Summary
Bu yazıda biz üretim yöntemleri ve bir IL4-10 rekombinant füzyon protein kalite kontrolü için ayrıntıları sağlar. Biz de bir fare modeli enflamatuar ağrı ağrı gidermek için bu proteinin etkinliğini test etmek nasıl göstereceğim.
Abstract
Kronik ağrı tedavi etmek zordur ve inatçı ağrı gidermek için yeni yaklaşımlar acilen ihtiyaç vardır. Anti-inflamatuar sitokinlerin zayıflatıcı acı koşulları nedeniyle kapasitelerini anormal nöro-bağışıklık etkileşimleri düzenleyen tedavisinde umut verici adaylar bulunmaktadır. Ancak, fizyolojik bir ağda çeşitli sitokinlerin çalışır ve bu nedenle onların tedavi edici etkiye tek başına ilaç olarak kullanıldığında en uygun olmayabilir. Bu sınırlamayı aşmak için IL4 ve IL10 anti-inflamatuar sitokinlerin bir füzyon protein geliştirdi. Burada, üretim ve kalite kontrol IL4-10 rekombinant füzyon proteinin yönelik yöntemler tanımlamak ve bir fare modeli inatçı enflamatuar ağrı ağrı gidermek için IL4-10 füzyon protein etkinliğini test.
Introduction
Kronik ağrı en 21, zayıflatıcı ve altında tedavi tıbbi problemlerden biri kalır etkileyen > yetişkin nüfusun1,%220'si. Ancak, kronik ağrı yardım sağlamak için Tedaviler çoğu kez etkisiz veya ciddi yan etkileri3nedeniyle devam etmemek gerekir. Önemli, şu anda kullanılabilir ilaçlar sadece semptomatik rahatlama sağlamak ama değil önemli ölçüde değiştirmek ya da kronik ağrı tedavi. Kronik ağrı bir nörolojik bozukluk gibi görünmesine karşın, kronik ağrı geliştirme4,5bağışıklık sisteminde katılımı kanıtlar gösteriyor. Ayrıca, ağrı tedavisinde bağışıklık tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkıyor. Örneğin, anti-inflamatuar sitokinlerin ağrı kronik ağrı6,7,8çeşitli modeller inhibe. Ancak, anti-inflamatuar sitokinlerin potansiyel ağrı inhibe etkileri azaltmak kısa bir yarı ömrü vardır. Ayrıca, anti-inflamatuar sitokinlerin en en iyi şekilde birbirleriyle uyum içinde çalışmak. Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için biz son zamanlarda anti-inflamatuar sitokinlerin İnterlökin-4 (IL4) ve İnterlökin-10 (IL10) bir molekül erimiş. IL4-10 füzyon protein bireysel sitokinler9' a göre kronik inflamatuar ve nöropatik ağrı inhibe üstün etkinlik gösterir. Burada biz böyle füzyon protein nasıl üretilir, saf, tarif ve nasıl kalite kontrol edilir.
IL4-10 füzyon proteini insan hücrelerinde pUPE ifade vektör IL4-10 füzyon protein kodlama cDNA sıra taşıyan bir HEK293-F hücreleri geçici transfection tarafından üretilir. HEK293-F hücreleri translasyonel modifikasyon protein, bakteriyel ifade sistemlerinde oluşmaz bir şey için izin vermek için seçilir. Glycan kapatma ile sialik asit, beta-galactoside-2, kodlama cDNA optimize etmek için 3-sialyl-transferaz ikinci bir transgene vektörde kurulmuştur. Füzyon proteini daha arıtma daha güçlü olduğu için benzeşme protein saflaştırma süpernatant kültürünün kullanarak diğer yöntemleri örneğin boyut-dışlama veya iyon Kromatografi10,11tarafından saf. IL4-10 füzyon protein arındırmak için şirket içinde yapılan monoklonal antikorlar IL4 karşı kullanılır. Saflık değerlendirilmesi ve bioactivity saf IL4-10 füzyon proteinin kalite kontrol bir parçası olarak gerçekleştirilir. Üretilen toplu işlemleri saflığı Sodyum Lauryl Sülfat Polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve yüksek basınç boyutu dışlama Kromatografi (HP-sn) tarafından değerlendirilir. Bioactivity IL4-10 füzyon proteinin lipopolysaccharide (LPS) inhibe kapasitesini ölçülerek değerlendirilir-tümör nekrozis faktör-alfa (TNFα) üretim tam kan kültürlerinde indüklenen ve bireysel birleşime karşılaştırarak sitokinler.
