2D- en 3D-echocardiografie in de Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Hier presenteren we echocardiografie protocollen voor tweedimensionale en driedimensionale Beeldacquisitie van het kloppende hart van de salamander axolotl (Ambystoma mexicanum), een soort model regeneratie van het hart. Deze methoden toestaan voor longitudinale evaluatie van de hartfunctie met een hoge resolutie van de spatio.

Abstract

Cardiale storing als gevolg van ischemische hartziekten is een belangrijke uitdaging, en regeneratieve therapie naar het hart zijn in hoge vraag. Een paar model soorten zoals zebravis en salamanders die kunnen intrinsieke hart regeneratie houdt belofte voor toekomstige regeneratieve therapieën voor menselijke patiënten. Om te evalueren van de resultaten van de experimenten van de cardioregenerative het absoluut noodzakelijk is dat de hartfunctie kan worden gecontroleerd. De axolotl salamander (A. mexicanum) vertegenwoordigt een reeds lang gevestigde model soort(en) in regeneratieve biologie maten te bereiken die het mogelijk voor de evaluatie van de hartfunctie maakt. Het doel van dit protocol is te voorzien in methoden voor het meten van reproducibly cardiale functie in de axolotl met echocardiografie. De toepassing van verschillende verdoving (benzocaïne, MS-222 en propofol) is aangetoond, en de verwerving van tweedimensionale (2D) echocardiographic gegevens in zowel de unanesthetized als de narcose axolotls wordt beschreven. 2D echocardiografie van het driedimensionale (3D) hart kan lijden aan onnauwkeurigheid en subjectiviteit van metingen, en om te verlichten dit verschijnsel een solide methode, namelijk intra/intersite-operator/waarnemer analyse, te meten en dit vooroordeel te minimaliseren is aangetoond. Tot slot, een methode om 3D echocardiographic gegevens van het kloppende axolotl hart bij een zeer hoge Spatio resolutie en met een uitgesproken bloed-naar-weefsel contrast te vergaren is beschreven. Over het geheel genomen moet dit protocol voorzien van de nodige methoden om hartfunctie en anatomie model te evalueren, en stromen van dynamiek in de axolotl met behulp van echografie imaging met toepassingen in zowel regeneratieve biologie en algemene fysiologische experimenten.

Introduction

Ischemische hartziekten is een belangrijke oorzaak van overlijden wereldwijd^1,2. Hoewel velen een hartinfarct als gevolg van snelle en verfijnd medische interventie overleven, leiden ischemische incidenten bij de mens vaak tot fibrotische littekenvorming gekoppeld aan hypertrofie, elektrische storing en een verminderde functionele capaciteit van het hart . Dit gebrek aan regeneratieve potentieel van cardiale weefsel wordt gedeeld door zoogdieren en hoewel controversiële claims van zoogdieren cardiale regeneratie hebben gemeld, deze zijn beperkt tot specifieke lymfkliertest stammen^3,4 en Hypoxie behandeld muizen⁵. Het gebied van cardiale regeneratieve geneeskunde en de biologie is dus over het algemeen beperkt tot niet-zoogdier diermodellen om intrinsieke hart regeneratieve verschijnselen bestuderen. De zebravissen (Danio rerio) is in het afgelopen decennium opgezet als de meest goed gekarakteriseerd model voor intrinsieke hart regeneratie^6,7,8,9,10 . Als gevolg van gemakkelijk laboratorium onderhoud, een korte generatietijd en een breed scala van moleculaire tools beschikbaar, is de zebravis geschikt als een model voor genetische en moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de cardiale ontwikkeling en regeneratie. Echter de minieme afmetingen van de zebravis hart maken het die minder voor functionele evaluatie geschikt en gecompliceerde chirurgische procedures en de niet-viervoeters fylogenie van de zebravis beperkt de verstandige extrapolatie van de bevindingen in dit soort, dus het gebruik van andere grotere tetrapod modellen te rechtvaardigen. Een van de vroegste modellen van gewervelde hart regeneratie was een Spiegelse amfibieën, de Oost-newt (Notophthalmus viridescens)¹¹, een soort die een waardevolle model^{12 blijft}.

