Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Abstract

ויטמינים ונוגדי חמצון המומלץ על ידי המחקר מחלת עיניים ז, אין אין טיפול יעיל עבור "יבש", או מנוונת הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) המייצגת 90% מהמקרים. טיפולים נדרשים כדי להאט או מפגר הפיתוח של אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי), להבנת הפתולוגיה ממברנה של ברוך הוא חלק מהתהליך הזה. שינויים בקרום של אדם ברוך להקדים את ההתקדמות של AMD בתרומה לחברה הנזק של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תאים. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד AMD, לשעבר vivo מודלים של בני ברוך האנושי של הממברנה לשמש כלי שימושי כדי ללמוד על אופן הפעולה של תאי RPE מ מונצחים, קווים התא הראשי, כמו גם קווי RPE נגזר גזע pluripotent המושרה תאים (iPSCs). כאן, אנו מציגים שיטה מפורט המאפשר אחד כדי לקבוע את ההשפעות של התנהגות התא RPE נזרע על explants ממברנה של ברוך האנושי שנקטפו מתורמים האנושי, כולל קובץ מצורף, אפופטוזיס, התפשטות, היכולת phagocytize קולט אור חיצוני מקטעים, הקמת קוטביות, ביטוי גנים. זה וזמינותו מספק מודל ex-vivo של הממברנה של ברוך בן כדי להעריך את המאפיינים פונקציונלי של תאי RPE כאשר נזרע על נחשף/יישון מטריצה חוץ-תאית.

Introduction

הקשורות לגיל שינויים מבניים הקרום של אדם ברוך, אשר נגרמת על ידי גורמים רבים, כולל nitrosative סטרס חמצוני, מפעילה מספר השפעות מזיקות על הפונקציה של הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) תאים ותורמת פתולוגיה של הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD)^{1,2,3,4,5,6,7,8,9} . כאשר שוקלים טיפול בתחליפי תא המתקדם AMD מנוונת או אטרופיה גיאוגרפית, טיפול סביר ידרוש את השתלת תאים על גבי מצע ניוון תאי RPE. שינויי גיל בתוך הממברנה של אדם ברוך עלולה להשפיע לרעה על ההצלחה של המושתלים שתלי תאי RPE, שגבה את הנזק^{10,11 9,6,}מטריצה חוץ-תאית ^{, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. האדם חקירת קרום ביולוגיה של ברוך ו כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה לתרום ההתקדמות ל AMD היא חיונית להבנת המחלה פתולוגיה. לפיכך, יש צורך החוקרים בשדה הקשורות לגיל העין לפתח פרוטוקולים המתארים vivo לשעבר קציר של הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך.

מבחינה היסטורית, מתקשים להפרעות הקשורות לגיל מודל כגון אטרופיה גיאוגרפית קרום של בני אדם ברוך חיות²³. הקושי נובע גורמים רבים כולל את תוחלת החיים של בני אדם לעומת מכרסמים ו מינים אחרים בשימוש תכוף עבור מידול המחלה, כמו גם חוסר macula רוב החולייתנים²⁴. היתרון של השיטה המתוארת במסמך זה הוא כי תאים יכול להיבדק ישירות על הממברנה של ברוך מופק פוסט מורטם עיניים של אנשים בגילאי ו/או חולה. המטרה הכוללת של מאמר זה היא לספק מתודולוגיה מפורט עבור מודל לשעבר vivo של גיל ו/או חולה אנוש ברוך של הממברנה, כולל ניתוקה של אדם ברוך של קרום explants מתורמים אנושי, זריעה של RPE תאים עבור ניסויים במורד הזרם. מודל זה יכול לשמש כמודל הרלוונטיים כדי לחקור את התרומה של מטריצה חוץ-תאית נזק ב RPE תא פתולוגיה ותפקוד^{20,25,26,27,28}.

Protocol

להלן כללי התנהגות מבוצעת המותרים של העקרונות את הצהרת הלסינקי והנחיות ועדת האתיקה במחקר האנושי אוניברסיטת ייל.