Son olarak, IL4-10 füzyon protein kapasitesi kronik ağrı etkisizleştirmek için test etmek için biz nasıl füzyon protein inatçı enflamatuar ağrı12,13,14 yaygın olarak kullanılan fare modellerinde analjezik olarak test edilebilir tarif . Burada bir enflamatuar ağrı modeli yöntemleri açıklanmaktadır. Ancak, diğer ağrı modellerinde kullanılan (örneğin, nöropatik ağrı modelleri) olabilir, bağlı olarak araştırma cevap gerek bu sorular unutmamak önemlidir. Bu modeller ağrı değerlendirmek için uyarılmış dahil davranış ölçümleri ve sigara uyarılmış ağrı önlemleri çeşitli kullanmak önemlidir. Burada, değerlendirme yöntemleri mekanik ve termal olarak uyarılmış davranışsal yanıt değişimler için açıklanan. Zararsız uyaranlara karşı mekanik hassasiyeti termal duyarlılık Hargreaves testi kullanılarak değerlendirilir ederken Von Frey testi kullanarak değerlendirilir. Önemlisi, uyarılmış hyperalgesia/allodynia dinamik ağırlık taşıma testi kullanılarak ölçülür. Bu önlemlerin yaygın ağrı ölçü olarak kabul edilir ve ağrı eşikleri ve potansiyel ağrı hayvanlar15,16,17tarafından deneyimli hakkında önemli bilgiler sağlar. Diğer sigara uyarılmış ağrı (örneğin, uyarıcı bağımsız), klimalı yer tercih testi gibi değerlendirmek için önlemler, değerli18olabilir. Yönetim bu yolu ile daha az protein doz sistemik (side-) etkileri19önlemek ve ağrı ile ilgili alanlara ulaşmak için gerektiği gibi ağrı inhibe ilaç potansiyelini değerlendirmek için biz İntratekal yönetim füzyon proteinin gerçekleştirilen, 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri önceden onay yerel deneysel Etik Komitesi ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tam kan, Üniversitesi Tıp Merkezi Utrecht (UMCU) Hollanda Mini donör hizmetinden (Mini donör Dienst, MDD) elde edildi. MDD Protokolü sayı 07-125/c için UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) tıbbi etik Komitesi olumlu onay aldı
1. protein üretimi ve karakterizasyonu
- Hücre kültürü
Not: Kültür orta kullanılan Malzemeler tablo bakın.- Buz küçük bir yığın olana HEK293-F hücreleri 37 ° C'de erimek. Çözdürülen hücreleri hemen buz gibi orta (4 ° C) için 10 mL aktarmak ve hücre süspansiyon, oda sıcaklığında (RT) 4 dakika (dk) 500 x g santrifüj kapasitesi.
- Orta kaldırmak ve hücre Pelet RT, 500 x g 4 dk için de Santrifüjü ardından taze orta 10 ml resuspend.
- Süpernatant kaldırmak ve Önceden ısıtılmış orta (37 ° C) 25 mL içeren doğrudan bir 125 mL şişe hücre Pelet RT. Ekle hücre süspansiyon orta 5 ml resuspend. 37 ° C, % 8 CO2ve % 95 nem üzerinde 125 rpm hızda dönen bir orbital Çalkalayıcı hücreler kültür.
- Alt kültür hücreleri haftada iki kez. Otomatik bir hücreyi kullanın (bkz. Tablo reçetesi) hücre sayısı ve hücre canlılığı değerlendirmek için counter. Tohum hücrelerin 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonu Erlenmeyer şişeler içine at. 1/5 kültür Erlenmeyer şişeler toplam hacminin kültür orta hacmi her havalandırma en iyi tutmak için zaman belirleyin.
- Transfection
Not: hücrelere üç dört kez transfection önce ve hücre canlılığı olduğunda onları transfect alt kültür > % 90. Hücre canlılığı değerlendirildi otomatik bir tarafından (elektrik alanı çok kanallı) plazma membran bütünlüğü üzerinde tabanlı cellcounting sistemi. Transfection reaktif için Malzemeler tablo görmek.- RT, hücreler için 500 x g de 4 dk santrifüj kapasitesi; hücre Pelet 10 mL Önceden ısıtılmış kültür orta (37 ° C) resuspend ve ~1.0 x 106 hücre/ml 1 L. Aliquot 500 mL Erlenmeyer şişe 100 mL 10 aliquots hücre süspansiyon toplam hacmi içinde hücre süspansiyon sulandırmak.
- Plazmid DNA 33 mL azaltılmış-serum en az gerekli orta 1 mg seyreltik (MEM, Tablo malzemelerigörmek) tarafından nazik karıştırma. Ayrı bir tüp içinde nazik karıştırılarak MEM transfection reaktif 1.330 µL oranında seyreltin. 5 dk. Ekle için her iki çözüm de RT, kuluçkaya ve MEM transfection reaktif için MEM içinde seyreltilmiş DNA mix ve karıştırmak için 30 dk RT. az kuluçkaya
- DNA-transfection reaktif mix (1 bölümünde kültürlü); hücrelere ekleme Mix 6.6 mL her 500 mL Erlenmeyer içeren hücre kültürü ortamında 100 mL şişe ekleyin. Daha önce bahsedilen kültür koşulları hücreleri korumak. Üç gün sonra transfection salgılanan IL4-10 füzyon protein içeren kültür süpernatant hasat.
