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Developmental Biology

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

doi: 10.3791/57084 Published: April 12, 2018

Summary

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

Abstract

비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, "건조" 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.

Introduction

나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리 . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.

역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물23세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추24에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리20,25,26,,2728에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.

Protocol

다음 프로토콜은 헬싱키의 선언 및 예일 대학 인간 연구 윤리 위원회 지침의 신조를 준수에서 수행 됩니다.

1. 인간 기증자 눈 소싱

  1. 국가 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, 펜 실바 니 아)에서 인간 기증자 글로브를 얻습니다. 프로젝트에 따라 각 실험 그룹 기증자 눈의 이상 3 쌍을 준비 합니다.
  2. 10 h 이내 기증자 눈 및 48 h 사후내 배 enucleate. 그런 다음 눈 살 균 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 문화 매체 얼음에 있는 실험실을 전송 합니다. 이전 보고 연구 기증자 눈 수확 및 생물 학적 기능 및 Bruch의 막25,,2629의 활동이 패션 보존에 이송 증명 하고있다.

2. 인간의 Bruch 막의 수확 Explants

  1. 1.5 x 1.5 인치 거 즈에 각 눈 적셔 100mm 문화 접시에 후부는 limbus sclera 3mm 통해 절 개를 만들기 위해 사용 잘 블레이드가 위 이산화탄소 독립적인 DMEM 미디어와 원주 어느 방향으로 확장 하는 장소.
  2. 확인 또는 참나무에 전체 두께 원주 절 개 (유리를 관통) 1mm 후부. 제거 하 고 이전 세그먼트 (각 막, 렌즈, 및 홍 채), 유리 체 및 망막을 삭제.
  3. 미세 수술가 위 공 막 엔, 맥락 막, 사이 4 개의 방사형 절 개를 사용 하 여 하 고을 피하기 위해 복잡 한 맥락 막/Bruch 막 끊어지고 돌보는 동안 시 신경에 주변에서 공 막 엔 껍질.
  4. 다음, ora 참나무 따라 suprachoroidal 공간을 통해 완곡 한 절 개를 확인 하 고는 sclera에서 뒤로 RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한 껍질.
  5. 0.02 M Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 DPBS (그림 1)에서 3 시간을 세척 하 여 다음 실 온에서 20 분 페 트리 접시에에서 수산화 암모늄을 explant 목욕 여 네이티브 RPE 세포를 제거 합니다.
  6. Unlaminated, 소수 성 65 µ m 두께 소계 막 막 직면 각 explant의 기저 lamina 레이어와 0.2 µ m 숨 구멍을 통해 이산화 탄소 자유로운 매체에 Bruch의 막 복잡 한 explant 부동.
  7. 유리 microanalysis 진공 필터 홀더 시스템에 Bruch의 막 explant와 소계 막을 유리 fritted 지원에 놓습니다.
  8. 미세 집게를 Bruch의 막 기저 laminin 측면을 건드리지 않도록 돌보는 테플론으로 코팅을 안 쪽에서 컬된 가장자리를 평평.
  9. Agarose DPBS (4%)의 15 mL를 열 및 다음 37 ° c 냉각 그럼는 explant 평면 유지 됩니다 보장 하기 위해 부드러운 흡입을 적용 하는 동안 안 쪽에서 Bruch의 막-맥락 막의 복잡 한에 liquidized 젤의 15 mL를 붓는 다. 2-3 분 하는 agarose를 공고히 하 고 다음 소계 막 떨어져 껍질 4 ° C에서 조직 유지.
  10. Bruch의 막 explant (응고 agarose 젤에서 직경에 있는 1.5 인치) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 셀 문화 접시에 (Bruch의 막 위로 향하도록)으로 늘어서 되었습니다 따뜻한 액체 agarose Bruch의 멤브레인을 해결 하기 위해 접시의 하단에 있는 장소 향하도록 explant 기저 laminin 레이어와 explant 우물의 바닥에.
  11. agarose Bruch의 막 explants 문화 접시에 안정화를 위해 상 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. Bruch의 막 문화에서 explants 커버 DPBS와 접시와 미래 사용을 위한 4 ° C에서 접시를 저장 합니다. 그림 2A 격리 Bruch 막 explants는 60 x 15 m m 문화 접시에 보여 줍니다.
  12. 96 잘 접시에 원하는 문화 시스템 있으면 최대 Bruch의 막 explant (1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤) laminin 사이드와 평면 테 플 론 시트에 놓습니다.
  13. 5 또는 6, 인하는 판형을 사용 하 여 복잡 한 Bruch의 막에서 6 mm 원형 버튼 explant 고 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 각각 4 %agarose 장소. agarose 각 우물의 바닥에 Bruch의 막 explants (버튼)를 해결 하기 위해 실 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다.
    참고: 그림 2B 는 96 잘 접시 trephined Bruch 막 단추를 보여 줍니다. 일반적으로 9-11 단추 또는 explants 각 눈에서 수확 될 수 있습니다.

3. 인간의 Bruch 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 배양 Explants

  1. 기증자 눈을 접수 한 후, 청소와 DPBS extraocular 조직. 완곡 한 절 개를 아이리스 sclera 아래 5mm subretinal 공간에 포인트 (동위 플) 터치를 확인 합니다. 이전 세그먼트, 유리 체 및 망막을 삭제 합니다.
  2. Bruch의 막과 차가운 DPBS RPE 시트 포함 아이피 워시. 각 눈 샘플 10 분 보다는 더 이상에 대 한 0.25 %trypsin 5 mL와 RPE 세포 분열 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 50 mL 튜브에 37 ° C에서 예 열 된 DMEM 완전 한 매체의 25 mL로 trypsin 반응을 끄다.
  3. 24 ° C에서 10 분 동안 200 × g에서 세포를 원심과 DMEM 완전 한 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (15 %FBS).
  4. 셀을 계산 하 고 각 다양 한 세 Bruch 막 explants (버튼) 혈 청 무료 최소 필수 미디어 (MEM)의 200 µ L에서 96 잘 접시에 항생제를 포함의 기저 lamina 에 15000 가능한 RPE 세포 씨앗 (100 IU/mL 페니실린 G, 100 mg / mL 스, 5 mg/mL gentamicin, 그리고 2.5 mg/mL 암포 B). 가정 셀 직경 20 µ m,이 밀도에서 도금의 도금 면적의 약 15%를 커버 하는 RPE 세포 수 있습니다.
  5. 그것에 의하여 셀 밀도 수 있습니다 다음까지 증가 시킬 stepwise 셀 동작에 각 매개 변수의 영향에 따라 100% 합류 하는 버튼에 셀 접시
  6. 37 ° c.에 95% air/5% CO2 의 습도 분위기에서 24 h explant 연결할 셀 허용 부드럽게 따뜻한 완벽 한 DMEM과 매체를 변경 합니다.

Representative Results

이 프로토콜 제대로 수행 되 면 하나 극성 및 외부 혈액 망막 방 벽의 설립, 성장 인자, cytokines의 편광된 분 비에 의해 RPE 세포 기능에 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 확인할 수 있습니다. 그리고 포토 리셉터 막대 외부 세그먼트의 식 균 작용입니다.

우리 세 인간의 Bruch 막에 질병 표현 형을 설명 하는 데이터를 생성 했습니다. 예를 들어 인간의 Bruch 막 explants 감소 RPE 세포 뚝 (그림 3) 세에 RPE 세포 배양. 세 인간의 Bruch 막에 경작 하는 RPE 세포 감소 수 이러한 세포의 phagocytize 막대 외부 세그먼트 (선생님), RPE는 중요 한 기능 (그림 4). 또한, apoptotic 세포 확인 하 고 이전 작업26에 설명 된 대로 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 얼룩을 사용 하 여 이러한 버튼 explants에 비교 될 수 있습니다. RPE 세포 유전자 표현 프로 파일에는 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 microarray 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 젊은 개인 (그림 5)27explants에 비해 더 오래 된 개인에서 인간의 Bruch 막에 경작 하는 경우 RPE 세포 유전자 발현 변경 설명 했다. 통계 분석을 위해 적어도 3-5 인간 기증자에서 explants는 그룹 당 사용 됩니다.

Figure 1
그림 1입니다. 기증자 눈에서 인간의 Bruch 막의 절연의 도식 대표. 인간의 Bruch 막 sclera, 앞쪽 세그먼트, 망막, 유리 체, 제거 하 여 수확 하 고 네이티브 망막 안료 상피 (RPE) 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 인간의 Bruch 막 (BM) 문화 접시에 절연. (A) 인간의 Bruch 막 explants (각 1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤)의 회로도에 배치 60 × 15 mm 폴리스 티 렌 셀 문화 접시 (BM 보여지는) 접시의 하단에 따뜻한 액체 agarose로 가득. 몇 가지 6mm 원형 단추 (explants)에 trephined은 (B)는 인간의 Bruch 막 explant 각 유량을 다음에 배치 되었다 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 4 %agarose. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 젊고 더 오래 된 인간의 Bruch 막 (BM)에 뚝 속도. 기본 RPE 세포 인간 Bruch의 막 영에서 explants에 시드 했다 (< 50 세, n = 3) 이상 (> 70 세, n = 5) 3 주 동안 기증자 눈. 세포 부착 속도 MTT 세포 생존 능력 분석 실험에 의해 측정 되었다. 더 오래 된 인간의 Bruch 막 RPE 세포 부착 속도 24% 감소 (젊은 BM 100 8.54 + 1.44 + 이전 BM 76.65 대 남동 남동). p < 0.05, 남동 표준 오류 =.

Figure 4
그림 4입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 먹어서 인간의 Bruch 막 (BM)의 나이 의해 영향을 받습니다. 기본 RPE 세포 이전 인간 Bruch의 막 explants에 경작 했다 감소 수 막대 외부 세그먼트 (선생님) phagocytize (9.3 + 젊은 BM 873 남동, n = 25.4 + 이전 BM 608 대 5 남동, n = 5). p < 0.01, 남동 표준 오류 =.

Figure 5
그림 5입니다. 수가 망막 안료 상피 (RPE) 셀 유전자 영에 경작 하는 각 샘플에 표현 또는 이전 인간의 Bruch 막 explants. 거기에 시드 기본 RPE 세포에 표현 된 유전자의 수에 더 많은 피해를 했다 젊은 인간의 Bruch 막 대 이전 (6201 ± 388 6439 ± 80, 대 각각); 5 explants는 각 연령 그룹에 대 한 테스트 되었습니다. Cai의 모든 작가의 전체 권한 함께 제시 H . 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.

앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.

눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.

가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.

또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.

요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식25 셀 동작 , 27. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.

Disclosures

작가의 아무도 어떤 상업적인 공개 선언 하 있다.

Acknowledgments

이 연구는 망막 퇴행 성 질병 기초 싸우는 장 님에 대 한 방지 실명, 뉴욕, www.rpbusa.org, 및 더 큰 뉴욕 센터 연구에 의해 지원 됩니다 www.blindness.org. 저자는 Luanna 바르 톨 로메 오, 박사,이 원고에의 그녀의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human donor globes National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995-065
Carbon-dioxide independent media Thermo Fisher Scientific 18045-088
60-mm polystyrene petri dish Corning Inc. 351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores Merck Millipore JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system  Thermo Fisher Scientific 09-753-102
Agarose Sigma-Aldrich A2576-5G
35 × 10mm culture dish VWR International 25373-041
Trephine Accutome AM0570 60
96 well plate Corning Inc. 3595
Minimum essential media (MEM)  Thermo Fisher Scientific 11095-080 
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032-1MU
Streptomycin Sigma-Aldrich S6501
Gentamicin Sigma-Aldrich G1914
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 1336-21-6
 

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References

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세 인간 Bruch 막의 <em>Ex Vivo</em> 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양
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Cai, H., Gong, J., Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Fields, M. A. Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane. J. Vis. Exp. (134), e57084, doi:10.3791/57084 (2018).More

Cai, H., Gong, J., Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Fields, M. A. Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane. J. Vis. Exp. (134), e57084, doi:10.3791/57084 (2018).

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