Summary
В этой статье мы предоставляем детали для методов производства и контроля качества IL4-10 рекомбинантных синтез белка. Мы также покажем, как для тестирования эффективности этого белка для устранения боли в мышиной модели воспалительные боли.
Abstract
Хроническая боль является трудно лечить, и срочно необходимы новые подходы к решению постоянной боли. Противовоспалительных цитокинов являются перспективными кандидатами для лечения изнурительных условиях боль из-за их способности регулировать аберрантных нейро иммунных взаимодействий. Однако физиологически они работают в сети различных цитокинов, и поэтому их терапевтический эффект не может быть оптимальной, при использовании в качестве автономного наркотики. Чтобы преодолеть данное ограничение, мы разработали синтез белка противовоспалительных цитокинов IL4 и IL10. Здесь мы описываем методы для производства и контроля качества IL4-10 рекомбинантных синтез белка, и мы проверить эффективность IL4-10 синтез белка для устранения боли в мышиной модели стойких воспалительных боли.
Introduction
Хроническая боль остается одним из наиболее изнурительных и под лечение медицинских проблем XXI века, затрагивающих > 20% взрослого населения1,2. Однако процедуры для оказания помощи от хронической боли часто оказываются неэффективными или должны быть прекращены из-за серьезных побочных эффектов3. Важно отметить, что в настоящее время доступных препаратов только симптоматическое облегчение, но не значительно изменять или вылечить хронические боли. Несмотря на хронические боли, как представляется, неврологические расстройства, свидетельства участия иммунной системы в хронической боли развития4,5. Кроме того новые подходы, основанные на иммунную, для лечения боли. К примеру противовоспалительных цитокинов препятствовать боли в нескольких моделей хронической боли6,,78. Однако противовоспалительных цитокинов имеют короткий период полураспада, уменьшая их потенциальные эффекты ингибирующих боль. Кроме того противовоспалительных цитокинов наиболее оптимально работают во взаимодействии друг с другом. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы недавно слились противовоспалительных цитокинов интерлейкина-4 (IL4) и интерлейкин-10 (IL10) в одну молекулу. Синтез белка IL4-10 показывает превосходной эффективности в подавлении хронических воспалительных и невропатической боли, по сравнению с отдельных цитокинов9. Здесь мы описываем, как производится такой синтез белка, очищаются, и как его качество контролируется.
IL4-10 синтез белка производится переходных transfection клеток HEK293-F с вектором выражения ЧУПП, перевозящих последовательность кДНК кодирования IL4-10 синтез белка в клетках человека. HEK293-F клетки выбираются для столб-поступательные изменения белка, то, что происходит не в системах бактериальных выражения. Чтобы оптимизировать glycan укупорки с сиаловая кислота, cDNA кодирования бета galactoside-2, 3-sialyl трансферазы включена в вектор как второй трансген. Синтез белка очищается с помощью очищение сродства белка супернатанта культуры, потому что он является более мощным, чем очистки другими методами например размер исключение или ионообменной хроматографии10,11. Для того чтобы очистить протеин сплавливания IL4-10, мы использовали собственного производства моноклональных антител против IL4. Оценка чистоты и отпорности очищенный протеин сплавливания IL4-10 выполняется как часть контроля качества. Чистоты производимых серий оценивается электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE) и высокого давления размер гель-проникающей хроматографии (HP-SEC). Биологическую IL4-10 синтез белка оценивается путем измерения его способность ингибировать липополисахарида (LPS)-индуцированной фактор некроза опухоли альфа (TNFα) производство в цельной крови культур и сравнивая его комбинации личности цитокины.
Наконец чтобы протестировать IL4-10 синтез белков способность препятствовать хронические боли, мы описываем, как синтез белка может быть проверена как анальгетик в широко используемых мыши модели стойких воспалительных боль12,13,14 . Здесь мы описываем методы модели воспалительные боли. Однако важно отметить, что другие модели боль может быть использоваться (например, модели невропатической боли), в зависимости от исследования вопросы, которые необходимо ответить. Для оценки боли в этих моделях, важно использовать целый ряд поведенческих мер, которые включают вызывали и не вызывают боли. Здесь мы описали методы оценки изменений в механически и термически вызванные поведенческих реакций. Механический чувствительность безобидные раздражители оценивается с помощью теста фон Frey, в то время как температурная чувствительность оценивается с помощью теста Харгривз. Главное не вызывали Гипералгезия/аллодиния измеряется с использованием тест динамического веса подшипника. Эти меры широко признается как боль меры и дать важную информацию о боль порогов и потенциальных боль испытываемых животных15,16,17. Другие меры для оценки не вызвала боль (например, стимул независимых), например тест предпочтение кондиционером место, может быть ценным18. Для оценки потенциального препарата подавляют боль, мы провели Интратекальное отправления синтез белка, как с этот маршрут администрации доза меньше белка необходимо достичь областях, связанных с боли и избежать системных (сторона-) эффекты19, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с международными руководящими принципами и предварительного одобрения от местных экспериментальных этического Комитета. Цельной крови был получен от службы доноров Mini (мини доноров Диста, MDD) в университете Утрехта медицинский центр (UMCU) в Нидерландах. MDD получил положительное одобрение от Комитета по медицинской этике UMCU (члена Ethische Toetscommissie) для протокола номер 07-125/C.
1. белки производство и характеристика
- Культура клеток
Примечание: См. Таблицу материалов для используемой среды культуры.- Потепление HEK293-F клетки при 37 ° C, до тех пор, пока существует небольшой комок льда. Незамедлительно передать талой клетки 10 мл ледяной средних (4 ° C) и центрифуги суспензию клеток при комнатной температуре (RT) за 4 минуты (мин) на 500 x g.
- Удалите носитель и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл свежей среды на RT, последующим центрифугированием на 500 x g на 4 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл среды на RT. Add суспензию клеток прямо в 125 мл флакон, содержащий 25 мл подогретым среды (37 ° C). Культура клетки при 37 ° C, 8% CO2и 95% влажности на орбитальный шейкер, вращающихся со скоростью 125 об/мин.
- Субкультура клетки дважды в неделю. Использование автоматизированных клеток противостоять (см. Таблицу материалы) для оценки количества клеток и жизнеспособность клеток. Семя жизнеспособных клеток в концентрации 3 x 105 клеток/мл в колбах Эрленмейера. Сохранить общий объем питательной среды на 1/5 общего объема колбы Эрленмейер культуры все время держать аэрации оптимальным.
- Трансфекция
Примечание: Субкультура клетки три четыре раза до transfection и transfect их жизнеспособность клеток при > 90%. Жизнеспособность клеток оценивается по автоматизированной (электрическое поле многоканальный) cellcounting система, основанная на целостность плазматической мембраны. Смотрите Таблицу материалов для transfection реагента.- Центрифуга клетки на RT 4 мин на 500 x g; Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл подогретым питательной среды (37 ° C) и разбавления суспензии клеток к ~1.0 x 106 клеток/мл в общем объеме 1 л Алиготе суспензию клеток в 10 аликвоты по 100 мл в 500 мл Эрленмейер колбы.
- Разбавьте 1 мг плазмидной ДНК в 33 мл сокращение сыворотке минимальным необходимым среднего (MEM, смотрите Таблицу материалы), нежный смешивая. В отдельном трубку разбавляют 1330 мкл Реагента трансфекции в MEM, нежный смешивая. Инкубировать оба решения на RT на 5 мин добавить и смесь разбавляют в MEM к трансфекции реагента в MEM ДНК и инкубировать смесь для 30 мин на RT.
- Добавить смесь реагент ДНК transfection клетки (культивировали в разделе 1); Добавьте 6.6 мл смеси в каждом 500 мл колбу Эрленмейера, содержащие 100 мл клеток в среде культуры. Сохранить клетки в ранее упомянутых культуры условиях. Урожай супернатант культуры, содержащий синтез белка выделяется IL4-10 через три дня после transfection.
- Определить концентрацию IL4-10 синтез белка в культуре супернатанта, выполняя IL10 ELISA согласно протоколу от производителя (см. Таблицу материалы).
Примечание: В условиях оптимального культуры, концентрация синтез белка можно ожидать между 2,5 и 5 мкг/мл.
- Очищение протеина хромотографией сродства
Примечание: Хромотография сродства производится при комнатной температуре. Однако все фракции (культура супернатанта, нагрузки, поток через и элюции фракции) хранятся на льду во время процедуры.- Пара 10 мг в дом сделал моноклональные антитела против IL4 до 1 г CNBr-активированный sepharose 4B, по словам производителя протокол (см. Таблицу материалы). Медленно залейте 2,5 мл спаренных sepharose бисера в столбце хроматографии стекла (30 см длиной и 1,5 см, внутренний диаметр, см. Таблицу материалы).
- Блокировать оставшиеся привязки сайтов бисера, передав 50 мл фосфатный буфер (PBS) содержит 1% альбумина Bovine сыворотки через колонку. Промойте колонку с 25 мл PBS (рН = 7,4) следуют 12,5 мл 0,1 М глицин буфера (рН = 2.5) и 25 мл PBS (рН = 7,4).
- Пройти 100 мл десятикратного концентрированные HEK293 клеточной культуры супернатанта через колонку потока со скоростью 1 мл/мин мыть столбец с 50 мл ФСБ.
- Элюировать связанный протеин сплавливания IL4-10 с 12,5 мл 0,1 М глицин буфера (рН = 2.5) со скоростью потока и сбора фракций 2,5 мл, 1 мл/мин. Мкл буфера Tris 1 М 350 (рН = 9) для каждой фракции довести рН до 7. Dialyze нейтрализованы дроби на ночь против 2 Л PBS (рН = 7,4).
- Использование труб диализа сухой диаметром 16 мм и свертывании молекулярной массой 3,5 K. Стерильными фильтр dialyzed фракций, с использованием одноразовых фильтры 0,45 мкм поры диаметром. Хранить стерильный раствор протеина сплавливания IL4-10 в аликвоты-80 ° c.
- Оцените чистоту eluted IL4-10 синтез белка Кумасси окрашенных геля SDS-PAGE 12% и HP-SEC (колонка 3 мкм SEC-2000). Для анализа HP-сек Загрузите 40 мкл белка на концентрацию ~ 1 мг/мл по столбцу. Использовать 100 мм натрия фосфат буфер с 150 мм хлорида натрия (рН = 6,8) как подвижная фаза. Установите скорость потока в 1 мл/мин.
- Определить концентрацию каждой партии очищенный протеин сплавливания IL4-10, IL10 ELISA и Assay протеина Bicinchoninic кислоты (BCA белка Assay Kit, смотрите Таблицу материалы) по данным производителя протоколы.
- Применение рекомбинантного человеческого IL10 для создания стандартной кривой в ELISA assay. Чтобы исправить размер разницы между рекомбинантных IL10 (18 кДа) и IL4-10 синтез белка (34 кДа), умножить на коэффициент 1,8 полученные концентрации.
- Биологическую IL4-10 синтез белка
Примечание: Цельная кровь генотипирования для каждой партии IL4-10 синтез белка производится и деятельность различных партий сравнивается в рамках контроля качества. Цельной крови генотипирования в свежей крови человека собранных в день assay в Гепарин труб. Кровь была получена из здоровых добровольцев в нашей службе внутренних доноров. Образцы должны быть обработаны как потенциально биологических опасностей.- Подготовить вывозимому серийных разведений предварительно очищенный IL4-10 синтеза белка в RPMI среднего (см. Таблицу материалы) концентрация диапазоне 5-1215 нг/мл.
- Подготовка предварительного разведения ПЛАСТИНОК (100 нг/мл) и человеческой крови, которая разводится в среде RPMI 4 раза.
- Пипетка предварительного разведения IL4-10 синтез белка, ПЛАСТИНОК и крови человека в 48-ну плиту. Для каждой скважины, добавьте 50 мкл IL4-10 синтез белка (конечная концентрация 1-243 нг/мл), 75 мкл RPMI среднего, 25 мкл ПЛАСТИНОК (конечная концентрация 10 нг/мл) и 100 мкл крови человека (финал разбавленный).
Примечание: Общий объем в скважины составляет 250 мкл. - Инкубируйте пластины при 37 ° C, 8% CO2и 95% влажности для 18 h.
- Оцените концентрацию TNFα в supernatants культуры с помощью TNFα ELISA, по словам производителя протокол.
- Рассчитать ингибирование воспалительной реакции, IL4-10 синтез белка по формуле: ингибирование % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
Примечание: Здесь A = TNFα уровней в LPS стимулировали культурах относились с IL4-10 синтез белка, B = TNFα уровни кератоз культуры, и C = TNFα уровней в LPS стимулировали культуры.
2. мыши модель для стойких воспалительных боли
Примечание: Важно использовать как мужчин, так и женские мышей (C57Bl/6), поскольку это позволит идентифицировать секс зависимых эффектов. В целом используемые мышей, между 8-16 недель. Чтобы определить количество животных, требуются, должны выполняться вычисления мощности. Веб-инструменты для выполнения таких расчетов легко найти в Интернете (например, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
Индукция хронические воспалительные боли
Примечание: Побудить стойких воспалительных боль в взрослых мышей с intraplantar инъекции Каррагинан или полный Фрейда адъювантной (CFA). Различные тесты не мешать друг другу.- Подготовьте Каррагинан (2% w/v), растворяя λ-Каррагинан (см. Таблицу материалы) в 0,9% NaCl, передав решение через 23-иглы для обеспечения что Каррагинан должным образом расторгнут. Готовить свежий раствор непосредственно перед выполнением инъекций.
- Кроме того если используется CFA, mix CFA решение должным образом перед инъекцией intraplantarly, потому что CFA воды в нефтяной эмульсии, содержащие 1 мг микобактерии туберкулеза (H37Ra) тепла убиты и сушеные, 0,85 мл парафинового масла, и 0,15 мл mannide моноолеат (см. Таблицу материалы).
Примечание: Гамильтон стекла шприцы с металлическими плунжеров рекомендуются для инъекций этого соединения, потому что резиновые поршни могут реагировать с маслом в адъювантной. -
Intraplantar инъекции
- Поддерживать соединение (шаги 2.1.1 и 2.1.2) в шприц на RT для по крайней мере 15 минут до инъекции, чтобы разрешить корректировку RT. Inject 20 мкл, комплекса (или растворители как элемент управления) подкожно в задние лапы-наркоз мыши с помощью 30-датчика иглы.
- Вставить иглу в основании большого пальца, направляя на пятки и инъекционные соединения, когда игла вводится примерно 0,5 см. После инъекции медленно втягивать иглы хотя слегка вращая шприца, чтобы избежать утечки раствора из укола.
3. боль измерения
Примечание: Убедитесь, что исследователи, выполняя поведенческих эксперименты слепы к мыши лечения. Это важно для акклиматизации животных для среды тестирования перед выполнением любого измерения. Предпочтительно за неделю до начала экспериментов животных расположены 1 - 2 раза за 15-30 мин в каждой из различных устройств, используемые для выполнения тестов. При обработке мужчин и женщин в том же эксперименте, оцените мужчин независимо от женщины. Чистой клетки и поверхностей широко между различными группами, чтобы избежать возможных нежелательных эффектов на поведение различных полов. Измерение задержки вывод исходных или механические порогов два-три раза, чтобы точно определить базовые пороги и определить, были ли они стабильны до intraplantar введения любых химических соединениях.
-
Фон Frey тест: механические чувствительность безобидные раздражители
- Место животные индивидуально в акриловые клетки на стенде сетки проволока и позволяют мышей, чтобы акклиматизироваться по крайней мере 15 минут до измерения.
- Оценки механических чувствительность, измеряя лапы вывода порога в ответ на серию калиброванный фон Frey волос от 0,02 до 4 g. рассмотреть любое движение лапы от прикладной волос как ответ положительный вывод. Примените нитей, перпендикулярно к поверхности лапы с достаточной силой, чтобы вызвать небольшое сгибание на коже и подержите ~ 3 s. Make уверен, что волосы не перекручивайте во время применения на лапу.
- Рассчитайте порог лапы снятие 50%, с использованием метода прихваченного15,21.
Примечание: Первый накаливания применять — 0,4 г (другие начиная нитей могут использоваться в зависимости от порогов, эти мыши отобразить базовые). Отсутствие реакции на нити указывает, что следующий толстые нити используется в следующих стимуляции, в то время как положительный ответ указывает на использование следующего тоньше нить накала. Количество волос презентации определяется первым дифференциального реагирования; После этого 5 больше приложений выполняются. Рассчитайте порог 50% согласно методы описанные ранее15,21.
-
Температурная чувствительность: Hargreaves тест
- Поместите животных в клетках на стеклянной пластины подогретым (30 ° C) и позволяют мышей, чтобы акклиматизироваться по крайней мере 15 минут до измерения, ожидание до тех пор, пока животные сидеть.
- Определите раз задержка вывода тепла путем нагревать лапы животных путем целенаправленного видимый луч света с помощью Харгривз аппарата (см. Таблицу материалы).
Примечание: Интенсивность пучка значение 12%, потому что с этой настройкой интенсивности экспериментальным путем, луч света вызывает вывод ответ среднее время 8 s на базовом мышей C57Bl/6. Установка интенсивности должен определяться на отдельные машины и мыши штамм. Максимальная отсечения раз 20 s или больше используется, чтобы избежать травмы животным. - Измерьте время задержка вывода ~ 4 раза за животное. Средняя измерены все ответы. Мера каждой лапой самостоятельно и с по крайней мере 1 мин интервалы между последующими измерениями в том же лапу.
-
Постуральной дефицита: динамический вес подшипника тест
- Мера веса тела каждого животного до испытания, так как вес несущих анализ требует массы тела каждого отдельного животного как входной параметр.
- Место животные индивидуально в полу инструментальной динамической весовой системе собраны на обложку, поддержка камеры, которая будет записывать движения мыши. Пусть животное акклиматизироваться на 0,5 – 1 мин перед записью на 5 мин.
Примечание: В этом тесте, только одно свободно движущихся животное может вычисляться одновременно. - Настройка параметров для выполнения несущие и анализировать данные.
Примечание: В этих экспериментах, мы используем следующие параметры: (i) низкий порог вес 0,6 g: это минимальный вес, необходимо активировать одну из ячеек датчика. (ii) высокий вес порог 1 g: это число указывает вес, необходимо полностью активировать одну ячейку. (iii) поверхности порог 2 клеток: это число показывает количество клеток, прилегающих друг к другу, которые должны быть активированы чтобы быть приняты во внимание. (iv) минимальное количество изображений-5: он принимает 0,1 s для каждого образа. Число указывает минимальное количество кадров, в которых не переместите мышь. Таким образом, значение 5 означает, что мышь поза должна быть стабильной для > 0.5 s для получения измерения, который учитывается для анализа. - Выполнить анализ каждого видео, воспроизведение видео и убедитесь, что каждый конечности правильно распознается программное обеспечение на временные сроки, указанные в программное обеспечение.
Примечание: Не менее 1 мин записанное время должна быть проверена. Динамических отягощения программное обеспечение вычисляет и предоставляет следующие параметры: (i) вес, покрываются каждый отдельных ПАУ в граммах, а в процентах от веса всего тела. (ii вес, покрываются комбинированных Передние лапы или комбинированные задние лапы в граммах и в процентах от веса всего тела. (iii) отношение влево/вправо лапы веса подшипника или передние/задние несущие. (iv площадь поверхности каждой лапой или комбинированных передние/задние лапы, активированные давления чувствительные pad. (v) среднее и стандартное отклонение для каждого параметра. (vi) продолжительность различных поз (воспитание, 3 лапы или 4 лапы) в течение всего эксперимента. (vii) время (s) каждой лапой несет вес в течение всего эксперимента.
4. Интратекальное инъекции IL4-10 синтез белка для обезболивания
Примечание: Подтверждают, что вентиляция в зал открыт для обеспечения надлежащего воздушного потока. Чтобы проверить эффективность IL4-10 синтез белка (1 мкг/мышь; объем всего впрыска 5 мкл) должны быть проверены против автомобиля инъекции и инъекции комбинации отдельных цитокинов (IL4 + IL10, 0,5 мкг + 0,5 мкг/мыши, объем всего впрыска 5 мкл).
- Анестезировать мышь с 3-4% изофлюрановая с расходом кислорода 2 Л/мин в зале индукции. Проверьте, что мышь должным образом наркоз, щипать на лапу, чтобы убедиться, что животное не реагировать.
- Место мыши на таблице с ее головой в носовой конус аппарата и поддерживать мыши седация с 1,5-2% изофлюрановая с расходом кислорода 2 Л/мин при выполнении инъекций Интратекальное.
- Обратно заполните инъекционные соединений в стакан чистой 25 мкл Гамильтон шприц подключен к 27-иглы.
- Держите мышь твердо позвоночника кзади ребер и слегка поднимите мыши. Поместите иглу вертикально между поясничного позвонка L5 и L6 и осторожно вставьте через кожу прямо в середине поясничных позвонков. Вставьте иглу в межпозвонкового пространства.
Примечание: Поиск межпозвонкового пространства может потребовать некоторых «Поиск» движением иглу вдоль оси ростральной брюшной, слегка нажав иглы, пока не почувствовал потери сопротивления костной ткани.- Подтвердите, правильной ориентации, проверяя, что хвост Флик произошло. Медленно вводить 5 мкл, комплекса, подождите пару секунд и затем медленно втягивать иглы. Если только одну лапу Флик наблюдается, игла, вероятно, не правильно размещен.
- После инъекции Проверьте мышь тесно для первые 30 мин после восстановления от анестезии для обеспечения отсутствия любой мотор обесценение/паралич.
Примечание: Боль поведения может быть измеренной (как описано в разделе 3) через 15 минут после восстановления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель картину геля SDS-PAGE, содержащий различные фракции, полученные во время очистки хромотографии сродства показан на рис. 1A. В нагрузку (L) и потока через фракций (FT) наблюдаются все белков, присутствующих в надосадке HEK293. Не белок наблюдается в мыть (W) фракции. В элюции (E) фракции две полосы 35 и 37 кДа наблюдаются соответствующие два разных glycoforms IL4-10 синтез белка (стрелки). Рисунок 1B, представитель потенции пробирного в цельной крови показано пробирного двух различных IL4-10 синтеза белка пакетов. Ингибирование дозозависимый LPS-индуцированной TNFα выпуска наблюдается, показаны сопоставимых отпорности для двух пакетов белка фьюжн IL4-10.
Далее приведен пример результатов испытаний представитель экспериментов, в которых IL4-10 синтез белка проверяется для ингибирования стойких воспалительных боль (рис. 2). Intraplantar для инъекций 2% Каррагинан было вызвано стойких воспалительных боли. Механические (рисA) также, как тепловые (рис. 2B) Гипералгезия последовала со временем. На 6 день после индукции воспалительные боли мышей вводили интратекально IL4-10 синтез белка или транспортного средства как элемент управления. IL4-10 значительно решены механические (рисA) и тепловой Гипералгезия (рис. 2B) и достиг своего максимального эффекта после 24 ч после инъекции. В идеале эффективность синтез белка в торможении боль должны также проверяться эквимолярных концентрации отдельных цитокинов, чтобы проверить свою способность сдерживать боль лучше, чем сумма отдельных цитокинов. Эти данные не отображаются здесь, но мы ссылаемся на недавней публикации, которая отображает этот данных9.
В CFA-индуцированной воспалительные боли модель9недавно был испытан эффективность IL4-10 синтез белка. В этом эксперименте многократные инъекции IL4-10 синтез белка были administered интратекально. Многократные инъекции полностью решены CFA-индуцированной стойких воспалительных Гипералгезия, измеряется с помощью фон Фрей и тесты Харгривз, демонстрируя потенциал IL4-10 синтез белка как болеутоляющее лечение9. Здесь мы покажем, что intraplantar CFA впрыска также индуцированной снижение веса подшипника пострадавших лапы (рис. 3A-B). Интратекальное введение IL4-10 синтез белка в день 7 после intraplantar инъекции CFA ослабленных сокращение веса подшипника пострадавших лапы, по сравнению с транспортного средства вводят мышей через 2 дня после IL4-10 синтеза белка администрации (рис. 3B ).
Рисунок 1 : Очищение и характеристика синтез белка IL4-10. (A) окрашенных Кумасси SDS-PAGE анализ фракций хромотографии сродства: L: нагрузки, FT: поток через, W: мыть, E: элюции. (B) функциональная проба: IL4-10 синтеза белка дозы зависимо подавляет TNFα производства в культуре стимулировали цельной крови ЛПС (выраженный как процент ингибирование, по сравнению с культурами стимулировали LPS только). Данные представлены как среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Ингибирование воспалительных Гипералгезия протеином сплавливания IL4-10. Воспалительные боли было вызвано intraplantar инъекции 20 мкл 2% каррагинана (автомобиль). Через шесть дней после intraplantar инъекции мышей получил интратекальное введение (стрелка) 1 мкг IL4-10 синтез белка или транспортного средства (PBS). (A) механические Гиперчувствительность (журнал 50% порог (g)) был измерен с течением времени, с помощью теста фон Frey и (B) тепловой чувствительностью (задержка (s)) была измерена с помощью Харгривз тест. Данные представлены в виде среднее ± SEM. звездочки представляют существенные различия, анализируемой двусторонний ANOVA, между транспортным средством и вводят IL4-10 животных. **, *** = p < 0.01 и p < 0,001, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Воспаление индуцированные изменения в несущие. Воспалительные боли было вызвано intraplantar инъекции 20 мкл полной Фрейда адъювантной (CFA). Вес подшипника на каждой лапе была измерена с помощью устройства динамический вес подшипника. Учитывая вес в граммах пострадавших лапы (ипсилатеральные задние лапы) и общий вес подшипника не пораженной лапы (передние лапы и контралатерального лапы) отображается, а также соотношение веса подшипника ипсилатеральные лапы, по сравнению с другими 3 лапы. (A) курс веса подшипника во время CFA-индуцированной воспаление (n = 10). (B) в день 7 после intraplantar CFA, мышей получил интратекальное введение 1 мкг IL4-10 синтез белка или транспортного средства (PBS). Вес подшипника была измерена на 0 и 7 дней после intraplantar CFA и через 2 дня после отправления IL4-10 синтез белка. Вес подшипника ипсилатеральные лапы, по сравнению с другими 3 лапы представлена (n = 3-4). Данные представлены как среднее ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0,05, по сравнению с базовой (день 0). # = p < 0,05, по сравнению с транспортного средства лечить животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает методы для производства и характеристика рекомбинантного IL4-10 синтез белка и методы для проверки его эффективности в подавлении воспалительных Гипералгезия в моделях мыши стойких воспалительных боли. Производства и очистки IL4-10 синтез белка производится в небольших масштабах. HEK293 клетки выбираются в качестве выражение системы для производства белка, потому что они позволяют столб-поступательные изменения, которые не могут быть достигнуты в системах прокариот выражения. Столб-поступательные изменения актуальны для функции протеина, и отсутствие таких изменений потенциально могут повлиять на терапевтическую эффективность IL4-10 синтез белка. Белок очищается от культуры супернатанта хромотографией сродства. Мы решили использовать дом сделал моноклональные антитела против IL4 очищение сродства и не производить IL4-10 синтез белка, содержащий тег для очистки с системой тегов сродства. Причина этого заключалась в том, чтобы избежать возможности тегов связанных изменений в сворачивание белков и функции. Тем не менее, если хватает высокоселективных моноклональных антител, белок с тегом необходимо развивать, например его тег. В этом случае это будет важно, чтобы определить, является ли C - или N-конечной белка лучше всего подходит для тега исключить влияние на функции белка.
От 1 Л HEK293 супернатанта получается примерно 3 мг очищенный протеин сплавливания IL4-10, но это может варьироваться от партии к партии. Столбец для очищение сродства может использоваться для нескольких циклов очистки, прежде чем выбросить. Наиболее чувствительным шаг в процедуре очистки является элюции IL4-10 синтез белка из столбца с низким рН, потому что низкий рН может побудить денатурации белков необратимым и осадков белок. Таким образом поддержание структуры собственных белков и отсутствие белка агрегатов имеет важное значение для хорошего качества пакетов. С этой целью оценки отпорности синтез белка необходимо протестированных в vitro до и после очистки с различными Элюирующий буфер. После очистки IL4-10 синтез белка биологическую не была сокращена по сравнению с не очищенный белок. Кроме того, совокупный формирования отсутствовал когда шаг элюции была выполнена с 0,1 М глицин буфера (рН = 2.5), и рН элюции фракций немедленно был нейтрализован с 1 М трис-буфер (рН = 9).
Концентрация очищенный протеин сплавливания IL4-10 оценивается на основе человеческого IL10 ИФА результаты. Assay протеина BCA используется для подтверждения концентрации белка. Восстановление белка после очистки оценивается на основе концентрации в нагрузки, поток через, мыть и элюции фракций, IL10 ELISA. Определение концентрации белка BCA IL4-10 синтез белка может быть оценен только в dialyzed элюции фракций. Элюирующий non-dialyzed фракции содержат имидазола, соединение, которое влияет на измерение BCA. Non очищенная фракции содержат другие белки от HEK293 питательной среды.
Определение отпорности IL4-10 синтез белка производится в assay цельной крови. Биологическую IL4-10 синтез белка должно оцениваться в цельной крови нескольких доноров, чтобы определить, сохраняется ли функциональной активности. Несколько доноров требуются, потому что в IL10 и IL4 способность ингибировать LPS-индуцированной TNFα выпуска существует дисперсия доноров для доноров. Кроме того выражение IL4R и IL10R могут отличаться между донорами, затрагивающих IL4-10 синтез белка способность ингибировать LPS-индуцированной TNFα производства.
В описанных методов мы подробно 2 мыши модели стойких воспалительных боль, чтобы оценить эффективность IL4-10 синтез белка для устранения боли в естественных условиях. Тем не менее для полной оценки болеутоляющее потенциал рекомбинантных синтез белков, молекулы должны испытываться в других моделях, а также хронической боли. Эти модели включают, но не ограничиваются, модели травмы нерва и химиотерапии индуцированной невропатической боли9,22. Хотя для тестирования болеутоляющие лекарства обычно используются фон Frey тест и тест Харгривз, стало ясно, что дополнительное испытание (например динамический вес подшипника) должны быть включены для оценки воздействия на боли, не вызывали behaviorsand также с assay оперантной боль (например кондиционером место предпочтения (НПК), обнаружить не вызвала боль поведения17,18). Чтобы выполнить CPP, наступления последствий боли подавляя синтез белка должны приниматься во внимание, потому что принадлежности животных от боли требует быстродействующие анальгетики (которые оказывают эффекты в менее чем 15 мин). Тем не менее если тест соединения имеет медленный onset анальгетик, но скорее всего, вызовет боль длительное торможение (больше 4 дней), НПК до сих пор может использоваться для проверки, является ли соединение тормозится боли. В этом случае соединение индуцированной потери кондиционирования с быстродействующими анальгетиков необходимо оценивать.
Инъекции Интратекальное выбираются в качестве маршрут администрации, как соединения будут достигать боль соответствующих областях таких как Спинной корень ганглиев и спинного мозга. В частности Интратекальное доставка анальгетик наркотиков стало обычной практикой для лечения больных с хронической болью, как этот подход снижает дозы обезболивающий препарат необходимо и уменьшает токсичность и системные побочные эффекты. Тем не менее этот маршрут администрации имеет некоторые ограничения; Это требует хорошо подготовленных сотрудников, и из-за небольшой субарахноидальное пространство, объем впрыска следует ограничить 5 мкл в мышей, требующих высококонцентрированных растворов синтез белка. Техника инъекции Интратекальное требует подготовки. Такая подготовка может выполняться на наркотизированных животных-восстановление с введения красителя для проверки правильного Интратекальное инъекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Частью этой работы были профинансированы, биологических наук Утрехтского университета Грант
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