In de afgelopen jaren een andere Spiegelse amfibieën, de Mexicaanse axolotl (A. mexicanum) heeft ingevoerd de scène als een grote (tot 100 g van lichaam massa) en zeer laboratorium aanpasbaar diermodel voor een breed scala van regeneratieve disciplines ledemaat regeneratie, spanning dwarslaesie en cardiale regeneratie^{13,14,15,16,17}. De axolotl is zeer vatbaar voor functionele metingen op het hart met hoge frequentie echocardiografie en het ontbreken van kalkhoudend structuren aan de ventrale zijde van het hart zorgt voor echografie imaging met een veel lager niveau van afbeelding artefacten (akoestisch schaduwen en galm in het bijzonder) dan waargenomen in andere dieren model met kalkhoudend borstbeen en ribben.

Het volgende protocol beschrijft diverse verschillende methoden en preparaten (Figuur 1, Figuur 2) te verwerven reproduceerbaar echocardiographic metingen op de axolotl hart in beide verdoofd (drie verschillende verdoving toe te passen: Benzocaïne, MS-222 en propofol) en dieren in twee unanesthetized (Figuur 3, Figuur 4 Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, Aanvullende bestanden 1-12) en drie (Figuur 8, Figuur 9, Aanvullende bestanden 13-14) ruimtelijke dimensies. Het hart van de amfibieën is drie-chambered (twee atria en een één ventrikel). De atria worden geleverd door een grote sinus venosus en het ventrikel uitmondt in de conus arteriosus uitstroom tractus (Figuur 2). Aangezien de meeste nadruk traditioneel geplaatste op ventriculaire regeneratie en minder op het herstel van de atria^{6,7,8,9,10,11 is , 12 , 14 , 17}, dit protocol is hoofdzakelijk gericht op metingen van ventriculaire functie.

Amfibieën echocardiografie is niet goed beschreven in de literatuur, en de ontwikkeling van de 2D methoden die worden beschreven in dit document zijn verdreven door de noodzaak om de beste vertegenwoordigen de functionaliteit van de axolotl kloppend hart op een bepaald moment en experimentele setting. Dus zijn de hier beschreven methoden toepassing in hart regeneratieve experimenten waar hartfunctie herhaaldelijk in de loop van een regeneratieproces kan worden gecontroleerd. Bovendien kunnen de methoden worden toegepast in cardiophysiological experimenten op de axolotl in het algemeen of enigszins gewijzigd om het beslaan van andere Spiegelse of anuran wormsalamanders modellen (e.g.,Xenopus). De axolotl bestaat in diverse verschillende stammen en kleurvariaties (bijvoorbeeldwildtype, melanoid, witte, albino, transgene wit met groene fluorescentie eiwit expressie), echter deze kenmerken hebben geen invloed op de verenigbaarheid van de Axolotl met het protocol beschreven. De hier beschreven te verwerven van 3D-gegevens van de echocardiographic methode is een gewijzigde versie van de spatio afbeelding correlatie (STIC) techniek ontwikkeld voor het klinische echografie en de kwadratische gemiddeld in de ontwikkelingslanden kip aan eerder beschreven methode verbeteren van het signaal van bloed spikkels in zachte weefsels in soorten met genucleëerde rode bloedcellen^18,19. Deze methode zorgt voor geavanceerde modellering van de cardiale contractie en berekende fluid dynamics in het hart van de axolotl.

Protocol

De procedures in dit protocol uitgevoerd werden volgens de Deense nationale wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de experimenten zijn goedgekeurd door de Deense nationale dier experimenten inspectie (protocol # 2015-15-0201-00615).

1. voorbereiding

1. Axolotl bereiden medium.
   1. Toepassing van hoge kwaliteit niet-chemisch behandeld leidingwater als axolotl medium. Als dit niet beschikbaar is, 40% Holtfreter de oplossing toepassen.
   2. Bereiden van 40% (wt/vol) Holtfreter de oplossing door het oplossen van 15.84 g NaCl, 0,54 g CaCl₂·2H₂O 1.11 g MgSO₄·7H₂O en 0.288 g KCl in gefilterde en gedeïoniseerd water tot een volume van 1 L.
2. Onderdompeling anesthetica zorg.
   1. Bereid benzocaïne (ethyl 4-aminobenzoaat) verdoving oplossing door ontbinding van 200 mg ethyl 4-aminobenzoaat in 3 mL aceton en dan de ontbinding van deze mix in 1 L leidingwater of 40% Holtfreter de oplossing.
   2. Bereid MS-222 (ethyl 3-aminobenzoaat Methaansulfonzuur, ook bekend als tricane) verdoving oplossing door ontbinding van 200 mg ethyl 3-aminobenzoaat Methaansulfonzuur direct in 1 L leidingwater of 40% Holtfreter de oplossing.
   3. Bereid propofol (2,6-diisopropylphenol) verdoving oplossing door ontbinding van 3,3 mg 2,6-diisopropylphenol in in 1 L leidingwater of 40% Holtfreter de oplossing. U kunt ook verdunnen commercieel premade oplossing voor 3,3 mg/L.
      Let op: Propofol is een krachtige menselijke verdoving (intraveneus toegediend) en verzorging, waaronder in de verdunde vorm moet worden behandeld.
3. Bed en container voorbereiden door echocardiografie.
   1. Echocardiografie lip-vormige dierlijke bed voorbereiden door een zachte doek stuk 70 x 55 cm eenmaal vouwen en dan rollen in "burrito vorm" (figuur 1A). Vervolgens over de uiteinden te buigen totdat ze ontmoeten elkaar en tape deze samen (figuur 1B).
   2. De lip vormige structuur in axolotl medium voor de narcose axolotl tijdens echografie imaging dompelen. Beveiligen van het dier aan de structuur en voorkomen zweven met behulp van losse elastiekjes; plaats deze midden-mandibulaire en over het sacrale gebied (Figuur 1 c).
      Opmerking: De elastiekjes moet niet knijp het dier als dit zal invloed hebben op hemodynamiek.
   3. Voor 2D echocardiografie op unanesthetized axolotls, een hangmat te bereiden door het houtsnijwerk uit een 16 x 8 cm x 5 cm gat in een 33 x 27 cm x 5 cm blok piepschuim (bv, een deksel van een middelgroot polystyreenschuim container) (Figuur 1 d).
   4. Een 33 x 27 cm stuk plasticfolie duw door het gat en beveiligen van de randen van de omslag aan de bovenkant van het blok piepschuim (figuur 1E) maken een hangmat. Voeg axolotl middellange tot 3 cm diepte in de hangmat. De unanesthetized axolotl zal zinken naar de bodem van de hangmat waardoor gemakkelijk ventrale toegang via de plasticfolie (figuur 1F).

2. anesthetize Axolotls

1. Onderdompelen axolotl in gewenste verdoving oplossing (benzocaïne, MS-222 of propofol).
2. Inspecteer op de eerste tekenen van sedatie, beperkte bewegingen en toenemende verlies van restarmen reflex, dit lijkt binnen 10 min bij dieren < 10 g (< 10 cm) en binnen 20 min in dieren tussen 10 en 50 g van de lichaamsmassa (10-22 cm).
3. Inspecteer op volledig gebrek aan bewegingen van het lichaam, gill ventilatie bewegingen en restarmen reflex, en ervoor te zorgen dat het dier is niet-reagerende tot matige pijn stimulatie getest door het knijpen van de gordel tussen cijfers.
   Opmerking: ondanks het feit dat narcose wordt bereikt binnen 30 min in benzocaïne verdoofd axolotls, hartfunctie niet is gestabiliseerd tot 1 h. Dit is niet het geval in MS-222 of propofol verdoofd axolotls (figuur 6A-F).
4. Houd het dier in de verdoving oplossing of verpakt in natte papieren doekjes bevochtigd in verdoving oplossing wilt behouden axolotl onder algemene verdoving.
   Opmerking: Verdoving kan worden gehandhaafd voor 7 h zonder nadelige effecten op het welzijn van het dier gezien het feit dat de huid en vooral de kieuwen vochtig worden bewaard.
5. Om te reawake axolotl, door het dier te overbrengen in anesthesie-gratis medium.
   Opmerking: Het eerste teken van het ontwaken is gill ventilatie bewegingen. Dier moet rechtop en inspelen op stimulatie binnen 1 uur.