1. לחיזוי התורם האנושי עיניים

1. לקבל כדורי אדם תורם נבחרת מחלות מחקר מחלף (NDRI, פילדלפיה, PA). בהתאם הפרויקט, להכין לא פחות משלושה זוגות עיניים התורם לכל קבוצה ניסיונית.
2. Enucleate תורם עיניים בתוך 10שע, הספינה בתוך 48 שעות לאחר המוות. תחבורה ואז העיניים למעבדה של Dulbecco סטרילי ששונה נשר בינוני (DMEM) תרבות בינוני על קרח. בעבר דווח על מחקרים הראו כי העיניים התורם שנקטפו, מועבר בשמורת האופנה הזאת של תכונות ביולוגיות ופעילויות של^26,25,ממברנה של ברוך²⁹.

2. קציר של הממברנה של אדם ברוך Explants

1. המקום כל עין על 1.5 x 1.5 אינטש גזה ספוגה פחמן דו-חמצני תלויית מדיה DMEM מאכל תרבות 100 מ מ, ולאחר שימוש במספריים להב בסדר לעשות חתך דרך sclera 3 מ מ אחורי לימבוס והארכת circumferentially בשני הכיוונים.
2. להפוך את ישבנה 1 מ מ מלא-עובי החתך במבניו (חדירה על הזגוגיות) אורה serrata. להסיר ולמחוק את המקטע הקדמי (קרנית, עדשה, איריס), הזגוגיות רשתית.
3. השתמש בסדר מספריים כירורגיים לעשות ארבעה חתכים רדיאליים sclera ועד דמית העין, ולקלף את sclera מן הפריפריה אל עצב הראייה, תוך דאגה להימנע קריעת הקרום של דמית העין/ברוך מורכבים.
4. בשלב הבא, עושים חתך במבניו בחלל suprachoroidal לאורך אורה serrata ולהתקלף מתחם של ברוך-RPE ממברנה-שכבה דמית posteriorly מ sclera.
5. להסיר תאי RPE מקורי על ידי רחצה את explant עם מ' 0.02 נקודות אמוניה מימית בתוך של Dulbecco באגירה פוספט תמיסת מלח (DPBS) בפוליסטירן 60 x 15 מ מ צלחת פטרי במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחריה שטיפה 3 - פעמים ב- DPBS (איור 1).
6. לרחף ממברנה explant של ברוך מורכבות בתקשורת ללא פחמן דו-חמצני מעל קרום טפלון 65 מיקרומטר בעובי unlaminated, הידרופוביות עם 0.2 µm נקבוביות, עם השכבה פרופריה הבזליים של כל explant מול הקרום.
7. במקום קרום טפלון עם explant ממברנה של ברוך על זכוכית fritted תמיכה במערכת מסנן ואקום-מחזיק microanalysis זכוכית.
8. לשטח את הקצוות מסולסל בצד חיבור עם מלקחיים בסדר מצופה טפלון, מטפל לא לגעת בצד laminin הבזליים ממברנה של ברוך.
9. מחממים 15 מ"ל של agarose (4% ב- DPBS), ואז את תירגע עד 37 מעלות צלזיוס. ואז שופכים 15 מ"ל של הג'ל liquidized אל מתחם ממברנה-דמית העין של ברוך מן הצד-חיבור תוך יישום יניקה עדינה כדי להבטיח כי explant יישאר שטוח. שמור את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות לחזק את agarose, ולקלף קרום טפלון משם.
10. המקום explant של ברוך ממברנה (1.5 סנטימטרים בקוטר בתוך ג'ל agarose הקרושה) 60 x 15 מ מ תא פוליסטירן תרבות בכלי (עם הממברנה של ברוך פונה כלפי מעלה) מצופה agarose נוזלים חמים בתחתית הצלחת לתקן את הממברנה של ברוך explant בתחתית הבאר עם השכבה laminin הבזליים explant פונה כלפי מעלה.
11. Agarose יחזק בתוך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לייצב explants של ברוך ממברנה בצלחת תרבות. כיסוי הקרום של ברוך explants בתרבות צלחת עם DPBS ולאחסן את המנה ב 4 ° C לשימוש עתידי. איור 2A מדגים שהממברנה של ברוך מבודד explants בצלחת תרבות 60 x 15 מ מ.
12. אם מערכת התרבות הרצויה בצלחת 96-ובכן, במקום explant של ברוך ממברנה (1.5 סנטימטרים בקוטר עם ג'ל agarose הקרושה) על גיליון טפלון שטוחה עם הצד laminin למעלה.
13. שימוש של trephine, לחתוך, חמש או שש הכפתורים 6 מ ממעגלי הממברנה של ברוך מורכבת explant, במקום אחד על agarose 4% בגיל 37 מעלות צלזיוס פוליסטירן שאינם מטופלים היטב של צלחת 96-ובכן. Agarose יחזק בתוך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את הממברנה explants של ברוך (לחצנים) על החלק התחתון של כל טוב.
    הערה: איור 2B מדגים לחצנים של ברוך trephined ממברנה בצלחת 96-ובכן. בדרך כלל, 9-11 כפתורים או explants ניתן לקצור מכל עין.

