Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

2D og 3D ekkokardiografi i Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Her præsenterer vi ekkokardiografi protokoller for to-dimensionelle og tre-dimensionelle billede erhvervelse af det bankende hjerte i axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), en model art i hjertet regenerering. Disse metoder tillade langsgående evaluering af hjertefunktion på et spatiotemporelle med høj opløsning.

Abstract

Hjerte fejl som følge af iskæmiske hjertesygdomme er en stor udfordring, og regenererende behandlinger til hjertet er i høj efterspørgsel. Et par model arter såsom zebrafisk og salamandre, der er i stand til at iboende hjerte regenerering holde løftet for fremtidige regenerative behandlinger for menneskelige patienter. For at evaluere resultatet af cardioregenerative eksperimenter er det bydende nødvendigt, at hjertefunktion kan overvåges. Axolotl salamander (A. mexicanum) repræsenterer en veletableret model art i regenerativ biologi at nå størrelser, der giver mulighed for evaluering af hjertefunktion. Formålet med denne protokol er at etablere metoder til reproducerbar måling af hjertets funktion i axolotl ved hjælp af ekkokardiografi. Anvendelsen af forskellige anæstetika (benzocain, MS-222 og propofol) er påvist, og erhvervelse af todimensionale (2D) ekkokardiografisk data i både bedøvede og sig Axolotler er beskrevet. 2D ekkokardiografi af tre-dimensionelle (3D) hjertet kan lider af unøjagtighed og subjektivitet målinger, og til at afhjælpe dette fænomen en solid metode, nemlig handelen/Inter-Diesel-operator/observatør analyse, til at måle og minimere denne skævhed er demonstreret. Endelig, en metode til at erhverve 3D ekkokardiografisk data af bankende axolotl hjerte med en meget høj spatiotemporelle opløsning og med udtalt blod til væv kontrast er beskrevet. Samlet set bør denne protokol give de nødvendige metoder til at evaluere hjertefunktion og model anatomi, og flow dynamics i axolotl ved hjælp af ultralyd imaging med programmer i både regenerativ biologi og generelle fysiologiske forsøg.

Introduction

Iskæmisk hjertesygdom er en førende årsag til dødsfald på verdensplan1,2. Selv om mange overleve et myokardieinfarkt på grund af hurtig og finjusteres medicinsk intervention, føre iskæmiske episoder hos mennesker ofte til fibrotisk ardannelse tilknyttet hypertrofi, elektriske fejl og et formindsket funktionelle kapacitet af hjertet . Denne mangel på regenerativ potentiale af hjertets væv er delt blandt pattedyr og selvom kontroversielle påstande om pattedyr hjerte regenerering er blevet rapporteret, disse har været begrænset til specifikke murine stammer3,4 og hypoxi behandlede mus5. Inden for hjerte regenerativ medicin og biologi er således generelt begrænset til ikke-pattedyr dyremodeller for at studere iboende hjerte regenerativ fænomener. Zebrafisk (Danio rerio) har i det seneste årti været etableret som den mest godt karakteriseret model for iboende hjerte regenerering6,7,8,9,10 . På grund af let laboratorium vedligeholdelse, en bred vifte af molekylære værktøjer til rådighed og en kort generationstid, er i zebrafisk veltilpasset som en model for genetiske og molekylære mekanismer bag hjerte udvikling og regeneration. Men minut dimensioner af zebrafisk hjertet gør det mindre velegnet til funktionel vurdering, og komplicerede kirurgiske procedurer og den ikke-tetrapodernes fylogeni af zebrafisk begrænser den fornuftige ekstrapolering af resultaterne af denne art, således begrunder anvendelsen af andre større tetrapodernes modeller. En af de tidligste modeller af hvirveldyr hjerte regenerering var en spiegelske padde, østlige newt (Notophthalmus viridescens)11, en art, som forbliver en værdifuld model12.

En anden spiegelske padde, den mexicanske axolotl (A. mexicanum) har i de seneste år ind scenen som en stor (op til 100 g af organ masse) og yderst laboratorium tilpasningsdygtige dyr model for en bred vifte af regenerativ discipliner spanning lemmer regenerering, rygmarvsskade, og cardiac regenerering13,14,15,16,17. Axolotl er meget modtagelig for funktionelle målinger af hjertet, ved hjælp af højfrekvente ekkokardiografi og fraværet af forkalkede strukturer på den ventrale side af hjertet giver mulighed for ultrasound imaging med et meget lavere niveau af billede artefakter (akustisk skygger og efterklang i særdeleshed) end observeret i andre model dyr med forkalkede brystbenet og ribben.

Følgende protokol beskriver flere forskellige metoder og præparater (figur 1, figur 2) at erhverve reproducerbare ekkokardiografisk målinger på axolotl hjertet i begge bedøvede (anvende tre forskellige anæstetika: benzocain, MS-222 og propofol) og unanesthetized dyr i to (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, Supplerende filer 1-12) og tre (figur 8, figur 9, Supplerende filer 13-14) rumlige dimensioner. Padder hjertet er tre-chambered (to forkamre og en enkelt ventrikel). Hjertets forkamre leveres af en stor sinus venosus og ventriklen munder ud i conus arteriosus udstrømning tarmkanalen (figur 2). Da de fleste vægt er traditionelt placeret på ventrikulær regenerering og mindre om inddrivelse af atria6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, denne protokol primært fokuserer på målinger af ventrikel funktion.

Padder ekkokardiografi er ikke velbeskrevet i litteraturen, og udviklingen af 2D metoderne beskrevet i denne hvidbog har været drevet af behovet for at bedste repræsenterer funktionaliteten af bankende axolotl hjerte i en given tid og eksperimentelle indstilling. Metoderne beskrevet her er således gældende i hjertet regenerativ eksperimenter hvor hjertefunktion gentagne gange kan overvåges i løbet af en regenereringsprocessen. Derudover kan metoderne, der anvendes i cardiophysiological eksperimenter på axolotl generelt eller ændret lidt for at spænde andre spiegelske eller anuran padder modeller (e.g.,Xenopus). Axolotl findes i flere forskellige stammer og farvevariationer (f.eks., vildtype, melanoid, hvid, albino, transgene hvid med grøn fluorescens protein udtryk), men disse egenskaber påvirker ikke foreneligheden af den Axolotl med den beskrevne protokol. Metoden beskrevet her til at erhverve 3D ekkokardiografisk data er en modificeret version af spatiotemporelle billede korrelation (STIC) teknik udviklet til klinisk ultralyd og kvadratiske gennemsnit, der er beskrevet tidligere i udviklingslandene kylling til at øge signal af blod pletter i bløddele i arter indeholdende nukleeret røde blodlegemer18,19. Denne metode giver mulighed for avanceret modellering af hjertets sammentrækning og beregnede fluid dynamik i axolotl hjerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedurer, der er foretaget i denne protokol var i overensstemmelse med den danske lovgivning for pleje og brugen af forsøgsdyr og forsøgene blev godkendt af det danske nationale Animal eksperimenter inspektorat (protokol # 2015-15-0201-00615).

1. præparater

  1. Forberede axolotl medium.
    1. Gælde høj kvalitet ikke-kemisk behandlet postevand som axolotl medium. Hvis dette er tilgængeligt, anvende 40% Holtfreter løsning.
    2. Forberede 40% (wt/vol) Holtfreter løsning ved at opløse 15.84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1.11 g MgSO4·7H2O og 0,288 g KCl i filtreret og deioniseret vand op til et volumen på 1 L.
  2. Gøre fordybelse anæstetika.
    1. Forbered benzocain (ethyl 4-aminobenzoat) bedøvelsesmiddel løsning ved at opløse 200 mg ethyl 4-aminobenzoat i 3 mL acetone og derefter opløse denne blanding i 1 L vand fra hanen eller 40% Holtfreters løsning.
    2. Forberede MS-222 (ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonic syre, også kendt som tricane) bedøvelsesmiddel løsning ved at opløse 200 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonic syre direkte i 1 L vand fra hanen eller 40% Holtfreters løsning.
    3. Forberede propofol (2,6-diisopropylphenol) bedøvelsesmiddel løsning ved at opløse 3,3 mg 2,6-diisopropylphenol i i 1 L vand fra hanen eller 40% Holtfreters løsning. Alternativt, fortyndes kommercielt premade løsning til 3,3 mg/L.
      Forsigtig: Propofol er en kraftfuld menneskelige anæstesi (intravenøst administreret) og skal håndteres med omhu, herunder i fortyndet form.
  3. Forberede seng og beholder til ekkokardiografi.
    1. Forberede ekkokardiografi læbe-formet animalske bed ved at folde en 70 cm x 55 cm stykke blød klud én gang og derefter rulle den ind i "burrito form" (figur 1A). Derefter bøje over enderne indtil de mødes og tape disse sammen (figur 1B).
    2. Dykke læbe formet struktur i axolotl medium til at rumme den bedøvede axolotl under ultrasound imaging. Sikre dyret struktur og forhindre flydende ved hjælp af løs gummi bands; Placer disse midten af mandibular og løbet af den sakrale region (figur 1 c).
      Bemærk: Elastikker bør ikke presse dyret, da dette vil påvirke Hæmodynamik.
    3. For 2D ekkokardiografi på sig Axolotler, forberede en hængekøje af udelader en 16 cm x 8 cm x 5 cm hul i en 33 cm x 27 cm x 5 cm blok af polystyrenskum (fx, låg fra en medium størrelse polystyren skum container) (fig. 1 d).
    4. Skub en 33 cm x 27 cm stykke plastic wrap gennem hullet og sikre kanterne af wrap til oversiden af polystyren skum blok (figur 1E) til at oprette en hængekøje. Tilføje axolotl medium til 3 cm dybde i hængekøjen. Den sig axolotl vil synke til bunden af hængekøjen giver nem ventrale adgang gennem plastikfolie (figur 1F).

2. bedøver Axolotler

  1. Fordyb axolotl i ønskede bedøvelsesmiddel løsning (benzocain, MS-222 eller propofol).
  2. Inspicér for første tegn på sedation, nedsat bevægelser og stigende tab af oprettende refleks, det ser ud inden for 10 min i dyr < 10 g (< 10 cm) og inden for 20 min på dyr mellem 10 g og 50 g af body mass (10-22 cm).
  3. Inspicér for komplet manglende kropsbevægelser, gill ventilation bevægelser og oprettende refleks, og sørg for, at dyret er ikke-responderende til moderate smerter stimulation testet ved at klemme gjorden mellem cifre.
    Bemærk: trods, at generel anæstesi er gennemført inden for 30 min i benzocain bedøvede Axolotler, hjertefunktion er ikke stabiliseret indtil 1 h. Dette er ikke tilfældet i MS-222 eller propofol bedøvede Axolotler (figur 6A-F).
  4. For at opretholde axolotl ind under general anesthesia, holde dyr i anæstesi løsning eller indpakket i vådt papir servietter chloroformvædet i anæstesi løsning.
    Bemærk: Anæstesi kan vedligeholdes for 7 h uden skadelige virkninger på dyrs velbefindende, at huden og især gællerne holdes fugtig.
  5. For at reawake axolotl, overføre dyret til anæstesi-frit medium.
    Bemærk: Det første tegn på opvågning er gill ventilation bevægelser. Dyret skal være oprejst og lydhøre over for stimulation i 1 h.

3. 2D ekkokardiografi på bedøvede Axolotl

  1. Sted bedøvede axolotl i en liggende stilling i læbe-formet animalske sengen (trin 1.3.1-1.3.2). Sikre det fra flydende ved hjælp af løs elastikker (figur 1 c). Sikre at den thorax overflade er dækket af 3-5 mm medium.
    Bemærk: For en kort erhvervelse (< 5 min) anæstesi-frit medium kan anvendes. For langvarig erhvervelse, bør bedøvende løsning anvendes som ultralyd medium at sikre stabile hjertefunktion hele målinger.
  2. Placere transduceren over midterlinjen af dyret i regionen thorax parallelt med denne akse af dyret (figur 2A, figur 3A-B, supplerende fil 2). Brug ved gennemlysning med en kold lyskilde på hvide og albino Axolotler til at sikre den korrekte anbringelse af transducer (figur 2 c og supplerende fil 1).
    1. Axolotler vejer < 20 g, bruge en 50 MHz transducer; for Axolotler > 20 g, bruge en 40 MHz transducer. Sikre positionering af kraniel/anterior retning til højre for standardiseret billede erhvervelse. Hvis dette ikke er tilfældet rotere transduceren 180 ° eller inverter billedet.
  3. Sørg for, i den lange akse midterlinje opfattelse, en lille del af ventriklen (placeret til højre i brysthulen, figur 2A) vises i rammen på ventrikulær diastolen og en stor del af de højre og venstre forkamre (placeret på center / lidt mod venstre i brysthulen, figur 2A) og sinus venosus ses både i atriale systole og diastole (figur 3A, B).
  4. Oversætte transducer 1-3 mm mod dyrets ret til at hente visningen ventrikulær længdeakse (figur 2A). Den korrekte position er nået, når tværsnitsareal af ende-systole ventrikel er med maksimal (figur 3 c-H).
  5. I B-mode, erhverve ≥ 3 hjerte cyklusser med > 50 rammer/s i enten generelle imaging (høj fysisk/lav tidsmæssige opløsning) eller «cardiology «(lav fysisk/høj tidsmæssige opløsning) tilstand.
    Bemærk: Denne visning giver mulighed for evaluering af ventrikel funktion. Ventrikel funktion kan evalueres i to dimensioner ved hjælp af den ventrikulære fraktioneret område ændring (FACv) beregnes ud fra den ende-diastolisk og ende-systolisk integrationskugle af ventrikel (CSAv) ved hjælp af ligningen:
    Equation 1(1)
    Axolotl's ventrikel antager form af en kugle og en geometri baseret slagtilfælde volumen [SV(geo)] kan beregnes med ligningen:
    Equation 2(2)
  6. Oversætte transducer langs længdeaksen på dyret, indtil midten af ventriklen er i midten af skærmen. Rotere transducer 90 ° med uret for at hente visningen midten af ventrikulær kort akse (figur 5A og B supplerende fil 10). Evaluere den cirkulære form af ventrikel ved at oversætte transducer langs længdeaksen på hjertet.
  7. Returnere transduceren med køretøjets længdeakse og oversætte det tilbage mod midterlinjen eller lidt til venstre for midterlinjen hente visningen atrieflimren længdeakse to kammer (figur 2A). Sørg for, at den korrekte position er nået ved at bekræfte at tværsnitsareal af ende-systole atria er på deres maxima og to forkamre kombineret antager omridset af nummeret '8' på skrå ~ 45 ° mod venstre (fig. 4A og B, Supplerende fil 6).
  8. I B-mode erhverve ≥ 3 hjerte cyklusser med > 50 rammer/s i enten 'generelle billeddannelse' eller 'kardiologi' tilstand.
    Bemærk: Axolotl's atria er uregelmæssig i form og 3D funktion kan ikke direkte udledes af 2D data, dermed deres funktion skal vurderes som en indeks foranstaltning som atrial fraktioneret område chance (FACa) baseret på den kombinerede integrationskugle (CSAa) af begge atrieflimren kamre i systole og diastole:
    Equation 3(3)
  9. Oversætte transduceren mod højre indtil udstrømning tarmkanalen (conus arteriosus) vises (tæt på visningen ventrikulær længdeakse) (figur 2A).
    Bemærk: Efter at have forladt ventrikel i en anterior retning, udstrømning tarmkanalen gør et skarpt sving og kører i en lille vinkel mod den ventrale overflade før igen antager en anterior retning og opdele i gill grene og systemisk fartøjer.
    1. Sørg for, at den korrekte udstrømning tarmkanal opfattelse opnås ved at bekræfte, at diameteren af udstrømningen er på sit maksimum på ventrikulær ende-systolen og to af de tre semilunarklapperne ved indgangen til udstrømningen er synlige på midten udslyngning (figur 4E, Supplerende fil 8).
      Bemærk: Den ventrale direktionalitet mod transducer af den mellemliggende del af udstrømning tarmkanalen giver mulighed for hastighed og flow måling ved hjælp af Doppler afbildning.
  10. Anvende farve Doppler-tilstand for at knytte blod flow hastigheder i udstrømning tarmkanalen under hjerte udslyngning (figur 4F og supplerende fil 9). Ligeledes gælde farve Doppler og Power Doppler imaging for at visualisere blodgennemstrømningen i de ventrikulære og atriale visninger (figur 3E-H, Supplerende filer 4-5 og figur 4 c-D, og supplerende fil 7).
  11. Anvende puls bølge (PW) Doppler-mode på maksimal blod velocity stilling i del af udstrømning tarmkanalen kører mod transduceren.
    1. Bruge 'stråle vinkel' og 'kantede korrektion' op til 45 ° at justere for udstrømningen ikke bliver helt vinkelret på ansigt af transducer (figur 4 g). Sørg for, at PW Doppler holdning ikke overlappes af spiral ventilen af udstrømningen i enhver fase af hjertets cyklus (figur 4E).
  12. I PW-Doppler-tilstand erhverve velocity klokkeslætsdata over ≥ 3 hjerte cyklusser.
  13. Tilbage til B-mode og erhverve ≥ 3 hjerte cyklusser på den nøjagtige samme fly som PWV blev anskaffet.
  14. Foranstaltning velocity tiden integreret (VTI) af blodgennemstrømningen i udstrømning tarmkanalen som arealet under hastighed/tid kurven for en fuld hjertets cyklus (figur 4 g, g1).
    Bemærk: Fra VTI og diameter (d) af udstrømning tarmkanalen ved udgangen-systole fremstillet af B-mode erhvervelse, en PW-Doppler baseret slagtilfælde volumen [SV(pw)] kan beregnes med ligningen:
    Equation 4(4)
    Puls (HR) måles fra hastigheden/tid kurven ved at måle varigheden af en hel hjertets cyklus. Minutvolumen [CO(pw)] beregnes ud fra ligningen:
    Equation 5(5)
  15. Opnå skrå paragill opfattelse, en opfattelse, der tilbyder et alternativ til måling af blod flow hastighed i udstrømning fordøjelseskanalen, ved at dreje axolotl 90 ° i læbe formet bed på en sådan måde, at den rigtige del af dyret vender opad (figur 2B). Vinkel og rotere transduceren og Placer det parallelle og lige posteriort for de fremspringende gæller (figur 2B). Sørg for, at den korrekte position er nået ved at bekræfte, at udstrømning tarmkanalen kører nedad på ~ 45 ° og at hjertets forkamre vises under udstrømning tarmkanalen under udslyngning (figur 5 C, supplerende fil 11).
  16. Anvende PW-Doppler-mode på maksimal blod velocity stilling i del af udstrømning tarmkanalen kører væk fra transduceren (figur 5 d, supplerende fil 12). Bruge 'stråle vinkel' og 'kantede korrektion' op til 45 ° at justere for udstrømningen ikke bliver helt vinkelret på ansigt af transducer (figur 5E).
  17. I PW-Doppler-mode erhverve blod hastighed over ≥ 3 hjerte cyklusser.
  18. Tilbage til B-mode og erhverve ≥ 3 hjerte cyklusser på den nøjagtige samme fly som PWV blev anskaffet.
    Bemærk: SV(pw) og CO(pw) er beregnet for de skrå paragill visningen ved hjælp af ligning 4 og ligning 5 som beskrevet ovenfor for visningen længdeakse.

4. 2D ekkokardiografi på sig Axolotl

  1. Placer den sig axolotl i en udsat position i hængekøje (trin 1.3.3).
  2. Lad dyret uforstyrret i 30-60 min. til at inddrive fra håndtering af stress.
  3. Placer ultralyd transducer med transducer hovedet opad mod axolotl i hængekøjen.
  4. Anvende ultralyd-gel på transduceren.
  5. Forsigtigt og uden at forstyrre dyret, placere transduceren over midterlinjen af dyret i regionen thorax parallelt med denne akse af dyret.
    Bemærk: Dette er den samme, men omvendt, holdning med hensyn til den bedøvede axolotl (trin 3.2).
  6. Få B-mode, farve Doppler tilstand, PW mode data i længdeakse og korte akse visningen som beskrevet i trin 3.2-3.14.
    Bemærk: En skrå paragill opfattelse er uopnåelig i den sig axolotl. Ekkokardiografisk dataene i sig Axolotler skal erhverves mellem gill ventilation bevægelser (en 10-20 s periode for en hvile dyret). Hvis axolotl flytter under erhvervelse, skal målingerne gentages.

5. vurdere 2D ekkokardiografi Data og minimere subjektivitet

  1. Undgå operatør/observatør bias i 2D ultrasound imaging og 3D evaluering af hjertefunktion baseret på 2D data forårsaget af subjektivitet i både dataopsamling og analysefasen data ved at udføre intra/Inter-Diesel-operator/observatør analyse20.
    Bemærk: I opstart af undersøgelser og når uddannelse af nyt personale denne subjektivitet skal kvantificeres og minimeret ved hjælp af samhandelen/Inter-Diesel-operator/observatør analyse.
  2. Indlede intra/Inter-Diesel-operator/observatør analyse i en to-personers setup med operatør/observatør 1 (mindre erfarne) bliver testet mod operatøren/observatør 2 (mere erfarne) ved at udføre ≥ 6 konsensus målinger sammen, herunder både bænk arbejde på ultralyd system (drift) og efterfølgende analyse af relevante parametre (observation).
  3. Skabe enighed mellem operatører og observatører og drive (operatør/observatør 1) ultralyd system for at tilvejebringe relevante data på ≥ 6 dyr (operation 1.1).
  4. Direkte efter, drive (operatør/observatør 2) ultralyd system for at tilvejebringe relevante data om de samme dyr (operation 2.1).
  5. Lad dyr inddrive i 3 dage. Derefter gentage (operatør/observatør 1) procedure (operation 1.2).
  6. Analysere (operatør/observatør 1) alle målte data (operation 1.1/observation 1.1; operation 2.1/observation 1.1, operation 1,2/observation 1.1) og efter 24 h Gentag analyse af operatør/observatør 2's data (operation 2.1/observation 1.2).
  7. Analysere (operatør/observatør 2) data erhvervet af hende selv (operation 2.1/observation 2.1). Bemærk at de værdier, der opnås ved denne analyse anses tættest på de sande værdier.
  8. Vurdere variation, tendenser og skævhed i sammenligninger mellem alle erhvervede parametre ved hjælp af Bland-Atman plotte, QQ plotte, t-test (lig middelværdien) og F-test (med ens varians) (figur 6 g).
    1. Bemærk, at operation 1.1/observationen 1.1 versus operation 2.1/observation 1.1 sammenligning viser Inter operator variation.
    2. Bemærk, at operation 2.1/observationen 1.1 versus operation 2.1/observation 2.1 sammenligning viser den indbyrdes observatør variation.
    3. Bemærk, at operation 1.1/observationen 1.1 versus operation 1,2/observation 1.1 sammenligning viser intra-operatør variationen.
    4. Bemærk, at operation 2.1/observationen 1.1 versus operation 2.1/observation 1.2 sammenligning viser intra-observatør variationen.
  9. Sørg for at middelværdi og variation af forskellige måleenheder, er ikke-væsentligt anderledes for de fire sammenligninger; forskellen mellem målte værdier skal falde inden for ± 1,96 standardafvigelser, og der bør vises ingen tendenser mod mindre præcision af hverken små eller store værdier.

6. 3D ekkokardiografi på bedøvede Axolotl

  1. 3D erhvervelse
    1. Placer den bedøvede axolotl i en liggende stilling i læbe-formet animalske sengen (trin 1.3.1). Sikre det fra flydende ved hjælp af løs elastikker (figur 1 c) og sørg for, at den thorax overflade er dækket af 3-5 mm medium. 3D erhvervelse er en langvarig procedure, derfor anvende bedøvelsesmiddel løsning som ultralyd medium at sikre stabile hjertefunktion hele målinger.
    2. Placere transduceren over midterlinjen af dyret i thorax regionen enten parallelt med denne akse af dyr (til en sagittal 3D optagelse) eller ortogonale i forhold til den lange akse (tværgående 3D optagelse).
    3. Oversætte transducer i dimensionen i fly (x og y) og ud af flyet dimension (z eller skive) til at sikre, at hele hjerte regionen vil blive dækket i de efterfølgende 3D capture.
    4. Justere den indramme sats og rumlige opløsning som ønsket ved at vælge enten generelle imaging (høj fysisk/lav tidsmæssige opløsning) eller «cardiology «(lav fysisk/høj tidsmæssige opløsning) tilstand. Til 0,33 Hz < HR < 1 Hz bruger en tidsmæssig opløsning på 50 rammer/s fremstillet med høj rumlige opløsning (generelle imaging), der giver mulighed for den kardiale cyklus skal genopbygges i 50-150 forskellige faser.
    5. Justere "2D gain" til et niveau, hvor anatomiske strukturer er næppe genkendelige i raw billedet for B-mode (~ 5 dB) at øge signal-til-støj-forholdet i de endelige rekonstruktioner.
    6. For hver skive (z trin), registrere ≥ 1.000 rammer.
    7. Oversætte transducer et z skridt ad gangen, f.eks., 20 µm eller 50 µm, og Gentag optagelse indtil hele hjerte regionen er dækket.
  2. 3D rekonstruktion (supplerende filer 13 og 14).
    1. Eksportere erhvervelser i Digital Imaging og kommunikation i Medicine DICOM (little endian).
      Bemærk: Hver skive, der indeholder et angivet antal rammer vil sammensætte en enkelt fil.
    2. Bestem antallet af rammer i en fuld hjertets cyklus. HR kan variere over tid, hvilken dette for både først og den sidste skive. Angiv det højeste antal rammer pr. cyklus, som den indledende øvre vurdering i fase beslutning, der kan senere blive reduceret (trin 6.2.8).
    3. Bestemme afgrøde grænser og punktafgifter irrelevant plads omkring vinduet B-tilstand.
      Bemærk: Disse grænser skal være konstant gennem hele skiver.
    4. Konvertere RGB farve billedet til 32-bit.
    5. Beregne korrelationen værdi (C) for hver ramme i stakken og antal billeder inkluderet i den første hjerte cyklus ved hjælp af formlen:
      Equation 6(6)
      Bemærk: Her Equation 7 er signal intensiteten af pixel på koordinat (i, j) i det første billede Equation 8 og er den samme i det andet billede, Equation 9 , Equation 10 og Equation 11 , Equation 12 er den gennemsnitlige intensitet og standard afvigelse, henholdsvis det første og andet billede i sammenligning, og jeg og J er antallet af kolonner og rækker i billedet. Den resulterende matrix af korrelation værdier vil have størrelsen af produktet af antallet af billeder per hjertets cyklus og det samlede antal rammer pr. Skive (f.eks.75 × 1.000 = 75.000 i figur 8) (Se eksemplarisk script i tillægs Fil 16). Correlation-værdi kan ikke beregnes, hvis en eller begge af billeder i sammenligningen har en standardafvigelse af pixelværdier på nul, dog dette er meget usandsynlig i ultralydsundersøgelser billeder.
    6. Afsløre lokale maxima i vifte af korrelation værdier (figur 8A, se eksemplarisk script i supplerende fil 17 til automatisk registrering af lokale maxima).
    7. Beregne kvadratiske gennemsnit Q(AVG) af rammer med peak korrelation værdier (dvs., matchende hjerte faser) ved hjælp af formlen:
      Equation 14(7)
      hvor N er det samlede antal rammer med matchende hjerte faser, Equation 15 er intensiteten af pixel på koordinat (i, j) af nth billede og Equation 16 er den timelige middelværdien af Equation 17 af nth billede (Se eksemplarisk script i supplerende fil 18).
    8. Gentag trin 6.2.3-6.2.7 for alle udsnittene.
    9. Marker et udsnit (reference slice) med let genkendelige anatomiske strukturer (f.eks.midten af ventrikulær) og kontrollere, hvis den rekonstruerede ensemble i gennemsnit ét hjerte cyklus svarer til nøjagtig en cyklus (dvs., hvis der er yderligere faser, hvilket resulterer i mere end ét hjerte cyklus). Slette flere faser for at give præcis ét hjerte cyklus (f.eks.går fra en overvurderet 75 faser/cyklus (i virkeligheden, 1.07 cyklus) i figur 8 til nøjagtig en cyklus, der indeholder 70 faser i figur 8).
    10. På den nærliggende Skive (test slice) slags ensemblet gennemsnit én hjertets cyklus t-stak ind matchende hjerte faser med reference skive ved hjælp af formlen korrelation værdi (ligning 6) (Se eksemplarisk scripts i supplerende fil 19 og supplerende fil 20).
      Bemærk: Selvom to ikke-identiske skiver ikke vises helt svarer på ethvert tidspunkt i løbet af hjertets cyklus, tilstødende udsnit med et tilstrækkeligt små trin størrelse (f.eks., 20 µm eller 50 µm) vil have en udtalt ligheder resulterer i sammenhæng værdi maxima, der kan oversættes til matchende faser.
    11. Gentag trin 6.2.9-6.2.10 for alle udsnittene.
    12. Skjule den hele 3D rekonstruktion, i en enkelt 3D Tagged Image File format (TIF) indeholdende z skiver og t rammer eller i en stak af DICOM-filer.
      NOTE: Data kan blive arkiveret lodret i hver dimension for at reducere størrelsen, øge signal / støj-forhold og generere isotropisk data (i flyet opløsning er normalt flere folder højere end ud af flyet opløsning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intrapericardial plads i axolotl er afhængig af størrelsen på dyret. Mindre dyr (2-20 g, 7-15 cm) vil have et overskud af perikardial væske (optræder mørke i ekkokardiografi) omkring hjertets kamre boer i større kønsmodne dyr (> 20 g, > 15 cm) kamrene vil besætte de fleste af de intrapericardial plads. For at skabe det bedste overblik for repræsentative resultater af ekkokardiografisk udsigt over axolotl hjertet, blev en mindre dyr (10 g, 10 cm) anvendt til figur 3, figur 4, figur 5og figur 9.

Visningen længdeakse generelt giver et godt overblik over hjertets anatomi i axolotl. Ind på midterlinjen flyet med sinus venosus, forkamre og en del af ventriklen i flyet (figur 3A, B, supplerende fil 2), enten det ventrikulære planet (figur 3 c-H) eller atrieflimren planet (figur 4A -D) kan nås ved at oversætte transducer til højre eller venstre for dyret, henholdsvis. Ventriklen vises sfæriske og meget trabeculated (figur 3 c, supplerende filer 3-5), hvorimod hjertets forkamre har en mere uregelmæssig form og næsten ingen trabeculation (figur 4A, Supplerende fil 6, supplerende fil 7). Visningen kort akse (figur 5A, B, supplerende fil 10) giver en mindre let fortolkelige oversigt over hjertets anatomi af axolotl hjerte, men det bidrager til evalueringen af korrekte hjertets sammentrækning (f.eks. infarcted eller ikke-kontraherende zoner af den cirkulære ventrikel er klart visualiseret i denne Se plan). I længdeakse Se fly, er midten af udstrømning tarmkanalen placeret tæt på midten af ventrikel (figur 2A, og Sammenlign figur 3 c med figur 4E og supplerende fil 3 med supplerende fil 8 ). Da det bløde væv i udstrømning tarmkanalen vil være at flytte ved blod udslyngning, høj intensitet blod signal under en hjertets cyklus målt af pulse wave Doppler i både længdeakse og skrå paragill fly vil være stødte op ved lav intensitet støj fra de bevægelser af det omgivende bløde væv (grå område omkring hvide område i hastighed/tid kurve i figur 4 g og figur 5E). Generelt bør kontrasten mellem blod signal og blødt væv støj være stor nok til segment kun blod signal når måling velocity time integral (figur 4 g (g1 forstørrelse) og figur 5E (e1 forstørrelse)).

For kvalitativ vurdering af blod flow mønstre, farve Doppler og power Doppler imaging levere visualiseringer af flow mønstre i forskellige hjertets kamre (ventrikel: figur 3E-H, supplerende fil 4, Supplerende fil 5; forkamre: figur 4 C, D, supplerende fil 7; udstrømning tarmkanalen: figur 4F, figur 5 D, supplerende fil 9, supplerende fil 12).

Axolotler anvendes til laboratorie eksperimenter varierer i størrelse fra den tidlige post larve fase af 2-4 g til fuld modenhed på 10-30 g og større dyr vejer > 100 g. ligeledes, hjertefunktion og nogle absolutte værdier af funktionelle parametre beskrevet her afhænge på størrelsen af dyrene. Generelt, fraktioneret område change er konstant i forskellige størrelse grupper med værdier spænder på 40-50% (skæv mod lavere værdier for større dyr). Slagtilfælde volumen er meget afhængig af størrelsen på dyret, dvs, størrelsen af hjertet, lige fra fx 20-30 µL i 5 g Axolotler, 50-70 µL i 10 g Axolotler og 250-300 µL i 50 g Axolotler. Heart rate og nogle grad slagtilfælde volumen er meget afhængigt af det anvendte bedøvelsesmiddel og niveauet for anæstesi (figur 6A-F, figur 7).

Traditionelle intra/Inter-Diesel-operator/observatør analyse involverer grafiske repræsentationer (Q-Q Plots og Bland-Altman parceller) og testning for lig middelværdi (t-test) og varians (F-test) at evaluere normal fordeling af data og sammenligne nøjagtighed og præcision mellem to personer (figur 6 g).

3D ekkokardiografi tilføjer en yderligere dimension (z eller dybde) til de mere traditionelle 2D erhvervelse. Dette giver mulighed for multi planar visualisering af data (figur 9A), reslicing (figur 9B), overflade og volumen rekonstruktioner (figur 9 c, supplerende fil 13og supplerende fil 14) og segmentering og generation af 3D-modeller (figur 9 C, supplerende fil 15).

Figure 1
Figur 1. Forberedelse af sengen og beholder til ekkokardiografi af bedøvede og unanesthetized axolotl. (A) A blødt stykke stof er foldet en gang og rullet ind i "burrito" form. (B) enderne er bøjet tilbage og tapede for at danne en læbe formet bed for axolotl under undersøiske scanning. (C) For 2D og 3D ekkokardiografi af en bedøvede axolotl, dyret placeres forsigtigt i en liggende stilling i sprække af læbe formet bed og fast med elastikker over midten af mandibular og sakrale regionen. (D, E) En hængekøje er udarbejdet af udelader et firkantet hul i et stykke af polystyren skum og tape plast wrap den øverste overflade. (F) For 2D ekkokardiografi af en sig axolotl, dyret er anbragt i en naturlig udsat position i hængekøjen og nærmede sig med en gel overdækket transducer tip fra nedenunder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Transducer placering. (A, B) Model af axolotl arteriel netværk med den omtrentlige placering af tryktransduceren for længdeakse og korte axis view (A) og skrå paragill view (B). (C) ved gennemlysning med en kraftig kold lyskilde kan støtte i at finde den nøjagtige placering af hjertets kamre før du anvender transduceren (Se supplerende fil 1). Anatomiske forkortelser: A, forkamre; OFT, udstrømning tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentative længdeakse ekkokardiografisk udsigt over ventriklen. (A, B) Typiske længdeakse midterlinjen Se i B-mode (gul linje i figur 2A) i ventrikulær ende-diastolisk (A) og ende-systolisk (B) faser (Se supplerende fil 2 video repræsentation). (C, D) Lange akse visning af ventrikel i B-mode (sort linje i figur 2A) i den ventrikulære ende-diastolisk (C) og ende-systolisk (D) faser (Se supplerende fil 3 video repræsentation). (E-H) Lignende se flyet som i (A) og (B) i farve Doppler (CD) og power Doppler (PD) tilstand viser blood flow (Se supplerende fil 4 og supplerende fil 5 video repræsentation af CD - og PD-tilstand, henholdsvis). Røde farver i CD-billeder angive blodet strømmer mod transduceren og blå farver viser modsat. Hjertets kamre og blodgennemstrømningen er blevet fremhævet med stiplede linjer. Indsatte tegnefilm i (A) og (C) Vis placeringen af transducer og oversættelse i forhold til den lange akse midterlinjen Se. Anatomiske forkortelser: A, forkamre; DC(L), forlod kanalen af Cuvier; OFT, udstrømning tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Repræsentative længdeakse ekkokardiografisk udsigt over hjertets forkamre og udstrømning tarmkanalen. (A, B) Lange akse visning af hjertets forkamre i B-mode (grøn linje i figur 2A) i atrieflimren ende-diastolisk (A) og ende-systolisk (B) faser (Se supplerende fil 6 video repræsentation). (C, D) Lignende se flyet som i (A) og (B) i farve Doppler (CD) tilstand viser blood flow (Se supplerende fil 7 video repræsentation). (E) længdeakse visning af udstrømning tarmkanalen i B-mode (blå linje i figur 2A) i midten udslyngning fase (Se supplerende fil 8 video repræsentation). F: Lignende se flyet som i (E) i CD-mode demonstrerer blod flow (Se supplerende fil 9 video repræsentation). (G) lignende se flyet som i (E) og (F) i pulse wave Doppler (PW) tilstand giver mulighed for varme sats påvisning og velocity integreret (VTI) tidsmåling for slagtilfælde volumen beregning. Røde farver i CD-billeder angive blodet strømmer mod transduceren og blå farver viser modsat. Hjertets kamre og blodgennemstrømningen er blevet fremhævet med stiplede linjer. Gule og røde pilespidser angive semilunar ventiler på roden af udstrømning tarmkanalen og spiral ventilen i udstrømning fordøjelseskanalen, henholdsvis. Indsatte tegnefilm i (A) og (E) Vis placeringen af transducer og oversættelse i forhold til den lange akse midterlinjen Se. Anatomiske forkortelser: A(R), højre atrium; A(L), venstre atrium; OFT, udstrømning tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikel; VC, vena cava. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Repræsentative kort akse og skrå paragill ekkokardiografisk visninger af ventrikel og udstrømning tarmkanalen. (A, B) Korte akse visning af ventrikel i B-mode (grå linje i figur 2A) i den ventrikulære ende-diastolisk (A) og ende-systolisk (B) faser (Se supplerende fil 10 video repræsentation). (C) skrå paragill visning af udstrømning tarmkanalen i B-mode (lilla linje i figur 2B) i midten udslyngning fase (Se supplerende fil 11 video repræsentation). (D) lignende se flyet som i (C) i CD-mode demonstrerer blood flow (Se supplerende fil 12 video repræsentation). (E) lignende se flyet som i (C) og (D) i pulse wave Doppler (PW) tilstand giver mulighed for varme sats påvisning og velocity integreret (VTI) tidsmåling for slagtilfælde volumen beregning. Røde farver i CD-billeder angive blodet strømmer mod transduceren og blå farver viser modsat. Hjertets kamre og blodgennemstrømningen er blevet fremhævet med stiplede linjer. Indsatte tegnefilm i (A) og (C) Vis placeringen af transducer og oversættelse i forhold til den lange akse midterlinjen Se. Anatomiske forkortelser: A, forkamre; OFT, udstrømning tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Repræsentative resultater af puls og slagtilfælde volumen målinger, virkningen af anæstesi og repræsentative intra/Inter-Diesel-operator/observatør analyse. (En-C) Heart rate (HR) i forhold til sig baseline afbildet over tid (0 h er på fuld anæstesi) for seks Axolotler bedøvede i benzocain (A), MS-222 (B) og propofol (C). (D-F) Slagtilfælde volumen (SV) i forhold til sig baseline afbildet over tid (0 h er på fuld anæstesi) for seks Axolotler bedøvede i benzocain (D), MS-222 (E), og propofol (F). (G) samhandelen/Inter-Diesel-operator/observatør analyse af slagtilfælde volumen. Bland-Altman grunde [forskel (Dif) mellem operatører (Op) / observatører (Obs) plottes i gennemsnit (Avg)] bør afslører ingen systematiske bias i de normalt distribuerede målinger (Q-Q parceller) fremstillet af forskellige operatører og observatører. Testning for lig middelværdi (t-test) og med ens varians (F-test) skal afsløre nogen væsentlige forskelle mellem operatører/observatører (tabel i nederste højre hjørne). A - F blev ændret fra materiale til rådighed under Creative Commons Attribution License (figur 1 i Thygesen et al. 21). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Sammenligning af slagtilfælde volumen anslået af de geometriske og pulse wave Doppler metode. Sammenligning af slagtilfælde volumen (SV) estimeret af enten to-dimensionelle B-mode geometriske (geo) målinger eller puls bølge Doppler målinger på hastigheden af blod forlader udstrømning tarmkanalen. Sv(geo) og SV(pw) registreres i de samme seks dyr med sekunder i mellem to måletyper og ved hjælp af tre forskellige anæstetika, benzocain (blå vippes firkanter), MS-222 (røde firkanter), og propofol (grønne trekanter) med en uge af recovery mellem anvende de forskellige anæstetika. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Repræsentative spatiotemporelle billede korrelation til 3D ekkokardiografi. (A) kurve repræsentation af givet korrelation værdier af en korrelation operation i en 1,000 indramme cine datasæt med 75 billeder per hjertets cyklus. To rammer med kun små forskelle, med angivelse af matchende hjerte faser, vil give en høj korrelation værdi. Efterfølgende kan en lokale maxima søger algoritme anvendes på data til at registrere alle matchende rammer. (B) grafisk repræsentation af de samme data som i (A). Når korrelation værdier fås ved at sammenligne den første hjerte cyklus med hele cine stakken, angiver Diagonale linjer af maksimale korrelation matchende hjerte faser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9. Repræsentative 3D ekkokardiografi. (A) multi planar visning af 3D rekonstruerede axolotl hjerte. Spatiotemporelle billede korrelation procedure giver mulighed for genopbygningen af et fuldt hjerte cyklus med flere særskilte faser (her 70 faser) i tre rumlige dimensioner, der kan derefter være skåret som dem til ønsket undersøgelse af spatiotemporelle fænomener i det bankende hjerte. (B) tre tværgående skiver af de rekonstruerede 115 skiver 3D data. Det kvadratiske gennemsnit procedure øger blod til væv kontrast og sænker den signal-støj-forhold, giver mulighed for en bedre forståelse af den trabeculated karakter af axolotl ventriklen og en klar visualisering af interatrial septum og den ventiler i udstrømning tarmkanalen. (C) overflade og volumen fremstillinger af det bankende hjerte i tre faser langs en farvekodede segmenteret model (Se supplerende fil 13 og supplerende fil 14 for video repræsentationer af overflade og volumen afsmeltet slå hjerte, og supplerende fil 15 for en tre-faset segmenterede interaktive 3D model). Anatomiske forkortelser: A, forkamre; Cau, caudale; CRA, kraniel; DEX, dexter (til den rigtige dyr); Dor, dorsale; OFT, udstrømning tarmkanalen; Synd, skummel (til dyr venstre); SinV, sinus venosus; V, ventrikel; Hven, ventrale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Ved gennemlysning finde hjertets kamre i denaxolotl. Se figur 2 c. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Længdeakse, midterlinjen visning, B-tilstand. Se figur 3A, B. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3. Længdeakse, ventrikulær visning, B-tilstand. Se figur 3 c, D. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4. Længdeakse, ventrikulær visning, farve Doppler tilstand. Se figur 3E, F. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5. Længdeakse, ventrikulær visning, Power Doppler tilstand. Se figur 3 g, H. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6. Længdeakse, atrieflimren visning, B-tilstand. Se figur 4A, B. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 7. Længdeakse, atrieflimren visning, farve Doppler tilstand. Se figur 4 c, D. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 8. Længdeakse, udstrømning tarmkanalen se, B-mode. Se figur 4E. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 9. Længdeakse, udstrømning tarmkanalen visning, farve Doppler tilstand. Se figur 4F. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 10. Korte akse, ventrikulær se, B-mode. Se figur 5A, B. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 11. Skrå paragill, udstrømning tarmkanalen visning, B-tilstand. Se figur 5 c. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 12. Skrå paragill, udstrømning tarmkanalen visning, farve Doppler tilstand. Se figur 5 d. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 13. Tre-dimensionelle overflade rendering af slå hjertet i 70 faser (19,6 ms tidsmæssige opløsning). Se figur 9 c. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 14. Tre-dimensionelle volumen gengivelse af slå hjertet i 70 faser (19,6 ms tidsmæssige opløsning). Se figur 9 c. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 15. Tre-dimensionelle interaktive model for at slå hjerte i 3 faser: ventrikulær ende-systolen, ventrikulær midten udslyngning og ventrikulær ende-systolen. Se figur 7C. Interaktive PDF-filen skal ses i Adobe Acrobat Reader 9 eller højere. Hvis du vil aktivere 3D-funktionen, skal du klikke på modellen. Ved hjælp af markøren, det er nu muligt at rotere, zoome, panorere modellen, og i modeltræet alle segmenter af modellen kan vendte tænd/sluk eller gennemsigtige. Modeltræet er et hierarki, der indeholder flere sub-lag, der kan åbnes (+). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 16. Repræsentant kommenteret script til beregning af værdien korrelation af en 1.000 rammer erhvervelse med et øvre skøn over 75 rammer/hjertestop cyklus. Manuskriptet er skrevet i IJ1 makrosprog og kan gennemføres som en batch makro i ImageJ at beregne korrelation værdier (75.000 pr. konvertering) på tværs af en hel z-stakken af 3D-data. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 17. Repræsentative script til automatisk peak påvisning i en serie af korrelation værdier fra en 1.000 rammer erhvervelse med et øvre skøn over 75 rammer/hjertestop cyklus. Serie af korrelation værdier (kolonne B, der er markeret i gul) kan udskiftes og efter aktivering af macro (Ctrl + r) listen over kommandoer til at vælge matchende hjerte faser og udføre kvadratiske gennemsnit bliver vises (kolonne Q, markeret med grønt). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 18. Repræsentant kommenteret script til at vælge matchende hjerte faser og udføre kvadratiske gennemsnit af en 1.000 rammer erhvervelse med et øvre skøn over 75 rammer/hjertestop cyklus (kolonne Q i supplerende fil 17). Script er skrevet i IJ1 makrosprog og kan gennemføres som en makro i ImageJ til at oprette et ensemble i gennemsnit ét cyklus (75 faser) 2D udsnit. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 19. Repræsentant kommenteret script til beregning af værdien korrelation mellem en 70 rammer reference skive og en tilstødende 75 rammer test skive. Manuskriptet er skrevet i IJ1 makrosprog og kan gennemføres som en makro i ImageJ at beregne korrelation værdier (5,250). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 20. Repræsentant Excel script til automatisk peak påvisning i en serie af korrelation værdier fra en sammenligning mellem en 70 rammer reference skive og en tilstødende 75 rammer test skive. Serie af korrelation værdier (kolonne C, der er markeret i gul) kan udskiftes og efter aktivering af macro (Ctrl + t) vises listen over skiver skal være markeret som en substack i test-Skive (kolonne L, række 2, markeret med grønt). Test skive substack vil have rumligt matchende rammer til reference skive. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ekkokardiografi i axolotl og andre ikke-pattedyr arter udbytter fundamentalt anderledes data end pattedyr ekkokardiografi på grund af nucleated arten af røde blodlegemer i alle hvirveldyr undtagen voksne pattedyr. Dette resulterer i en udtalt blod signal og mindre blod til væv kontrast i axolotl ekkokardiografisk billeder sammenlignet med fx mus eller menneskelige ekkokardiografi. Dette kan gøre billedsegmentering på uforarbejdede enkelt ramme ultralyd billeder mere vanskeligt, da det kan være svært at skelne blod fra væv. Dette fænomen kan dog være fordelagtig, når det bruges til at oprette blod signal forbedret billeder ved at anvende kvadratiske gennemsnit proceduren beskrevet tidligere18 og modificeret til axolotl ekkokardiografi i protokollen afsnit 6. Da blod pletter er langt mere dynamiske end dem, der findes i blødt væv, vil kvadratiske gennemsnit generere markant kontrast mellem disse to rum, som letter billedsegmentering i to og tre dimensioner.

Denne protokol beskriver tre forskellige anæstetika til den axolotl, der er blevet grundigt testet tidligere21. Både benzocain og MS-222 stimulere en stigning i hjertefrekvensen, hvilket kan være ønskeligt, når test hjertefunktion stress betingelser. Propofol inducerer mindre stress til hjertet under anæstesi og kan bruges som en erstatning for sig ekkokardiografi i situationer hvor erhvervelse tid overskrider grænserne for stillesiddende adfærd i sig Axolotler.

2D ekkokardiografi beskriver 3D hjertet påvirkes af subjektivitet. Derfor er det bydende nødvendigt at adfærd og handel/Inter-Diesel-operator/observatør analyse før foretage en faktiske eksperiment, som beskrevet i protokollen afsnit 5. Ligeledes bør ekkokardiografisk målinger ses mere som indeksværdier, der kan anvendes til at undersøge potentielle forskelle i hjertefunktion under forskellige omstændigheder i stedet for absolutte værdier. Slagtilfælde volumen bestemmes af den geometriske ligning (ligning 2) sjældent giver den samme absolutte værdi som puls bølge Doppler ligning (ligning 4; Figur 7), og det skal være besluttet som mål for at tiltræde gennem en serie af eksperimenter. SV(geo) kan opnås hurtigere end SV(pw), men den sfæriske antagelse af figuren ventrikulær gælder kun for sund ensartet kontraherende hjerter, og i sygdom og revitalisering modeller, SV(pw) bør anses for en bedre afspejling af den sande slagtilfælde volumen.

Korrelation og kvadratiske gennemsnit procedure af protokollen afsnit 6 kan gennemføres i flere forskellige imaging og matematiske pakker. Da programmering færdigheder og adgang til software-pakker varierer meget inden for life science forskere, vi har bestræbt os mod at give repræsentative scripts for metoder i software-pakker, de fleste forskere er bekendt med (fx Excel) der er let behandles og frit tilgængelige (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Supplerende filer 16 - 20 giver kommenteret eksemplarisk scripts skrevet i IJ1 makrosprog og som .xlsm makroer, der bør være forståelige selv med minimal erfaring i kodningen.

Iboende hjerte regenerering er et fænomen, der udelukkende findes i hjerter af små arter (i forhold til menneske), og dermed målinger og afbildning grundlinje hjertefunktion og funktionelle fremskridt under regenerering udfordres af størrelsen af hjertet og den rumlige opløsning af imaging modalitet anvendes. Høj frekvens ultralyd imaging giver en ønskelig trade-off mellem en høj i fly rumlig opløsning (~ 30 x 30 µm2 på 50 MHz) der kan sammenlignes med i vivo µCT billeddannelse og meget højere end i vivo µMRI, som har en dybde på penetration (~ 1 cm på 50 MHz) flere fold større end Konfokal mikroskopi, og en meget høj tidsmæssige opløsning (50-300 rammer/s på 50 MHz, 1 cm dybde). Kombineret med manuel eller automatiske z dimensionel bevægelse af transduceren, giver ultralyd uovertruffen genopbygning af hjertefunktion og anatomiske modellering i fire dimensioner. Desuden, non-invasiv art af teknikken, der giver mulighed for langsgående eksperimenter. Til vores viden findes der i øjeblikket ingen matrix matrix transducere til højfrekvente mikro ultrasound imaging. Udviklingen af denne teknologi vil i høj grad støtte opkøb af 3D data af små hjerter som axolotl i en hurtigere procedure end mekanisk bevægelse transduceren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Kasper Hansen, Institut for Bioscience, Aarhus Universitet for at give adgang til og bistand med den elektroniske micromanipulator for 3D ekkokardiografisk erhvervelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Medicin sag 141 ekkokardiografi ultralyd hjerte hjerte ultrasonografi regenerering axolotl Ambystoma mexicanum spatiotemporelle billede korrelation
2D og 3D ekkokardiografi i Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter