Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد في أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

نقدم هنا البروتوكولات تخطيط صدى القلب للحصول على الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لقلب ينبض من السمندر أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)، أنواع نموذجية في إنعاش القلب. تسمح هذه الأساليب لتقييم وظيفة القلب بدقة عالية الزمانية المكانية الطولية.

Abstract

قصور القلب نتيجة مرض القلب الاقفاري يشكل تحديا رئيسيا، والعلاجات التجديدي للقلب في ارتفاع الطلب. عدد قليل من أنواع نموذجية مثل الزرد والوزغ قادرة على إنعاش القلب الجوهرية تبشر بمستقبل العلاجات التجدد للمرضى البشر. لتقييم نتائج تجارب كارديوريجينيراتيفي من المحتم أنه يمكن رصد وظيفة القلب. سلمندر axolotl (A. ميكسيكانوم) تمثل أنواع نموذجية راسخة في البيولوجيا التجدد بلوغ الأحجام التي تسمح لتقييم وظيفة القلب. والغرض من هذا البروتوكول إنشاء طرق لتكاثر قياس وظيفة القلب في أكسولوتل استخدام تخطيط صدى القلب. هو أظهر تطبيق المسكنات المختلفة (البنزوكائين ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 بروبوفول)، ويرد وصف للحصول على بيانات مشخصين (2D) ثنائي الأبعاد في أكسولوتلس تخديره وأونانيسثيتيزيد على حد سواء. تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد للقلب (3D) ثلاثي الأبعاد يمكن أن تعاني من عدم الدقة والموضوعية من القياسات، والتخفيف من حدة هذه الظاهرة طريقة متينة، إلا وهي تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة، لقياس وتقليل هذا التحيز تظاهر. وأخيراً، يرد وصف طريقة الحصول على بيانات مشخصين 3D القلب axolotl الضرب بدقة عالية للغاية الزمانية المكانية ومع تباين الدم إلى الأنسجة وضوحاً. عموما، ينبغي توفير الوسائل اللازمة لتقييم وظيفة القلب وتشريح النموذج هذا البروتوكول، وتدفق الديناميات في أكسولوتل استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مع التطبيقات في علم الأحياء التجدد والتجارب الفسيولوجية العامة.

Introduction

مرض القلب الاقفاري سبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1،2. على الرغم من أن العديد من البقاء على قيد الحياة من احتشاء عضلة القلب بسبب التدخل الطبي السريع وصقلها، الحوادث الدماغية في البشر غالباً ما تؤدي إلى ندبات تليفية المرتبطة بتضخم وعطل كهربائي، وتناقص قدرة وظيفية للقلب . وهذا الافتقار إلى إمكانات التجدد أنسجة القلب مشترك بين الثدييات ورغم المطالبات المثيرة للجدل لإنعاش القلب الثدييات، هذه كانت محدودة لسلالات مورين محددة3،4 و نقص يعامل الفئران5. وهكذا، ميدان البيولوجيا والطب التجديدي القلب يقتصر عموما على غير الثدييات نماذج حيوانية دراسة الظواهر التجدد قلب الجوهرية. الزرد (دانيو rerio) أنشئت في العقد الماضي نموذجا تتسم معظم جيدا للقلب الذاتية التجدد6،،من78،9،10 . سبب مختبر سهلة الصيانة، وقت جيل قصيرة ومجموعة واسعة من الأدوات الجزيئية المتاحة، الزرد تكييف كنموذج للآليات الوراثية والجزيئية التي ترتكز عليها التنمية القلب والتجدد. ومع ذلك، بالأبعاد الدقيقة لقلب الزرد جعله أقل ملاءمة للتقييم الوظيفي، والإجراءات الجراحية المعقدة ونسأله غير تيترابود من الزرد حدود المعقول استقراء النتائج التي توصل إليها في هذه الأنواع، وبالتالي تبرير استخدام نماذج tetrapod أخرى أكبر. وكان من نماذج أقرب من قلب الفقاريات التجدد من البرمائيات كودات، نيوت الشرقية (فيريديسسينس نوتوفثالموس)11، وأنواع التي ما زال نموذج قيمة12.

في السنوات الأخيرة آخر كودات البرمائية، أكسولوتل المكسيكية (A. ميكسيكانوم) قد دخلت الساحة ككبير (يصل إلى 100 جرام جسم الجماعي) والغاية مختبر قابلة للتكيف الحيوان نموذج لمجموعة واسعة من التخصصات التجدد التي تغطي التجدد أطرافهم، إصابة الحبل الشوكي، وإنعاش القلب13،،من1415،،من1617. Axolotl عالية قابلة للقياسات الوظيفية على القلب باستخدام تخطيط صدى القلب عالية التردد وغياب الهياكل متكلسة في الجانب البطني من القلب يسمح للتصوير بمستوى أقل بكثير من الصورة التحف (الصوتية بالموجات فوق الصوتية التظليل وصدى خاصة) مما لوحظ في الحيوانات النموذجية الأخرى مع متكلسة القص والاضلاع.

البروتوكول التالي توضح هذه المقالة العديد من الأساليب المختلفة والأعمال التحضيرية (الشكل 1و الشكل 2) للحصول على قياسات مشخصين استنساخه على القلب أكسولوتل في كلا تخديره (تطبيق المسكنات المختلفة الثلاثة: البنزوكائين ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 بروبوفول) وأونانيسثيتيزيد الحيوانات في اثنين (الشكل 3، الرقم 4، الرقم 5، الرقم 6، و الرقم 7، و ملفات تكميلية 1-12)، وثلاثة (الرقم 8، الرقم 9، ملفات تكميلية 13-14) الأبعاد المكانية. قلب البرمائيات ثلاث غرف (اتريا اثنين ومن طين واحدة). الاذينين هي توفرها وريدية الجيوب الأنفية كبيرة، ويصب البطين في المسالك تدفق السالكة كونوس (الشكل 2). حيث ينصب معظم التركيز تقليديا على التجدد البطين وبدرجة أقل على الانتعاش من الاذينين6،7،،من89،،من1011 , 12 , 14 , 17، هذا البروتوكول يركز أساسا على قياسات لوظيفة البطين.

تخطيط صدى القلب البرمائية ليس وصف جيدا في الأدب، وتطوير الأساليب 2D المذكورة في هذه الورقة يكون مدفوعا بالحاجة إلى تمثيل أفضل وظيفة القلب axolotl الضرب في وقت معين والإعداد التجريبية. وهكذا، الأساليب الموصوفة هنا المطبقة في التجارب التجديدية القلب حيث يمكن مراقبة وظيفة القلب مرارا وتكرارا على مدى عملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الأساليب المطبقة في التجارب كارديوفيسيولوجيكال في أكسولوتل بصورة عامة أو تعديل طفيف تمتد إلى نماذج البرمائية كودات أو أنوران أخرى (e.g.,Xenopus). أكسولوتل موجود في العديد من سلالات مختلفة وتباين الألوان (مثلاً، wildtype، ميلانويد، أبيض، ألبينو، الأبيض المحورة وراثيا مع تعبير البروتينات الفلورية الخضراء)، ولكن هذه الخصائص لا تؤثر على التوافق أكسولوتل مع بروتوكول وصف. الأسلوب الموصوفة هنا الحصول على بيانات مشخصين 3D نسخة معدلة من تقنية الارتباط (الإدامة) صورة الزمانية المكانية المتقدمة بالموجات فوق الصوتية السريرية والدرجة الثانية متوسط الطريقة الموصوفة سابقا في الدجاج النامي إلى تعزيز الإشارة الواردة من تلامس الدم في الأنسجة الرخوة في الأنواع التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء المنواه18،19. هذا الأسلوب يسمح للنمذجة المتقدمة انقباض القلب وديناميات السوائل محسوب في قلب أكسولوتل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت الإجراءات المضطلع بها في هذا البروتوكول وفقا للتشريعات الوطنية الدانمركية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتجارب التي أقرها "المفتشية التجارب الحيوانية الوطنية الدانمركية" (بروتوكول # 2015-15-0201-00615).