3. 2D echocardiografie op narcose Axolotl

1. Plaats verdoofd axolotl in een liggende positie in het lip-vormige dierlijke bed (stappen 1.3.1-1.3.2). Beveilig het zwevend met behulp van losse elastiekjes (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat de thoracale oppervlak is bedekt met 3-5 mm van medium.
   Opmerking: Voor een korte verwerving (< 5 min) verdoving-gratis medium kan worden toegepast. Voor langdurige overname, moet de verdoving oplossing als echografie medium om stabiele hartfunctie gedurende de gehele meting worden toegepast.
2. Plaatst de transducer op de middellijn van het dier in de thoracale regio evenwijdig aan de lengteas van het dier (figuur 2A, figuur 3A-B, aanvullende bestand 2). Transillumination met een koude lichtbron op wit en albino axolotls gebruiken om te zorgen voor de juiste plaatsing van de transducer (figuur 2C en aanvullende bestand 1).
   1. Voor axolotls weegt < 20 g, gebruikt u een 50 MHz transducer; voor axolotls > 20 g, gebruiken een 40 MHz transducer. Zorg ervoor de positionering van de craniale/anterior richting naar rechts voor gestandaardiseerde Beeldacquisitie. Als dit niet het geval is de transducer roteren 180 ° of de afbeelding omkeren.
3. Ervoor te zorgen dat in de lengteas middellijn weergave, een klein gedeelte van het ventrikel (gepositioneerd aan de rechterkant in de borstholte, figuur 2A) in het frame op ventriculaire diastole en een groot deel van de linker- en atria verschijnt (gepositioneerd in het midden / iets aan de linkerkant in de borstholte, figuur 2A) en de sinus venosus zijn zichtbaar zowel in atriale systole en de diastole (figuur 3A, B).
4. Vertalen de transducer 1-3 mm naar van het dier recht op de ventriculaire lengteas weergave (figuur 2A). De juiste positie wordt bereikt wanneer de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de einde-systole ventrikel op zijn maximum (Figuur 3 c-H is).
5. In de B-modus, verwerven ≥ 3 cardiale cycli met > 50 frames/s in beide 'general imaging' (hoge ruimtelijke/lage temporele resolutie) of 'cardiologie' (lage ruimtelijke/hoge temporele resolutie) modus.
   Opmerking: In deze weergave kunt voor evaluatie van ventriculaire functie. Ventriculaire functie kan worden geëvalueerd in twee dimensies met behulp van de ventriculaire fractionele gebied verandering (FACv) berekend op basis van de einde-diastolische en systolische einde cross doorsnede van de ventrikel (CSAv) met behulp van de vergelijking:
   (1)
   De axolotl de ventrikel wordt ervan uitgegaan dat de vorm van een bol en een meetkunde op basis lijn volume [SV(geo)] kan worden berekend met de vergelijking:
   (2)
6. Vertalen de transducer langs de lange as van het dier tot het centrum van het ventrikel in het midden van het scherm is. Draai de transducer 90 ° met de klok mee om het beeld van de medio-ventriculaire korte as (figuur 5A en B, aanvullende bestand 10) te krijgen. De ronde vorm van de ventrikel evalueren door het vertalen van de transducer langs de lange as van het hart.
7. De transducer terug te keren naar de lengteas vliegtuig en vertaal het terug naar de middellijn of iets naar links van de middellijn om de atriale lengteas twee kamer beeld (figuur 2A) te krijgen. Ervoor te zorgen dat de juiste positie is bereikt door te bevestigen dat de transversale sectoren van de einde-systole atria nog in hun maxima en de twee atria gecombineerd de omtrek van het nummer "8 aanvaarden" gekanteld ~ 45 ° naar links (figuur 4A en B, Aanvullende bestand 6).
8. In de B-modus verwerven ≥ 3 cardiale cycli met > 50 frames/s in 'general imaging' of 'cardiologie' modus.
   Opmerking: De axolotl de atria zijn onregelmatig in vorm en 3D functie kan niet worden rechtstreeks afgeleid uit 2D gegevens, dus hun functie moet worden geëvalueerd als een maatregel van de index zoals atriale fractionele gebied kans (FACa) gebaseerd op de gecombineerde cross-sectionele gebied (CSAa) van beide atriale chambers in de systole en de diastole:
   (3)
9. Vertalen van de transducer naar rechts totdat de uitstroom tractus (conus arteriosus) (dicht bij de weergave van ventriculaire lengteas verschijnt) (figuur 2A).
   Opmerking: Na het verlaten van het ventrikel in de richting van een anterior, de uitstroom tractus maakt een scherpe bocht en loopt onder een kleine hoek naar het ventrale oppervlak alvorens weer uitgaande van een anterieure richting en opsplitsen in gill takken en systemische vaartuigen.
   1. Ervoor te zorgen dat de juiste uitstroom tract weergave wordt bereikt door te bevestigen dat de diameter van de uitstroom op zijn maximum op ventriculaire einde-systole en twee van de drie halvemaanvormige kleppen bij de ingang van de uitstroom zichtbaar op midden uitwerpen (figuur 4E zijn, Aanvullende bestand 8).
      Opmerking: De ventrale directionaliteit richting de transducer van het tussenliggende gedeelte van het darmkanaal uitstroom zorgt voor snelheid en stroom metingen met behulp van Doppler imaging.
10. Doppler-kleurmodus toewijzen van bloed stroomsnelheden in de tractus uitstroom tijdens cardiale uitwerpen (figuur 4F en aanvullende bestand 9) van toepassing. Tevens Color Doppler en Power Doppler imaging om te visualiseren van de bloedstroom in de weergaven van het ventriculaire en atriale (figuur 3E-H, Aanvullende bestanden 4-5 en figuur 4C-D, en aanvullende bestand 7) van toepassing.
11. Toepassing Pulse Wave (PW) Doppler-modus op de positie van bloed van de maximale snelheid in het gedeelte van het darmkanaal van de uitstroom naar de transducer uitgevoerd.
    1. Gebruik 'stralingshoek' en 'hoekige correctie' tot 45 ° te passen voor de uitstroom wordt niet volledig loodrecht op het gezicht van de transducer (Figuur 4 g). Zorg ervoor dat de PW Doppler positie niet wordt overlapt door de klep van de spiraal van de uitstroom tijdens elke fase van de cardiale cyclus (figuur 4E).
12. Verwerven in de PW Doppler-modus snelheid-/ tijdgegevens over ≥ 3 cardiale cycli.
13. Terug naar B-modus en verwerven van ≥ 3 cardiale cycli bij de exacte hetzelfde vliegtuig als PWV werd overgenomen.
14. Maatregel snelheid tijde integraal (VTI) van de bloedstroom in het darmkanaal van de uitstroom als het gebied onder de curve van de snelheid/tijd voor één volledige cardiale cyclus (Figuur 4 g, g1).
    Opmerking: Het VTI en de diameter (d) van de tractus uitstroom bij einde-systole verkregen uit de verwerving van de B-modus, een PW Doppler gebaseerde beroerte volume [SV(pw)] kan worden berekend met de vergelijking:
    (4)
    Hartslag (HR) wordt gemeten vanaf de snelheid/tijd-curve door het meten van de duur van een gehele cardiale cyclus. Cardiale output [CO(pw)] wordt berekend met de vergelijking:
    (5)
15. Het verkrijgen van de schuine paragill-weergave, een weergave die een alternatief voor de meting van de stroomsnelheid van het bloed in de uitstroom tractus, biedt door het draaien van de axolotl 90 ° in de lip vormige bed op een zodanige wijze dat het rechterdeel van het dier wordt geconfronteerd met stijgende (figuur 2B). Hoek en draai de transducer en plaats ze parallel en gewoon posterieure de vooruitstekende kieuwen (figuur 2B). Ervoor te zorgen dat de juiste positie is bereikt door te bevestigen dat het darmstelsel uitstroom naar beneden draait op ~ 45 ° en dat de atria onder de uitstroom tractus tijdens uitwerpen (Figuur 5 C, aanvullende bestand 11 weergegeven).
16. PW Doppler-modus op de positie van bloed van de maximale snelheid in het gedeelte van het darmkanaal van de uitstroom weglopen van de transducer (figuur 5D, aanvullende bestand 12) van toepassing. Gebruik 'stralingshoek' en 'hoekige correctie' tot 45 ° te passen voor de uitstroom wordt niet volledig loodrecht op het gezicht van de transducer (figuur 5E).
17. Verwerven in de PW Doppler-modus bloed snelheid over ≥ 3 cardiale cycli.
18. Terug naar B-modus en verwerven van ≥ 3 cardiale cycli bij de exacte hetzelfde vliegtuig als PWV werd overgenomen.
    Opmerking: SV(pw) en CO(pw) worden berekend voor de weergave van de schuine paragill zoals hierboven beschreven voor de weergave van de lange as met behulp van de vergelijking 4 en 5 van de vergelijking .

4. 2D echocardiografie op Unanesthetized Axolotl

1. Plaats de unanesthetized axolotl in een liggend in de hangmat (stap 1.3.3).
2. Laat de dieren ongestoord voor 30-60 min om te herstellen van de behandeling van stress.
3. De echografie transducer positie met het hoofd van de transducer naar boven gericht naar de axolotl in de hangmat.
4. Ultrageluid-gel van toepassing op de transducer.
5. Zachtjes en zonder verstoring van het dier, plaatst de transducer op de middellijn van het dier in de thoracale regio evenwijdig aan de lengteas van het dier.
   Opmerking: Dit is het zelfde, maar omgekeerd, standpunt wat betreft de narcose axolotl (stap 3.2).
6. B-modus, Doppler kleur modus, PW modus gegevens in de lengteas en korte axis Bekijk zoals beschreven in stappen 3.2-3.14 verkrijgen.
   Opmerking: Een weergave van de schuine paragill is onverkrijgbaar in de unanesthetized axolotl. De echocardiographic gegevens in unanesthetized axolotls moet worden verworven tussen gill ventilatie bewegingen (een 10-20 s periode voor een rust dier). Indien de axolotl tijdens overname beweegt, moeten metingen worden herhaald.

5. evaluatie van de gegevens van de 2D echocardiografie en minimaliseren van subjectiviteit

1. Vermijd de vooringenomenheid van de exploitant/waarnemer tijdens 2D echografie imaging- en 3D-evaluatie van de hartfunctie gebaseerd op 2D gegevens veroorzaakt door subjectiviteit in zowel de data-acquisitie en de fase van de analyse van de gegevens door het uitvoeren van de analyse van de intra/intersite-operator/waarnemer²⁰.
   Opmerking: In het opstarten van studies en wanneer het opleiding van nieuw personeel deze subjectiviteit moet worden gekwantificeerd en geminimaliseerd met behulp van intra/intersite-operator/waarnemer analyse.
2. De analyse van de intra/intersite-operator/waarnemer in een twee persoon setup met de exploitant/waarnemer 1 (minder ervaren) wordt getoetst aan de exploitant/waarnemer 2 (meer ervaren) door het uitvoeren van ≥ 6 consensus metingen samen, met inbegrip van zowel bank werk bij starten de echografie systeem (operatie) en de daaropvolgende analyse van relevante parameters (Opmerking).
3. Het bereiken van consensus tussen exploitanten en waarnemers en werken (operator/waarnemer 1) het systeem van de echografie te verwerven van de relevante gegevens over ≥ 6 dieren (operatie 1.1).
4. Direct na, werken (operator/waarnemer 2) het systeem van de echografie te verwerven van de relevante gegevens over de dezelfde dieren (operatie 2.1).
5. Laat dieren herstellen voor 3 dagen. Daarna herhaal (operator/waarnemer 1) de procedure (operatie 1.2).
6. Analyseren (operator/waarnemer 1) alle meetgegevens (operatie 1.1/observatie 1.1; operatie 2.1/observatie 1.1 operatie 1.2/observatie 1.1) en na 24 h herhalen de analyse van exploitant/waarnemer 2 van gegevens (operatie 2.1/opmerking 1.2).
7. Analyseren (operator/waarnemer 2) de gegevens overgenomen door haar/zichzelf (operatie 2.1/opmerking 2.1). Merk op dat de waarden die zijn verkregen door deze analyse worden beschouwd als zich het dichtst bij de werkelijke waarden.
8. Evalueren van variatie, tendensen en bias in vergelijkingen tussen alle verworven parameters met behulp van Bland-Atman plotten, QQ plotten, t-test (gelijke gemiddelde) en F-test (gelijke variantie) (figuur 6G).
   1. Merk op dat de bewerking 1.1/observatie 1.1 versus operatie 2.1/observatie 1.1 vergelijking de variatie tussen exploitant toont.
   2. Merk op dat de bewerking 2.1/observatie 1.1 versus operatie 2.1/observatie 2.1 vergelijking de variatie tussen waarnemer toont.
   3. Merk op dat de bewerking 1.1/observatie 1.1 versus operatie 1.2/observatie 1.1 vergelijking de variatie van de intra-operator toont.
   4. Merk op dat de bewerking 2.1/observatie 1.1 versus operatie 2.1/observatie 1.2 vergelijking de variatie van de intra-observer toont.
9. Zorg ervoor dat de gemiddelde en variatie van de verschillende metingen niet-significant verschillend voor de vier vergelijkingen zijn; het verschil tussen de gemeten waarden moet binnen ± 1.96 standaarddeviaties vallen, en er geen tendensen richting minder precisie van kleine noch grote waarden moeten verschijnen.

