Summary
在这里, 我们提出了超声心动图方案的二维和三维图像采集的轴突蜥蜴 (金银花) 的跳动的心脏, 在心脏再生的模型物种。这些方法允许在高时空分辨率下对心功能进行纵向评估。
Abstract
缺血性心脏病引起的心脏故障是一个重大挑战, 对心脏的再生疗法的需求很大。一些模型物种, 如斑马鱼和蜥蜴, 能够内在的心脏再生有希望为人类患者未来的再生疗法。为了评价心脏再生实验的结果, 必须监测心脏功能。蜥蜴 (a. mexicanum) 是再生生物学中一个成熟的模型物种, 达到可以评估心脏功能的大小。该方案的目的是建立方法, 重现性测量心脏功能在轴突超声心动图。介绍了不同麻醉剂 (苯并卡因、ms-222 和异丙酚) 的应用, 并介绍了二维超声心动图数据在麻醉和非麻醉轴突中的获取。三维 (3d) 心脏的二维超声心动图可以受到测量的不精确和主观性的影响, 并为缓解这种现象而采用的一种坚实的方法, 即内--------------------------------------------------------------------------------------------------证明。最后, 介绍了一种以非常高的时空分辨率和明显的血液与组织对比度获取轴突心脏跳动的三维超声心动图数据的方法。总体而言, 该协议应提供必要的方法来评估心脏功能和模型解剖, 以及流动动力学使用超声成像与应用于再生生物学和一般生理实验。
Introduction
缺血性心脏病是全世界 1,2人死亡的主要原因。尽管许多人由于快速和微调的医疗干预而在心肌梗死中存活下来, 但人类的缺血性事件往往会导致与肥大、电故障和心脏功能能力下降相关的纤维化疤痕.这种缺乏心脏组织再生潜力的情况在哺乳动物之间是共同的, 虽然有争议的哺乳动物心脏再生的说法已经报告, 这些已被限制在特定的小鼠菌株3,4和缺氧治疗小鼠5。因此, 心脏再生医学和生物学领域一般仅限于研究内在心脏再生现象的非哺乳动物动物模型。斑马鱼 (daio rerio)在过去的十年里被确立为最有特色的内在心脏再生模型 6,7,8,9,10.由于易于实验室维护, 生成时间短, 分子工具种类繁多, 斑马鱼很好地适应了心脏发育和再生的遗传和分子机制模型。然而, 斑马鱼心脏的微小尺寸使其不太适合功能评估, 复杂的外科手术和斑马鱼的非四足系统发育限制了在该物种的结果的合理推断, 从而证明使用其他较大的四足动物模型是合理的。脊椎动物心脏再生的最早模型之一是尾状两栖动物, 东方牛顿 (诺特西特)11, 一个物种仍然是一个有价值的模型 12。
近年来, 另一种尾状两栖动物--墨西哥轴突 (a. mexicanum) 作为一个大型 (高达100克的体重) 和高度实验室适应性的动物模型进入了这一领域, 用于广泛的再生学科, 包括肢体再生,脊髓损伤和心脏再生13,14,15,16, 17.axolotl 是高度友好的功能测量心脏使用高频超声心动图和心脏腹侧没有钙化结构允许超声成像与更低的图像伪影 (声学特别是阴影和混响) 比观察到的其他模型动物与钙化胸骨和肋骨。
下面的协议描述了几种不同的方法和制剂 (图 1,图 2), 以获得可重复的超声心动图测量轴突心脏在两个麻醉 (应用三种不同的麻醉剂:苯并被杀、ms-222 和异丙酚) 和非麻醉动物合两个 (图 3,图 4,图 5,图 6, 图 7,补充文件 1-12) 和三 (图 8,图 9, 补充文件 13-14) 空间尺寸。两栖动物的心脏是三室 (两个心房和一个心室)。心房由一个大的窦静脉提供, 脑室排空到动脉壁流出道 (图 2)。由于传统上最强调的是心室再生, 而不是心房6、7、8、9、10、11的恢复,12,14,17、本协议主要研究心室功能的测量。
两栖动物超声心动图在文献中没有得到很好的描述, 本文描述的2d 方法的发展是由于需要在给定的时间和实验环境下最好地代表跳动的轴突心脏的功能。因此, 这里描述的方法适用于心脏再生实验, 在这些实验中, 可以在再生过程中反复监测心脏功能。此外, 这些方法可应用于一般轴索替特的心脏生理实验, 或稍作修饰, 以跨越其他尾状物或无源两栖动物模型 (例如,)。轴索醇存在于几种不同的菌株和颜色变化 (例如, 野生型, 黑色素瘤, 白色, 白化病, 转基因白色与绿色荧光蛋白表达), 但这些特征不影响的兼容性轴索图尔与描述的协议。本文所述的获取三维超声心动图数据的方法是为临床超声开发的时空图像相关 (stic) 技术的改进版本, 以及前面所述的发展鸡的二次平均法。增强含有有核红细胞 18、19的物种软组织中的血斑信号。这种方法允许先进的心脏收缩模型和计算流体动力学的轴突心脏。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该议定书所执行的程序符合丹麦关于照顾和使用实验动物的国家立法, 实验得到丹麦国家动物实验监察局的批准 (议定书 # 2015-15-010-0015)。
1. 准备工作
- 制备轴索醇培养基。
- 应用高质量的非化学处理自来水作为轴索特培养基。如果此方法不可用, 请应用 40% holtfreter 的解决方案。
- 通过溶解 15.84 g nacl、0.54 g ccl2222o、1.11 g mgso 4·7h2o 和 0.54 g kcl 过滤和去离子水中的 col 溶液制备 40% (wt/vol)wt/vol的溶液, 最高可达 1 l 的体积.
- 制造浸泡麻醉剂。
- 在3毫升丙酮中溶解200毫克 4-氨基苯甲酸乙酯, 然后在1升自来水或 40% holtfreter 溶液中溶解该混合物, 制备苯并被烷 (4-氨基苯甲酸乙酯) 麻醉溶液。
- 通过直接在1升自来水或 40% holtfreter 溶液中溶解200毫克 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸酯, 制备 ms-222 (3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸, 也俗称三烷) 麻醉剂溶液。
- 在1升自来水或 40% holtfreter 溶液中溶解3.3 毫克 2, 6-二异丙基酚, 制备异丙酚 (2, 6-二异丙基酚) 麻醉剂溶液。或者, 将商业预混溶液稀释至 3.3 mgl。
注意: 异丙酚是一种功能强大的人体麻醉剂 (静脉注射), 应小心处理, 包括稀释后的形式。
- 准备超声心动图的床和容器。
- 准备唇形动物床超声心动图, 折叠一块70厘米 x 55 厘米的软布一次, 然后将其卷成 "卷饼形状" (图 1 a)。然后弯曲两端, 直到它们满足并将它们粘在一起 (图 1b)。
- 在超声成像过程中, 将唇形结构浸入轴索尔介质, 以适应麻醉后的轴突。将动物固定在结构上, 防止使用松散的橡皮筋漂浮;将这些下颌骨中部和下颌区域放置 (图 1c)。
注: 橡皮筋不应挤压动物, 因为这将影响血流动力学。 - 对于非麻醉轴相的二维超声心动图, 准备一个吊床, 方法是在33厘米 x27 厘米 x 5 厘米的聚苯乙烯泡沫 (例如, 中型聚苯乙烯容器泡沫的盖子) 中雕刻出一个16厘米 x8 厘米 x 5 厘米的孔 (例如, 从中型聚苯乙烯容器泡沫的盖子) (图 1d)。
- 通过孔推一个33厘米 x 27 厘米的塑料包装, 并将包装边缘固定到聚苯乙烯泡沫块 (图 1e) 的顶部表面, 以创建一个吊床。在吊床中加入中至3厘米深度的轴索特。未麻醉的轴突将沉入吊床底部, 以便通过塑料包装轻松进入腹侧 (图 1f)。
2. 麻醉轴突
- 将轴突浸入所需的麻醉剂 (苯并胺、ms-222 或异丙酚) 中。
- 检查镇静的最初迹象, 减少运动和增加失去纠正反射, 这出现在10分钟内的动物 & lt; 10 克 (& lt; 10 厘米) 和20分钟内的动物在10克和50克的体重 (10-22 厘米)。
- 检查是否完全缺乏身体活动、刺通气运动和纠正反射, 并确保动物对通过挤压数字之间的织带进行测试的中度疼痛刺激没有反应。
注: 尽管全身麻醉是在30分钟内完成的苯并胺麻醉轴突, 心功能是不稳定, 直到1小时。ms-222 或异丙酚麻醉轴突 (图 6a-f) 的情况并非如此。 - 为了在全身麻醉下保持轴突, 将动物保存在麻醉液中或包裹在湿纸湿巾中, 在麻醉溶液中浸湿。
注: 麻醉可以保持 7小时, 不会对动物的健康产生不利影响, 因为皮肤, 特别是刺保持湿润。 - 要重新唤醒轴索醇, 将动物转移到无麻醉介质。
注: 觉醒的第一个迹象是刺通风运动。动物应直立, 并在1小时内对刺激有反应。
3. 麻醉轴索洛特的二维超声心动图
- 将麻醉后的轴索醇放置在唇形动物床 (步骤 1.3.1-1.3.2) 的仰角位置。使用松散的橡皮筋使其不漂浮 (图 1c)。确保胸部表面被3-5 毫米的介质覆盖。
注: 对于短暂的收购 (& lt; 5分钟) 无麻醉剂介质可以应用。对于长时间采集, 麻醉溶液应作为超声介质应用, 以确保在整个测量过程中保持稳定的心功能。 - 将换能器放置在与动物长轴平行的胸腔区域的中线上 (图 2 a,图 3a/b,补充文件 2)。在白色和白化天轴上使用冷光源的透射照明, 以确保传感器的正确位置 (图 2c和补充文件 1)。
- 对于重量 & lt; 20 克的轴突, 使用 50 mhz 换能器;对于轴索 & gt; 20 克, 使用 40 mhz 换能器。确保颅骨前向的定位, 以实现标准化图像采集。如果不是这种情况, 请将传感器旋转180°或反转图像。
- 确保在长轴中线视图中, 心室的一小部分 (位于胸腔右侧,图 2 a) 出现在心室舒张的框架中, 左心房和左、右心房的很大一部分 (位于中心/在胸腔的左侧,图 2a) 和窦静脉可见, 在心房收缩和舒张 (图 3 a, b)。
- 将换能器向动物的右侧转换1-3 毫米, 以获得心室长轴视图 (图 2a)。当收缩期末端心室的横截面面积达到最大值时, 就会获得正确的位置 (图 3c-h)。
- 在 b 模式下, 在 "一般成像" (高空间/低时间分辨率) 或 "心脏病" (低时空分辨率) 模式下, 获得≥3个心脏周期, 具有 & gt; 50 帧。
注: 此视图允许评估心室功能。心室功能可以评估在两个维使用心室分数面积变化 (facv) 计算从室的最终舒张和结束收缩期横截面面积使用该方程:
(2)