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد axolotl المتوسطة.
    1. تطبيق ماء الصنبور عالية الجودة غير كيميائيا يعامل كوسيلة أكسولوتل. إذا كان هذا غير متوفر، تطبيق الحل 40% هولتفريتير.
    2. إعداد حل 40% (wt/المجلد) هولتفريتير بتذويب 15.84 ز كلوريد الصوديوم وز 0.54 كاكل2·2H2س ز 1.11 مجسو4·7H2س ز 0.288 بوكل في المياه التي تمت تصفيتها ومنزوع تصل إلى حجم 1 ل.
  2. جعل الغمر المسكنات.
    1. إعداد البنزوكائين مخدر (إيثيل 4-أمينوبينزواتي) الحل بحل 200 مغ إيثيل 4-أمينوبينزواتي في 3 مل الأسيتون وثم تذويب هذا المزيج في الحل ل 1 لتر ماء الصنبور أو 40% هولتفريتير.
    2. يعد مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفونيك الحمضية، أيضا المعروف تركان) حل مخدر بتذويب 200 مغ إيثيل 3-أمينوبينزواتي حمض ميثانيسولفونيك مباشرة في الحل ل 1 لتر ماء الصنبور أو 40% هولتفريتير.
    3. إعداد حل مخدر بروبوفول (2، 6-دييسوبروبيلفينول) بإذابة 2، 6 مغ 3.3-دييسوبروبيلفينول في الحل ل 1 لتر ماء الصنبور أو 40% هولتفريتير. وبدلاً من ذلك، يؤدي إلى تمييع الحل premade تجارياً إلى 3.3 مغ/لتر.
      تنبيه: بروبوفول مخدر بشرية قوية (تدار عن طريق الوريد) وينبغي التعامل معها بعناية، بما في ذلك في شكل مخفف.
  3. إعداد سرير وحاوية لضربات القلب.
    1. إعداد سرير الحيوان على شكل الشفة لضربات القلب بطي قطعة قماش ناعمة 70 سم × 55 سم مرة واحدة وثم المتداول في "شكل بوريتو" (الشكل 1A). ثم انحنى ينتهي حتى يجتمع والشريط هذه معا (الشكل 1B).
    2. غمر الشفة على شكل هيكل في المتوسط أكسولوتل لاستيعاب axolotl أنيسثيتيزيد أثناء التصوير بالموجات فوق الصوتية. تأمين الحيوان للهيكل ومنع العائمة باستخدام الأربطة المطاطية فضفاضة؛ ضع هذه منتصف الفك السفلي وعلى المنطقة المقدسة (الشكل 1).
      ملاحظة: أشرطة المطاط ينبغي عدم الضغط الحيوان كما سيؤثر هذا الهليوكبتر.
    3. لتخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد في أكسولوتلس أونانيسثيتيزيد، وإعداد أرجوحة بنحت خارجاً من 16 سم × 8 سم × 5 سم ثقب في 33 سم × 27 سم × 5 سم كتلة رغوة البوليسترين (مثلاً، غطاء من حاوية رغوة البوليسترين متوسطة حجم) (الشكل 1).
    4. دفع قطعة 33 سم × 27 سم من البلاستيك من خلال الثقب وتأمين حواف الالتفاف على السطح العلوي لكتلة رغوة البوليسترين (الشكل 1E) لإنشاء أرجوحة. إضافة axolotl المتوسطة إلى 3 سم عمق في هزاز. أكسولوتل أونانيسثيتيزيد سوف تنزل إلى أسفل الأرجوحة السماح لسهولة الوصول البطني من خلال غلاف بلاستيكي (الشكل 1F).

2-تخدير أكسولوتلس

  1. تزج axolotl في الحل المنشود مخدر (البنزوكائين أو مرض التصلب العصبي المتعدد-222 بروبوفول).
  2. فحص للعلامات الأولى للتخدير وحركات انخفاض وزيادة فقدان الاستقامة العاكسة، وهذا يظهر في 10 دقيقة في الحيوانات < 10 ز (< 10 سم) وفي حدود 20 دقيقة في الحيوانات بين ز 10 و 50 جرام من كتلة الجسم (10-22 سم).
  3. فحص لغياب كامل لحركات الجسم وحركات التهوية جيل منعكس الاستقامة، وتأكد من الحيوان غير المستجيبة لتحفيز الألم المعتدل اختبار بواسطة معسر حزام بين الأرقام.
    ملاحظة: على الرغم من الحقيقة أن التخدير العام يتم إنجازه في غضون 30 دقيقة في أكسولوتلس البنزوكائين تخديره، وظيفة القلب لا يستقر حتى ح 1. وهذا ليس هو الحال في مرض التصلب العصبي المتعدد-222 أو بروبوفول تخديره أكسولوتلس (الشكل 6A-F).
  4. للحفاظ على أكسولوتل تحت التخدير العام، الحفاظ على الحيوانات في محلول التخدير أو ملفوفة في ورقة الرطب المسحات تبلل في محلول التخدير.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ التخدير ح 7 دون آثار سلبية على رفاهية الحيوان نظراً لأن يتم الاحتفاظ الجلد وخاصة الخياشيم رطبة.
  5. رياواكي أكسولوتل، نقل الحيوان إلى متوسط خالية من التخدير.
    ملاحظة: هو أول علامة على صحوة جيل التهوية الحركات. ينبغي أن يكون الحيوان تستقيم وتستجيب للتحفيز ضمن ح 1.