3. culturing של הפיגמנט ברשתית תאי אפיתל (RPE) על הממברנה של אדם ברוך Explants

1. עם קבלת בעיניים תורם, לנקות את הרקמה extraocular עם DPBS. עושים חתך במבניו 5 מ מ מתחת איריס-בסקלרה לגעת בנקודה (pars plana) לחלל subretinal. למחוק את מקטע קדמי נוזל זגוגי, רשתית העין.
2. לשטוף את עיינית, אשר מכיל ממברנה של ברוך RPE גיליון, עם DPBS קר. מביצועם תאי RPE עם 5 מ של טריפסין 0.25% לא יותר מ- 10 דקות עבור כל דגימה העין. להרוות את תגובת טריפסין 25 מ ל DMEM בינוני מלא עם 15% עוברית שור סרום (FBS) להתחמם ב- 37 מעלות צלזיוס ב שפופרת 50 מ.
3. Centrifuge התאים ב- 200 גרם × 10 דקות ב 24 ° C, ו- resuspend בגדר ב 5 מ של בינוני מלא DMEM (עם 15% FBS).
4. לספור את התאים ואת הזרעים 15,000 תאי RPE קיימא על הנדן הבזליים של קרום explants של כל שונים בני ברוך (לחצנים) לתוך צלחת 96-ובכן ב- µL 200 אמצעי חיוני ללא סרום מינימלי (מאמ) המכיל אנטיביוטיקה (100 IU/mL פניצילין G, 100 מ ג / mL סטרפטומיצין, גנטמיצין 5 מ"ג/מ"ל ו- 2.5 מ"ג/מ"ל המפוטריצין). בהנחה תא בקוטר של 20 מיקרומטר, ציפוי על צפיפות זו תאפשר תאי RPE לכסות כ- 15% של שטח ציפוי.
5. צלחת את התאים על גבי הלחצן, לפיה צפיפות התאים ואז ניתן להגדיל stepwise כדי 100% הנהרות בהתאם להשפעה של כל פרמטר בהתנהגות התא.
6. לאפשר את התאים לצרף explant במשך 24 שעות ביממה באווירה humidified של 95% air/5% CO₂ ב 37 º C. בעדינות לשנות בינוני עם חמים DMEM מלאה.

Representative Results

כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, ניתן לקבוע את ההשפעות של הקרום של גיל ו/או חולה אנוש ברוך על תפקוד תאי RPE בהקמת קוטביות מחסום הדם החיצוניים ברשתית, מקוטב הפרשת ציטוקינים, וגורמי צמיחה phagocytosis קולט אור רוד מקטעי החיצוני.

יש לנו שנוצר נתונים הממחישים הפנוטיפ המחלה על הממברנה של ברוך בן אדם. לדוגמה, culturing תאי RPE בן ממברנה explants ירידות RPE תא reattachment של אדם ברוך (איור 3). תאי RPE תרבותי על הממברנה של ברוך בן אדם מקטין את היכולת של תאים אלה phagocytize רוד מקטעי החיצוני (ROS), פונקציה קריטית RPE (איור 4). יתר על כן, מוות התאים יכול להיות מזוהה, נערכת השוואה בין אלה explants לחצן באמצעות מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז dUTP ניק תיוג-סוף (TUNEL) כתם כפי שמתואר עבודה קודמות²⁶. השפעת הקרום של גיל ו/או חולה אנוש ברוך על פרופיל ביטוי גנים תא RPE יכול להיקבע microarray בטכנולוגיה. הראו כי ביטוי גנים תאי RPE משתנה כאשר תרבותי על הממברנה של אדם ברוך מאנשים מבוגרים לעומת explants של יחידים (איור 5) הצעיר²⁷. לשם ניתוח סטטיסטי, explants מתורמים האדם לפחות 3-5 משמשים לכל קבוצה.