6. 3D echocardiografie op narcose Axolotl

1. 3D overname
   1. Plaats de narcose axolotl in een liggende positie in het lip-vormige dierlijke bed (stap 1.3.1). Beveilig het zwevend met behulp van losse elastiekjes (Figuur 1 c) en ervoor te zorgen dat de thoracale oppervlak is bedekt met 3-5 mm van medium. 3D acquisitie is een langdurige procedure, dus breng verdoving oplossing als echografie medium om stabiele hartfunctie gedurende de gehele meting.
   2. Plaatst de transducer op de middellijn van het dier in de thoracale regio evenwijdig aan de lengteas van het dier (voor een Sagittaal 3D opname) of loodrecht op de lengteas (transversale 3D opname).
   3. Vertalen de transducer in de in-plane dimensie (x en y) en de uit-van-plane (z of segment) om ervoor te zorgen dat de gehele cardiale regio zal worden behandeld in de volgende 3D-vastlegging.
   4. De framesnelheid en de ruimtelijke resolutie desgewenst aanpassen door te selecteren van beide 'general imaging' (hoge ruimtelijke/lage temporele resolutie) of 'cardiologie' (lage ruimtelijke/hoge temporele resolutie) modus. Voor 0.33 Hz < HR < 1 Hz gebruiken een temporele resolutie van 50 frames per seconde verkregen met hoge ruimtelijke resolutie ('general imaging'), dat voorziet in de cardiale cyclus te worden gereconstrueerd in verschillende fasen van de 50-150.
   5. Aanpassen "2D winst" aan een niveau waar anatomische structuren nauwelijks herkenbaar in de onbewerkte afbeelding B-modus zijn (~ 5 dB) te verhogen tot-ruis-signaalverhouding in de definitieve reconstructies.
   6. Voor elk segment (z stap), ≥ 1.000 frames, geregistreerd.
   7. Translate transducer één z stap op een tijd, bijvoorbeeld, 20 µm of 50 µm en herhaalt u opnemen totdat de hele cardiale regio is gedekt.
2. 3D reconstructie (aanvullende bestanden 13 en 14).
   1. Exporteren van overnames in Digital Imaging and Communications in Medicine DICOM (little endian).
      Opmerking: Elk segment met een bepaald aantal frames zal het samenstellen van een enkel bestand.
   2. Bepaal het aantal frames in een volledige cardiale cyclus. Als HR in de tijd variëren kan, dit voor zowel de eerste als het laatste segment bepalen. Stel het hoogste aantal frames per cyclus zoals de oorspronkelijke bovenste schatting van fase-resolutie die later kan worden verminderd (stap 6.2.8).
   3. Bepalen van de grenzen van het gewas en de accijnzen irrelevant ruimte rond het B-modus venster.
      Opmerking: Deze grenzen moet constant hele segmenten.
   4. De RGB Color-afbeelding omzetten in 32-bits.
   5. Bereken de waarde van correlatie (C) voor elk frame in de stack en het aantal frames in de eerste cardiale cyclus met gebruikmaking van de formule opgenomen:
      (6)
      Opmerking: Hier de signaalsterkte van de pixel op coördinaat (i, j) is in de eerste afbeelding en het is hetzelfde in het tweede beeld, , en , zijn de gemiddelde intensiteit en standaard afwijking, respectievelijk van de eerste en de tweede afbeelding in de vergelijking, en I en J zijn het aantal kolommen en rijen in de afbeelding. De resulterende array van correlatie waarden zal de grootte van het product van het aantal frames per cardiale cyclus en het totale aantal frames per segment (bijvoorbeeld75 × 1.000 = 75.000 in Figuur 8) hebben (Zie voorbeeldige script in aanvullende Bestand 16). De waarde van correlatie kan niet worden berekend als één of beide van de beelden in de vergelijking een standaarddeviatie pixelwaarden van nul hebben, maar dit hoogst onwaarschijnlijk in ultrasonographic beelden is.
   6. Detecteren lokale maxima in de matrix met waarden van de correlatie (figuur 8A, zie voorbeeldige script in aanvullende bestand 17 lokale maxima automatisch worden gedetecteerd).
   7. Berekenen van kwadratische gemiddelde Q(AVG) frames met piekwaarden correlatie (d.w.z., bijpassende cardiale fasen) met behulp van de formule:
      (7)
      waar N staat voor het totale aantal frames met bijpassende cardiale fasen, is de intensiteit van de pixel op coördinaat (i, j) van het n^th beeld en is de tijdelijke rekenkundig gemiddelde van de van de n^th afbeelding (Zie voorbeeldige script in aanvullende bestand 18).
   8. Herhaal stap 6.2.3-6.2.7 voor alle segmenten.
   9. Selecteer een segment (referentie slice) met gemakkelijk herkenbare anatomische structuren (b.v.midden-ventriculaire) en check als het gereconstrueerde ensemble gemiddeld één cardiale cyclus komt overeen met één cyclus (dat wil zeggen, als er extra fasen wat resulteert in meer dan één cardiale cyclus). Verwijder extra fasen zodanig dat deze precies één cardiale cyclus (b.v., gaande van een overschatte 75 fasen/cyclus (in werkelijkheid 1.07 cyclus) in Figuur 8 tot precies één cyclus met 70 fasen in Figuur 8).
   10. Op het aangrenzende segment (test segment), soort het ensemble gemiddeld één cardiale cyclus t-stack in bijpassende cardiale fasen met het segment van de referentie met de correlatie waarde formule (vergelijking 6) (Zie voorbeeldige scripts in aanvullende bestand 19 en aanvullende bestand 20).
       Opmerking: Hoewel twee niet-identieke segmenten niet volledig op elk gewenst moment tijdens de cardiale cyclus lijken zal, aangrenzende segmenten met een voldoende kleine stap-grootte (b.v., 20 µm of 50 µm) zal hebben uitgesproken gelijkenissen resulterend in correlatie de maxima van waarde die kunnen worden omgezet in de overeenkomende fasen.
   11. Herhaal stap 6.2.9-6.2.10 voor alle segmenten.
   12. Samenvouwen het gehele 3D reconstructie in een 3D Tagged Image File formaat (TIF) met z segmenten en t frames op een stack van DICOM-bestanden.
       Opmerking: Gegevens kan worden weggegooid in elke dimensie te verkleinen, verhogen van signal-to-noise verhouding en isotrope gegevens genereren (in-plane resolutie is meestal verschillende plooien hoger is dan de resolutie van de uit-van-plane).