3. 2D تخطيط صدى القلب على تخديره Axolotl

  1. مكان تخديره axolotl في موقف ضعيف في السرير الحيوان على شكل الشفاه (1.3.1-1.3.2 خطوات). تأمينه من العائمة باستخدام الأربطة المطاطية فضفاضة (الشكل 1). التأكد من أن تغطيها سطح الصدر 3-5 مم متوسطة.
    ملاحظة: لعملية شراء قصيرة (< 5 دقيقة) يمكن تطبيق المتوسط خالية من مخدر. للحصول على فترة طويلة، ينبغي تطبيق حل مخدر كالمتوسطة بالموجات فوق الصوتية التأكد من وظيفة القلب مستقرة في جميع أنحاء القياسات.
  2. ضع محول على خط الوسط للحيوان في منطقة الصدر موازية للمحور الطويل للحيوان (الشكل 2A، الشكل 3 ألف-باء، التكميلية ملف 2). استخدام تضوء مع مصدر ضوء الباردة على أكسولوتلس الأبيض والبيضاء لضمان الموضع الصحيح لمحول (الشكل 2 و التكميلية ملف 1).
    1. بالنسبة أكسولوتلس وزنها < ز 20، استخدم محول 50 ميغاهرتز؛ أكسولوتلس > ز 20، استخدم محول 40 ميغاهرتز. التأكد من اتجاه الجمجمة/الأمامي إلى اليمين للحصول على صورة موحدة لتحديد المواقع. إذا كان هذا ليس هو الحال تدوير محول 180 ° أو عكس الصورة.
  3. تأكد من أن جزء صغير من البطين (المتمركزة على الحق في تجويف الصدر، الشكل 2 أ) تظهر في طريقة العرض طويلة محور خط الوسط، الإطار في البطين االنبساط وجزء كبير من الاذينين الأيمن والأيسر (المتمركزة في المركز/ قليلاً نحو اليسار في تجويف الصدر، الشكل 2 ألف) ومرئية وريدية الجيوب الأنفية سواء في االنقباض أذينية واالنبساط (الشكل 3 أ، ب).
  4. ترجمة محول 1-3 ملم تجاه الحيوان الحق في الحصول على عرض المحور الطويل البطين (الشكل 2A). ويتحقق في الموضع الصحيح عند منطقة مستعرضة البطين نهاية االنقباض إلى الحد الأقصى (الشكل 3-H).
  5. ب-وضع، تكتسب ≥ 3 دورات القلب مع إطارات > 50/s في أما 'التصوير العام' (عالية الدقة المنخفضة/المكاني الزماني) أو وضع 'القلب' (الزمانية المكانية/عالية الدقة المنخفضة).
    ملاحظة: يسمح هذا الرأي لتقييم وظيفة البطين. يمكن تقييم وظيفة البطين في هذين البعدين باستخدام مجال الكسري البطين التغيير (فاكف) محسوبة من نهاية الانبساطي والانقباضي نهاية عبر قطاعات منطقة البطين (CSAv) باستخدام المعادلة:
    Equation 1(1)
    البطين axolotl يفترض الشكل من المجال ووحدة السكتة دماغية هندسة على أساس [SV(geo)] يمكن أن تحسب باستخدام المعادلة:
    Equation 2(2)
  6. ترجمة محول على طول المحور الطويل للحيوان حتى يصل مركز البطين في منتصف الشاشة. تدوير 90 ° باتجاه عقارب الساعة للحصول على رأي المحور قصيرة منتصف البطين (الشكل 5A وب التكميلية الملف 10) محول. تقييم الشكل الدائري البطين بترجمة محول على طول المحور الطويل للقلب.
  7. العودة محول إلى الطائرة محور طويل وترجمة ذلك إلى الوراء نحو خط الوسط أو قليلاً إلى اليسار من خط الوسط للحصول على رأي الدائرة هما محور طويل الرجفان (الشكل 2A). تأكد من أن الموقف الصحيح الذي يتحقق بالتأكيد على أن مجالات اتريا االنقباض نهاية مقطعية على ماكسيما والاذينين اثنين جنبا إلى جنب تحمل الخطوط العريضة لعدد '8' يميل ~ 45 درجة نحو اليسار (الشكل 4 أ و ب، ملف تكميلي 6).
  8. في الوضع ب-اكتساب ≥ 3 دورات القلب مع إطارات > 50/s في وضع 'القلب' أو 'التصوير العامة'.
    ملاحظة: اتريا axolotl غير منتظمة في الشكل ووظيفة 3D لا يمكن مباشرة الاستدلال من البيانات ثنائية الأبعاد، ومن ثم يجب أن يتم تقييم وظيفتها كتدبير مؤشر مثل منطقة كسرى أذينية فرصة (فردا) على أساس مجتمعة عبر قطاعات المنطقة (CSAa) على حد سواء خوارج من الدوائر في االنقباض واالنبساط:
    Equation 3(3)
  9. ترجمة محول نحو اليمين حتى يظهر المسالك إلى الخارج (كونوس السالكة) (قريب من عرض المحور الطويل البطين) (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: بعد أن غادر البطين في اتجاه أمامي، المسالك إلى الخارج يجعل منعطف حاد ويعمل بزاوية صغيرة نحو السطح البطني قبل مرة أخرى مع افتراض اتجاه أمامي وتقسيم إلى فروع جيل والأوعية الجهازية.
    1. تأكد من أن يرى المسالك التدفق الصحيح يتحقق بالتأكيد على أن قطر التدفق إلى الحد الأقصى في االنقباض نهاية البطين واثنين من صمامات semilunar ثلاثة من التدفق مدخل مرئية في منتصف الإخراج (4E الشكل، ملف التكميلية 8).
      ملاحظة: يسمح اتجاهية البطني نحو محول الجزء المتوسط من المسالك إلى الخارج لقياسات السرعة والتدفق باستخدام تصوير دوبلر.
  10. تطبيق لون دوبلر-وضع لتعيين سرعات تدفق الدم في المسالك إلى الخارج أثناء قذف القلب (4F الشكل و التكميلية الملف 9). وبالمثل تطبيق لون دوبلر ودوبلر السلطة التصوير لتصور تدفق الدم في آراء البطين والرجفان (الرقم 3E-حو الملفات التكميلية 4-5 و الشكل 4-د، و التكميلية الملف 7).
  11. تطبيق نبض الموجه (PW) دوبلر-وضع في موقف السرعة القصوى الدم في جزء المسالك إلى الخارج بتشغيل نحو محول.
    1. استخدام 'زاوية شعاع' و 'التصويب الزاوي' يصل إلى 45 ° لضبط تدفق لا يجري عمودي تماما على وجه محول (الشكل 4). تأكد من أن موقف دوبلر PW لا يتراكب صمام حلزوني تدفق إلى الخارج أثناء أي مرحلة من دورة القلب (الرقم 4E).
  12. طريقة دوبلر PW الحصول على بيانات السرعة/الزمن عبر ≥ 3 دورات القلب.
  13. العودة إلى الوضع ب-ويكتسب ≥ 3 دورات القلب في نفس الطائرة الدقيقة كما حصل بوب.
  14. دورة تدبير الوقت السرعة لا يتجزأ (VTI) تدفق الدم في المسالك إلى الخارج كمنطقة تحت منحنى السرعة/الوقت للقلب كامل واحد (الشكل 4، g1).
    ملاحظة: من VTI والقطر (د) المسالك إلى الخارج في نهاية االنقباض الحصول عليها من الحصول على وضع ب، PW دوبلر السكتة الدماغية استناداً إلى حجم [SV(pw)] يمكن أن تحسب باستخدام المعادلة:
    Equation 4(4)
    يتم قياس معدل ضربات القلب (HR) من منحنى السرعة/الزمن بقياس مدة دورة القلب أكمله. إخراج القلب [CO(pw)] يحسب باستخدام المعادلة التالية:
    Equation 5(5)
  15. الحصول على رأي برجل منحرف، رأي أن يوفر بديلاً لقياس سرعة تدفق الدم في المسالك إلى الخارج، عن طريق تناوب axolotl 90 ° في الشفة على شكل سرير في مثل هذه طريقة أن يواجه الجزء الأيمن من الحيوان إلى أعلى (الشكل 2). زاوية وتدوير محول ووضعه موازية والخلفي فقط إلى الخياشيم بارزة (الشكل 2). تأكد من أن الموقف الصحيح الذي يتحقق بالتأكيد على أن يشغل المسالك تدفق النزولي في ~ 45 ° وأن الاذينين تظهر تحت المسالك إلى الخارج أثناء الإخراج (الشكل 5 ج، التكميلية الملف 11).
  16. تطبيق PW دوبلر-وضع في موقف السرعة القصوى الدم في جزء المسالك تدفق يعمل بعيداً عن محول (الشكل 5، 12 ملف تكميلي). استخدام 'زاوية شعاع' و 'التصويب الزاوي' يصل إلى 45 ° لضبط تدفق لا يجري عمودي تماما على وجه محول (الشكل 5E).
  17. في وضع "دوبلر" PW اكتساب السرعة الدم على ≥ 3 دورات القلب.
  18. العودة إلى الوضع ب-ويكتسب ≥ 3 دورات القلب في نفس الطائرة الدقيقة كما حصل بوب.
    ملاحظة: يتم حسابها SV(pw) و CO(pw) لطريقة العرض برجل المائلة باستخدام المعادلة 4 و 5 المعادلة كما هو موضح أعلاه لعرض المحور الطويل.

4-2D تخطيط صدى القلب على أكسولوتل أونانيسثيتيزيد

  1. ضع أكسولوتل أونانيسثيتيزيد في موقف معرضة في الأرجوحة (الخطوة 1.3.3).
  2. ترك الحيوان دون عائق لمدة 30-60 دقيقة للتخلص من التعامل مع الإجهاد.
  3. ضع محول بالموجات فوق الصوتية مع رأس محول الطاقة التي تواجه صعودا نحو axolotl في هزاز.
  4. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على محول.
  5. ضع بلطف، ودون الإخلال بالحيوان، ومحول على خط الوسط للحيوان في منطقة الصدر موازية للمحور الطويل للحيوان.
    ملاحظة: هذا هو الموقف نفسه، ولكن مقلوب، أما بالنسبة أكسولوتل أنيسثيتيزيد (الخطوة 3، 2).
  6. الحصول على ب-الوضع، وضع "لون دوبلر"، PW وضع البيانات في محور طويل وعرض المحور القصير كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.14.
    ملاحظة: طريقة عرض برجل مائل لا يمكن الحصول عليه في أكسولوتل أونانيسثيتيزيد. ينبغي الحصول على البيانات مشخصين في أكسولوتلس أونانيسثيتيزيد بين حركات التهوية جيل (فترة 10-20 s لحيوان راحة). إذا أكسولوتل تحرك خلال اقتناء، يجب تكرار القياسات.

5-تقييم البيانات 2D تخطيط صدى القلب، والتقليل من الذاتية

  1. تجنب التحيز المشغل أو المراقبة في 2D الموجات فوق الصوتية ثلاثي الأبعاد والتصوير تقييم وظيفة القلب على أساس 2D البيانات الناجمة عن الذاتية في الحصول على البيانات ومرحلة تحليل البيانات عن طريق إجراء تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة20.
    ملاحظة: بدء التشغيل للدراسات وعند تدريب الأفراد الجدد يجب أن تكون الكمية هذه الذاتية والتقليل من استخدام التحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة.
  2. الشروع في تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة في إعداد شخصين مع المشغل أو المراقبة 1 (أقل خبرة) يجري اختبار ضد عمل المشغل أو المراقبة 2 (أكثر خبرة) عن طريق إجراء قياسات توافق 6 ≥ معا، بما في ذلك كلا من مقاعد البدلاء في نظام الموجات فوق الصوتية (العملية) والتحليل اللاحق للمعلمات ذات الصلة (المراقبة).
  3. التوصل إلى توافق في الآراء بين المشغلين والمراقبين وتشغيل (عامل/مراقب 1) نظام الموجات فوق الصوتية للحصول على البيانات ذات الصلة عن ≥ 6 الحيوانات (تشغيل 1.1).
  4. مباشرة بعد، تعمل (عامل/المراقب 2) نظام الموجات فوق الصوتية للحصول على البيانات ذات الصلة بالحيوانات نفسها (عملية 2.1).
  5. واسمحوا الحيوانات استرداد لمدة 3 أيام. وبعد ذلك، كرر (عامل/مراقب 1) الإجراء (العملية 1.2).
  6. تحليل (عامل/مراقب 1) قياس جميع البيانات (تشغيل 1.1/المراقبة 1.1؛ العملية 2.1/المراقبة 1.1 العملية 1.2/المراقبة 1.1) وبعد 24 ساعة كرر تحليل البيانات المشغل أو المراقبة في 2 (عملية 2.1/المراقبة 1.2).
  7. (عامل/المراقب 2) تحليل البيانات التي حصل عليها نفسه (عملية 2.1/المراقبة 2.1). لاحظ أن القيم التي تم الحصول عليها عن طريق هذا التحليل تعتبر الأقرب إلى القيم الحقيقية.
  8. تقييم التباين، والاتجاهات، والتحيز في مقارنات بين جميع المعلمات المكتسبة باستخدام اتمان بلاند التآمر، والتآمر ف، تي-الاختبار (يعني المساواة)، و F-اختبار (تساوي الفرق) (الشكل 6).
    1. لاحظ أن العملية 1.1/مراقبة 1.1 مقابل عملية 2.1/المراقبة 1.1 مقارنة يوضح الاختلاف بين المشغل.
    2. لاحظ أن العملية 2.1/مراقبة 1.1 مقابل عملية 2.1/المراقبة 2.1 مقارنة يوضح الاختلاف بين المراقبين.
    3. لاحظ أن العملية 1.1/مراقبة 1.1 مقابل 1.2/المراقبة 1.1 عملية المقارنة يوضح التباين داخل المشغل.
    4. لاحظ أن العملية 2.1/مراقبة 1.1 مقابل عملية 2.1/المراقبة 1.2 مقارنة يوضح التباين داخل-مراقب.
  9. تأكد من غير-تختلف اختلافاً كبيرا عن المقارنات أربعة؛ يعني والتباين للقياسات المختلفة الفرق بين القيم المقاسة ينبغي أن تندرج ضمن ± 1.96 الانحرافات المعيارية، ويجب أن تظهر وجود لا ميول نحو أقل دقة من القيم لا صغيرة أو كبيرة.

6-3D تخطيط صدى القلب على تخديره Axolotl

  1. اقتناء 3D
    1. ضع أكسولوتل أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف في السرير الحيوان على شكل الشفاه (الخطوة 1.3.1). تأمينه من العائمة باستخدام الأربطة المطاطية فضفاضة (الشكل 1)، وتأكد من أن تغطيها سطح الصدر 3-5 مم متوسطة. اقتناء 3D إجراءات مطولة، ولذلك تطبيق حل مخدر كالمتوسطة بالموجات فوق الصوتية التأكد من وظيفة القلب مستقرة في جميع أنحاء القياسات.
    2. ضع محول على خط الوسط للحيوان في منطقة الصدر موازية للمحور الطويل للحيوان (لتسجيل 3D السهمي) أو متعامدة على محور طويل (مستعرضة تسجيل ثلاثي الأبعاد).
    3. ترجمة محول في البعد في الطائرة (x و y) وبعد الخروج من الطائرة (z أو شريحة) التأكد من أنه سيتم تغطية منطقة القلب بأكملها في التقاط 3D اللاحقة.
    4. ضبط معدل الإطار والقرار المكانية كما هو مطلوب باختيار أما 'التصوير العام' (عالية الدقة المنخفضة/المكاني الزماني) أو وضع 'القلب' (الزمانية المكانية/عالية الدقة المنخفضة). لهرتز 0.33 < HR < 1 هرتز استخدام الأزمنة من 50 الإطارات/s التي حصلوا عليها في عالية الدقة المكانية (التصوير العامة) التي تسمح لدورة القلب أن أعيد بناؤها إلى مراحل متميزة 50-150.
    5. ضبط 'كسب 2D' إلى مستوى بالكاد يمكن التعرف عليها في الصورة ب-وضع الخام فيها الهياكل التشريحية (~ 5 dB) لزيادة إشارة-إلى----نسبة الضوضاء في إعادة البناء النهائية.
    6. لكل شريحة (z خطوة)، سجل ≥ 1,000 الإطارات.
    7. ترجمة محول واحد z الخطوة في وقت، مثلاً، ميكرومتر 20 أو 50 ميكرون، وتكرار تسجيل حتى تغطي منطقة القلب بأكملها.
  2. 3D التعمير (تكميلية الملفات 13 و 14).
    1. تصدير المقتنيات في التصوير الرقمي والاتصالات في الطب DICOM (ليتل endian).
      ملاحظة: سوف يؤلف كل شريحة تحتوي على عدد محدد من إطارات ملف واحد.
    2. تحديد عدد الإطارات في دورة كاملة من القلب. كما يمكن أن تختلف الموارد البشرية على مر الزمن، تحديد هذا الأول والشريحة النهائية. تعيين أكبر عدد من الإطارات لكل دورة حسب تقدير العلوي الأولية من مرحلة القرار في وقت لاحق يمكن أن تخفض (الخطوة 6.2.8).
    3. تحديد حدود المحاصيل والمكوس غير ذي صلة الفضائية المحيطة ب-وضع الإطار.
      ملاحظة: يجب أن تكون هذه الحدود ثابتة في جميع أنحاء شرائح.
    4. تحويل صورة RGB لون 32-بت.
    5. حساب قيمة الارتباط (ج) لكل إطار في المكدس وعدد الإطارات المدرجة في دورة القلب الأولى باستخدام الصيغة:
      Equation 6(6)
      ملاحظة: هنا Equation 7 هو كثافة إشارة بكسل في تنسيق (الأول، ي) في الصورة الأولى Equation 8 وهو نفسه في الصورة الثانية، Equation 9 ، Equation 10 و Equation 11 ، Equation 12 هي متوسط الكثافة ومستوى الانحراف، على التوالي، من الصورة الأولى والثانية في المقارنة، و أنا وي هي أرقام الأعمدة والصفوف الموجودة في الصورة. المصفوفة الناتجة من قيم الارتباط سيكون حجم المنتج من عدد الإطارات لكل دورة قلبية وإجمالي عدد الإطارات لكل شريحة (مثلاً، 75,000 = 75 × 1,000 في الشكل 8) (راجع السيناريو المثالي في تكميلية الملف 16). لا يمكن حساب قيمة الارتباط إذا كان أحد أو كلا من الصور في المقارنة بين انحراف المعياري لقيم بكسل من الصفر، لكن هذا من المستبعد جداً في الصور أولتراسونوجرافيك.
    6. الكشف عن ماكسيما المحلية في صفيف قيم الارتباط (الشكل 8 أ، انظر السيناريو المثالي في 17 ملف تكميلي الكشف تلقائياً عن ماكسيما المحلية).
    7. حساب متوسط الدرجة الثانية ف(متوسط) إطارات مع ذروة القيم الارتباط (أي، مطابقة مراحل القلب) باستخدام الصيغة:
      Equation 14(7)
      حيث أن N هو العدد الإجمالي لإطارات مع مطابقة مراحل القلب، Equation 15 هو كثافة بكسل في تنسيق (الأول، ي) للصورةال نو Equation 16 الوسط الحسابي الزماني من Equation 17 الصورةth n(انظر البرنامج النصي المثالية في 18 ملف تكميلي).
    8. كرر الخطوة 6.2.3-6.2.7 لكل الشرائح.
    9. حدد شريحة (مرجع شريحة) مع الهياكل التشريحية يمكن التعرف عليها بسهولة (مثلاً، منتصف البطين) والتحقق إذا كان متوسط الفرقة أعيد بناؤها دورة قلبية واحدة يتوافق مع دورة واحدة بالضبط (أي، إذا كان هناك إضافية المراحل أدى دورة قلبية واحدة أو أكثر). حذف مراحل إضافية تسفر عن دورة قلبية واحدة بالضبط (مثلاً، تسير من المبالغة في تقدير 75 مراحل/دورة (في الواقع، دورة 1.07) في الشكل 8 بدوره واحدة بالضبط التي تحتوي على مراحل 70 في الشكل 8).
    10. على الشريحة (شريحة الاختبار) المجاورة، بلغ الفرز الفرقة واحدة دورة القلب تي-المكدس في مطابقة مراحل القلب مع شريحة مرجع باستخدام الصيغة قيمة الارتباط (المعادلة 6) (انظر مخطوطات المثالية في التكميلية الملف 19 و ملف تكميلي 20).
      ملاحظة: على الرغم من أن الشرائح غير المتطابقة اثنين لن تظهر مماثلة تماما في أي نقطة أثناء دورة القلب، شرائح متجاورة مع حجم خطوة صغيرة بما فيه الكفاية (مثلاً، ميكرومتر 20 أو 50 ميكرومتر) سوف وضوحاً التشابه أدى الارتباط ماكسيما القيمة التي يمكن ترجمتها إلى مطابقة مراحل.
    11. كرر الخطوة 6.2.9-6.2.10 لكل الشرائح.
    12. انهيار إعمار 3D كاملة في تنسيق "ملف صورة ذات علامات" 3D (TIF) واحد يحتوي على شرائح z وإطارات t أو في كومة من ملفات DICOM.
      ملاحظة: يمكن إهمال البيانات في كل بعد من الأبعاد تقليل الحجم وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتوليد بيانات الخواص (القرار في الطائرة عادة أعلى من قرار الخروج من الطائرة عدة طيات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الفضاء إينترابيريكارديال في أكسولوتل فيعتمد على حجم الحيوان. أصغر الحيوانات (ز 2-20، 7-15 سم) سيكون وجود فائض من السوائل التامور (ظهور الظلام في ضربات القلب) المحيطة بالدوائر القلب بينما في الحيوانات الناضجة جنسياً أكبر (> 20 غرام، > 15 سم) الدوائر سوف تشغل معظم إينترابيريكارديال الفضاء. توفير نظرة عامة أفضل لنتائج تمثيلية الآراء مشخصين القلب أكسولوتل، طبق حيوان أصغر (ز 10، 10 سم) الرقم 3و رقم 4و الشكل 5و الرقم 9.

عموما يوفر عرض المحور الطويل نظرة عامة جيدة من تشريح القلب في أكسولوتل. إدخال في الطائرة خط الوسط مع الجيوب الأنفية وريدية والاذينين، وجزء من البطين في الطائرة (الشكل 3 ألف، ب، 2 الملف التكميلي)، أما الطائرة البطين (الشكل 3–ح) أو الطائرة الرجفان (الشكل 4A –د) ويمكن الوصول إلى ترجمة محول إلى اليمين أو إلى اليسار للحيوان، على التوالي. سوف تظهر البطين كروية وشدة ترابيكولاتيد (الشكل 3، 3 ملفات تكميلية–5)، في حين اتريا شكل منتظم أكثر وتقريبا لا ترابيكوليشن (الشكل 4 أ، ملف تكميلي 6، ملف تكميلي 7). عرض المحور قصيرة (الشكل 5 ألف، باء، التكميلية الملف 10) يقدم عرضاً أقل سهولة التفسير لتشريح القلب أكسولوتل القلب، بيد أن ذلك يسهم في تقييم انقباض القلب الصحيح (مثلاً ، هي وضوح تصور مناطق إينفاركتيد أو غير المتعاقدة البطين التعميم في هذه الطائرة عرض). في الطائرة عرض المحور الطويل، يتم وضع مركز المسالك إلى الخارج عن كثب إلى مركز البطين (الشكل 2A، وقارن بين الرقم 3 مع الشكل 4E و التكميلية الملف 3 مع التكميلية الملف 8 ). ما تتحرك على قذف الدم الأنسجة اللينة من المسالك إلى الخارج، وسوف ملاصقة إشارة ارتفاع كثافة الدم خلال دورة القلب تقاس بنبض موجه دوبلر في المحور الطويل والطائرة برجل المائلة بكثافة منخفضة الضوضاء من حركات الأنسجة اللينة المحيطة بها (المنطقة الرمادية المحيطة بالمنطقة البيضاء في منحنى السرعة/الوقت في الشكل 4 و الشكل 5E). عموما، ينبغي أن يكون التباين بين الإشارات الدم والأنسجة اللينة الضوضاء كبيرة بما يكفي للجزء فقط إشارة الدم عند قياس متكاملة الوقت السرعة (الشكل 4 (g1 التكبير) و الشكل 5E (e1 التكبير)).

للحصول على التقييم النوعي لأنماط تدفق الدم، لون دوبلر وتصوير دوبلر السلطة تقديم تصورات لأنماط التدفق في مختلف الدوائر القلب (البطين: 3E الرقم–ح، و التكميلية ملف 4، الملف التكميلي 5؛ اتريا: الشكل 4 ج، د، 7 الملف التكميلي؛ المسالك إلى الخارج: 4F الرقم، الرقم 5 د، التكميلية الملف 9، التكميلية الملف 12).

أكسولوتلس المستخدمة لإجراء تجارب في المختبرات تختلف في الحجم من مرحلة اليرقات وظيفة المبكر من 2-4 ز إلى النضج الكامل في ز 10-30 وأكبر الحيوانات وزنها > 100 زاي المثل، تعتمد وظيفة القلب وبعض القيم المطلقة لمعلمات الفنية الموصوفة هنا على حجم الحيوانات. عموما، منطقة كسرى تغيير مستمر في مجموعات مختلفة الحجم بقيم تتراوح بين 40-50% (تميل نحو القيم الأدنى للحيوانات الكبيرة). حجم السكتة الدماغية تعتمد اعتماداً كبيرا على حجم الحيوان، أي، حجم القلب، وتتراوح مثلاً 20-30 ميليلتر في أكسولوتلس ز 5 و 50-70 ميليلتر في أكسولوتلس ز 10 250-300 ميليلتر في أكسولوتلس 50 جرام. معدل القلب وإلى بعض حجم السكتة الدماغية درجة تعتمد اعتماداً كبيرا على مخدر التطبيقية ومستوى التخدير (الشكل 6A–و، الرقم 7).

تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة التقليدية تنطوي على تمثيلات رسومية (س-س المؤامرات والتمان بلاند المؤامرات) واختبار لتعنى المساواة (تي-اختبار) والفرق (F-اختبار) لتقييم التوزيع الطبيعي للبيانات ومقارنة والدقة بين شخصين (الشكل 6).

ضربات القلب 3D يضيف بعدا إضافيا (z أو العمق) لاقتناء 2D الأكثر تقليدية. وهذا ما يسمح للتصور مستو متعددة من البيانات (الشكل 9 ألف)، reslicing (9B الشكل) وعمليات إعادة البناء السطح والحجم (الشكل 9، التكميلية الملف 13و 14 ملف تكميلي) وتجزئة و توليد نماذج ثلاثية الأبعاد (الشكل 9 ج، 15 ملف تكميلي).

Figure 1
رقم 1. إعداد سرير وحاوية لضربات القلب لتخديره وأونانيسثيتيزيد أكسولوتل- قطعة قماش ناعمة (A) A يتم طيها مرة واحدة ودخلت الشكل "بوريتو". (ب) الغايات هي بنت مرة أخرى ومسجلة لتشكيل شفة على شكل سرير أكسولوتل أثناء المسح تحت الماء. (ج) لتخطيط صدى القلب 2D و 3D أكسولوتل أنيسثيتيزيد، يوضع الحيوان برفق في موقف ضعيف في الشق الشفة على شكل سرير والثابتة مع الأربطة المطاطية على المنطقة منتصف الفك السفلي والمقدسة. (د، ه) أرجوحة أعدت نحت بحفرة مربعة في قطعة من البوليسترين الرغوي وتسجيل الأغطية البلاستيكية على السطح العلوي. (و) لتخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد أكسولوتل أونانيسثيتيزيد، وضعت في موقف معرضة طبيعية في هزاز الحيوان واقترب مع تلميح محول طاقة تغطي جل من تحتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. محول طاقة التنسيب. (أ، ب) نموذج الشبكة الشريانية في axolotl مع موقف التقريبي لمحول لمحور طويل وعرض المحور قصيرة (A) وعرض برجل المائلة (ب). (ج) تضوء مع مصدر ضوء الباردة قوية يمكن أن تساعد في العثور على الموقع الدقيق للدوائر القلب قبل تطبيق محول (انظر 1 ملف تكميلي). الاختصارات التشريحية: A، اتريا؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ سينف، وريدية الجيوب الأنفية؛ الخامس، بطين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. المحور الطويل الممثل آراء مشخصين البطين. (أ، ب) المحور الطويل نموذجي خط الوسط عرض في ب-وضع (الخط الأصفر في الشكل 2 أ) في نهاية االنبساطي البطين (A) وانتهاء الانقباضية (ب) مراحل (انظر 2 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (ج، د) عرض المحور الطويل البطين في وضع ب (الخط الأسود في الشكل 2 ألف) في نهاية االنبساطي البطين (ج) ونهاية الانقباضية المراحل (د) (انظر 3 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (حمنه–) طائرة عرض مماثلة كما هو الحال في (أ) و (ب) في لون دوبلر (CD) ووضع دوبلر (PD) الطاقة مما يدل على الدم تدفق (انظر التكميلية ملف 4 و 5 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو من وضع مؤتمر نزع السلاح، وشعبة المشتريات، على التوالي). الألوان أحمر في مؤتمر نزع السلاح--وضع الصور تشير إلى الدم يتدفق نحو محول والألوان الزرقاء تشير إلى عكس ذلك. وقد أبرزت الدوائر القلب وتدفق الدم مع الخطوط المنقطة. نظر الرسوم المدرجة في (أ) و (ج) إظهار موضع محول طاقة والترجمة بالنسبة لخط الوسط محور طويل. الاختصارات التشريحية: A، اتريا؛ DC(L)، يترك مجرى هواء كوفييه؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ سينف، وريدية الجيوب الأنفية؛ الخامس، بطين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. المحور الطويل الممثل آراء مشخصين الاذينين وتدفق المسالك. (أ، ب) عرض المحور الطويل الاذينين في الوضع ب (الخط الأخضر في الشكل 2 أ) في نهاية االنبساطي الرجفان (A) وانتهاء الانقباضية (ب) مراحل (انظر 6 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (ج، د) طائرة عرض مماثلة كما هو الحال في (أ) و (ب) في وضع اللون دوبلر (CD) يدل الدم تدفق (انظر 7 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (ﻫ) محور طويل عرض المسالك التدفق في الوضع ب (الخط الأزرق في الشكل 2 ألف) في مرحلة منتصف الإخراج (انظر 8 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). واو: طائرة عرض مماثلة كما هو الحال في (ه) في الدم تبين وضع مؤتمر نزع السلاح-التدفق (انظر 9 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (ز) الطائرة عرض مماثلة كما هو الحال في (ه) و (و) في وضع دوبلر (PW) موجه النبض مما يسمح للحرارة معدل الكشف والسرعة لا يتجزأ (VTI) قياس الوقت لحساب حجم السكتة الدماغية. الألوان أحمر في مؤتمر نزع السلاح--وضع الصور تشير إلى الدم يتدفق نحو محول والألوان الزرقاء تشير إلى عكس ذلك. وقد أبرزت الدوائر القلب وتدفق الدم مع الخطوط المنقطة. رؤساء السهم الأصفر والأحمر تشير إلى صمامات سيميلونار في الجذر من المسالك إلى الخارج وصمام حلزوني في المسالك إلى الخارج، على التوالي. عرض الرسوم المدرجة في (أ) وتنسيب (ه) عرض محول طاقة والترجمة بالنسبة إلى خط الوسط محور طويل. الاختصارات التشريحية: A(R)، الاذين الأيمن؛ A(L)، غادر اتريوم؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ سينف، وريدية الجيوب الأنفية؛ الخامس، بطين؛ الرأسمالي، الوريد الأجوف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. المحور قصيرة الممثل وآراء مشخصين باراجيل منحرف من المسالك البطين وتدفق- (أ، ب) عرض المحور القصير البطين في وضع ب (خط رمادي في الشكل 2 أ) في نهاية االنبساطي البطين (A) وانتهاء الانقباضية (ب) مراحل (انظر 10 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). (ج) برجل المائلة عرض المسالك إلى الخارج في الوضع ب (الخط الأرجواني في الشكل 2) في مرحلة منتصف الإخراج (انظر 11 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). طائرة عرض مماثل (د) كما هو الحال في (ج) في مؤتمر نزع السلاح--وضع الدم تبين التدفق (انظر 12 ملف تكميلي لتمثيل الفيديو). طائرة عرض مماثل (ه) كما هو الحال في (ج) و (د) في وضع دوبلر (PW) موجه النبض مما يسمح للحرارة معدل الكشف والسرعة لا يتجزأ (VTI) قياس الوقت لحساب حجم السكتة الدماغية. الألوان أحمر في مؤتمر نزع السلاح--وضع الصور تشير إلى الدم يتدفق نحو محول والألوان الزرقاء تشير إلى عكس ذلك. وقد أبرزت الدوائر القلب وتدفق الدم مع الخطوط المنقطة. نظر الرسوم المدرجة في (أ) و (ج) إظهار موضع محول طاقة والترجمة بالنسبة لخط الوسط محور طويل. الاختصارات التشريحية: A، اتريا؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ سينف، وريدية الجيوب الأنفية؛ الخامس، بطين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. نتائج تمثيلية من قياسات الحجم بمعدل ضربات القلب، والسكتة الدماغية، وتأثير التخدير، والتمثيلية داخلها أو بينها-operator/المراقبة التحليل. (أ–ج) معدل ضربات القلب (HR) بالنسبة لخط الأساس أونانيسثيتيزيد المرسومة على مر الزمن (ح 0 في التخدير الكامل) لستة أكسولوتلس تخديره في البنزوكائين () ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 (ب) بروبوفول (ج). (د–و) السكتة الدماغية حجم (SV) مقارنة بخط الأساس أونانيسثيتيزيد المرسومة على مر الزمن (ح 0 في التخدير الكامل) لستة أكسولوتلس تخديره في البنزوكائين (د)، مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (ه)، وبروبوفول (F). (ز) تحليل داخلها أو بينها-operator/المراقبة من حجم السكتة الدماغية. ألتمان بلاند المؤامرات [الفرق (Dif) بين المشغلين (Op)/المراقبين (Obs) رسم مقابل متوسط (Avg)] ينبغي أن تكشف عن أي تحيز منهجي في القياسات عادة الموزعة (س-س المؤامرات) التي تم الحصول عليها من شركات مختلفة والمراقبين. اختبار لتعنى المساواة (تي-اختبار) والفرق متساوية (F-اختبار) ينبغي أن تكشف عن لا اختلافات كبيرة بين مشغلي/المراقبين (الجدول في أسفل اليمين). A - تعديل و من المواد المتاحة بموجب "الإبداعي لجنة إسناد الترخيص" (الرقم 1 من تيغيسن et al. 21)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7. مقارنة بين حجم السكتة الدماغية وتقدر هندسية وموجه النبض طريقة دوبلر. مقارنة حجم السكتة الدماغية (SV) وتقدر ب-وضع الأبعاد الهندسية (geo) القياسات أو قياسات دوبلر موجه النبض على السرعة إنهاء المسالك تدفق الدم. يتم تسجيل SV(geo) و SV(pw) في نفس الحيوانات الستة بالثواني بين أنواع القياس