- Bir IL10 ELISA üreticisinin protokolüne göre gerçekleştirerek süpernatant kültür IL4-10 füzyon protein konsantrasyonu belirlemek ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: en iyi kültür koşullarında, füzyon protein konsantrasyonu 2.5 ve 5 µg/mL arasında olacağı tahmin.
- Protein saflaştırma benzeşme Kromatografi tarafından
Not: Benzeşme Kromatografi oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Ancak, tüm kesirler (kültür süpernatant, yük, akışı sayesinde ve elüsyon) işlem sırasında buz üzerinde tutulur.- Çift bir all-in house yapılan Monoklonal antikor IL4 karşı CNBr - 1 g için 10 mg aktif sepharose 4B, üreticinin protokole göre ( Tablo malzemelerigörmek). Eşleşmiş sepharose boncuk 2.5 mL cam Kromatografi sütuna (30 cm uzunluğunda ve 1.5 cm iç çapı, Tablo malzemelerigörmek) yavaş yavaş dökün.
- 50 mL % 1'i içeren fosfat tamponlu tuz (PBS) aktararak siteleri boncuklar bağlama kalan blok sığır Serum albümin üzerinden sütun. Sütun PBS 25 mL ile yıkayın (pH 7.4 =) tarafından 12,5 mL 0.1 M glisin arabelleği takip (pH = 2,5) ve PBS 25 mL (pH 7.4 =).
- 100 mL 10 kat konsantre HEK293 hücre kültürünün sütunu boyunca süpernatant 1 mL/dak yıkama debisi sütun PBS 50 mL ile geçmektedir.
- 12,5 mL 0.1 M glisin arabelleği ile ilişkili IL4-10 füzyon protein elute (pH 2.5 =) 1 mL/dk ve 2.5 mL toplamak kesirler akış hızında. 1 M Tris arabelleği 350 µL ekleyin (pH = 9) pH 7'ye getirmek için her kesir için. Gecede 2 litre PBS karşı etkisiz kesirler Diyaliz (pH 7.4 =).
- Diyaliz tüp 16 mm Kuru çapı ve 3.5 K molekül ağırlığı kesme ile kullanın. Steril diyaliz kesirler 0,45 µM gözenek çapı ile tek kullanımlık filtreleri kullanarak filtreleme. Steril IL4-10 füzyon protein çözüm aliquots-80 ° C'de depolayın
- Eluted IL4-10 füzyon protein % 12 SDS-sayfa jel Coomassie lekeli ve HP-sn (3 µm sn-2000 sütun) tarafından saflığı değerlendirin. HP-sn analiz için ~ 1 mg/mL konsantrasyonu sütun adlı proteinin 40 µL yükleyin. 150 mM Sodyum Klorür ile 100 mM sodyum fosfat tampon kullanmak (pH 6.8 =) mobil faz olarak. Akış hızı 1 mL/dk ayarlayın.
- Her toplu iş iş IL10 ELISA tarafından arıtılmış IL4-10 füzyon protein ve Bicinchoninic asit Protein tahlil konsantrasyonu belirlemek ( Malzemeler tablobkz: BCA Protein tahlil seti,) göre üreticinin iletişim kuralları.
- Rekombinant insan IL10 standart bir eğri ELISA tahlil oluşturmak için kullanın. Rekombinant IL10 arasındaki büyüklük farkı düzeltmek için (18 kDA) ve IL4-10 füzyon proteini (34 kDa), çarpma elde edilen konsantrasyon 1.8 kat.
- Bioactivity IL4-10 füzyon protein
Not: IL4-10 füzyon protein üretilen her toplu işlem için tam kan tahlil gerçekleştirilir ve farklı gruplar halinde faaliyet kalite kontrol bir parçası olarak karşılaştırılır. Tam kan tahlil taze insan kanında toplanan heparin boru testin gün gerçekleştirilir. Kan bizim in-house donör hizmetindeki sağlıklı gönüllülerden elde edildi. Örnekleri potansiyel biyolojik tehlikeleri ele alınmalıdır.- 3 kat seri öncesi dilutions saf IL4-10 füzyon protein RPMI ortamda hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 5-1,215 ng/mL üzerinde bir konsantrasyon aralığı.
- LPS öncesi dilutions hazırlamak (100 ng/mL) ve 4 kez RPMI ortamda seyreltilmiş insan kanı.
- 48-şey plaka içine IL4-10 füzyon protein, LPS ve insan kanı dilutions öncesi pipette. Her şey için 50 µL IL4-10 füzyon proteini (son konsantrasyonu 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI orta, 25 µL LPS (son konsantrasyonu 10 ng/mL) ve 100 µL insan kanı ekleyin (seyreltilmiş final).
Not: Toplam iyi başına 250 µL birimdir. - Plaka 37 ° C, % 8 CO2ve % 95 nem 18 h için kuluçkaya.
- TNFα konsantrasyon TNFα ELISA kullanarak kültür supernatants üreticinin protokole göre değerlendirin.
- IL4-10 füzyon protein formüle göre tarafından inflamatuar yanıt inhibisyonu hesaplamak: % inhibisyon (1-(A-B)/(C-B)) x 100 =
Not: Burada A TNFα düzeyleri LPS uyarılmış kültürlerde IL4-10 füzyon protein, B ile tedavi = unstimulated kültür ve C TNFα Level = LPS uyarılmış kültür seviyelerinde TNFα =.
2. fare modeli kalıcı enflamatuar ağrı için
Not: Bu seks bağımlı etkileri tanımlaması sağlayacaktır çünkü hem erkek hem de dişi fareler (C57Bl/6) kullanılması önemlidir. Genel olarak, kullanılan fareler arasında 8-16 hafta eski değildir. Hayvanların gerekli sayıda belirlemek için güç hesaplamaları yapılmalıdır. Bu tür hesaplamaları gerçekleştirmek için web tabanlı araçları kolayca internette (örneğin, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net) bulunur.
-
İndüksiyon kronik inflamatuvar ağrı
Not: alprazolzm veya tam Freud'un adjuvan (CFA) intraplantar enjeksiyonu ile yetişkin farelerde inatçı enflamatuar ağrı neden. Farklı testler birbirleri ile müdahale değil.- Alprazolzm (% 2 w/v) λ-alprazolzm çözülerek hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) %0,9 alprazolzm düzgün çözünmüş emin olmak için çözüm bir 23-gauge iğne geçirerek NaCl. Taze bir çözüm doğrudan enjeksiyon yapılmadan önce hazır olun.
- CFA kullandıysanız, CFA Mycobacterium öldürdü ve kurutulmuş tüberküloz (H37Ra) ısı, 0,85 mL parafin yağı ve 0,15 mL mannide 1 mg içeren bir petrol su emülsiyon olduğu için alternatif olarak, CFA çözüm intraplantarly, enjekte önce mix düzgün monooleate ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Cam Hamilton şırınga ile metal itici kauçuk itici adjuvan yağda ile tepki çünkü bu bileşik enjekte için tavsiye edilir. -
İntraplantar enjeksiyon
- RT, şırınga en az 15 dk önce enjeksiyon RT. enjekte 20 µL bahçedeki (veya dissolvent bir denetim olarak) ayarlanmasına izin vermek için (Adım 2.1.1 veya 2.1.2) bileşik subkutan bir 30-ölçer kullanarak olmayan anestezi fare arka pençe korumak iğne.
- Başparmak için topuk yönetmenlik Bankası iğne ekleyin ve iğne takıldığında bileşik enjekte yaklaşık 0.5 cm. Enjeksiyon sonra biraz enjeksiyon yeri dışında çözüm kaçağı önlemek için şırınga dönen iken iğne yavaş yavaş geri çek.
3. ağrı ölçümleri
Not: araştırmacılar davranışsal deney yapmak için fare tedavi kör olduğundan emin olun. Herhangi bir ölçüm yapmadan önce sınama ortamının hayvanlarla parkenizin önemlidir. Tercihen, deneyler, başlamadan önce hafta 1 - 2 kez için 15-30 dakika her testleri gerçekleştirmek için kullanılan farklı cihazların hayvanlar yerleştirilir. Kadın ve erkek aynı deneyi olarak ele alırken, erkek kadın bağımsız olarak değerlendirin. Temiz kafes ve yüzeylere farklı cinsiyetler davranışını potansiyel istenmeyen etkileri önlemek için kapsamlı bir şekilde farklı gruplar arasında. Temel para çekme gecikmeleri var mı ya da mekanik eşikleri ikisi doğru temel eşikleri belirlemek ve bunlar herhangi bir bileşik intraplantar enjeksiyon önce kararlı olup olmadığını belirlemek için üç kez için ölçmek.
-
Von Frey testi: zararsız uyaranlara karşı mekanik hassasiyeti
- Hayvanlar ayrı ayrı bir tel kafes stand akrilik kafesler içine yerleştirin ve en az 15 dk önce ölçümleri için parkenizin fareler sağlar.
- Mekanik hassasiyeti pençe çekilme eşik yanıt olarak 0,02 4'e kadar von Frey kıllar kalibre edilmiş bir dizi ölçerek değerlendirmek g. pençe uygulanan saç uzak herhangi bir hareket olumlu çekilme yanıt olarak düşünün. Ciltte hafif bükme neden ve ~ 3 s. yapmak için kesinlikle saç tutmak için yeterli gücü ile pençe yüzeyine dik pençe başvuru sırasında twist değil filamentler uygulanır.
- Kullanarak alçalarak yöntemi15,%2150 pençe-çekilme eşik hesaplayın.
Not: uygulamak için ilk filaman 0.4 g olduğunu (diğer başlangıç filamentler bu fareler görüntülemek temel eşikleri bağlı olarak kullanılabilir). Yanıt-e doğru bir filament eksikliği olumlu bir yanıt sonraki ince filament kullanımı gösterirken sonraki kalın filaman aşağıdaki stimülasyon kullanıldığını belirtir. Saç sunumlar ilk fark yanıt tarafından belirlenir; Bundan sonra 5 daha fazla uygulama gerçekleştirilir. % 50 eşik yöntemlerine göre daha önce15,21açıklanan hesaplayın.
-
Termal duyarlılık: Hargreaves testi
- Hayvanlar Önceden ısıtılmış (30 ° C) cam tabakta kafesler içine yerleştirin ve en az 15 dakika önce hayvanlar hala oturmak kadar bekleyerek ölçümleri, parkenizin fareler sağlar.
- Isı çekilmesi gecikme süresi kez hayvanlar pençe bir Hargreaves aparatı ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak bir odaklı görünür ışık demeti tarafından Isıtma tarafından belirleyin.
Not: Bu deneysel olarak kararlı yoğunluk ayarıyla, ışık demeti 8 ortalama bir zaman bir para çekme yanıt çağrıştırır çünkü ışın yoğunluğunu için % 12, küme s, temel C57Bl/6 fareler üzerinde. Yoğunluk ayarı başına bireysel makine ve fare zorlanma tespit edilmelidir. Maksimum kesme kez 20 s ya da daha fazla hayvanlara yaralanmayı önlemek için kullanılır. - Para Çekme gecikmesi kez hayvan başına ~ 4 kez ölçmek. Tüm yanıtları ölçülen ortalama. Her pençe bağımsız olarak ölçmek ve en az 1 dk aralıklarla aynı sonraki ölçümlerde arasında pençe.
-
Postural açıkları: dinamik ağırlık taşıyan testi
- Ağırlık analiz taşıyan bir girdi parametresi olarak bireysel her hayvanın vücut ağırlığı gerektirdiğinden her hayvan test önce vücut ağırlığını ölçmek.
- Hayvanları tek tek fare hareketlerini kaydeden bir kamera destekleyen bir kapak monte bir kat Enstrümante dinamik ağırlık taşıyan sistem yerleştirin. 0.5-1 dk kayıt için 5 dk önce parkenizin hayvanın izin.
Not: Bu testte, bir defada yalnızca bir serbestçe hareket hayvan değerlendirilebilir. - Ağırlık taşıyan gerçekleştirmek ve verileri çözümlemek için ayarları yapın.
Not: bu deneylerde, biz aşağıdaki parametreleri kullanın: (i) düşük ağırlık eşik 0.6 g: minimum ağırlık sensörü hücrelerden birini etkinleştirmek için gereken bu. (ii) yüksek ağırlık 1 g: eşiğinde bu sayı tam bir hücre etkinleştirmek için gerekli ağırlık gösterir. (III) 2 hücre yüzey eşik: Bu dikkate alınması için etkinleştirilmesi gereken birbirine bitişik hücreleri gösterir. (iv) en küçük sayı-in imge olan 5: 0,1 alır s her görüntü yakalamak için. Hangi fare hareket etmez çerçeveleri olabildiğince az sayıda gösterir. Bu nedenle, değeri fare duruş 5 anlamına gelir için kararlı olması gerekir > 0,5 s analiz için dikkate alınır bir ölçü elde etmek için. - Her video video oynatırken tarafından çözümlemesi ve her bacak doğru yazılım tarafından belirtilen zaman dilimi yazılım tarafından tanınan olun.
Not: 1 dk süresi en az doğrulanması gerekiyor. Dinamik ağırlık yazılım taşıyan hesaplar ve aşağıdaki parametreleri sağlar: (i) ağırlık gram ve tüm vücudun ağırlık yüzdesi olarak her bireysel pençe tarafından karşılanacaktır. (ii) ağırlık kombine ön pençe veya kombine arka paws gram ve tüm vücudun ağırlık yüzdesi olarak tarafından karşılanacaktır. (III) sol/sağ oranı pençeleri taşıyan ağırlık veya ön/arka ağırlık taşıyan. (iv) her pençe veya basınç duyarlı pad aktif kombine ön/arka paws yüzey alanı. (v) ortalama ve standart sapma her parametre için. (vi) bütün deneyin sırasında farklı duruşlar (yetiştirme, 3 pençeleri veya 4 pençeleri) süresi. (VII) Time (s) her pençe tüm deneme sırasında ağırlık taşır.
4. İntratekal enjeksiyon IL4-10 füzyon protein analjezi için
Not: Havalandırma odasına uygun hava akışı sağlamak için açık olduğunu doğrulayın. IL4-10 füzyon proteini (1 µg/fare; 5 µL toplam enjeksiyon birim) etkinliğini test etmek için bu araç enjeksiyonları ve bireysel sitokinler (IL4 + IL10, 0,5 µg + 0,5 µg/fare, 5 µL toplam enjeksiyon birim) kombinasyonu enjeksiyonlari karşı test edilmelidir.
- Fare ile % 3-4 isoflurane 2 L/dak indüksiyon odasında bir oksijen akış hızı ile anestezi. Fare düzgün hayvan duyarlı olmadığından emin olun pençe pinching tarafından anestezi kontrol edin.
- Yer fare kafasını tablo içinde burun konisi cihazları yerleştirilen ve İntratekal enjeksiyonun gerçekleştirme iken % 1.5-2 isoflurane oksijen akış oranı 2 L/dk ile fare sedasyon korumak.
- Arka-dolgu temiz 25 µL cam Hamilton şırınga içine enjekte edilebilir bileşikler 27'lik iğne için bağlı.
- Fare Kaburgalara arka omurga tarafından sıkıca tutun ve hafifçe fareyi kaldırın. Lomber vertebra L5 ve L6 arasında dikey olarak iğne ve dikkatle lomber vertebra ortasında şu deri yoluyla yerleştirin. İğne intervertebral alanı yerleştirin.
Not: intervertebral yer bulma bazıları 'hareket ettirmek yanında iğne direnç kemik doku kaybı hissedilir kadar hafifçe iğne basmaya rostral ventral eksen boyunca arama' gerekebilir.- Bir kuyruk hareketiyle meydana geldiğini doğrulayarak doğru hedefleme onaylamak. Bahçedeki 5 µL yavaş yavaş enjekte, birkaç saniye bekleyin ve sonra yavaş yavaş iğne geri çek. Yalnızca bir tek pençe hareketi gözlenen, iğne doğru yerleştirilmedi olasıdır.
- Enjeksiyon sonra fareyi yakından ilk 30 dk için herhangi bir motor bozukluğu/felç yokluğu sağlamak için anestezi kurtarma sonra kontrol edin.
Not: Ağrı davranışlar (anlatıldığı Bölüm 3) olarak ölçülen 15 dakika sonra kurtarma olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı kesirler benzeşme Kromatografi arıtma sırasında elde edilen içeren bir SDS-sayfa jel temsili resmi şekil 1içindeAgösterilir. Yük (L) ve (FT) kesirler ile akışı tüm proteinler HEK293 süpernatant mevcut gözlenir. Hiç protein yıkama (W) kesir görülmektedir. Elüsyon (E) kesir, IL4-10 füzyon proteini (oklar) iki farklı glycoforms için karşılık gelen 35 ve 37 kDa iki grup gözlenir. Şekil 1B, tam kan bir temsilcisi kudret tahlil tahlil iki farklı IL4-10 füzyon protein toplu işlemleri gösterilir. İki IL4-10 füzyon protein toplu işlemler için karşılaştırılabilir bioactivity gösterilen LPS kaynaklı TNFα yayın doz bağımlı inhibisyonu görülmektedir.
Sonra test sonuçlarını temsilcisi deneylerin hangi IL4-10 füzyon protein inatçı enflamatuar ağrı etkisizleştirmek için test örneği (Şekil 2) gösterilir. İnatçı enflamatuar ağrı % 2 alprazolzm intraplantar enjeksiyonu ile akımıdır. Mekanik (Şekil 2A) yanı sıra termal (Şekil 2B) hyperalgesia zaman içinde izledi. 6. gün indüksiyon inflamatuar acı sonra fareler intrathecally IL4-10 füzyon protein veya araç ile bir denetim olarak enjekte edildi. IL4-10 önemli ölçüde mekanik (Şekil 2A) ve termal (Şekil 2B) hyperalgesia çözülmüş ve maksimal etkisi 24 saat sonra enjeksiyon sonra ulaştı. İdeal olarak, ağrı inhibisyon füzyon protein etkinliği de ağrı inhibe kapasitesini bireysel sitokinler toplamından daha iyi olup olmadığını sınamak için bireysel sitokinler ekimolar konsantrasyonları karşı test edilmelidir. Bu veriler burada görüntülenmez, ancak biz bu veri9görüntüler son bir yayına bakın.
IL4-10 füzyon protein etkinliğini son zamanlarda enflamatuar ağrı CFA kaynaklı modeli9' test edildi. Bu deneyde, IL4-10 füzyon proteinin birden çok enjeksiyonları yönetilen intrathecally vardı. Birden çok enjeksiyonları von Frey ve IL4-10 füzyon proteini bir analjezik tedavi9olarak potansiyelini gösteren Hargreaves testleri kullanarak ölçülen CFA kaynaklı kalıcı inflamatuar hyperalgesia, tamamen çözüldü. İşte intraplantar CFA enjeksiyon da etkilenen pençe (şekil 3A-B) bir azalma ağırlık taşıyan indüklenen göstermektedir. Gün intraplantar CFA enjeksiyon ağırlık taşıyan araç enjeksiyonlu fareler için 2 gün sonra IL4-10 füzyon protein Yönetim (şekil 3B karşılaştırıldığında etkilenen pençe azaltılması zayıflatılmış sonra 7, IL4-10 füzyon proteinin İntratekal enjeksiyon ).
Resim 1 : Arıtma ve IL4-10 füzyon protein karakterizasyonu. Benzeşme Kromatografi kesirler (A) Coomassie lekeli SDS-sayfa analizi: L: yük, FT: akış, W: yıkama, E: elüsyon. (B) fonksiyonel tahlil: IL4-10 füzyon protein doz bağımlı TNFα üretim LPS uyarılmış tam kan kültürü (kültürler uyarılmış LPS ile karşılaştırıldığında yüzde inhibisyon olarak ifade edilir) engeller. Verileri ortalama ± SD temsil edilen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : IL4-10 füzyon protein tarafından inflamatuar hyperalgesia inhibisyonu. Enflamatuar ağrı 20 µL % 2 alprazolzm (araba), intraplantar bir iğne ile akımıdır. Altı gün sonra intraplantar enjeksiyon fareler İntratekal enjeksiyonu (ok) 1 µg IL4-10 füzyon protein veya araç (PBS) aldı. (A)mekanik aşırı duyarlılık (günlük % 50 eşik (g)) kullanarak Von Frey test zaman içinde ölçülen ve (B) termal duyarlılık (gecikme süresi (s)) ölçülen Hargreaves testi kullanılarak. Verileri ortalama ± SEM yıldız önemli farklılıklar araç ve IL4-10 enjekte hayvanlar arasında iki yönlü ANOVA tarafından analiz temsil olarak gösterilir. **, *** p = < 0,01 ve p < 0,001, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : İltihap kaynaklı değişiklikleri ağırlık taşıyan. Enflamatuar ağrı 20 µL tam Freud'un adjuvan (CFA) intraplantar bir iğne ile akımıdır. Ağırlık her pençe üzerinde taşıyan dinamik ağırlık taşıyan aygıt kullanılarak ölçüldü. Etkilenen pençe (Ipsilateral arka pençe) gram içinde ağırlık taşıyan ve Etkilenmeyen paws (ön pençeleri ve kontralateral pençe) toplam ağırlığı taşıyan görüntülenir, diğer 3 pençeleri karşılaştırıldığında Ipsilateral pençe ağırlık taşıyan oranı yanı sıra. (A)tabii ki ağırlık taşıyan CFA kaynaklı enflamasyon sırasında (n = 10). (B) gün 7 intraplantar CFA sonra fareler İntratekal iğne 1 µg IL4-10 füzyon protein veya araç (PBS) aldı. Ağırlık taşıyan 0 ve 7 gün sonra intraplantar CFA ile 2 gün sonra Yönetim IL4-10 füzyon proteinin ölçüldü. Ağırlık taşıyan diğer 3 pençeleri karşılaştırıldığında Ipsilateral pençe ile temsil edilir (n = 3-4). Verileri ortalama ± SEM temsil edilen *** p = < 0,001; ** p = < 0,01; * p = < (0 gün) satır taban çizgisine göre 0,05. # p = < tedavi araç hayvanlara göre 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması yöntemleri için üretim ve rekombinant IL4-10 füzyon protein karakterizasyonu ve kalıcı enflamatuar ağrı fare modellerinde inflamatuar hyperalgesia inhibe onun etkinliğini test etmek için yöntemler açýklanmýþtýr. Üretim ve arıtma IL4-10 füzyon proteinin küçük bir ölçekte yapılır. Prokaryotik ifade sistemlerinde elde edilemez translasyonel modifikasyonlar etkinleştirmek çünkü protein üretim için bir ifade sistemi olarak HEK293 hücreler seçilir. Translasyonel modifikasyonlar protein işlevi için uygun olan ve tür değişiklikler yokluğu potansiyel olarak IL4-10 füzyon protein tedavi edici etkinliği etkileyebilir. Protein kültüründen süpernatant benzeşme Kromatografi tarafından saf. Şirket içinde yapılan IL4 karşı Monoklonal antikor benzeşme arıtma ve arıtma bir benzeşme etiket sistemi ile izin vermek için bir etiket içeren bir IL4-10 füzyon proteini üretmek için kullanmak seçtik. Bu etiket ile ilgili değişiklikler protein katlanması ve fonksiyon olasılığını önlemek için yapıldı. Çok seçici bir Monoklonal antikor eksik, yine de, bir protein ile bir etiket geliştirilen, örneğin gerekir bir onun etiketi. Bu durumda, C - ya da N-terminus protein protein işlevi etkilenmemesi etiket için en uygun olup olmadığını belirlemek önemli olacaktır.
1 l HEK293 süpernatant ile yaklaşık 3 mg arıtılmış IL4-10 füzyon protein elde edilir, ancak bu toplu iş toplu değişebilir. Sütun benzeşme arıtma atılmadan önce birkaç arıtma döngü için kullanılabilir. Arıtma yordam en hassas adımda IL4-10 füzyon protein sütuna göre düşük pH, elüsyon çünkü düşük pH geri dönüşü olmayan proteini denatürasyon ve protein yağış neden olabilir. Böylece, yerli protein yapısının bakım ve protein toplamları yokluğu kaliteli toplu işlemler için gereklidir. Bu amaçla, bioactivity füzyon proteinin değerlendirilmesi önce ve sonra arıtma ile farklı elüsyon tampon test vitro olması gerekiyor. Sonra arıtma IL4-10 füzyon proteinin bioactivity sigara saf protein ile karşılaştırıldığında sınırlı değil. Ayrıca, ne zaman elüsyon adım 0.1 M glisin arabellek ile gerçekleştirildi yok toplama oluşumu oldu (pH 2.5 =), ve elüsyon kesirler pH 1 M Tris arabellek ile hemen etkisiz hale (pH = 9).
Saf IL4-10 füzyon protein konsantrasyonu temelinde insan IL10 ELISA sonuçları tahmin edilmektedir. BCA protein tahlil protein konsantrasyonları doğrulamak için kullanılır. Kurtarma arıtma değerlendirilir sonra protein konsantrasyonları yük, akışı sayesinde, yıkama ve elüsyon kesirler IL10 ELISA tarafından ölçülen temel. IL4-10 füzyon protein BCA protein konsantrasyonu tayini sadece diyaliz elüsyon kesirler değerlendirilebilir. Sigara diyaliz elüsyon kesirler imidazole, BCA ölçüm etkiler bir bileşik içerir. Sigara saf kesirler HEK293 kültür ortamdan diğer proteinler içerir.
Bioactivity IL4-10 füzyon protein tayini bir tam kan tahlil gerçekleştirilir. Bioactivity IL4-10 füzyon proteinin fonksiyonel etkinlik korunup korunmadığını belirlemek için birkaç bağış tam kan içinde değerlendirilmelidir. LPS kaynaklı TNFα yayın etkisizleştirmek için IL10 ve IL4 kapasitesini donör-donör farkı var olduğundan birkaç bağış gereklidir. Ayrıca, IL4R ve IL10R ifadesi TNFα LPS kaynaklı üretim etkisizleştirmek için IL4-10 füzyon protein kapasitesini etkileyen bağışçılar arasında farklı olabilir.
Açıklanan yöntemleri 2 fare modelleri kalıcı enflamatuar ağrı acı içinde vivogidermek için IL4-10 füzyon proteinin etkinliğini değerlendirmek için ayrıntılı. Yine de, rekombinant füzyon protein analjezik potansiyelini tam değerlendirilmesi için molekülleri kronik ağrı de diğer modellerinde test edilmelidir. Bu modeller, bunlarla sinir hasarı ve kemoterapi kaynaklı nöropatik ağrı9,22modelleri için sınırlı değildir. Von Frey test ve Hargreaves testi genellikle analjezik ilaçlar test etmek için kullanılır, ancak ek bir testi (örneğin dinamik ağırlık taşıyan test) sigara uyarılmış ağrı behaviorsand ile de üzerindeki etkilerini değerlendirmek için dahil gereken açık hale gelmiştir operant ağrı tahlil (sigara uyarılmış ağrı davranışları17,18algılayan şartınaörneğin yer tercih (CPP)). Klima ağrı tarafından hayvanların (hangi etkileri daha az 15dk sarfetmek) hızlı oyunculuk analjezikler gerektirdiğinden CPP gerçekleştirmek için füzyon protein ağrı inhibe etkileri başlangıcı dikkate alınmalıdır. Bileşik test yavaş bir analjezik başlangıçlı varsa ancak uzun süreli ağrı inhibisyon (4 günden fazla) ikna etmek büyük olasılıkla yine de, CPP hala ağrı bileşik inhibe olup olmadığını sınamak için kullanılabilir. Bu durumda, bileşik kaynaklı kaybı Klima ile hızlı hareket analjezikler değerlendirilmek gerekir.
Bileşik dorsal kök gangliyon ve omurilik gibi ilgili alanlarda ağrı ulaşacak İntratekal enjeksiyonları yönetim, bir yol olarak seçilir. Özellikle İntratekal teslim analjezik ilaçların bu yaklaşım analjezik ilaç gerekli doz indirgeyerek kronik ağrısı olan hastaların tedavisi olarak yaygın bir uygulama haline gelmiştir ve toksisite ve sistemik yan etkileri azalır. Yine de, bu yönetim yolu bazı sınırlamalar vardır; iyi eğitimli personel gerektirir ve küçük subaraknoid boşluk nedeniyle enjeksiyon hacmi 5 µL farelerde, füzyon protein yüksek konsantrasyonlu çözümler gerektiren sınırlı olmalıdır. İntratekal enjeksiyonları teknik eğitim gerektirir. Bu eğitim olmayan kurtarma imzalat hayvan doğru İntratekal enjeksiyon doğrulamak için bir boya enjeksiyonu ile gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser parçası Utrecht Üniversitesi Yaşam Bilimleri tarafından finanse edilen hibe
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
