Summary
En este trabajo ofrecemos detalles de los métodos de producción y control de calidad de una proteína de fusión recombinante de IL4-10. También mostramos cómo probar la efectividad de esta proteína para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio.
Abstract
El dolor crónico es difícil de tratar y se necesitan urgentemente nuevos enfoques para resolver el dolor persistente. Citoquinas antiinflamatorias son candidatos prometedores para el tratamiento de afecciones debilitantes dolor debido a su capacidad para regular interacciones neuro-inmune aberrantes. Sin embargo, fisiológicamente funcionan en una red de varios cytokines, y por lo tanto su efecto terapéutico no puede ser óptimo cuando se utilizan como drogas independientes. Para superar esta limitación, hemos desarrollado una proteína de fusión de las citoquinas antiinflamatorias IL4 y IL10. Aquí, describimos los métodos de producción y control de calidad de la proteína de fusión recombinante de IL4-10 y probamos la eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio persistente.
Introduction
Dolor crónico sigue siendo una de las más debilitantes y tratamiento problemas médicos del siglo XXI, que afecta a > 20% de la población adulta1,2. Sin embargo, los tratamientos para aliviar el dolor crónico son a menudo ineficaces o deben suspenderse debido a efectos secundarios graves3. Importante, actualmente fármacos disponibles sólo proporcionan alivio sintomático, pero no significativamente modificar o curar el dolor crónico. Aunque el dolor crónico parece ser un desorden neurológico, la evidencia sugiere la implicación del sistema inmune en el desarrollo de dolor crónico4,5. Por otra parte, están surgiendo enfoques inmune para tratar el dolor. Por ejemplo, citoquinas antiinflamatorias inhiben dolor en varios modelos de dolor crónico6,7,8. Sin embargo, citoquinas antiinflamatorias tienen una vida media corta, reduciendo sus efectos de inhibición de dolor. Por otra parte, citocinas antiinflamatorias más óptimo trabajan en concierto con los demás. Para superar estas limitaciones, hemos recientemente fusionados el antiinflamatorio cytokines interleukin-4 (IL4) y interleukin-10 (IL10) en una molécula. La proteína de la fusión de IL4-10 muestra una eficacia superior en la inhibición de dolor inflamatorio y neuropático crónico en comparación con el de citoquinas individuales9. Aquí describimos cómo se produce dicha proteína de fusión, purificados, y cómo se controla su calidad.
Proteína de la fusión de IL4-10 se produce en las células humanas por transitorios de la transfección de las células HEK293-F con un vector de expresión de pUPE llevando la secuencia de cDNA, codificación de la proteína de la fusión de IL4-10. Las células HEK293-F se eligen para permitir la modificación poste-de translación de la proteína, algo que no ocurre en sistemas de expresión bacteriana. Para optimizar glycan tapado con ácido siálico, cDNA codificación beta-galactósido-2, 3 sialil-transferasa se incorpora en el vector como un transgen segundo. La proteína de fusión se purifica mediante purificación de proteínas de afinidad de la cultura sobrenadante debido a que es más poderoso que la purificación por otros métodos por ejemplo tamaño de exclusión o cromatografía de intercambio iónico10,11. Para purificar la proteína de la fusión de IL4-10, que utilizamos en anticuerpos monoclonales hizo contra IL4. Evaluación de la pureza y la bioactividad de la proteína purificada de la fusión de IL4-10 se realizan como parte del control de calidad. Se evalúa la pureza de los lotes producidos por sodio dodecil sulfato poliacrilamida Gel electroforesis (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión de tamaño (HP-SEC) de alta presión. La bioactividad de la proteína de fusión de IL4-10 se evalúa midiendo su capacidad para inhibir el lipopolisacárido (LPS)-inducida por la producción de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) en cultivos de sangre entera y que comparan la combinación de la persona cytokines.
Por último, para poner a prueba la capacidad de inhibir el dolor crónico IL4-10 de proteínas de fusión, se describe cómo la proteína de fusión puede ser probada como analgésico en modelos de ratón ampliamente utilizado del dolor inflamatorio persistente12,13,14 . Aquí describimos los métodos de un modelo de dolor inflamatorio. Sin embargo, es importante tener en cuenta que otros modelos de dolor puede ser utilizado (por ejemplo, modelos de dolor neuropático), dependiendo de la investigación las preguntas que necesitan ser contestadas. Para evaluar el dolor en estos modelos, es importante utilizar una gran variedad de medidas conductuales que incluyen evocadas y dolor no evocado. Aquí, hemos descrito los métodos de evaluación de cambios en las respuestas conductuales evocadas mecánicamente y termal. Sensibilidad mecánica a los estímulos inocuos se evaluó utilizando el test de Von Frey, mientras que la sensibilidad térmica se evaluó mediante la prueba de Hargreaves. Lo importante, no evocados hiperalgesia/alodinia se mide mediante la prueba dinámica peso teniendo. Estas medidas son ampliamente aceptadas como medidas de dolor y obtener información importante sobre los umbrales de dolor y posible dolor experimentado por los animales15,16,17. Otras medidas para evaluar el dolor evocado no (p. ej., independiente del estímulo), como el test de preferencia de lugar condicionada, puede ser valioso18. Para evaluar el potencial del fármaco para inhibir el dolor, se realizó la administración intratecal de la proteína de fusión, ya que con esta vía de administración menos dosis de proteína para llegar a las zonas relacionadas con el dolor y evitar sistémica (lado a) efectos19, 20.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices internacionales y previa aprobación del Comité local de ético experimental. Sangre fue obtenida desde el servicio de donantes de Mini (Mini donantes Dienst, MDD) en la Universidad médica centro de Utrecht (UMCU) en los países bajos. El MDD ha recibido la aprobación positiva de la Comisión de ética médica de la UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) para el protocolo número 07-125/C.
1. Caracterización y producción de proteínas
- Cultivo de células
Nota: Consulte la Tabla de materiales para medio de cultivo utilizado.- Descongelar las células HEK293-F a 37 ° C hasta que haya un grupo pequeño de hielo. Transferir inmediatamente las células descongeladas a 10 mL de medio helada (4 ° C) y Centrifugue la suspensión celular a temperatura ambiente (RT) durante 4 minutos (min) x 500 g.
- Quite el medio y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio fresco a temperatura ambiente, seguida por centrifugación a 500 x g durante 4 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL de medio en RT. agregar la suspensión de células directamente en un frasco de 125 mL que contenga 25 mL de medio precalentado (37 ° C). Cultura de las células a 37 ° C, 8% CO2y 95% de humedad en un agitador orbital girando a una velocidad de 125 rpm.
- Subcultura las células dos veces a la semana. Utilizar una célula automatizada contador (véase Tabla de materiales) para evaluar el numero de celular y viabilidad celular. Semillas viables las células a una concentración de 3 x 105 células/mL en matraces Erlenmeyer. Mantenga el volumen total de medio de cultivo en 1/5 del volumen total de matraces de Erlenmeyer de cultura en todo momento para mantener una óptima aireación.
- Transfección
Nota: Subcultivo las células de tres a cuatro veces antes de transfección y transfectarles cuando la viabilidad de las células es > 90%. Se evaluó la viabilidad celular por una automatizada (campo eléctrico multicanal) sistema de cellcounting basado en la integridad de la membrana plasmática. Vea la Tabla de materiales para el reactivo de transfección.- Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 4 min a 500 x g; Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo precalentado (37 ° C) y diluir la suspensión de células a ~1.0 x 106 células/mL en un volumen total de 1 L. alícuota la suspensión de células en 10 alícuotas de 100 mL en matraces Erlenmeyer de 500 mL.
- Diluir 1 mg de ADN plásmido en medio esencial mínimo de 33 mL Suero reducido (MEM, véase Tabla de materiales) mezclando suave. En un tubo aparte, diluya 1.330 μl de reactivo de transfección en MEM mezclando suave. Incubar ambas soluciones a temperatura ambiente por 5 minutos agregar y mezclar el ADN diluido en MEM para el reactivo de transfección en MEM e incubar la mezcla durante 30 min a TA.
- Añadir la mezcla de reactivo de transfección de ADN a las células (cultivadas en la sección 1); Añadir 6,6 mL de la mezcla a cada 500 mL matraz Erlenmeyer que contenga 100 mL de células en el medio de cultivo. Mantener las células en las condiciones de cultivo anteriormente mencionado. Coseche el sobrenadante de cultivo que contiene proteína de fusión secretan IL4-10 tres días después de la transfección.
- Determinar la concentración de la proteína de la fusión de IL4-10 en el sobrenadante de cultivo mediante la realización de un ELISA de IL10 según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales).
Nota: En condiciones de cultivo óptimo, la concentración de la proteína de fusión puede esperarse entre 2,5 y 5 μg/mL.
- Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad
Nota: Cromatografía de afinidad se realiza a temperatura ambiente. Sin embargo, todas aquellas fracciones (fracciones de sobrenadante, carga, flujo y elución de cultura) se mantienen en hielo durante el procedimiento.- Par 10 mg de un hecho de casa en anticuerpo monoclonal contra IL4 a 1 g de CNBr - activado sepharose 4B, según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Vierta lentamente 2,5 mL de granos de sepharose acoplado en la columna de cromatografía de vidrio (30 cm de longitud y 1,5 cm de diámetro interior, véase Tabla de materiales).
- Bloquear el resto de sitios de las cuentas de la Unión al pasar 50 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 1% de seroalbúmina bovina a través de la columna. Lavar la columna con 25 mL de PBS (pH = 7,4) seguida por 12,5 mL de tampón de glicina de 0,1 M (pH = 2.5) y 25 mL de PBS (pH = 7,4).
- Pasar 100 mL de cultivo de células de HEK293 concentrada 10 veces sobrenadante a través de la columna a un flujo de 1 mL/min lavado de la columna con 50 mL de PBS.
- Eluir la proteína de la fusión de IL4-10 consolidada con 12,5 mL de tampón de glicina de 0,1 M (pH = 2.5) con un caudal de 1 mL/min y recogemos fracciones de 2,5 mL. Añadir 350 μl de tampón de Tris de 1 M (pH = 9) a cada fracción para llevar el pH a 7. Dializan fracciones neutralizadas durante la noche contra 2 L de PBS (pH = 7,4).
- Use tubería de la diálisis con 16 mm de diámetro seco y un corte de peso molecular de 3,5 K. Las fracciones dializadas con filtros desechables de 0,45 μm de diámetro de poro del filtro estéril. Almacenar la solución de la proteína de fusión de IL4-10 estéril en alícuotas a-80 ° C.
- Evaluar la pureza de la proteína de fusión de IL4-10 eluída por tinción de Coomassie 12% SDS-PAGE gel y HP-SEC (columna 3 μm s-2000). Para el análisis del HP-SEC, carga 40 μl de proteína en la concentración de ~ 1 mg/mL en la columna. Uso de 100 mM de tampón fosfato de sodio con cloruro de sodio de 150 mM (pH = 6.8) como fase móvil. Establecer la tasa de flujo de 1 mL/min.
- Determinar la concentración de cada lote de purificado proteína de fusión de IL4-10 por ELISA de IL10 y ensayo de proteína ácido Bicinchoninic (Kit de ensayo de proteína BCA, véase Tabla de materiales) según protocolos del fabricante.
- Uso IL10 recombinante humana para crear una curva estándar en el ensayo de ELISA. Para corregir la diferencia de tamaño entre IL10 recombinante (18 kDA) y IL4-10 proteína de fusión (34 kDa), la concentración obtenida se multiplican por un factor de 1.8.
- Bioactividad de la proteína de la fusión de IL4-10
Nota: El análisis de sangre se realiza para cada lote de IL4-10 proteína de fusión producida y se compara la actividad de diferentes lotes como parte del control de calidad. El análisis de sangre se realiza en sangre humana fresca recogida el día de la prueba en tubos de heparina. Se obtuvo sangre de voluntarios sanos en nuestro servicio de donantes internos. Las muestras deben manipularse como potencialmente biológicas peligros.- Preparar diluciones de la serie 3-fold de la proteína purificada de la fusión de IL4-10 en Medio RPMI (véase Tabla de materiales) en una concentración intervalo de 1.215 5 ng/mL.
- Preparar diluciones previas de LPS (100 ng/mL) y sangre humana que se diluye 4 veces en Medio RPMI.
- Pipetear las diluciones antes de la proteína de la fusión de IL4-10 LPS y sangre humana en una placa de 48 pozos. A cada pocillo, añadir 50 proteína de fusión de IL4-10 μl (concentración final 1-243 ng/mL) 75 μl de Medio RPMI, 25 LPS μl (concentración final 10 ng/mL) y sangre humana 100 μl (final diluido).
Nota: Volumen Total por pozo es de 250 μl. - Incubar la placa a 37 ° C, 8% CO2y 95% de humedad durante 18 horas.
- Evaluar la concentración de TNFα en sobrenadantes de cultivo mediante un ELISA de TNFα, según protocolo del fabricante.
- Calcular la inhibición de la respuesta inflamatoria por la proteína de la fusión de IL4-10 según la fórmula: % de inhibición = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
Nota: De aquí A = niveles TNFα en cultivos estimulados LPS tratados con proteína de la fusión de IL4-10, B = niveles TNFα en cultura sin estimular y C = los niveles de TNFα en cultura estimulada LPS.
2. ratón modelo de dolor inflamatorio persistente
Nota: Es importante utilizar ratones machos y hembras (C57Bl/6) ya que esto permitirá la identificación de efectos dependientes del sexo. En general, los ratones utilizados son entre 8-16 semanas de edad. Para determinar el número de animales requeridos, se deben realizar cálculos de energía. Herramientas basadas en web para realizar dichos cálculos se encuentran fácilmente en internet (por ejemplo, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
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Inducción de dolor inflamatorio crónico
Nota: Inducir dolor inflamatorio persistente en ratones adultos con inyecciones intraplantar de carragenina o adyuvante completo de Freud (CFA). Las diferentes pruebas no interfieren entre sí.- Preparar la carragenina (2% p/v) disolviendo carragenina λ (véase Tabla de materiales) en 0.9% NaCl pasando la solución a través de una aguja de calibre 23 para asegurar que la carragenina se disuelva correctamente. Preparar una solución fresca directamente antes de realiza la inyección.
- Alternativamente, si se utiliza el CFA, mezclar la solución CFA correctamente antes de inyectar intraplantarly, debido a que el CFA es una emulsión agua en aceite que contiene 1 mg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) calor muerto y seco, 0,85 mL de aceite de parafina y 0,15 mL mannide monooleato (véase Tabla de materiales).
Nota: Jeringas de vidrio Hamilton con émbolos de metal se recomiendan para inyectar este compuesto debido a émbolos de goma pueden reaccionar con el aceite en el adyuvante. -
Inyección intraplantar
- Mantener el compuesto (pasos 2.1.1 o 2.1.2) en la jeringa a temperatura ambiente durante al menos 15 min antes de la inyección para permitir ajuste RT. inyectar 20 μl de la sustancia (o disolventes como control) por vía subcutánea en la pata trasera del ratón no anestesiados con un calibre 30 aguja.
- Inserte la aguja en la base de la dirección del pulgar en el talón y se inyectan el compuesto cuando se inserta la aguja aproximadamente 0,5 cm. Después de la inyección, retraiga lentamente la aguja mientras gira ligeramente la jeringa para evitar fugas de solución en el sitio de inyección.
3. dolor medidas
Nota: Asegúrese de que los investigadores realizando los experimentos conductuales son ciegos para el tratamiento de ratón. Es importante aclimatarse a los animales en el ambiente de examen antes de efectuar cualquier medición. Preferiblemente, la semana antes de iniciar los experimentos, los animales se colocan 1 - 2 veces durante 15-30 min en cada uno de los diversos dispositivos utilizados para realizar las pruebas. Manejo de machos y hembras en el mismo experimento, evaluar los machos independientemente de las hembras. Jaulas limpias y superficies extensivamente entre los diferentes grupos para evitar posibles efectos no deseados en el comportamiento de los diferentes sexos. Medir latencias de retiro de línea de base o mecánicos umbrales de dos a tres veces con precisión determinar los umbrales de la línea de base y determinar si éstas son estables antes de la inyección intraplantar de cualquier compuesto.
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Prueba de von Frey: sensibilidad mecánica a los estímulos inocuos
- Coloque los animales individualmente en jaulas de acrílico en un soporte de malla de alambre y permitir que los ratones para aclimatarse al menos 15 min antes de las mediciones.
- Evaluar la sensibilidad mecánica midiendo el umbral de retirada de la pata en respuesta a una serie calibrada de pelos de von Frey desde 0.02 hasta 4 g. considerar cualquier movimiento de la pata de pelo aplicada como una respuesta positiva del retiro. Aplicar los filamentos perpendiculares a la superficie de la pata con fuerza suficiente como para causar flexión ligeramente contra la piel y sostenga por ~ 3 s. hacer que el pelo no se tuerza durante la aplicación a la pata.
- Calcular el umbral de la pata-retiro de 50% usando el método de arriba hacia abajo15,21.
Nota: El primer filamento aplicar es 0,4 g (dependiendo de los umbrales de estos ratones mostrar al inicio se pueden utilizar otros filamentos de partida). La falta de respuesta a un filamento indica que el siguiente filamento más grueso se utiliza en el siguiente estímulo, mientras que una respuesta positiva indica el uso del filamento más fino siguiente. El número de presentaciones del pelo está determinado por la primera respuesta diferencial; después de eso, se realizan aplicaciones más 5. Calcular que el umbral de 50% según los métodos descritos previamente15,21.
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Sensibilidad térmica: prueba de Hargreaves
- Colocar los animales en jaulas en una placa de vidrio previamente calentado (30 ° C) y permita que los ratones para aclimatarse durante al menos 15 min antes de las mediciones, espera hasta que los animales sientan todavía.
- Determinar tiempos de latencia de retirada de calor calentando la pata de los animales por un haz enfocado de luz visible utilizando un aparato de Hargreaves (véase Tabla de materiales).
Nota: La intensidad de la viga se encuentra a 12%, porque con esta configuración de intensidad determinado experimentalmente, el haz de luz evoca una respuesta de retirada de un tiempo promedio de 8 s al inicio del estudio en ratones C57Bl/6. El ajuste de la intensidad se determinará por máquina individual y cepa de ratón. Tiempos de corte máxima de 20 s o más se utilizan para evitar lesiones a los animales. - Medir los tiempos de latencia de retiro ~ 4 veces al animal. Promedio de todas las medidas. Medir independientemente cada pata y con intervalos de al menos 1 min entre mediciones sucesivas de la misma pata.
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Déficit postural: prueba del cojinete de peso dinámico
- Medir el peso corporal de cada animal antes de la prueba, ya que requiere de análisis de carga el peso corporal de cada animal individual como un parámetro de entrada.
- Colocar los animales individualmente en un sistema carga dinámico instrumentada por el piso montado en una cubierta de apoyo a una cámara que graba movimientos del ratón. Deje que el animal aclimatarse por 0,5 a 1 min antes de grabar durante 5 minutos.
Nota: En esta prueba, sólo un animal libremente móvil se puede evaluar en un momento. - Ajuste la configuración para realizar peso y analizar los datos.
Nota: En estos experimentos, utilizamos los siguientes parámetros: umbral de peso (i) baja de g: 0,6 es el peso mínimo necesario para activar una de las células del sensor. (ii) umbral el alto peso de 1 g:, este número indica el peso necesario para activar completamente una célula. (iii) superficie umbral de 2 células: este número indica el número de las células adyacentes entre sí que deben activarse para ser tomado en cuenta. (iv) el mínimo número de imágenes es 5: tarda 0,1 s para capturar cada imagen. El número indica el número mínimo de fotogramas en la que el ratón no se mueve. Como tal, un valor de 5 significa que el ratón la postura debe ser estable para > 0.5 s para obtener una medición que se toma en cuenta para el análisis. - Realizar el análisis de cada vídeo por reproducir el video y asegúrese de que cada miembro sea reconocido correctamente por el software en el marco de tiempo indicado por el software.
Nota: Un mínimo de 1 minuto de tiempo grabado debe ser validado. La carga dinámica de software calcula y proporciona los siguientes parámetros: (i) el peso soportado por cada pata individual en gramos y como porcentaje del peso del cuerpo entero. (ii) el peso soportado por la pata delantera combinada o las patas traseras combinadas en gramos y como porcentaje del peso del cuerpo entero. (iii) la relación izquierda/derecha patas peso rodamiento o cojinete de peso delantero/trasero. (iv) la superficie de cada pata o patas de frente/parte posterior combinadas que activa la almohadilla de presión sensible. (v) media y desviación para cada parámetro. (vi) duración de las diferentes posturas (cría, 3 patas o 4 patas) durante el experimento entero. (vii) tiempo (s) cada pata lleva peso durante el experimento entero.
4. proteína de fusión intratecal inyectable de IL4-10 para la analgesia
Nota: Confirmar que la ventilación a la sala está abierta para asegurar el flujo de aire adecuado. Para probar la eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 (1 μg/ratón; volumen de total de la inyección de 5 μl) debe ser probado contra vehículo las inyecciones y las inyecciones de la combinación de las individuales citoquinas (IL4 IL10, μg 0,5 + 0,5 μg/ratón, volumen de inyección total de 5 μl).
- Anestesiar el ratón con 3-4% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 2 L/min en la cámara de inducción. Compruebe que el ratón correctamente está anestesiado pellizcando la pata para asegurar que el animal no responda.
- El ratón sobre la mesa con su cabeza colocada en el cono de la nariz del aparato y mantener la sedación de ratón con isoflurane 1.5-2% con una tasa de flujo de oxígeno de 2 L/min mientras que realizando la inyección intratecal.
- Back-fill los compuestos inyectables en un vaso limpio 25 μl jeringa Hamilton conexión a una aguja de calibre 27.
- Sujete el mouse con firmeza por la columna vertebral posterior a las costillas y levantar ligeramente el ratón. Coloque la aguja verticalmente entre la vértebra lumbar L5 y L6 e introducirlo cuidadosamente a través de la piel en el centro de las vértebras lumbares. Coloque la aguja en el espacio intervertebral.
Nota: Encontrar el espacio intervertebral puede requerir algunos 'buscando' por mover la aguja a lo largo del eje ventral rostral, presionando ligeramente la aguja hasta que se note una pérdida de la resistencia del tejido óseo.- Confirmar objetivo correcto verificando que se produjo un movimiento de cola. Inyecte lentamente 5 μl del compuesto, esperar unos segundos y luego retraiga lentamente la aguja. Si sólo se observa un movimiento de la pata sola, la aguja es probable que no esté colocado correctamente.
- Después de la inyección, compruebe el ratón cerca de los primeros 30 min después de la recuperación de la anestesia para garantizar la ausencia de cualquier deterioro motor, parálisis.
Nota: Comportamientos de dolor pueden ser medidos (como se describe en sección 3) 15 minutos después de la recuperación.
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Representative Results
Una imagen representativa de un gel de SDS-PAGE que contiene diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de cromatografía de afinidad se muestra en la figura 1A. En la carga (L) y el flujo a través de fracciones (FT), se observan todas las proteínas presentes en el sobrenadante HEK293. Ninguna proteína se observa en la fracción de lavado (W). En la fracción de elución (E), se observan dos bandas de 35 y 37 kDa correspondientes a dos diferentes glicoformas de IL4-10 proteína de fusión (flechas). En la figura 1B, un análisis representativo de la potencia en una sangre muestra ensayo de diferentes IL4-10 dos lotes de fusión proteína. Se observa una inhibición dosis dependiente de la liberación TNFα inducida por LPS, mostrando bioactividad comparable para los dos lotes de proteína de fusión de IL4-10.
A continuación, se muestra un ejemplo de resultados de experimentos representativos en los que la proteína de la fusión de IL4-10 se prueba para inhibir el dolor inflamatorio persistente (figura 2). Dolor inflamatorio persistente fue inducida por la inyección intraplantar de 2% de carragenina. Mecánico (figura 2A), así como hiperalgesia térmica de (figura 2B) siguió en el tiempo. En el día 6 después de la inducción de dolor inflamatorio, ratones fueron inyectados por vía intratecal con la proteína de la fusión de IL4-10 o vehículo como control. IL4-10 significativamente resueltos mecánica (figura 2A) y térmico (figura 2B) hiperalgia y alcanzó su máximo efecto después de 24 h después de la inyección. Idealmente, la eficacia de la proteína de fusión en la inhibición del dolor debe probarse también contra concentraciones equimolares de las citoquinas individuales para comprobar su capacidad para inhibir el dolor es mejor que la suma de las citoquinas individuales. Estos datos no se muestran aquí, pero nos referimos a una reciente publicación que muestra los datos9.
La eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 fue probada recientemente en el modelo de dolor inflamatorio inducido por el CFA9. En este experimento, múltiples inyecciones de la proteína de la fusión de IL4-10 fueron administrados por vía intratecal. Las inyecciones múltiples resuelven totalmente inducida por CFA persistente inflamatoria hiperalgia, midió con von Frey y Hargreaves ensayos, demostrando el potencial de la proteína de fusión de IL4-10 como un tratamiento analgésico9. Aquí mostramos que la inyección intraplantar de CFA también induce una reducción de peso de la pata afectada (figura 3A-b). Inyección intratecal de proteína de la fusión de IL4-10 en el día 7 después de la inyección intraplantar de CFA atenúa la disminución de peso de la pata afectada en comparación con ratones inyectados de vehículo 2 días después de la administración de la proteína de fusión de IL4-10 (figura 3B ).
Figura 1 : Purificación y caracterización de la proteína de la fusión de IL4-10. Análisis de (A) tinción de Coomassie SDS-PAGE de las fracciones de cromatografía de afinidad: L: carga, FT: flujo a través, W: lavado, E: elución. (B) análisis funcional: IL4-10 dosis de la proteína de fusión dependiente inhibe la producción de TNFα en LPS estimulados todo hemocultivo (expresado como inhibición por ciento en comparación con cultivos estimulados con LPS solo). Datos se representan como media ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Inhibición de la hiperalgesia inflamatoria por la proteína de fusión de IL4-10. Dolor inflamatorio fue inducida por la inyección intraplantar de 20 μl de 2% de carragenina (coche). Seis días después de la inyección intraplantar ratones recibieron una inyección intratecal (flecha) de 1 μg proteína de fusión de IL4-10 o vehículo (PBS). (A) hipersensibilidad mecánica (umbral del 50% de Log (g)) se midió con el tiempo mediante prueba de Von Frey y sensibilidad térmica (B) (latencia (s)) se midió usando prueba de Hargreaves. Datos se representan como media ± SEM. asteriscos representan diferencias significativas analizadas por ANOVA de dos vías, entre vehículos y animales de IL4-10 inyectado. **, *** = p < 0.01 y p < 0.001, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Inflamación inducida por cambios en el peso. Dolor inflamatorio fue inducida por la inyección intraplantar de 20 μl de adyuvante completo de Freud (CFA). Carga en cada pata se midió usando el dispositivo del cojinete de peso dinámico. Cojinete de peso en gramos de la pata afectada (pata trasera ipsilateral) y el cojinete de peso total de las patas no afectados (patas delanteras y la pata contralateral) se muestra, así como el cociente del cojinete de peso de la pata ipsolateral en comparación con las otras 3 patas. (A) curso de carga durante la inflamación inducida por la CFA (n = 10). (B) en el día 7 después de CFA intraplantar, ratones recibieron una inyección intratecal de 1 μg IL4-10 proteína de fusión o vehículo (PBS). Peso se midió en 2 días después de la administración de la proteína de la fusión de IL4-10, 0 y 7 días después intraplantar CFA. Cojinete de peso de la pata ipsolateral en comparación con las otras 3 patas está representada (n = 3-4). Datos se representan como media ± SEM. *** = p < 0.001; ** = p < 0.01; * = p < 0.05 en comparación con el basal (día 0). # = p < 0.05 comparado con animales de vehículo tratado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este manuscrito describe métodos para la producción y caracterización de un recombinante de la proteína de la fusión de IL4-10 y métodos para probar su eficacia en la inhibición de hiperalgesia inflamatoria en modelos de ratón de dolor inflamatorio persistente. La producción y purificación de la proteína de fusión de IL4-10 se realiza en pequeña escala. Se seleccionan las células HEK293 como sistema de expresión para la producción de proteína porque permiten modificaciones post-traduccionales que no pueden lograrse en sistemas de expresión procariotas. Modificaciones post-traduccionales son relevantes para la función de la proteína, y la ausencia de tales modificaciones podría afectar la eficacia terapéutica de la proteína de la fusión de IL4-10. La proteína es purificada del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad. Optamos por utilizar interno hecho anticuerpo monoclonal contra IL4 para la purificación de la afinidad y no para producir una proteína de fusión de IL4-10 que contiene una etiqueta para permitir la purificación con un sistema de etiqueta de afinidad. La razón de esto era para evitar la posibilidad de cambios relacionados con la etiqueta en el plegamiento de la proteína y la función. Sin embargo, si se carece de un anticuerpo monoclonal altamente selectivo, una proteína con una etiqueta necesita ser desarrollada, por ejemplo un su etiqueta. En ese caso, será importante determinar si el C - o N-terminal de la proteína es más adecuado para la etiqueta para no afectar a la función de la proteína.
De 1 L de sobrenadante HEK293, se obtiene aproximadamente 3 mg de proteína purificada de la fusión de IL4-10, pero esto puede variar de lote a lote. La columna para la purificación de la afinidad se puede utilizar para varios ciclos de purificación antes de desecharlo. El paso más sensible en el procedimiento de purificación es la elución de la proteína de fusión de IL4-10 de la columna por un pH bajo, ya que el pH bajo puede inducir proteínas irreversible desnaturalización y precipitación de la proteína. Por lo tanto, el mantenimiento de la estructura de la proteína nativa y la ausencia de agregados de proteína es esenciales para lotes de buena calidad. Para ello, evaluación de la bioactividad de la proteína de fusión debe ser probado en vitro antes y después de la purificación con tampones de elución diferentes. Después de la purificación de la proteína de fusión de IL4-10, la actividad biológica no se redujo en comparación con no purificado de la proteína. Por otra parte, formación agregada estaba ausente cuando el paso de elución se realizó con tampón de glicina de 0,1 M (pH = 2.5), y el pH de las fracciones elución fue inmediatamente neutralizado con tampón de Tris de 1 M (pH = 9).
La concentración de proteína purificada de la fusión de IL4-10 se estima en base a resultados de ELISA IL10 humanas. Análisis de proteína BCA se utilizan para confirmar las concentraciones de proteína. Recuperación de la proteína después de purificación se evalúa basado en las concentraciones medidas en carga, flujo, lavado y elución fracciones por ELISA de IL10. La determinación de concentración de proteína BCA de IL4-10 proteína de fusión puede ser evaluada sólo en fracciones elución dializado. Fracciones elución dializaron no contienen imidazol, un compuesto que afecta a la medición de la BCA. Fracciones purificadas no contienen otras proteínas del medio de cultivo HEK293.
La determinación de la bioactividad de la proteína de fusión de IL4-10 se realiza en un análisis de sangre. La bioactividad de la proteína de la fusión de IL4-10 debe ser evaluada en la sangre de varios donantes para determinar si se mantiene la actividad funcional. Varios donantes se requiere porque el donante a donante variación existe en la capacidad de IL10 y IL4 inhiben liberación TNFα inducida por LPS. Por otra parte, expresión de IL4R y IL10R puede diferir entre los donantes, que afectan a la capacidad de la proteína de la fusión de IL4-10 para inhibir la producción de TNFα inducida por LPS.
En los métodos descritos, nos detalló 2 modelos de ratón de dolor inflamatorio persistente para evaluar la eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 para resolver el dolor en vivo. Sin embargo, para la evaluación completa del potencial analgésico de proteínas de fusión recombinantes, las moléculas deben probarse en otros modelos de dolor crónico también. Estos modelos incluyen, pero no se limitan a, los modelos de lesión del nervio y dolor neuropático inducido por quimioterapia9,22. Aunque la prueba de von Frey y prueba de Hargreaves se utilizan para las pruebas de fármacos analgésicos, ha quedado claro que se debe incluir una prueba adicional (por ejemplo, prueba de rodamiento de peso dinámico) para evaluar los efectos sobre dolor evocado no behaviorsand también con el ensayo de dolor operante (por ejemplo acondicionado lugar preferencia (CPP) que detectan el dolor evocado no comportamientos17,18). Para realizar el CPP, la aparición de los efectos de dolor-la inhibición de la proteína de fusión debe tenerse en cuenta, porque el acondicionamiento de los animales por el alivio del dolor requiere analgésicos de acción rápida (que ejercen efectos en menos de 15 minutos). Sin embargo, si la sustancia de ensayo tiene un inicio lento de analgésicos, pero es probable inducir inhibición de dolor de larga duración (más de 4 días), CPP puede todavía utilizar para probar si el compuesto inhibe el dolor. En este caso, pérdida inducida por el compuesto de acondicionado con analgésicos de acción rápida debe ser evaluados.
Las inyecciones intratecales se seleccionan como una vía de administración, como el compuesto llega a dolor áreas relevantes tales como los ganglios de raíz dorsal y la médula espinal. En particular, la entrega intratecal de fármacos analgésicos se ha convertido en práctica común como tratamiento de pacientes con dolor crónico, este enfoque reduce la dosis de medicamento analgésico necesitada y disminuye la toxicidad y efectos secundarios sistémicos. Sin embargo, esta vía de administración tiene algunas limitaciones; se requiere de personal bien formado y, debido al pequeño espacio subaracnoideo, el volumen de inyección debe limitarse a 5 μL en ratones, que requieren de soluciones altamente concentradas de la proteína de fusión. La técnica de inyección intratecal requiere entrenamiento. Esta formación puede realizarse en animales anestesiados no recuperar con la inyección de un medio de contraste para verificar la inyección intratecal correcto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Parte de este trabajo ha sido financiado por una ciencias biológicas de la Universidad de Utrecht conceda
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
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