واستخدام المسكنات المختلفة الثلاثة، البنزوكائين (المربعات الزرقاء مائلة)، مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (المربعات الحمراء)، وبروبوفول (مثلثات خضراء) مع أسبوع واحد لاسترداد بين تطبيق المسكنات المختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الرقم 8. ارتباط صورة تمثيلية الزمانية المكانية لضربات القلب 3D- (أ) منحنى تمثيل قيم الارتباط أثمرت عملية الارتباط في dataset سينما 1,000 إطار مع إطارات 75 في كل دورة قلبية. إطارين مع الاختلافات الصغيرة فقط، مما يشير إلى مطابقة مراحل القلب، سوف تسفر عن قيمة ارتباط عالية. بعد ذلك يمكن تطبيقها ماكسيما محلية البحث خوارزمية على البيانات للكشف عن كل الإطارات مطابقة. (ب) تمثيل رسومي للبيانات نفسها كما هو الحال في (A). عندما يتم الحصول على قيم الارتباط بمقارنة دورة القلب الأولى مع مكدس كامل سينمائية، تبين خطوط قطري الارتباط أقصى مطابقة مراحل القلب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9. تخطيط صدى القلب 3D الممثل. (أ) عرض متعدد مستو من قلب 3D axolotl أعيد بناؤها. يسمح الإجراء ارتباط الصورة الزمانية المكانية لإعادة بناء دورة القلب كاملة مع عدة مراحل متميزة (هنا مراحل 70) في الأبعاد المكانية الثلاثة التي يمكن أن تكون شرائح ثم كتلك للتحقيق المطلوب من الظواهر الزمانية المكانية في قلب ينبض. (ب) ثلاث شرائح مستعرضة من 115 أعيد بناؤها شرائح بيانات ثلاثية الأبعاد. الدرجة الثانية متوسط الإجراء على النقيض من الدم إلى الأنسجة ويعزز ويخفض نسبة الإشارة إلى الضجيج تسمح بفهم أفضل لطبيعة ترابيكولاتيد البطين axolotl ووضع تصور واضح لحاجز إينتيراتريال الصمامات في المسالك إلى الخارج. مجزأة تمثيلات (ج) المياه السطحية وحجم من قلب ينبض في ثلاث مراحل على طول لون ترميز نموذج (انظر التكميلية الملف 13 و 14 ملف تكميلي لتمثيل فيديو لسطح وحجم المقدمة الضرب القلب، و 15 ملف تكميلي لثلاث مراحل مجزأة تفاعلية نموذج ثلاثي الأبعاد). الاختصارات التشريحية: A، اتريا؛ كاو، والذيلية؛ اللجنة السويسرية للطعون، الجمجمة؛ التنفيذ المباشر، دكستر (للحيوان الصحيح)؛ دور، الظهرية؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ الخطيئة، الشريرة (للحيوانات اليسار)؛ سينف، وريدية الجيوب الأنفية؛ الخامس، بطين؛ فين، البطني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الملف 1. تضوء لتحديد موقع القلب من الدوائر فيأكسولوتل. انظر الشكل 2. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2. المحور الطويل، طريقة عرض خط الوسط، الوضع ب-- انظر الشكل 3 ألف، باء. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية ملف 3. المحور الطويل، طريقة عرض البطين، الوضع ب-- انظر الشكل 3، د. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 4. المحور الطويل، رأي البطين، وضع "لون دوبلر". انظر الشكل 3E، و. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 5. المحور الطويل، رأي البطين، طريقة "دوبلر السلطة". انظر الشكل 3، ح. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 6. المحور الطويل، طريقة عرض الرجفان، الوضع ب-- انظر الشكل 4 أ، ب. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 7. المحور الطويل، عرض الرجفان، ووضع "لون دوبلر"- انظر الشكل 4، د. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 8. المحور الطويل، عرض المسالك إلى الخارج، ب-وضع. انظر الشكل 4E. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 9. المحور الطويل، عرض المسالك إلى الخارج، ووضع "لون دوبلر"- انظر الشكل 4F. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 10. المحور قصيرة، عرض البطين، ب-الوضع. انظر الشكل 5A، ب. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 11. برجل المائلة، تدفق عرض المسالك، الوضع ب-- انظر الشكل 5. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 12. برجل المائلة، عرض المسالك إلى الخارج، ووضع "لون دوبلر"- انظر الشكل 5. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 13. التقديم السطحي ثلاثي الأبعاد لقلب ينبض في مراحل 70 (19.6 مرض التصلب العصبي المتعدد الأزمنة). انظر الشكل 9. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 14. عرض حجم ثلاثي الأبعاد لقلب ينبض في مراحل 70 (19.6 مرض التصلب العصبي المتعدد الأزمنة). انظر الشكل 9. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 15. نموذج تفاعلي ثلاثي الأبعاد لقلب ينبض في ثلاث مراحل: االنقباض نهاية البطين وقذف البطين منتصف ونهاية البطين-االنقباض- انظر الشكل 7. وينبغي أن ينظر إلى ملف PDF تفاعلية في Adobe Acrobat Reader 9 أو أعلى. لتنشيط ميزة ثلاثية الأبعاد، انقر فوق النموذج. باستخدام المؤشر، من الممكن الآن تدوير، التكبير، وعموم للنموذج، وفي شجرة النموذج يمكن تشغيل/إيقاف كافة شرائح من النموذج أو شفافية. شجرة النموذج هو التسلسل هرمي الذي يحتوي على عدة طبقات فرعية يمكن أن تكون فتحه (+). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 16. الممثل المشروح البرنامج النصي لحساب قيمة الارتباط اقتناء إطارات 1,000 مع تقدير أعلى من 75 الإطارات/القلب دورة. السيناريو مكتوب بلغة الماكرو IJ1 ويمكن تنفيذ الماكرو دفعة في إيماجيج لحساب قيم الارتباط (75,000 الواحدة واقتناء) عبر أكمله z-كومة من بيانات ثلاثية الأبعاد. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 17. التمثيل النصي للكشف عن ذروة التلقائية في سلسلة من قيم الارتباط من عملية شراء إطارات 1,000 بتقدير أعلى من 75 الإطارات/القلب دورة. يمكن استبدال سلسلة ترابط القيم (العمود B، تميز باللون الأصفر) وسوف يكون قائمة بالأوامر لتحديد مطابقة مراحل القلب وأداء متوسط الدرجة الثانية بعد تنشيط الماكرو (Ctrl + r) عرض (ف العمود، تميز باللون الأخضر). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 18. الممثل المشروح البرنامج النصي لتحديد مطابقة مراحل القلب وأداء متوسط الدرجة الثانية من عملية شراء إطارات 1,000 مع تقدير العلوي 75 الإطارات/القلب دورة (عمود ف في 17 ملف تكميلي). البرنامج النصي هو مكتوب بلغة الماكرو IJ1 ويمكن تنفيذها كما بلغ ماكرو في إيماجيج لإنشاء فرقة شريحة واحدة في 2D دورة (مراحل 75). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 19. الممثل المشروح البرنامج النصي لحساب قيمة الارتباط بين شريحة مرجعية إطارات 70 وشريحة اختبار إطارات 75 المتاخمة. السيناريو مكتوب بلغة الماكرو IJ1، ويمكن تنفيذها كوحدة ماكرو في إيماجيج لحساب قيم الارتباط (5,250). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 20. Excel ممثل البرنامج النصي للكشف عن ذروة التلقائية في سلسلة من قيم الارتباط من مقارنة بين شريحة مرجعية إطارات 70 وشريحة اختبار إطارات 75 المتاخمة. يمكن استبدال سلسلة ترابط القيم (العمود C، تميز باللون الأصفر) وبعد تنشيط الماكرو (Ctrl + t) عرض قائمة الشرائح يتم اختيارها كما سيكون سوبستاك في شريحة الاختبار (ل العمود، صف 2، تميز باللون الأخضر). وسيكون سوبستاك شريحة اختبار مكانياً مطابقة إطارات بشريحة المرجعية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تخطيط صدى القلب أكسولوتل وغيرها من الأنواع غير الثدييات غلة البيانات تختلف اختلافاً جوهريا من الثدييات ضربات القلب بسبب طبيعة الأنوية من خلايا الدم الحمراء في جميع الفقاريات عدا الثدييات الكبار. هذه النتائج في إشارة دم وضوحاً وأقل على النقيض من الدم إلى الأنسجة في الصور مشخصين axolotl مقارنة بالماوس مثلاً أو ضربات القلب البشري. وهذا يجعل تجزئة الصورة في إطار واحد غير المجهزة بالموجات فوق الصوتية صور أكثر صعوبة كما يمكن أن يكون من الصعب التمييز بين الدم من الأنسجة. ومع ذلك، هذه الظاهرة يمكن أن يكون مفيداً عند استخدامه لإنشاء الدم إشارة الصور المحسنة عن طريق تطبيق الدرجة الثانية متوسط الإجراء الموصوفة سابقا18 وتعديلها لضربات القلب أكسولوتل في 6 قسم البروتوكول. متوسط الدرجة الثانية منذ تلامس الدم دينامية أكثر بكثير من تلك التي عثر عليها في الأنسجة اللينة، سوف تولد تباين واضح بين هذه الأقسام اثنين مما يسهل تقسيم الصورة في اثنين وثلاثة أبعاد.

ويصف هذا البروتوكول المسكنات المختلفة الثلاثة أكسولوتل التي كانت دقة اختبار قبل21. البنزوكائين ومرض التصلب العصبي المتعدد-222 حفز زيادة في معدل ضربات القلب، التي يمكن أن تكون مرغوبة عند اختبار وظيفة القلب تحت ظروف الإجهاد. بروبوفول يدفع أقل الإجهاد للقلب أثناء التخدير، ويمكن استخدامها كبديل لضربات القلب أونانيسثيتيزيد في حالات حيث شراء الوقت يتجاوز حدود السلوك المستقرة في أكسولوتلس أونانيسثيتيزيد.

تخطيط صدى القلب 2D تصف قلب 3D يتأثر بالذاتية. ولذلك، يتحتم على السلوك والتحليل داخل/بينها-operator/المراقب قبل إجراء تجربة الفعلية كما هو موضح في القسم 5 البروتوكول. وبالمثل، ينبغي النظر القياسات مشخصين أكثر كقيم الفهرس التي يمكن تطبيقها على التحقيق في الاختلافات المحتملة في وظيفة القلب تحت ظروف مختلفة بدلاً من القيم المطلقة. حجم السكتة الدماغية تحددها المعادلة الهندسية (المعادلة 2) نادراً ما تعطي نفس القيمة المطلقة كموجة النبض الدوبلري المعادلة (4 المعادلة؛ الشكل 7)، وينبغي أن يكون قررت التي تقيس على التمسك بها في جميع أنحاء سلسلة من التجارب. يمكن الحصول SV(geo) أسرع من SV(pw)، بيد أن افتراض كروية الشكل البطين لا ينطبق إلا على صحي موحد المتعاقدة القلوب، وفي نماذج المرض وتجديدها، ينبغي النظر في SV(pw) لانعكاس أفضل من حجم السكتة الدماغية الحقيقية.

يمكن تنفيذ الارتباط والدرجة الثانية متوسط الداخلي لبروتوكول القسم 6 في تصوير مختلف وحزم رياضية عدة. منذ برمجة المهارات والحصول على حزم البرمجيات تختلف اختلافاً كبيرا داخل الباحثين علوم الحياة، ونحن تسعى نحو تقديم البرامج النصية الممثل للأساليب الموجودة في حزم البرمجيات أن معظم الباحثين على دراية (مثل Excel) التي متاحة بحرية واقترب بسهولة (إيماجيج: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). الملفات التكميلية 16 - 20 تقديم البرامج النصية النموذجية مشروحة مكتوب بلغة الماكرو IJ1 .xlsm وحدات الماكرو التي ينبغي أن تكون مفهومة حتى بالحد الأدنى من الخبرة في الترميز.

قلب جوهري تجدد ظاهرة موجودة حصرا في قلوب الأنواع الصغيرة (بالنسبة للإنسان)، وهكذا قياسات والتصوير من الأساس وظيفة القلب والتقدم الوظيفي أثناء التجديد هو تحدي حجم القلب و القرار المكانية التصوير طريقة تطبيقها. يوفر التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد المرغوب فيه مفاضلة بين عالية دقة مكانية في الطائرة (~ 30 × 30 ميكرون2 في 50 ميغاهرتز) الذي يماثل في فيفو µCT التصوير وأعلى بكثير في فيفو µMRI، الذي له عمق اختراق (~ 1 سم في 50 ميغاهرتز) عدة مرات أكبر من مجهرية [كنفوكل]، واستبانة زمنية عالية جداً (50-300 إطارات/ثانية في 50 ميغاهرتز، عمق 1 سم). إلى جانب حركة يدوية أو تلقائية ض الأبعاد لمحول، الموجات فوق الصوتية تمكن التعمير لا مثيل لها من وظيفة القلب والنمذجة التشريحية في أربعة أبعاد. بالإضافة إلى ذلك، تسمح طبيعة التقنية غير الغازية للتجريب الطولية. على حد علمنا لا تتوفر حاليا لا محولات المصفوفة مصفوفة للتصوير الدقيقة بالموجات فوق الصوتية عالية التردد. تطوير هذه التكنولوجيا سيساعد إلى حد كبير مقتنيات بيانات ثلاثية الأبعاد من قلوب صغيرة مثل تلك أكسولوتل في إجراء أسرع مما تتحرك ميكانيكيا محول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نعترف كاسبر هانسن، معهد العلوم البيولوجية، جامعة آرهوس لتوفير إمكانية الوصول إلى والمساعدة مع ميكرومانيبولاتور الإلكترونية لاكتساب مشخصين 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

الطب، 141 قضية، تخطيط صدى القلب، والموجات فوق الصوتية، القلب، القلب الموجات فوق الصوتية، والتجدد، أكسولوتل، ميكسيكانوم أمبيستوما، ارتباط الصورة الزمانية المكانية
تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد في أكسولوتل (<em>ميكسيكانوم أمبيستوما</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter