족 긍정적인 반응을 나타냅니다 다음 얇은 필 라 멘 트를 사용 하 여 다음 두꺼운 필 라 멘 트를 다음과 같은 자극에 사용 함을 나타냅니다. 머리 프레 젠 테이 션의 수; 첫 번째 차동 응답에 의해 결정 됩니다. 그 후, 5 더 많은 응용 프로그램을 수행 합니다. 계산 하는 방법에 따라 50% 임계값15,21설명한.
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열 감도: Hargreaves 테스트
- 미리 따뜻하게 (30 ° C) 유리 접시에 연습장에 동물을 놓고 측정, 동물 앉아 여전히 때까지 기다리는 전에 적어도 15 분에 대 한 순응을 마우스를 허용 합니다.
- 하 그 리브스 기구 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 초점 을된 보이는 빛 광선에 의해 동물의 발을가 열 하 여 열 철수 지연 시간을 결정 합니다.
참고: 광속의 강렬이 실험적으로 결정된 강도 설정, 광선 끝 8의 평균 시간 철수 응답 때문에 12%로 설정 됩니다 C57Bl/6 쥐에 기준선에서 s. 강도 설정은 개별 기계 및 마우스 변형 결정 되어야 합니다. 20의 최대 커트 오프 시간 s 이상의 동물에 상해를 피하기 위해 사용 됩니다. - 동물 1 ~ 4 번 철수 대기 시간을 측정 합니다. 측정 하는 모든 응답을 평균 한다. 독립적으로, 각 발을 측정 하 고 같은 후속 측정 사이 적어도 1 분 간격으로 발.
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자세 적자: 동적 무게 베어링 테스트
- 무게 베어링 분석 입력된 매개 변수로 각 개별 동물의 몸 무게를 필요로 하기 때문에 테스트 하기 전에 각 동물의 몸 무게를 측정 합니다.
- 바닥 계측 동적 체중-베어링 시스템에서 지 원하는 마우스 동작을 기록 하는 카메라 커버 조립 동물을 개별적으로 놓습니다. 5 분 동안 녹음 하기 전에 0.5 ~ 1 분에 대 한 순응 하는 동물을 보자.
참고:이 테스트에서 자유롭게 움직이는 동물 하나만 한 번에 평가할 수 있습니다. - 무게 베어링을 수행 하 고 데이터를 분석 하는 설정을 조정 합니다.
참고:이 실험에서 우리는 다음 매개 변수 사용: (i) 낮은 무게 임계값 0.6 g: 이것은 센서의 셀 중 하나를 활성화 하는 데 필요한 최소 무게. (ii) 높은 무게 1 g:의 임계값이 완전 한 세포를 활성화 하는 데 필요한 무게를 나타냅니다. (2 셀 iii) 표면 임계값:이 수 고려 되어야 활성화 될 필요가 있는 서로 인접 한 셀의 수를 나타냅니다. (이미지 4) 최소 수는 5: 걸리는 0.1 s 모든 이미지. 수 없는 마우스를 이동 하지 않으면 프레임의 최소 수를 나타냅니다. 따라서, 마우스 자세 5 의미의 값에 대 한 안정 될 필요 > 0.5의 분석에 대 한 고려는 측정을 얻기 위해. - 비디오를 재생 하 여 각 비디오의 분석을 수행 하 고 각 사지는 소프트웨어에 의해 표시 된 시간 프레임에 소프트웨어에 의해 올바르게 인식 됩니다 확인 합니다.
참고: 기록 시간 1 분의 최소의 유효성을 검사 해야 합니다. 소프트웨어를 베어링 동적 무게 계산 하 고 다음 매개 변수를 제공 합니다: (i) 각 개별 발 그램, 그리고 전체 몸 무게의 비율로 부담 하는 무게. (ii) 무게는 전체 몸 무게의 비율로 결합 된 앞 발 또는 결합 된 후방 발 그램에서 부담. (iii) 왼쪽/오른쪽의 비율 발 베어링 무게 또는 전면/후면 체중 베어링. (4) 각 발 또는 압력 민감한 패드를 활성화 하는 결합 된 정면/후방 발의 표면 영역. (각 매개 변수에 대 한 v) 평균 및 표준 편차입니다. (vi) 전체 실험 기간 동안 다른 자세 (양육, 3 발 또는 4 발)의 기간입니다. (vii) 시간 (s) 각 발 전체 실험 동안 무게를 운반합니다.
4. Intrathecal 주입 IL4-10의 퓨전 단백질 진통에 대 한
참고: 방에 환기 적절 한 공기 흐름을 보장 하기 위해 오픈 되는지 확인 합니다. IL4-10 융합 단백질 (1 µ g/마우스; 5 µ L 총 주입 량)의 효능을 테스트 차량 주사 및 주사 (IL4 + IL10, 0.5 µ g + 0.5 µ g/마우스, 5 µ L 총 사출 볼륨) 개별 cytokines의 조합에 대하여 시험 되어야 한다.
- 3-4 %isoflurane 유도 실에서 2 L/min의 산소 흐름 속도 마우스 anesthetize 마우스가 제대로 동물을 응답 하지 않도록 발을 곤란 하 게 하 여 마 취를 확인 하십시오.
- 그것의 머리를 가진 테이블에 마우스 장치의 원뿔에 장소와 intrathecal 주입을 수행 하는 동안 1.5-2% isoflurane 2 L/min의 산소 흐름 속도 마우스 진정을 유지.
- 다시-채우기 깨끗 25 µ L 유리 해밀턴 주사기로 주사 화합물 27 게이지 주사 바늘에 연결.
- 잡고 마우스 단단히 척추 갈비뼈에 후부를 약간 마우스를 들어 올립니다. 요 추는 L5, L6는 사이 수직으로 바늘 놓고 신중 하 게 오른쪽 허리 뼈의 중간에 피부를 통해 그것을 삽입 합니다. 척추 공간으로 바늘을 놓습니다.
참고: 척추 공간을 찾는 '검색' 이동에 의해 뼈 조직의 저항 손실 느낌까지 바늘을 가볍게 누르면 rostral 복 부 축 바늘 일부 필요할 수 있습니다.- 꼬리 영화 발생을 확인 하 여 올바른 대상으로 확인 합니다. 화합물의 5 µ L를 천천히 주입 하 고, 몇 초를 기다릴 다음 천천히 바늘을 철회. 경우에 단일 발 영화 관찰 바늘이 높습니다 제대로 배치 되지 않습니다.
- 주입 후 어떤 모터 장애/마비의 부재를 보장 하기 위해 마 취에서 회복 후 첫 30 분 동안 밀접 하 게 마우스를 확인 합니다.
참고: 통증 행동 (설명된 단원 3)로 측정 된 15 분 후 복구 될 수 있습니다.
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Representative Results
친화성 크로마토그래피 정화 하는 동안 얻은 다른 분수를 포함 하는 SDS 페이지 젤의 대표 그림 그림 1에 표시 됩니다. 로드 (L) (FT) 분수를 통해 흐름에, 모든 단백질 HEK293 상쾌한에 관찰 된다. 아무 단백질 세척 (W) 분수에서 관찰 됩니다. 차입 (E) 분수에서 35와 37 kDa의 두 밴드 IL4-10 융합 단백질 (화살표)의 두 개의 서로 다른 glycoforms를 해당 관찰 된다. 그림 1B, 전체 혈액의 대표적인 효능 분석 결과에서 두 개의 다른 IL4-10 퓨전 단백질 배치의 분석 결과 표시 됩니다. LPS 유발 TNFα 릴리스의 복용량 의존 저해, 두 IL4-10 퓨전 단백질 일괄 처리에 대 한 비교 bioactivity를 보여주는 관찰 됩니다.
다음으로, 대표적인 실험 IL4-10 퓨전 단백질 지속적인 염증 성 통증을 억제 하기 위해 테스트의 테스트 결과의 예 (그림 2) 표시 됩니다. 지속적인 염증 성 통증 2 %carrageenan intraplantar 주입에 의해 유도 했다. 기계 (그림 2A) 뿐만 아니라, 열 (그림 2B) 통 시간이 지남에 따라 그 뒤를 이었다. 염증 성 통증의 유도 후 일 6에서 마우스 컨트롤 IL4-10 융해 단백질 또는 차량 intrathecally는 주입 했다. IL4-10는 크게 기계 (그림 2A) 및 열 (그림 2B) 통을 해결 하 고 주입 후 24 시간 후 최대 효과 도달. 이상적으로, 통증 억제에 융해 단백질의 효능 또한 통증을 억제 하는 능력은 개별 cytokines의 합계 보다 더 나은 테스트를 개별 cytokines의 아데닌 농도 대하여 시험 되어야 한다. 이러한 데이터는 여기에 표시 되지 않습니다 하지만 우리는9이 데이터 표시 하는 최근 게시를 참조 하십시오.
IL4-10 융해 단백질의 효과 최근 CFA 유도 된 염증 성 통증 모델9에서 테스트를 했다. 이 실험에서 IL4-10 융해 단백질의 여러 주사 관리 intrathecally 했다. CFA-유도 된 지속적인 염증 성 통, 폰 Frey와 진통 치료9IL4-10 융해 단백질의 잠재력을 보여주는 하 그 리브스 테스트를 사용 하 여 측정 여러 주사에 완전히 해결 되었습니다. 여기 우리가 체중 베어링 감소의 영향을 받는 발 (그림 3A-B)을 유도 하는 intraplantar CFA 주입을 보여줍니다. 하루 7 intraplantar CFA 주입 감쇠의 영향을 받는 발 IL4-10 퓨전 단백질 관리 (그림 3B 후에 2 일 차량 주입 쥐에 비해 체중 베어링에 감소 후에 IL4-10 융해 단백질의 Intrathecal 주입 ).
그림 1 : 정화와 IL4-10 융해 단백질의 특성. 친화성 크로마토그래피 분수의 (A) Coomassie 스테인드 SDS 페이지 분석: l: 부하, 피트: 통해, w: 세척, e: 차입. (B) 기능 분석 결과: IL4-10 퓨전 단백질 복용량 독립적으로 (혼자 LPS 자극된 문화에 비해 % 억제로 표현) LPS 자극된 전체 혈액 문화에서 TNFα 생산을 억제. 데이터는 평균 ± sd.로 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : IL4-10 융합 단백질에 의해 염증 성 통 억제. 선 동적인 고통 2 %carrageenan (자동차)의 20 µ L의 intraplantar 주입에 의해 유도 했다. Intraplantar 주입 후 6 일 쥐 1 µ g IL4-10 융해 단백질 또는 차량 (PBS) intrathecal 주사 (화살표)를 받았다. (A) 기계적 과민 증 (로그 50% 임계값 (g))는 폰 Frey 테스트를 사용 하 여 시간이 지남에 따라과 (B) 열 감도 (대기 시간 (s)) Hargreaves 테스트를 사용 하 여 측정 했다. 데이터는 ± SEM. 별표 나타냅니다 차량과 IL4-10 주입 동물 사이의 양방향 ANOVA로 분석 하는 중요 한 차이점이 의미로 표현 됩니다. * *, * * * = p < 0.01 및 p < 0.001, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 무게 베어링에 염증 유발 변경. 염증 성 통증이 20 µ L의 완전 한 프로이트의 보조 (CFA)의 intraplantar 주입에 의해 유도 했다. 각 발에 베어링 무게 동적 체중 베어링 장치를 사용 하 여 측정 했다. 다른 3 발에 비해 동측 발의 무게 베어링의 비율 뿐만 아니라 영향을 받는 발 (동측 뒷 발)의 g 무게 베어링과 영향을 비 발 (앞 발과 contralateral 발)의 총 무게 베어링 표시 됩니다. CFA-유도 된 염증 동안 베어링 무게의 (A) 과정 (n = 10). (B) intraplantar CFA 후 7 일 쥐 1 µ g IL4-10 융해 단백질 또는 차량 (PBS)의 intrathecal 주입 받았다. 무게 베어링 0와 intraplantar CFA, 후에 7 일 그리고 IL4-10 융해 단백질의 관리 후 2 일에서 측정 했다. 다른 3 발에 비해 동측 발의 무게 베어링 표시 됩니다 (n = 3-4). 데이터는 평균 ± SEM.로 표현 * * * = p < 0.001; * * p = < 0.01; p 를 = < 기준선 (0 일)에 비해 0.05. # p = < 동물 취급 하는 차량에 비해 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고는 생산과 재조합 IL4-10 융해 단백질의 특성에 대 한 방법 및 지속적인 염증 성 통증의 마우스 모델에서 염증 성 통 억제에 효능을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 생산과 IL4-10 융해 단백질의 정화는 작은 규모에서 수행 됩니다. 그들은 통해 간결한 식 시스템에서 얻을 수 없는 포스트 번역 상 수정 때문 HEK293 세포 단백질 생산을 위한 식 시스템으로 선택 됩니다. 포스트 번역 상 수정 단백질 기능에 대 한 관련 되며 이러한 수정이 없을 경우 잠재적으로 영향을 미칠 수 IL4-10 융해 단백질의 치료 효능. 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 표면에 뜨는 문화에서 정화입니다. 우리 자체 만든 단일 클론 항 체 IL4에 대 한 친 화력 정화 하지 선호도 태그 시스템으로 정화 수 있도록 태그를 포함 하는 IL4-10 융해 단백질을 생성 하 고 사용 하기로. 이것을 위한 이유의 단백질 폴딩과 기능에 태그 관련 변화 가능성을 방지 했다. 그럼에도 불구 하 고, 매우 선택적 단일 클론 항 체 부족 하다 면 태그와 단백질 예를 들면 개발 필요는 그의 태그. 이 경우, 그것은 단백질 C 또는 N terminus 단백질 기능에 영향을 미치는 것을 방지 하려면 태그에 대 한 적합 인지 결정 하는 중요 한 것입니다.
HEK293 상쾌한의 1 l, 순화 IL4-10 융해 단백질의 약 3 mg을 획득 하지만이 일괄 처리에서 일괄 다를 수 있습니다. 삭제 하기 전에 여러 정화 사이클에 대 한 친 화력 정화에 대 한 열을 사용할 수 있습니다. 정화 과정의 가장 중요 한 단계는 낮은 pH에 의해 열에서 IL4-10 융해 단백질의 차입 낮은 pH는 돌이킬 수 없는 단백질 변성 그리고 단백질 강 수 유도 수 있습니다 때문입니다. 따라서, 네이티브 단백질 구조의 유지 보수 및 단백질의 부재 좋은 품질 일괄 처리에 대 한 필수적입니다. 이 위해, 융해 단백질의 bioactivity의 평가 이전과 다른 차입 버퍼가 정화 후 시험 체 외에 있이 필요가 있다. IL4-10 융해 단백질의 정화, 후에 bioactivity 하지 비 순화 단백질에 비해 감소 했다. 또한, 집계 형성 차입 단계 0.1 M 글리신 버퍼 수행한 결 석 했다 (pH 2.5 =), 및 차입 분수의 pH는 즉시 1 M Tris 버퍼 무력화 (pH = 9).
순화 IL4-10 융해 단백질의 농도 인간 IL10 ELISA 결과 근거 하 여 추정 된다. BCA 단백질 분석 결과 단백질 농도 확인 하는 데 사용 됩니다. 단백질 정화 평가 후의 복구 IL10 ELISA 부하, 통해, 세척 및 차입 분수에 측정 농도에 따라. BCA 단백질 농도 결정 IL4-10 융해 단백질의 dialyzed 차입 분수에만 평가할 수 있습니다. 비 dialyzed 차입 분수 이미, BCA 측정에 영향을 미치는 화합물 포함. 비 정화 분수 HEK293 문화 매체에서 다른 단백질을 포함.
IL4-10 융해 단백질의 bioactivity의 결정은 전체 혈액 분석 결과에 수행 됩니다. IL4-10 융해 단백질의 bioactivity 기능 활동 유지 되는지 여부를 확인 하려면 여러 기증자의 전체 혈액에 평가 되어야 한다. 몇몇 기증자는 기증자 기증자 분산 LPS 유발 TNFα 출시를 억제 하기 위해 IL10와 IL4 용량에 존재 하기 때문에 필요 합니다. 또한, IL4R 및 IL10R의 표현 LPS 유발 TNFα 생산을 억제 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 능력에 영향을 미치는 기증자 간 달라질 수 있습니다.
설명된 방법에 우리는 통증 비보를 해결 하려면 IL4-10 융해 단백질의 효능을 평가 하기 위해 지속적인 염증 성 통증의 2 마우스 모델 자세한. 그럼에도 불구 하 고, 재조합 융합 단백질의 진통 잠재력의 완전 한 평가 대 한 분자 뿐만 아니라 만성 통증의 다른 모델에서 테스트 되어야 합니다. 이 모델을 포함, 하지만 신경 손상 및 화학요법 유도 neuropathic 고통9,22의 모델에 국한 되지 않습니다. 폰 Frey 테스트 Hargreaves 테스트는 일반적으로 사용 되는 및 진통 약물을 테스트, 하지만 그것은 또한 비 갖는 고통 behaviorsand에 미치는 영향을 평가 하기 위해 추가 테스트 (예: 동적 무게 베어링 테스트)를 포함 한다 분명 해졌다 고통 작동 시험 (예: 조건 장소 설정 (CPP) 갖는 비 통증 행동17,18감지) 통증에 의해 동물의 컨디셔닝 (15 분 미만에 효과 발휘) 하는 빠른 행동 진통제 필요 하기 때문에 CPP를 수행 하려면 융해 단백질의 통증 억제 효과 계정에,가지고 한다. 그럼에도 불구 하 고, 복합 테스트 느린 진통 개시는 오랫동안 고통 억제 (4 일 이상)을 유도 하는 경우, CPP 여전히 사용할 수 있습니다 화합물 저해 통증 여부를 테스트 하. 이 경우에, 빠른 행동 진통제와 컨디셔닝의 화합물 유도 손실 평가 될 필요가 있다.
화합물 고통을 느 루트 신경 절 및 척수 등 관련 분야 도달 것 이다 Intrathecal 주사 관리, 경로으로 선택 됩니다. 특히, 진통 약물의 intrathecal 배달이 이렇게 필요한 진통 약물의 복용량을 줄일 수 만성 통증 환자의 치료로 일반적인 관행 되 고 독성 및 조직의 부작용을 감소. 그럼에도 불구 하 고,이 관리 경로 몇 가지 제한 사항이; 그것은 잘 훈련 된 인력을 필요로 하 고, 작은 거미 막 밑 공간으로 인해 주입의 볼륨 쥐, 융해 단백질의 농축된 솔루션이 필요한 5 µ L로 제한 해야 합니다. Intrathecal 주사의 기술과 훈련이 필요합니다. 이러한 훈련은 정확한 intrathecal 주입을 확인 하는 염료의 주입을 가진 복구 비 마 취 동물에 수행할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품의 일부는 위트레흐트 대학 생명 과학에 의해 자금 하고있다 부여
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
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