轴索尔的心室假定球体的形状和基于几何的笔划体积 [sv (geo)] 可以使用公式计算:
(3) - 沿动物的长轴翻译换能器, 直到心室中心位于屏幕中央。顺时针旋转换能器90°, 以获得室中短轴视图 (图 5 a 和 b,补充文件 10)。通过沿心脏长轴平移换能器, 评估心室的圆形形状。
- 将传感器返回长轴平面, 并将其转换回中线或稍微向左的中线, 以获得心房长轴两个腔视图 (图 2 a)。确保通过确认收缩端心房的横截面面积达到最大值, 并且两个心房组合假定数字 "8" 向左倾斜 ~ 45°的轮廓, 以确保获得正确的位置 (图 4 a和 b,补充文件 6)。
- 在 b 模式下, 在 "一般成像" 或 "心脏科" 模式下, 获得≥3个心脏周期, 并具有 & gt; 50 帧。
注: 轴索尔的心房形状不规则, 不能从2d 数据中直接推断三维函数, 因此必须将其功能评估为基于两者的组合横截面面积 (csaa) 的心房分数面积机会 (faca) 等指数度量值, 如心房分数面积机会 (faca)。收缩期和舒张期心房:
(2) - 将换能器向右转换, 直到流出道 (动脉轴) 出现 (靠近心室长轴视图) (图 2a)。
注: 在前向离开心室后, 流出道会产生急弯, 并以一个小角度向腹侧表面运行, 然后再假设前向, 并分裂成刺分支和全身血管。- 确保通过确认流出的直径在心室末端收缩期达到最大值, 并在流出入口的三个半月阀中的两个在弹射中可见, 以确保达到正确的流出通道视图 (图 4e,补充文件 8)。
注: 向流出道中间部分的传感器方向的腹侧方向性允许使用多普勒成像进行速度和流量测量。
- 确保通过确认流出的直径在心室末端收缩期达到最大值, 并在流出入口的三个半月阀中的两个在弹射中可见, 以确保达到正确的流出通道视图 (图 4e,补充文件 8)。
- 应用彩色多普勒模式来绘制心脏弹射过程中流出道的血流速度图 (图 4f和补充文件 9)。同样, 应用彩色多普勒和功率多普勒成像来可视化室和心房的血流 (图 3-e-h,补充文件 4-5和图 4c-d, 以及补充文件 7)。
- 在向换能器运行的流出道部分的最大血速位置应用脉冲波 (pw) 多普勒模式。
- 使用高达45°的 "光束角度" 和 "角度校正" 来调整流出, 以适应与传感器表面不完全垂直的流出 (图 4g)。确保在心脏循环的任何阶段, pw 多普勒位置不会与流出的螺旋阀重叠 (图 4e)。
- 在 pw 多普勒模式中, 通过≥3个心脏周期获取速度数据。
- 返回到 b 模式, 并获得≥3心脏周期在完全相同的平面上的 pwv 被获得。
- 测量流出道中血流的速度时间积分 (vti), 作为一个完整心脏周期 (图 4g, g1) 的速度-时间曲线下的区域。
注: 从从 b 模式采集获得的收缩期末端流出道的 vti 和直径 (d) 中, 可以使用该公式计算基于 pw 多普勒的行程体积 [sv (pw)]:
(2)
心率 (hr) 是通过测量整个心脏周期的持续时间, 从速度时间曲线测量的。心脏输出 [co (pw)] 是使用公式计算的:
(3) - 通过旋转唇形床上的轴索尔 90°, 使动物的右部分朝上 (图 2b), 获得了一种可供测量流出道血流速度的替代视图。 倾斜和旋转传感器, 并将其平行放置, 只是在突出的刺后面 (图 2b)。通过确认流出道在 ~ 45°向下运行, 并且在弹射过程中心房出现在流出道下, 确保达到正确的位置 (图 5c,补充文件 11)。
- 在流出道的最大血流位置应用 pw doppler-mod, 从传感器中离开 (图 5d,补充文件 12)。使用高达45°的 "光束角度" 和 "角度校正" 来调整流出, 以适应与传感器表面不完全垂直的流出 (图 5e)。
- 在 pw 多普勒模式中, 血液速度超过≥3个心脏周期。
- 返回到 b 模式, 并获得≥3心脏周期在完全相同的平面上的 pwv 被获得。
注: sv (pw) 和 co (pw) 是使用上述公式4和公式 5为长轴视图计算斜副视图的。
(2)
(3)
(2)
(2)
(3)4. 非麻醉轴索洛特的二维超声心动图
- 将未麻醉的轴突放置在吊床中的俯卧位置 (步骤 1.3.3)。
- 让动物不受干扰 30-60, 从处理压力中恢复。
- 将超声波换能器放置在吊床中, 换能器头朝上向轴索醇。
- 在换能器上涂上超声波凝胶。
- 轻轻地, 在不干扰动物的情况下, 将换能器放置在与动物长轴平行的胸腔区域的动物中线上。
注: 这是相同的, 但倒置, 位置为麻醉轴索尔 (步骤 3.2)。 - 获取 b 模式、彩色多普勒模式、长轴和短轴视图中的 pw 模式数据, 如步骤 3.2-3.14 中所述。
注: 在未麻醉的轴突中, 无法获得斜副视图。在未麻醉的轴突中, 超声心动图数据应在刺通气运动 (休息动物10-20 秒) 之间获得。如果轴索醇在采集过程中移动, 则必须重复测量。