איור 1. ייצוג סכמטי של הבידוד של הממברנה של ברוך האנושי מעיניה התורם. הממברנות של אדם ברוך נקצרים על-ידי הסרת את sclera מקטע קדמי, רשתית, הזגוגיות, יליד רשתית פיגמנט אפיתל (RPE) תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. מבודד ממברנה של אדם ברוך (מוניטור) בקערה תרבות. (א) סכמטית ממברנה explants של אדם ברוך (כל 1.5 אינץ ' קוטר, עם ג'ל agarose הקרושה) להציב אותם × 60 15 מ מ תא פוליסטירן תרבות מאכל (מוניטור פנים למעלה) מלא חמים agarose נוזלי על החלק התחתון של המנה. (B) הממברנה explant של ברוך האנושי זה יש כבר trephined לתוך על כמה כפתורים עגולים 6 מ מ (explants), כל אוו אשר היה ואז להניח אותה על 4% agarose-37 מעלות צלזיוס פוליסטירן שאינם מטופלים היטב של צלחת 96-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תא reattachment שיעור על הממברנה של צעירים ומעלה אנושי ברוך (מוניטור). תאי RPE העיקרי היו נזרע על האדם הממברנה של ברוך explants הצעירים (< בת 50, n = 3) ומעלה (> בת 70, n = 5) התורם העיניים במשך שלושה שבועות. קצב התאים מצורף נמדדה על ידי MTT תא הכדאיות וזמינותו. הממברנות של ברוך אדם מבוגר מופחת הקצב המצורף תאי RPE בשיעור של 24% (100 צעירים מוניטור + /-8.54 S.E. לעומת מבוגר 76.65 מוניטור + /-1.44 S.E.). p < S.E. 0.05, = שגיאה סטנדרטית.

באיור 4. Phagocytosis תא (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית מושפע לגיל הממברנה של ברוך האנושי (מוניטור). ראשי תאי RPE תרבותי על אדם מבוגר הממברנה של ברוך explants היה בעל יכולת מופחתת כדי phagocytize רוד מקטעי החיצוני (ROS) (873 צעיר מוניטור + /-9.3 S.E., n = 5 לעומת 608 בוגרים מוניטור + /-25.4 S.E., n = 5). p < S.E. 0.01, = שגיאה סטנדרטית.

איור 5. מספר רשתית פיגמנט אפיתל (RPE) תא גנים ביטוי בכל מדגם תרבותי על צעירים או הקרום בוגרים ברוך האנושי של explants. היה פיזור נוסף במספר גנים ביטוי ראשי תאי RPE נזרע על בוגרים לעומת הממברנה הצעיר ברוך האנושי של (± 6201 388 לעומת 6439 ± 80, בהתאמה); explants חמש נבדקו עבור כל קבוצת גיל. הציג באישורו המלא של כל המחברים של קאי, H ואח. ²⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הממברנה בן ברוך האנושי של (מטריצה חוץ-תאית) תורמת התקדמות המחלה של AMD, ולכן יש צורך להבין כיצד שינו מטריצה זו תורמת בתפקוד תאי RPE. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד שינויי גיל ב- AMD, שמחוץ מערכות מודל המחקים את ההשפעות של המחלה יכול לשמש כלי חשוב להבין הפתופיזיולוגיה. המתודולוגיה המתוארת בכתב היד ניתן לבודד האנושי explants הממברנה של ברוך ואת התרבות RPE תאים, כולל ראשי מונצחים, קווים, או נגזר תאי RPE תא באופן עקבי.

כפי שהוזכר קודם לכן, explants ממברנה של אדם ברוך הטרייה של NDRI. פרוטוקול נוסדה עם NDRI אשר מציינת על הקריטריונים שהוגדרו עבור התורם עיניים להיות מקובל. לדוגמה, תורמים כנראה אין מחלות עיניים ברשתית מוכר, העיניים/גלובס מאוחזרות בתוך 10 h לאחר המוות, גלובס מגיעים במעבדה בתוך 48 שעות לאחר המוות (באמצעות משלוח החבילה לילי על קרח). ציין את טווח הגילאים המתאים ואת מספר העיניים הדרושים לניתוח סטטיסטי של המחקר, למשל., חמישה זוגות של גלובס מתורמים בין הגילאים 20-49 שנים עד חמישה זוגות גלוב מתורמים בין הגילאים 50-89 שנים.

הזמינות של גלובס העין משתנה, בדרך כלל ממוצע של עשרה זוגות של גלובס זמין בכל חודש. החבילה העין מגיע עם מידע בסיסי, שזוהה מבטל את התורם: גיל, גזע, שעת המוות, סיבת המוות, ותתדרך העבר הרפואי (פירוט מחלה או מחלות רקע).

והכי חשוב, קציר ממברנה explants של אדם ברוך דורש את ההסרה של המקטע הקדמי של העין, הזגוגיות, המאפשר הבידוד של קומפלקס ממברנה-דמית העין של RPE-ברוך. ברגע קרום של ברוך מבודד, תאי RPE יכול להיות נזרע על גבי explants acellular בריכוזים שונים, תרבותי לניסויים במורד הזרם. הכנה וטיפול פרוצדורלי כמתואר להלן הוא קריטי, תשומת לב הכיוון של הממברנה של ברוך מבודד כדי לוודא כי המשטח laminal הוא שפונה למעלה תוך כדי לא לגעת במשטח מכנית כדי למנוע נזק מטריצה חוץ-תאית מבנה פני השטח.

יש גם לציין כי בעת שימוש ממברנה explant מערכות של ברוך, ישנם משתנים מסוימים אשר עשויים להשפיע על תוצאות ניסויים במורד הזרם כגון רקע גנומית התורמים, לגיל קרום של ברוך, או שעה לאחר המוות של ברוך ממברנה, ואת המיקום של הממברנה של ברוך, כלומר., מרכזי או היקפי חלק explants ממברנה של ברוך. כמו עם כל המחקר רקמות אנושיות אחרות, אחד לגייס את המספר דוגמת עין התורם המתאים יש את הכוח סטטיסטית הצורך ולהתאים גיל עין התורם במידת הצורך. קביעת קריטריונים מחמירים על קבלת העיניים מבנקים העין הוא פרמטר קריטי. לקבל רק העיניים זה הם enucleated לאחר המוות פחות מ 10 h ואשר ניתן לקצור הכנה ממברנה של ברוך בתוך 24-48 שעות לאחר המוות. האתר עצב הראייה יכול לשמש כסמן לאוריינטציה, ולהשתמש באותם המיקומים עבור ניסיוני ולשלוט קבוצות לימוד. על-ידי נקיטת אמצעים אלה, אחד יכול למזער את השתנות ניסיוני.

לסיכום, ההבנה של ברוך-RPE את מתחם דירות ממברנה-דמית העין, איך זה מושפע הגיל ומחלות חיוני להבנת תרומתה הפתופיזיולוגיה של AMD. דגם מערכות שמעסיקים שמחוץ טכניקות הן כלי חשוב לחקור תופעות אלה באמצעות רקמה אנושית. במסמך זה, אנו מתארים מתודולוגיה מעסיקה explants התורם האנושית כמודל הרלוונטיים vivo לשעבר של הממברנה של ברוך בן. טכניקה זו מאפשרת להשתמש ממברנה בגילאי ו/או חולה אנוש ברוך של כלי מחקר כדי לחקור כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה יכול להשפיע על-ידי כיסוי RPE בהתנהגות התא כולל ביטוי של קובץ מצורף, התפשטות, ג'ין-^{25 , 27}. פיתוח מוצלח של ex-vivo דגם מערכות דומות לקדם את ההבנה שלנו של AMD וכדי להקל על הפיתוח של הרומן אפשרויות טיפוליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human donor globes	National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995-065
Carbon-dioxide independent media	Thermo Fisher Scientific	18045-088
60-mm polystyrene petri dish	Corning Inc.	351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores	Merck Millipore	JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system	Thermo Fisher Scientific	09-753-102
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576-5G
35 × 10mm culture dish	VWR International	25373-041
Trephine	Accutome	AM0570 60
96 well plate	Corning Inc.	3595
Minimum essential media (MEM)	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032-1MU
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1914
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	1336-21-6