Summary
I detta papper tillhandahåller vi Detaljer för metoder för produktion och kvalitetskontroll av en IL4-10 rekombinant fusionsprotein. Vi visar också hur att testa effektiviteten av detta protein att lösa smärta i en musmodell för inflammatorisk smärta.
Abstract
Kronisk smärta är svårbehandlad och nya metoder att lösa ihållande smärta behövs omgående. Anti-inflammatoriska cytokiner är lovande kandidater för behandling av försvagande smärta villkor på grund av deras förmåga att reglera avvikande neuro-immun interaktioner. Men de arbetar fysiologiskt i ett nätverk av olika cytokiner och deras terapeutiska effekt kan därför inte vara optimalt när de används som fristående droger. För att övervinna denna begränsning, utvecklade vi ett fusionsprotein av den antiinflammatoriska cytokiner IL4 och IL10. Här beskriver vi metoderna för produktion och kvalitetskontroll av IL4-10 rekombinant fusionsprotein och vi testa effektiviteten av IL4-10 fusion proteinet att lösa smärta i en musmodell av ihållande inflammatorisk smärta.
Introduction
Kronisk smärta är fortfarande en av de mest försvagande och underbehandlad medicinska problem av 2000-talet som påverkar > 20% av den vuxna befolkning1,2. Dock är ofta ineffektiva behandlingar för att ge lindring av kronisk smärta eller måste avbrytas på grund av allvarliga biverkningar3. Ännu viktigare, för närvarande tillgängliga läkemedel endast ge symtomlindring, men inte avsevärt ändra eller bota kronisk smärta. Även kronisk smärta verkar vara en neurologisk sjukdom, tyder på engagemang av immunsystemet i kronisk smärta utveckling4,5. Dessutom framträder immun-baserade metoder för att behandla smärta. Exempelvis hämmar antiinflammatoriska cytokiner smärta i flera modeller av kronisk smärta6,7,8. Antiinflammatoriska cytokiner har dock en kort halveringstid, att minska de smärthämmande effekterna. Dessutom fungerar antiinflammatoriska cytokiner mest optimalt i samförstånd med varandra. För att övervinna dessa begränsningar, smält vi nyligen den antiinflammatoriska cytokiner interleukin-4 (IL4) och interleukin-10 (IL10) i en molekyl. Proteinet IL4-10 fusion visar bättre effekt i att hämma kronisk inflammatorisk och neuropatisk smärta jämfört med de enskilda cytokiner9. Beskriver här vi hur sådana fusionsprotein produceras, renat, och hur dess kvalitet kontrolleras.
IL4-10 fusionsprotein produceras i mänskliga celler av övergående transfection HEK293-F celler med en pUPE uttryck vektor transporterar cDNA sekvensen kodning proteinet IL4-10 fusion. HEK293-F celler väljs för posttranslationella modifieringen av protein, något som inte förekommer i bakteriell uttryck system. För att optimera glycan tak med sialic acid, cDNA kodning beta-galactoside-2, införlivas 3-sialyl-transferas i vektorn som en andra transgenens. Fusionsprotein renas med affinitet protein rening av kulturen supernatant eftersom det är mer kraftfull än rening genom andra metoder t.ex. storlek-uteslutning eller jonbyte kromatografi10,11. För att rena IL4-10 fusion proteinet, använde vi in-house gjorde monoklonala antikroppar mot IL4. Utvärdering av renhet och bioaktivitet av renat IL4-10-fusionsprotein utförs som en del av kvalitetskontroll. Renhet av producerade partier utvärderas av Sodium Dodecyl Sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och höga tryck storlek utslagning kromatografi (HP-SEC). Bioaktiviteten av proteinet IL4-10 fusion utvärderas genom att mäta dess förmåga att hämma lipopolysackarid (LPS)-inducerad tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα) produktion i helblod kulturer, och jämföra den till en kombination av enskilda cytokiner.
Slutligen för att testa IL4-10 fusionsproteinerna förmåga att hämma kronisk smärta, beskriver vi hur proteinet fusion kan testas som smärtstillande i utbredda musmodeller av ihållande inflammatorisk smärta12,13,14 . Här beskriver vi metoderna för en inflammatorisk smärta modell. Det är dock viktigt att notera att andra smärta-modeller kan vara används (t.ex., neuropatisk smärta modeller), beroende på forskningen frågor som behöver besvaras. För att bedöma smärta i dessa modeller, är det viktigt att använda en mängd beteendemässiga åtgärder som inkluderar framkallat och icke-framkallat smärta åtgärder. Här, beskrivit vi metoderna för bedömning av förändringar i mekaniskt och termiskt evoked beteendemässiga svaren. Mekaniska känslighet för innocuous stimuli bedöms med Von Frey testet, medan Termisk känslighet bedöms i Hargreaves test. Allt mäts icke-framkallat hyperalgesi/allodyni med det dynamiska vikt bär-testet. Dessa åtgärder är allmänt accepterade som smärta åtgärder och ge viktig information om smärttrösklar och potentiella smärta upplevs av den djur15,16,17. Andra åtgärder för att bedöma icke-framkallat smärta (t.ex., stimulans oberoende), t ex betingad plats preferens test kan vara värdefulla18. För att bedöma potentialen av läkemedlet som hämmar smärta, utfört vi intratekal administrering av proteinet fusion, som med detta administreringssätt mindre protein dos som behövs för att nå smärta-relaterade områden och undvika systemiska (side-) effekter19, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har utförts i enlighet med internationella riktlinjer och förhandsgodkännande från den lokala experimentella etiska kommittén. Helblod erhölls från tjänsten Mini givare (Mini givare Dienst, MDD) på den University Medical Center Utrecht (UMCU) i Nederländerna. MDD har fått positiva godkännande från medicinsk etikkommittén av UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) för den protokoll nummer 07-125/C.
1. proteinproduktion och karakterisering
- Cellkultur
Obs: Se Tabell av material för kultur medium som används.- Tina HEK293-F cellerna vid 37 ° C tills det finns en liten klump av is. Överföra de upptinade cellerna omedelbart till 10 mL iskallt medium (4 ° C) och centrifugera cellsuspensionen i rumstemperatur (RT) i 4 minuter (min) 500 x g.
- Ta bort mediet och återsuspendera cellpelleten i 10 mL färsk medium på RT, följt av centrifugering vid 500 x g i 4 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 mL medium på RT. Add cellsuspensionen direkt i en 125 mL mätkolv som innehåller 25 mL före värmde medium (37 ° C). Odla cellerna vid 37 ° C, 8% CO2och 95% luftfuktighet i orbitalskak roterar med en hastighet av 125 rpm.
- Subkultur cellerna två gånger i veckan. Använda en automatiserad cell counter (se Tabell för material) för att bedöma antalet celler och cellernas viabilitet. Utsäde viabla celler vid en koncentration på 3 x 105 celler/mL i Erlenmeyer-kolvar. Hålla den totala volymen av odlingssubstratet på 1/5 av den totala volymen av kultur Erlenmeyer-kolvar hela tiden för att hålla luftning optimal.
- Transfection
Obs: Subkultur cellerna tre till fyra gånger före transfection och transfect dem när cellviabiliteten är > 90%. Cellernas viabilitet bedöms av en automatiserad (elektriskt fält flerkanaligt) cellcounting system baserat på integriteten i plasmamembranet. Se Tabell för material för transfection reagensen.- Centrifugera cellerna på RT för 4 min på 500 x g; Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av pre värmde odlingsmedium (37 ° C) och späd cellsuspensionen till ~1.0 x 106 celler/mL i en total volym av 1 L. alikvot cellsuspensionen i 10 alikvoter om 100 mL 500 mL Erlenmeyer-kolvar.
- Späd 1 mg av plasmid DNA i 33 mL minskas-serum väsentliga minimalmedium (MEM, se Tabell för material) av mild blandning. I en separat slang, späd 1 330 µL transfection reagens i MEM av mild blandning. Inkubera båda lösningarna på RT för 5 min. Lägg och blanda DNA utspätt i MEM till transfection reagenset i MEM och inkubera mixen i 30 min på RT.
- Lägga till DNA-transfection reagens mixen i cellerna (odlade i avsnitt 1); lägga till 6,6 mL av blandningen varje 500 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 100 mL av celler i odlingsmedium. Upprätthålla cellerna i de tidigare nämnda odlingsbetingelserna. Skörda kultur supernatanten innehållande utsöndrade IL4-10-fusionsprotein tre dagar efter transfection.
- Bestämma koncentrationen av IL4-10 fusion proteinet i kulturen supernatanten genom att utföra ett IL10 ELISA enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material).
Obs: I optimala odlingsbetingelser, koncentrationen av proteinet fusion kan förväntas vara mellan 2,5 och 5 µg/mL.
- Protein rening av affinitetskromatografi
Obs: Affinitetskromatografi utförs i rumstemperatur. Dock förvaras alla fraktioner (kultur supernatanten, belastning, flödet genom och eluering fraktioner) på is under förfarandet.- Par 10 mg av en i-inhysa-made monoklonal antikropp mot IL4 till 1 g CNBr - aktiverat sepharose 4B, enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material). Häll 2,5 mL av kopplade sepharose pärlor långsamt i kolumnen glas kromatografi (30 cm längd och 1,5 cm inre diameter, se Tabell för material).
- Blockera de återstående bindande platser av pärlor genom att passera 50 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% bovint serumalbumin genom kolonnen. Tvätta kolonnen med 25 mL PBS (pH = 7.4) följt av 12,5 mL 0,1 M glycin buffert (pH = 2,5) och 25 mL PBS (pH = 7.4).
- Passera 100 mL 10-faldig koncentrerad HEK293 cellkultur supernatant genom kolonnen med en flödeshastighet av 1 mL/min. Tvätta kolonnen med 50 mL PBS.
- Eluera de bundna IL4-10-fusionsprotein med 12,5 mL 0,1 M glycin buffert (pH = 2,5) med en flödeshastighet av 1 mL/min och samla fraktioner av 2,5 mL. Tillsätt 350 µL av 1 M Tris buffert (pH = 9) till respektive fraktion att få pH till 7. Dialyze neutraliserat fraktioner över natten mot 2 L PBS (pH = 7.4).
- Använda dialys slangar med torr 16 mm i diameter och en 3.5 K molekylvikt cut-off. Steril filtrera dialyzed fraktioner med engångsfilter med pordiameter 0,45 µM. Lagra steril IL4-10 fusion protein lösning i alikvoter vid-80 ° C.
- Utvärdera renheten av eluerat IL4-10-fusionsprotein av Coomassie-färgade 12% SDS-PAGE gel och HP-SEC (3 µm SEC-2000 kolumn). För HP-SEC analys, Ladda 40 µL av protein ~ 1 mg/mL koncentration på kolumnen. Använd 100 mM natriumfosfat buffert med 150 mM natriumklorid (pH = 6,8) som en mobil fas. Ställa in flödet vid 1 mL/min.
- Bestämma koncentrationen av varje tillverkningssats av renat IL4-10-fusionsprotein av IL10 ELISA och Bicinchoninic Acid Protein Assay (BCA Protein Assay Kit, se Tabell för material) enligt tillverkarens protokollen.
- Använda rekombinant humant IL10 för att skapa en standardkurva i ELISA-testet. Att korrigera för storlek skillnaden mellan rekombinant IL10 (18 kDA) och IL4-10 fusionsprotein (34 kDa), multiplicera den erhållna koncentrationen med en faktor på 1,8.
- Bioaktivitet av IL4-10 fusionsprotein
Obs: Helblodsanalys utförs för varje parti av IL4-10 fusionsprotein producerat och aktiviteten av olika partier jämförs som en del av kvalitetskontroll. Helblodsanalys utförs i färskt blod samlas in dagen för analysen i heparin rör. Blod erhölls från friska frivilliga i vår interna givaren tjänst. Proverna ska hanteras som potentiellt biologiska faror.- Förbereda inför 3-faldig seriespädningar av renat IL4-10 fusionsprotein i RPMI medium (se Tabell för material) över en koncentration range 5-1 215 ng/mL.
- Förbereda inför utspädningar av LPS (100 ng/mL) och humant blod som späds 4 gånger i RPMI medium.
- Pipettera före spädningarna av IL4-10 fusionsprotein, LPS och humant blod till en 48-bra platta. I varje brunn, tillsätt 50 µL IL4-10 fusionsprotein (slutlig koncentration 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI medium, 25 µL LPS (slutlig koncentration 10 ng/mL) och 100 µL humant blod (slutlig utspädd).
Obs: Total volym per brunn är 250 µL. - Inkubera plattan vid 37 ° C, 8% CO2och 95% luftfuktighet för 18 h.
- Utvärdera koncentrationen av TNFα i cellkulturer med hjälp av en TNFα-ELISA, enligt tillverkarens protokollet.
- Beräkna hämning av den inflammatoriska reaktionen genom IL4-10 fusionsprotein enligt formeln: % hämning = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
Obs: Här A = TNFα nivåer i LPS stimuleras kulturer behandlas med IL4-10 fusionsprotein, B = TNFα nivåer i ostimulerade kultur och C = TNFα nivåer i LPS stimuleras kultur.
2. musmodell för ihållande inflammatorisk smärta
Obs: Det är viktigt att använda såväl kvinnliga som manliga möss (C57Bl/6) eftersom detta kommer att möjliggöra identifiering av kön-beroende effekter. De möss som används är i allmänhet mellan 8-16 veckor gamla. För att avgöra antalen djur som krävs, bör power beräkningar utföras. Webbaserade verktyg att utföra sådana beräkningar är lätt kan hittas på internet (t.ex., http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
Induktion av kronisk inflammatorisk smärta
Obs: Framkalla ihållande inflammatorisk smärta hos vuxna möss med intraplantar injektioner av karragenan eller komplett Freuds Adjuvant (CFA). De olika testerna stör inte varandra.- Förbereda karragenan (2% w/v) genom att lösa upp λ-karragenan (se Tabell för material) i 0,9% NaCl som passerar lösningen genom en 23-gauge nål att säkerställa att karragenan är ordentligt upplöst. Förbereda en ny lösning direkt innan injektionen ges.
- Alternativt, om CFA används, blanda CFA lösningen ordentligt innan du injicerar det intraplantarly, eftersom CFA är en vatten-i-olja emulsion innehåller 1 mg av Mycobacterium tuberkulos (H37Ra) värme dödade och torkade, 0,85 mL paraffinolja och 0,15 mL mannide monooleat (se Tabell för material).
Obs: Glas Hamilton sprutor med metall kolvar rekommenderas för att injicera denna förening eftersom gummi kolvarna kan reagera med oljan i adjuvans. -
Intraplantar injektion
- Upprätthålla föreningen (steg 2.1.1 eller 2.1.2) i sprutan på RT minst 15 min före injektion för att tillåta justering RT. Injicera 20 μl av föreningen (eller lösningsmedel som kontroll) subkutant till hind tass av icke-sövd musen med hjälp av en 30-gauge nålen.
- För in nålen vid basen av tummen ledningen till hälen och injicera substansen när nålen sätts cirka 0,5 cm. Efter injektionen långsamt dra tillbaka nålen samtidigt något roterande sprutan för att undvika läckage av lösning ur injektionsstället.
3. smärta mätningar
Anmärkning: Se till att forskare som utför de beteendemässiga experiment är blinda för mus behandling. Det är viktigt att acklimatisera sig djuren till testmiljön innan du utför någon mätning. Helst, veckan innan experimenten, djur är placerade 1 - 2 gånger för 15-30 min i varje av de olika enheter som används för att utföra testerna. Vid hantering av hanar och honor i samma experiment, utvärdera män oberoende av honor. Rena burar och ytor i stor utsträckning mellan de olika grupperna att undvika potentiella oönskade effekter på beteendet hos de olika könen. Mäta baslinjen uttag latenser eller mekaniska trösklar två till tre gånger för att exakt fastställa baslinjen tröskelvärden och identifiera om dessa är stabil innan intraplantar injektion av någon förening.
-
Von Frey test: mekaniska känslighet för innocuous stimuli
- Ställ djuren individuellt i akryl burar på en wire mesh monter och mössen acklimatisera sig för minst 15 min före mätningar.
- Bedöma mekaniska känslighet genom att mäta tass tillbakadragande tröskelvärdet i svar på en kalibrerad rad von Frey hårstrån, från 0,02 till 4 g. överväga varje förflyttning av tass ifrån tillämpad hår som positiva uttag svar. Tillämpa glödtrådarna vinkelrätt mot tass ytan med tillräcklig kraft att orsaka svag böjning mot huden och hålla för ~ 3 s. gör att håret inte vrider under applicering till tass.
- Beräkna tröskelvärdet på 50% tass-uttag med hjälp av de up-and-down metod15,21.
Obs: Första glödtråden att tillämpa är 0,4 g (andra start filament kan användas beroende på de tröskelvärden som dessa möss visar vid baslinjen). Brist på svar på en glödtråd indikerar att nästa tjockare glödtråden används i följande stimulering, medan ett positivt svar indikerar användning av nästa tunnare glödtråden. Antalet hår presentationer bestäms av den första differentiell Svaren; efter det utförs 5 fler program. Beräkning av tröskelvärdet på 50% enligt metoderna som beskrivs tidigare15,21.
-
Termisk känslighet: Hargreaves test
- Placera djuren i burarna på en pre värmde (30 ° C) glasskiva och låta mössen acklimatisera sig för minst 15 min före mätningar, vänta tills djuren sitta still.
- Bestämma värme uttag latens gånger genom upphettning tass djur av en fokuserad synliga ljusstråle som använder en Hargreaves apparatur (se Tabell för material).
Obs: Intensiteten av balken är inställd på 12%, eftersom med detta experimentellt bestämd intensitet inställning ljusstrålen frammanar ett tillbakadragande svar i en genomsnittlig tid av 8 s vid baslinjen på C57Bl/6 möss. Inställningen intensitet bör fastställas per enskild dator och mus stam. Maximal brytningstider 20 s eller mer används för att undvika skador på djuren. - Mäta latens uttagstider ~ 4 gånger per djur. Genomsnittliga alla svar mätt. Mäta varje tass självständigt och med minst 1 min mellanrum mellan efterföljande mätningar i samma tass.
-
Postural underskott: dynamisk vikt uthärda test
- Mäta kroppsvikt varje djur före provet eftersom viktbärande analys kräver kroppsvikt varje enskilt djur som indataparameter.
- Placera djuren individuellt i en våningen-instrumenterad dynamisk viktbärande system monteras på en cover som stöder en kamera som kommer att registrera musrörelser. Låt djuret acklimatisera sig för 0,5 till 1 min innan inspelning för 5 min.
Obs: I det här testet bara ett fritt rörliga djur kan utvärderas i taget. - Justera inställningar för att utföra viktbärande och analysera data.
Obs: I dessa experiment, använder vi följande parametrar: (i) låg vikt tröskelvärdet 0.6 g: är detta den minsta vikten som krävs för att aktivera en av cellerna i sensorn. (ii) hög vikt tröskeln på 1 g: siffran anger den vikt som krävs för att fullt ut aktivera en cell. (iii) surface tröskeln på 2 celler: siffran anger antalet celler intill varandra som behöver aktiveras för att beaktas. (iv) minsta antalet bilder är 5: det tar 0,1 s till fånga varje bild. Siffran anger det minimala antalet ramar där musen inte flytta. Som sådan, ett värde av 5 innebär att musen hållning behöver vara stabil för > 0,5 s att få en mätning som beaktas för analys. - Utför analysen av varje video genom att spela upp videon och se till att varje lem känns igen korrekt av programvaran på den tidsram som anges av programvaran.
Obs: Minst 1 min av inspelad tid behöver valideras. Den dynamisk viktbärande programvara beräknar och ger följande parametrar: (i) den vikt som belastar varje enskilda tass i gram och i procent av hela kroppens vikt. (ii) vikt bärs av kombinerad främre tass eller kombinerade bakre tassarna i gram och i procent av hela kroppens vikt. (iii) förhållandet mellan vänster/höger tass viktbärande eller främre/bakre viktbärande. (iv) yta på varje tass eller kombinerad främre/bakre tassar som aktiverat tryck känslig pad. (v) genomsnittlig och standard avvikelse för varje parameter. (vi) varaktigheten av olika ställningar (uppfödning, 3 tassar eller 4 tassar) under hela experimentet. (vii) tid (s) var tass bär vikt under hela försöket.
4. intratekal injektion av IL4-10 fusionsprotein för analgesi
Obs: Bekräfta att ventilationen i rummet är öppen att säkerställa luftombyte. För att testa effekten av proteinet IL4-10 fusion (1 µg/mus; 5 µL totala injektionsvolymen) ska det testas mot fordonet injektioner och injektioner av kombinationen av de enskilda cytokiner (IL4 + IL10, 0,5 µg + 0,5 µg/mus, 5 µL totala injektionsvolymen).
- Söva musen med 3-4% isofluran med en syre flöde 2 L/min i induktion kammaren. Kontrollera att musen är ordentligt bedövas genom att nypa tass för att säkerställa att djuret inte är lyhörd.
- Plats med musen på tabellen med huvudet placeras i näskotten av apparaten och upprätthålla mus sedering med 1,5-2% isofluran med en syre flöde 2 L/min medan utför intratekal injektion.
- Back-fylla de injicerbara föreningarna i en ren 25 µL glas Hamilton spruta ansluten till en 27-gauge nål.
- Håll musen fast ryggraden posteriort revbenen och lyft musen. Placera nålen lodrätt mellan ländkotorna L5 och L6 och försiktigt in det genom huden precis vid mitten av ländkotorna. Placera nålen i intervertebral utrymme.
Anmärkning: Att hitta intervertebral utrymme kan kräva några 'söka' av Flytta nålen längs den rostralt ventrala axeln, trycka lätt på nålen tills en förlust av motstånd av benvävnad är klädde med filt.- Bekräfta rätt inriktning genom att verifiera att en svans-flick inträffat. Injicera 5 µL av substansen långsamt, vänta ett par sekunder och sedan långsamt dra tillbaka nålen. Om endast en enda tass flick observeras, är nålen sannolikt inte placeras korrekt.
- Efter injektionen, kontrollera musen nära för de första 30 min efter återhämtning från anestesi att säkerställa frånvaro av någon motor leverfunktion/förlamning.
Obs: Smärta beteenden kan vara uppmätta (som beskrivs i avsnitt 3) 15 minuter efter återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representativ bild av en SDS-PAGE gel innehållande olika fraktioner erhålls under affinitet kromatografi reningen visas i figur 1A. I Last (L) och flödet genom (FT) fraktioner observeras alla proteiner i HEK293 supernatanten. Ingen protein observeras i bråket som wash (W). I eluering (E) fraktionen observeras två band av 35 och 37 kDa motsvarar två olika glycoforms av IL4-10 fusionsprotein (pilar). I figur 1B, en representativ potens-analys en helblod visas test i två olika IL4-10 fusion protein satser. En dosberoende hämning av LPS-inducerad TNFα release observeras, visar jämförbara bioaktivitet för de två IL4-10 fusion protein batcharna.
Därefter visas ett exempel på testresultat av representativa experiment där proteinet IL4-10 fusion är testade för att hämma ihållande inflammatorisk smärta (figur 2). Ihållande inflammatorisk smärta var inducerad av intraplantar injektion av 2% karragenan. Mekanisk (figur 2A) samt termiska (figur 2B) hyperalgesi följdes över tid. Dag 6 efter induktion av inflammatorisk smärta injicerades möss intratekalt med IL4-10 fusionsprotein eller fordon som en kontroll. IL4-10 betydligt löst både mekaniska (figur 2A) och termisk (figur 2B) hyperalgesi, och nådde sin maximala effekt efter 24 h efter injektionen. Effekten av proteinet fusion smärta hämning bör helst testas också mot equimolar koncentrationer av de enskilda cytokiner att testa om dess förmåga att hämma smärtan är bättre än summan av de enskilda cytokiner. Dessa data visas inte här, men vi hänvisar till en ny publikation som visar detta data9.
Effektiviteten av IL4-10 fusionsprotein testades nyligen i CFA-inducerad inflammatorisk smärta modell9. I detta experiment var flera injektioner av proteinet IL4-10 fusion administreras intratekalt. Flera injektioner löst helt CFA-inducerad ihållande inflammatorisk hyperalgesi, mätt med von Frey och Hargreaves tester, visar potentialen för IL4-10 fusion proteinet som en smärtstillande behandling9. Här visar vi att intraplantar CFA injektion också induceras en minskning i viktbärande av drabbade tass (figur 3A-B). Intratekal injektion av IL4-10 fusionsprotein dag 7 efter intraplantar CFA injektion försvagade minskningen i viktbärande av drabbade tass jämfört med fordon-injiceras möss 2 dagar efter IL4-10 fusion protein administration (figur 3B ).
Figur 1 : Rening och karakterisering av IL4-10 fusionsprotein. (A), Coomassie-färgade SDS-PAGE analys av affinitet kromatografi fraktioner: L: belastning, FT: flödet genom, W: wash, E: eluering. (B) funktionell analys: IL4-10 fusion protein dosen beroende hämmar TNFα produktion i LPS stimuleras helblod kultur (uttryckt som procentuell hämning jämfört med kulturer stimuleras med LPS ensam). Data representeras som medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Hämning av inflammatoriska hyperalgesi av proteinet IL4-10 fusion. Inflammatorisk smärta förmåddes av en intraplantar injektion av 20 µL av 2% karragenan (bil). Sex dagar efter intraplantar injektion möss fick en intratekal injektion (pil) 1 µg IL4-10 fusionsprotein eller fordon (PBS). (A) mekanisk överkänslighet (Log 50% tröskelvärde (g)) mättes över tiden med Von Frey-testet och (B) termisk känslighet (latens (s)) mättes med Hargreaves test. Data representeras som medelvärde ± SEM. asterisker representerar betydande skillnader analyseras av tvåvägs ANOVA, mellan fordon och IL4-10 injiceras djur. **, *** = p < 0,01 och p < 0,001, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Inflammation-inducerade förändringar i viktbärande. Inflammatorisk smärta förmåddes av en intraplantar injektion av 20 µL av komplett Freuds Adjuvant (CFA). Viktbärande på varje tass mättes med hjälp av den dynamiska vikt bärande enheten. Viktbärande i gram av den drabbade tassen (ipsilaterala hind tass) och den totala viktbärande av icke-drabbade Tafsar (främre tassar och kontralaterala tass) visas, liksom förhållandet mellan viktbärande av ipsilaterala tass jämfört med andra 3 tassar. (A) jagar av viktbärande under CFA-inducerad inflammation (n = 10). (B) vid dag 7 efter intraplantar CFA, möss fick en intratekal injektion 1 µg IL4-10 fusionsprotein eller fordon (PBS). Viktbärande mättes på 0 och 7 dagar efter intraplantar CFA och 2 dagar efter administrering av IL4-10 fusionsprotein. Viktbärande av ipsilaterala tass jämfört med andra 3 tassar representeras (n = 3-4). Data representeras som medelvärde ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0,05 jämfört med utgångsvärdet (dag 0). # = p < 0,05 jämfört med fordon som behandlade djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver metoder för tillverkning och karakterisering av ett rekombinant IL4-10 fusionsprotein, och metoder för att testa dess effektivitet i att hämma inflammatoriska hyperalgesi i musmodeller av ihållande inflammatorisk smärta. Produktion och rening av proteinet IL4-10 fusion utförs i liten skala. HEK293 celler är markerade som ett uttryck system för produktion av proteiner eftersom de möjliggör post-translationella modifieringar som inte kan uppnås i prokaryota uttryck system. Post-translationella modifieringar är relevanta för proteinfunktion och avsaknad av sådana ändringar potentiellt kan påverka den terapeutiska effekten av proteinet IL4-10 fusion. Proteinet renas från kultur supernatanten genom affinitetskromatografi. Vi valde att använda internt gjort monoklonal antikropp mot IL4 för affinitet rening och inte för att producera en IL4-10 fusionsprotein som innehåller en tagg som möjliggör rening med affinitet tag system. Anledningen till detta var att undvika möjligheten att tag-relaterade förändringar i proteinveckning och funktion. Dock om en mycket selektiv monoklonal antikropp saknas ett protein med en tagg behöver utvecklas, t.ex. en sin tagg. Det blir i så fall viktigt att avgöra om C - eller N-terminalen av protein är bäst lämpad för taggen för att undvika att påverka proteinfunktion.
Från 1 L HEK293 supernatant, cirka 3 mg av renat IL4-10-fusionsprotein erhålls, men detta kan variera från batch till batch. Kolumnen för affinitet rening kan användas för flera rening cykler innan kasta. Det känsligaste steget i förfarandet för rening beror elueringen av IL4-10 fusionsprotein från kolumnen av lågt pH, lågt pH kan orsaka oåterkalleliga protein denaturering och protein nederbörd. Således, underhåll av infödda proteinstruktur och avsaknad av protein aggregat är avgörande för god kvalitet partier. Därför behöver utvärdering av bioaktiviteten av proteinet fusion vara testade in vitro- före och efter rening med olika eluering buffertar. Efter rening av proteinet IL4-10 fusion sänktes bioaktiviteten inte jämfört med icke-renat protein. Dessutom samlade bildandet var frånvarande när steget eluering utfördes med 0,1 M glycin buffert (pH = 2,5), och pH-värdet i eluering fraktioner var omedelbart neutraliseras med 1 M Tris buffert (pH = 9).
Koncentrationen av renat IL4-10 fusionsprotein beräknas på grundval av mänskliga IL10 ELISA resultat. BCA protein assay används för att bekräfta koncentrationerna som protein. Återvinning av proteinet efter rening utvärderas baserat på koncentrationerna mäts i belastning, flödet genom, tvätta och eluering fraktioner av IL10 ELISA. BCA protein koncentration bestämning av IL4-10 fusionsprotein kan utvärderas endast i dialyseras eluering fraktioner. Icke-dialyseras eluering fraktioner innehåller Imidazol, en förening som påverkar BCA mätningen. Icke-renade fraktioner innehåller andra proteiner från HEK293 odlingssubstratet.
Bestämning av bioaktiviteten av proteinet IL4-10 fusion utförs i en helblodsanalys. Bioaktiviteten av IL4-10 fusionsprotein bör utvärderas i hela blodet från flera bidragsgivare att avgöra huruvida funktionella aktiviteten behålls. Flera givare krävs eftersom givaren till givaren varians finns i IL10 och IL4 förmåga att hämma LPS-inducerad TNFα release. Dessutom uttryck för IL4R och IL10R kan skilja sig mellan givare, som påverkar IL4-10 fusionsprotein förmåga att hämma LPS-inducerad TNFα produktion.
I de beskrivna metoderna detaljerade vi 2 musmodeller av ihållande inflammatorisk smärta att utvärdera effekten av IL4-10 fusionsprotein att lösa smärta i vivo. För fullständig utvärdering av rekombinant fusionsproteinerna smärtstillande potential, bör dock molekylerna testas i andra modeller av kronisk smärta samt. Dessa modeller inkluderar, men är inte begränsade till, modeller av nervskada och kemoterapi-inducerad neuropatisk smärta9,22. Även om den von Frey och Hargreaves-proven används ofta för att testa smärtstillande läkemedel, har det blivit tydligt att ett ytterligare test (t.ex. dynamisk vikt uthärda test) bör ingå för att bedöma effekterna på icke-framkallat smärta behaviorsand också med operant smärta analysen (t.ex. luftkonditionering plats preferens (CPP) som upptäcka icke-framkallat smärta beteenden17,18). För att utföra CPP, bör uppkomsten av smärthämmande effekten av proteinet fusion beaktas, eftersom konditionering av djuren av smärtlindring kräver snabb beter analgetika (som utövar effekter i mindre än 15 min). Dock om testet förening har en långsam smärtstillande debut, men sannolikt att inducera långvariga smärta hämning (mer än 4 dagar), kan CPP fortfarande användas att testa om föreningen hämmade smärta. I detta fall behöver förening-inducerad förlust av luftkonditionering med snabbverkande smärtstillande medel bedömas.
Intratekala injektioner har valts som en administreringsväg, som föreningen kommer att nå smärta relevanta områden såsom dorsalrotsganglier och ryggmärg. Särskilt, intratekal leverans av smärtstillande läkemedel har blivit allmän praxis som en behandling av patienter med kronisk smärta, eftersom denna strategi minskar dosen av smärtstillande läkemedel behövs och minskar toxicitet och systemiska biverkningar. Detta administreringssätt har dock vissa begränsningar. Det kräver välutbildad personal och på grund av små subaraknoidalrummet, volymen av injektion bör begränsas till 5 µL i möss, som kräver mycket koncentrerade lösningar av proteinet fusion. Tekniken för intratekala injektioner krävs utbildning. Sådan utbildning kan utföras på icke-återvinna sövda djur med injektion av ett färgämne att kontrollera rätt intratekal injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Del av arbetet har finansierats av en Utrecht University Life Sciences bevilja
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