5. 评价二维超声心动图数据, 最大限度地降低主观性
- 通过进行操作内/操作器分析, 避免二维超声成像中的操作者偏差/观察者偏差, 并基于二维数据对心脏功能的三维评估, 包括数据采集和数据分析阶段的主观性。
注: 在开始研究和培训新人员时, 必须使用内/操作员/观察者分析来量化和尽量减少这种主观性。 - 通过一起执行6个共识测量 (包括两个工作台工作), 在两个人的设置中启动操作器/操作员 1 (经验较少的) 对操作员 2 (经验较丰富) 进行测试。超声系统 (操作) 和相关参数的后续分析 (观察)。
- 在操作人员和观察者之间达成共识, 并操作 (操作员/观察者 1) 超声系统, 以获取有关≥6只动物的相关数据 (操作 1.1)。
- 然后, 操作 (操作者/观察者 2) 超声系统以获取有关同一动物的数据 (操作 2.1)。
- 让动物恢复3天。此后, 重复 (操作员/观察者 1) 程序 (操作 1.2)。
- 分析 (操作人员/观察者 1) 所有测量数据 (操作 1.1; 操作 2.1; 操作 2.1; 操作 1.2/观察 1.1), 并在24小时后重复对操作员/观察者2的数据的分析 (操作 2.1.--观察 1.2)。
- 分析 (操作人员/观察者 2) 自己获得的数据 (操作 2.-观察 2.1)。请注意, 此分析获得的值被认为最接近真实值。
- 使用 bland-atman 绘图、qq 绘图、 t-测试 (相等均值) 和f-测试 (相等方差) (图6g), 评估所有获得参数之间的比较中的变化、趋势和偏差。
- 请注意, 操作1.1 与操作2.1 的比较显示了操作间的变化。
- 请注意, 第2.---观察1.1 与操作 2.---观察2.1 的比较表明了观察者之间的差异。
- 请注意, 第1.----观察1.1 和操作 1.2/观察1.1 的比较表明了操作人员内部的变化。
- 请注意, 操作2.1 与操作2.1 的比较, 显示了观察者内部的差异。
- 确保四种比较的平均值和变化无显著性差异;测量值之间的差异应在±1.96 标准偏差范围内, 并且不应出现大小值精度较低的趋势。
6. 麻醉轴突的三维超声心动图
- 3d 采集
- 将麻醉后的轴索醇放置在唇形动物床 (步骤 1.3.1) 的仰角位置。用松散的橡皮筋 (图 1c) 保护它不漂浮, 并确保胸部表面覆盖3-5 毫米的介质。3d 采集是一个漫长的过程, 因此应用麻醉溶液作为超声介质, 以确保在整个测量过程中稳定的心功能。
- 将换能器放置在胸腔区域中动物的中线上, 与动物的长轴平行 (用于矢状三维记录), 也可与长轴正交 (横向3d 记录)。
- 翻译平面内尺寸 (x和y) 和平面外尺寸 (z或切片) 中的传感器, 以确保在随后的3d 捕获中覆盖整个心脏区域。
- 通过选择 "一般成像" (高空间/低时间分辨率) 或 "心脏病" (低空间/高时间分辨率) 模式, 根据需要调整帧速率和空间分辨率。对于 0.33 hz & lt; hr & lt; 1 hz 使用在高空间分辨率 ("一般成像") 下获得的50个帧的时间分辨率, 从而使心脏循环重建为50-150 不同的阶段。
- 将 "2d 增益" 调整到原始 b 模式图像 (~ 5 db) 中几乎无法识别解剖结构的水平, 以提高最终重建中的信噪比。
- 对于每个切片 (z 级), 记录≥1, 000 帧。
- 一次翻译一个 z 分 z 的传感器,例如, 20μm 或 50μm, 并重复记录, 直到覆盖整个心脏区域。
- 3d 重建 (补充文件 13和14)。
- 将收购产品出口到数字成像和通信中的医学 dicom (小电子)。
注: 每个包含一组帧数的切片将组成一个文件。 - 确定整个心脏周期中的帧数。由于 hr 可能会随着时间的推移而变化, 因此请为第一个和最后一片确定这一点。设置每个周期的最高帧数, 作为以后可以降低的相位分辨率的初始上限估计 (步骤 6.2.8)。
- 确定裁剪边界, 并在 b 模式窗口周围使用不相关的空间。
注: 这些边界应在整个切片中保持不变。 - 将 rgb 彩色图像转换为32位。
- 使用公式计算堆栈中每个帧的相关值 (c) 以及第一个心脏周期中包含的帧数:
(5)
注: 以下
是第一个图像
中的
坐标 (i, j) 处像素的信号强度, 在第二张图像中是相同的, 
并且
是
平均强度和标准比较中的第一张和第二张图像的偏差, i和j分别是图像中的列数和行数。生成的相关值数组将具有每个心脏周期的帧数和每个切片的帧总数的乘积大小 (例如 , 图8中的75x1, 000 = 75, 000) (参见补充中的示例性脚本文件 16)。如果比较中的一个或两个图像的像素值标准偏差为零, 则无法计算相关值, 但这在超声图像中是极不可能的。 - 检测相关值数组中的局部最大值 (图 8a, 请参阅补充文件 17中的示例性脚本, 以自动检测本地最大值)。
- 使用该公式计算具有峰值相关值 (即匹配的心脏相) 的帧的二次平均q(avg):
(4)
其中n是与心相匹配的帧总数,
是 n 图像坐标 (i, j) 处像素的强度, 是 
(参见补充文件 18中的示例性脚本)。 - 对所有切片重复步骤 6.2.3-6.2.7。
- 选择具有易于识别的解剖结构 (例如, 中心室) 的切片 (参考切片), 并检查重建的组合平均一个心脏周期是否与一个周期 (即, 如果有额外的会导致多个心脏周期)。删除额外的阶段, 以产生一个心脏循环 (例如, 从图 8中的一个高估的75个周期 (实际上为1.07 周期) 到包含图 8中70个阶段的完全一个周期)。
- 在相邻切片 (测试切片) 上, 使用相关值公式 (公式 6) 将集合平均一个心周期t 堆栈与参考切片匹配为参考切片 (参见补充文件19中的示例性脚本)和补充文件 20)。
注: 虽然两个不相同的切片在心脏周期的任何时候都不会出现完全相似, 但具有足够小的步长 (例如, 20μm 或 50μm) 的相邻切片将具有明显的相似性, 从而导致相关性值最大值, 可转换为匹配阶段。 - 对所有切片重复步骤 6.2.9-6.2.10。
- 将整个3d 重建折叠成包含z切片和t帧的单个3d 标记图像文件格式 (tif), 或折叠成一叠 dicom 文件。
注: 可以在每个维度中绑定数据, 以减小大小、增加信噪比并生成各向同性数据 (平面内分辨率通常比平面外分辨率高出几倍)。
- 将收购产品出口到数字成像和通信中的医学 dicom (小电子)。
(5)
是第一个图像
中的
坐标 (i, j) 处像素的信号强度, 在第二张图像中是相同的, 
并且
是
平均强度和标准比较中的第一张和第二张图像的偏差, i和j分别是图像中的列数和行数。生成的相关值数组将具有每个心脏周期的帧数和每个切片的帧总数的乘积大小 (例如 , 图8中的75x1, 000 = 75, 000) (参见补充中的示例性脚本文件 16)。如果比较中的一个或两个图像的像素值标准偏差为零, 则无法计算相关值, 但这在超声图像中是极不可能的。
(4)
是 n 图像坐标 (i, j) 处像素的强度, 是 
(参见补充文件 18中的示例性脚本)。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
轴索特的心包内空间取决于动物的大小。较小的动物 (2-20 克, 7-15 厘米) 将有过多的心包液 (在超声心动图中显示黑暗) 周围的心脏腔, 而在较大的性成熟动物 (& gt; 20 克, & gt; 15 厘米) 腔将占据心包内的大部分空间。为了提供轴突心脏超声心动图视图的最佳结果,在图 3、图 4、图 5和图 9中应用了一种较小的动物 (10 克, 10 厘米)。
长轴视图通常提供了一个很好的概述心脏解剖轴索尔。进入中线平面与窦静脉, 房, 和部分心室在平面 (图 3a, b, 补充文件 2), 心室平面 (图 3c-h) 或心房平面 (图 4 a -d) 可以通过将传感器分别平移到动物的右侧或左侧来到达。脑室将出现球形和高度小梁 (图 3c,补充文件3-5), 而心房有一个更不规则的形状, 几乎没有小梁 (图 4 a, 补充文件 6,补充文件 7)。短轴视图 (图 5a, b, 补充文件 10) 提供了一个较不容易解释的概述的心脏解剖轴洛特心脏, 但它有助于正确的心脏收缩的评估 (例如., 在这个视镜平面上可以清楚地显示圆形心室的梗塞或非收缩区)。在长轴视图平面上, 流出道的中心与心室中心紧密相连 (图 2a, 将图 3c与图 4e和补充文件 3与补充文件8进行比较).由于流出道的软组织会在血液喷射时移动, 因此在用脉冲波多普勒测量的心脏周期中, 长轴和斜副面的高强度血液信号将与来自周围软组织的运动 (在速度中白色区域周围的灰色区域/时间曲线如图 4g和图 5e)。一般来说, 在测量速度时间积分时, 血液信号和软组织噪声之间的对比度应足以只分割血液信号 (图 4g (g1 放大倍率) 和图 5e (e1 放大倍率))。
为了对血流模式进行定性评估, 彩色多普勒和功率多普勒成像提供了不同心脏室的血流模式的可视化 (脑室:图 3e-h,补充文件 4, 补充文件 5;心房:图 4c, d,补充文件 7;流出段:图 4f,图 5d,补充文件 9,补充文件 12)。
用于实验室实验的轴突从2-4 克的幼虫后早期到10-30 克的完全成熟, 以及体重 & gt; 100 克的较大动物, 其大小也各不相同. 同样, 心功能和功能参数的一些绝对值取决于此类分析关于动物的大小。通常, 在不同大小的组中, 分数区域变化是不变的, 其值范围为 40-50% (对于较大的动物, 则倾向于较低的值)。行程体积高度依赖于动物的大小,即心脏的大小,例如,在5克轴索中20-30 微克 l, 在10克轴索中50-70 微克, 在50克轴索中250-300μl。心率和一定程度的脑卒中体积高度依赖于应用的麻醉和麻醉水平 (图 6a-f,图 7)。
传统的内部/操作器/观察者分析涉及图形表示 (q-q 地块和 bland-altman 图) 和相等均值 (t-测试) 和方差 (f-测试) 的测试, 以评估数据的正态分布并进行比较两个人之间的精度和精度 (图 6g)。
三维超声心动图为更传统的2d 采集增加了一个额外的维度 (z或深度)。这允许数据的多平面可视化 (图 9a)、重新排序 (图 9A)、曲面和卷重构 (图 9A、补充文件 13和补充文件 14)、分段和(图 9c,补充文件 15)。
图1。麻醉和非麻醉轴索尔超声心动图床和容器的制备.(a) 一块柔软的布折叠一次, 卷成 "玉米饼" 形。(b) 在水下扫描过程中, 两端向后弯曲并贴上胶带, 形成轴索醇的唇形床。(c) 对于麻醉轴索的2d 和3d 超声心动图, 动物被轻轻地放置在唇形床的缝隙中的仰角位置, 并用橡皮筋固定在下颌骨和肱骨的中部区域。(D, E)吊床是通过在一块聚苯乙烯泡沫上雕刻出一个方形的洞, 并在上面的表面贴上塑料包装来准备的。(f) 对于非麻醉轴索尔的二维超声心动图, 动物被放置在吊床的自然俯卧位置, 并从下面用凝胶覆盖的换能器尖端接近。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。换能器放置.(A、 B)轴相和短轴视图 (a) 和斜副视图 (b) 的传感器大致位置的轴索尔动脉网络模型。(c) 使用强大的冷光源进行透射照明, 可帮助在应用传感器之前找到心脏室的确切位置 (参见补充文件 1)。解剖缩写: a, 心房;oft, 流出道;新五、鼻窦;v, 心室。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。代表性长轴超声心动图视图的心室.(A、 B)典型的长轴中线视图在 b 模式 (黄线在图 2a) 在心室末端舒张期 (a) 和收缩端 (b) 阶段 (请参阅补充文件2的视频表示)。(C, D)心室室的长轴视图在 b 模式 (黑线在图 2 a) 在心室末端舒张期 (c) 和收缩端 (d) 阶段 (参见补充文件 3为视频表示)。(E-H)类似的视平面如 (a) 和 (b) 中的彩色多普勒 (cd) 和功率多普勒 (pd) 模式, 显示血液流动 (见补充文件 4和补充文件 5的 cd 和 pd 模式的视频表示,)。cd 模式图像中的红色表示血液流向传感器, 蓝色表示相反。心脏室和血流已突出与虚线。插入 (a) 和 (c) 中的卡通片显示了传感器的位置和相对于长轴中线视图的平移。解剖缩写: a, 心房;cdc (l), cuvier 左风管;oft, 流出道;新五、鼻窦;v, 心室。请点击这里查看此图的较大版本.
图4。代表性长轴超声心动图视图的心房和流出道.(A、 B)心房末端舒张期 (a) 和收缩期 (b) 期的心房长轴视图 (图 2a 中的绿线) (视频表示的补充文件 6 )。(C, D)在彩色多普勒 (cd) 模式下显示血液流动的类似视图平面 (如 (a) 和 (b) 中所示 (视频表示)。(e) 在弹射中期阶段 b 模式出道的长轴视图 (图 2 a 中的蓝线 ) ( 视频表示见补充文件 8 ) 。f:cd 模式中的类似视图平面 (e) 表示血液流动 (有关视频表示, 请参阅补充文件 9 )。(g) 脉冲波多普勒 (pw) 模式中的类似视面 (e) 和 (f), 允许热率检测和速度时间积分 (vti) 测量, 用于行程体积计算。cd 模式图像中的红色表示血液流向传感器, 蓝色表示相反。心脏室和血流已突出与虚线。黄色和红色箭头分别表示流出道根部的半瓣阀和流出道的螺旋阀。插入 (a) 和 (e) 中的漫画显示了传感器的位置和相对于长轴中线视图的平移。解剖缩写: a (r), 右心房;a (l), 左心房;oft, 流出道;新五、鼻窦;v、心室;vc, vena cava。请点击这里查看此图的较大版本.
图5。代表性短轴和斜副超声心动图视图的心室和流出道.(A、 B)在心室舒张期 (a) 和收缩端 ( b) 相的心室短轴视图 (图2 a 中的灰色线) (视频表示的补充文件 10 )。(c) 在弹射中期阶段 b 模式 (图2b 中的紫色线) 流出道的斜段视图 (视频表示见补充文件 11 )。(d) cd 模式中的类似视平 (c) 显示血液流动 (视频表示见补充文件 12 )。(e) 脉冲波多普勒 (pw) 模式中的 (c) 和 (d) 相似的视图平面, 允许热率检测和速度时间积分 (vti) 测量, 用于行程体积计算。cd 模式图像中的红色表示血液流向传感器, 蓝色表示相反。心脏室和血流已突出与虚线。插入 (a) 和 (c) 中的卡通片显示了传感器的位置和相对于长轴中线视图的平移。解剖缩写: a, 心房;oft, 流出道;新五、鼻窦;v, 心室。请点击这里查看此图的较大版本.
图6。心率和脑卒中体积测量的代表性结果, 麻醉的效果, 以及有代表性的手术内观察者分析.(A-C)随着时间的推移 (0小时处于完全麻醉状态) 绘制的6个轴突被麻醉在苯并胺 (a)、ms-222 (b) 和异丙酚 (c) 中的轴突的心率 (hr)。(D-F)脑卒中体积 (sv) 相对于非麻醉基线绘制随着时间的推移 (0小时是在充分麻醉), 用于在苯并胺 (d)、ms-222 (e) 和异丙酚 (f) 中麻醉的六个轴索洛特。(g) 笔划体积的操作内/观察者分析。bland-altman 图 [运算符 (op)/观测器 (obs) 与平均值 (avg) 绘制的差异 (obs)] 不应显示不同运算符和观察者获得的正常分布测量 (q-q 图) 中的系统偏差。对相等均值 (t-测试) 和相等方差 (f-测试) 的测试应显示操作者/观察者之间没有显著差异 (右下角的表)。a 个-f是根据《知识共享归因许可证》 (thygesen等人的图 1)提供的材料修改的。21).请点击这里查看此图的较大版本.
图7。用几何和脉冲波多普勒方法估计的行程体积比较.通过二维 b 模式几何 (地理) 测量或脉冲波多普勒测量对流出道流出道的血液速度进行的行程体积 (sv) 的比较。sv (geo) 和 sv (pw) 记录在相同的六个动物与秒在这两种测量类型之间, 并使用三种不同的麻醉剂, 苯 (蓝色倾斜的正方形), ms-222 (红色方块) 和异丙酚 (绿色三角) 之间的恢复一周应用不同的麻醉剂请点击这里查看此图的较大版本.
图8。具有代表性的三维超声心动图时空图像相关性.(a) 在 1, 000 帧 cine 数据集中, 每个心脏周期有75帧的相关操作的相关值的曲线表示。两个帧只有微小的差异, 表明匹配的心脏相, 将产生一个高相关值。随后, 可以在数据上应用局部最大值搜索算法来检测所有匹配帧。(b) 以图形方式表示与 (a) 中相同的数据。当通过比较第一个心脏周期和整个 cine 堆栈得到相关值时, 最大相关的对角线表示匹配的心相。请点击这里查看此图的较大版本.
图9。代表性3d 超声心动图.(一) 三维重建轴突心脏的多平面视图。时空图像相关程序允许重建一个完整的心脏周期与几个不同的阶段 (这里70阶段) 在三个空间维度, 然后可以切片作为一个想要的研究时空现象跳动的心脏。(b) 重建的115片3d 数据的三个横向切片。二次平均程序增强了血液与组织的对比度, 降低了信噪比, 从而可以更好地了解轴突心室的小梁特性, 并清晰地显示房间隔和流出道中的阀门。(c) 跳动的心脏的表面和容量表示在三个阶段沿颜色编码的分段模型 (参见补充文件 13和补充文件 14关于表面和容量被渲染的跳动的视频表示和补充文件15的三相分段交互式3d 模型)。解剖缩写: a, 心房;考, 尾生;cra, 颅内;dex, dexter (对动物的权利);多尔, 背侧;oft, 流出道;罪, 阴险 (对动物左);新五、鼻窦;v、心室;文腹请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件1。定位轴索尔中心脏室的流形.请参见图 2c。请点击此处下载此文件.
补充文件 2。长轴, 中线视图, b 模式.参见图 3 a, b。请点击此处下载此文件.
补充文件3。长轴, 心室视图, b 模式.参见图 3c, d。请点击此处下载此文件.
补充文件4。长轴, 心室视图, 彩色多普勒模式。参见图 3e, f。请点击此处下载此文件.
补充文件5。长轴, 心室视图, 动力多普勒模式。参见图 3g, h。请点击此处下载此文件.
补充文件6。长轴, 心房视图, b 模式.参见图 4 a, b。请点击此处下载此文件.
补充文件7。长轴, 心房视图, 彩色多普勒模式.参见图 4c, d。请点击此处下载此文件.
补充文件8。长轴, 流出道视图, b 模式。请参见图 4e。请点击此处下载此文件.
补充文件9。长轴, 流出道视图, 彩色多普勒模式.请参见图 4f。请点击此处下载此文件.
补充文件10。短轴, 心室视图, b 模式。参见图 5a, b。请点击此处下载此文件.
补充文件11。斜副格, 流出道视图, b 模式.请参见图 5c。请点击此处下载此文件.
补充文件12。斜副体, 流出线视图, 彩色多普勒模式.请参见图 5d。请点击此处下载此文件.
补充文件13。70级跳动心脏的三维表面渲染 (19.6 毫秒时间分辨率)。请参见图 9c。请点击此处下载此文件.
补充文件14。70阶段跳动心脏的三维体积渲染 (19.6 毫秒时间分辨率)。请参见图 9c。请点击此处下载此文件.
补充文件15。3个阶段心脏跳动的三维交互模型: 室室收缩期、室性中射室和心室室室期收缩期.请参见图 7c。交互式 pdf 文件应在 adobe acrobatreader 9 或更高版本中查看。要激活3d 功能, 请单击模型。使用光标, 现在可以旋转、缩放、平移模型, 并且在模型树中可以关闭或使模型的所有段保持透明度。模型树是包含可打开 (+) 的多个子图层的层次结构。请点击此处下载此文件.
补充文件16。代表性注释脚本计算的相关值的 1, 000 帧采集与上限估计为75帧/心脏周期.该脚本是用 ij1 宏语言编写的, 可以在 imagej 中作为批处理宏实现, 以计算整个z堆栈3d 数据的相关值 (每次采集 75, 000)。请点击此处下载此文件.
补充文件17。代表脚本自动峰值检测在一系列相关值从 1, 000 帧采集与上限估计为75帧/心脏周期。可以替换一系列相关值 (标记为黄色的列 b), 在激活宏 (ctrl + r) 后, 将显示选择匹配的心脏相位和执行二次平均的命令列表 (列 q, 标记为绿色)。请点击此处下载此文件.
补充文件18。代表性注释脚本, 以选择匹配的心脏相, 并执行二次平均1000帧采集与上限估计75框架/心脏周期 (列 q 在补充文件 17)。该脚本是用 ij1 宏语言编写的, 可以在 imagej 中作为宏实现, 以创建一个平均周期 (75个阶段) 2d 切片。请点击此处下载此文件.
补充文件19。用于计算70帧参考切片和相邻的75帧测试切片之间的相关值的具有代表性的注释脚本.该脚本是用 ij1 宏语言编写的, 可以作为宏在 imagej 中实现, 以计算相关值 (5, 250)。请点击此处下载此文件.
补充文件20。代表 excel 脚本, 用于在一系列相关值中自动检测70帧参考切片和相邻的75帧测试片之间的比较.可以替换一系列相关值 (标记为黄色的 c 列), 在激活宏 (ctrl + t) 后, 将显示要在测试切片中选择为子堆栈的切片列表 (列 l, 第2行, 标记为绿色)。测试切片子堆栈将具有与参考切片空间匹配的帧。请点击此处下载此文件.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
轴突和其他非哺乳动物物种中的超声心动图产生的数据与哺乳动物超声心动图有着根本不同的数据, 因为除成年哺乳动物外, 所有脊椎动物的红血球都有核化的性质。这导致一个明显的血液信号和较少血液对组织对比轴突超声心动图图像相比, 例如, 小鼠或人超声心动图。这可能会增加未处理单帧超声图像的图像分割难度, 因为很难区分血液和组织。然而, 这种现象可以是有利的, 当用于创建血液信号增强图像通过应用二次平均程序前面描述的 18 和修改的轴突超声心动图在协议第6节。由于血液斑点比软组织中的斑点更有活力, 二次平均将在这两个隔间之间产生明显的对比, 从而促进二维和三维图像分割。
该方案描述了三种不同的麻醉剂, 用于轴索醇, 这些麻醉剂以前经过过彻底的测试。苯并被原和 ms-222 都能刺激心率的增加, 这在压力条件下测试心脏功能是可取的。异丙酚在麻醉过程中对心脏的压力较小, 在采集时间超过非麻醉轴索运动久坐行为限度的情况下, 可作为非麻醉超声心动图的替代。
描述三维心脏的二维超声心动图受主观性的影响。因此, 在进行《议定书》第5节所述的实际实验之前, 必须进行和内部/操作员/操作人员----观察员分析。同样, 超声心动图测量应更多地被视为可用于研究不同情况下心脏功能的潜在差异的指数值, 而不是绝对值。由几何方程 (方程 2) 确定的冲程体积很少产生与脉冲波多普勒方程相同的绝对值 (方程 4;图 7), 并应决定在整个一系列实验中坚持哪种措施。sv (geo) 可以比 sv (pw) 更快地获得, 但心室形状的球形假设只适用于健康的均匀收缩心脏, 在疾病和再生模型中, 应考虑 sv (pw), 以便更好地反映真正的笔画音量。
协议第6节的相关和二次平均过程可以在几个不同的成像和数学包中实现。由于生命科学研究人员的编程技能和对软件包的访问方式千差万别, 我们一直在努力为大多数研究人员熟悉的软件包中的方法提供有代表性的脚本 (例如 excel )很容易接近和免费提供 (imagej: https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。补充文件 16-20提供了用 ij1 宏语言编写的注释示例性脚本和. xlsm 宏, 即使在编码方面的经验最少, 这些脚本也应该是可以理解的。
内在心脏再生是一种现象, 完全存在于小物种的心脏 (相对于人类), 因此, 在再生过程中, 基线心功能和功能进展的测量和成像受到心脏大小和大小的挑战。所应用的成像方式的空间分辨率。高频超声成像提供了一个理想的权衡之间的高平面空间分辨率 (~ 30 x 30μm 2在 50 mhz), 可与体内的微克 ct 成像, 远远高于体内μmri, 后者的深度为渗透 (约1厘米在 50 mhz) 比共聚焦显微镜大几倍, 和一个非常高的时间分辨率 (50-300 帧在 50 mhz, 1 厘米深度)。再加上传感器的手动或自动z尺寸运动, 超声波可实现心脏功能的无与伦比的重建和四个维度的解剖建模。此外, 该技术的非侵入性允许纵向实验。据我们所知, 目前还没有可用于高频微超声成像的矩阵阵列传感器。这项技术的发展将极大地帮助获取三维数据的小心脏, 如轴索尔的, 在一个更快的程序比机械移动传感器。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢奥胡斯大学生物科学研究所的卡斯珀·汉森提供了获取3d 超声心动图的电子微机械手并为其提供帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. |
References
- Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
- Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
- Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
- Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
- Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
- McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
- Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
- Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
- Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).