Representative Results

Intrapericardial ruimte in de axolotl is afhankelijk van de grootte van het dier. Kleinere dieren (2-20 g, 7-15 cm) zal moeten excess pericardvocht vloeistof (verschijnt donkere in echocardiografie) rondom die de cardiale chambers overwegende dat in grotere seksueel volwassen dieren (> 20 g, > 15 cm) de kamers allermeest naar de intrapericardial bezetten zal ruimte. Om het beste overzicht voor representatieve resultaten van echocardiographic gedachten van het hart van de axolotl, werd een kleinere dier (10 g, 10 cm) Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5en Figuur 9aangevraagd.

De lange as-weergave biedt over het algemeen een goed overzicht van cardiale anatomie in de axolotl. Invoeren op het vlak van de middellijn met de sinus venosus, atria, en een deel van de ventrikel in vliegtuig (figuur 3A, B, aanvullende bestand 2), ofwel de ventriculaire vlak (Figuur 3 c-H) of de atriale vlak (figuur 4A -D) kan worden bereikt door het vertalen van de transducer naar rechts of links van het dier, respectievelijk. De ventrikel verschijnt bolvormig en zeer trabeculated (Figuur 3 c, aanvullende bestanden 3--5), overwegende dat de atria een meer onregelmatige vorm en bijna geen trabeculation (figuur 4A, hebben Aanvullende bestand 6, aanvullende bestand 7). De korte as weergave (figuur 5A, B, aanvullende bestand 10) biedt een minder makkelijk interpreteerbaar overzicht van de cardiale anatomie van de axolotl hart, maar het draagt bij aan de evaluatie van de juiste cardiale contractie (b.v. infarcted of niet-verdragsluitende zones van de circulaire ventrikel zijn duidelijk gevisualiseerd in deze weergave vlak). In de lengteas weergave vlak, het middelpunt van de uitstroom tractus nauw geplaatst naar het midden van het ventrikel (figuur 2A, en Vergelijk Figuur 3 c met figuur 4E en aanvullende bestand 3 met aanvullende bestand 8 ). Aangezien het zachte weefsel van de uitstroom tractus bewegen op bloed uitwerpen zullen, het hoge intensiteit bloed signaal tijdens een cardiale cyclus gemeten door pulse wave Doppler in zowel de lange as en het vlak van de schuine paragill zal worden grenst door lage intensiteit lawaai van de bewegingen van de omliggende weke delen (grijze gebied witte omgeving in de snelheid/tijd-curve in Figuur 4 g en 5E van de figuur). In het algemeen, het contrast tussen bloed-signaal en de ruis van de weke delen moet groot genoeg zijn om segment signaal alleen het bloed bij het meten van de snelheid tijd integraal (Figuur 4 g (g1 vergroting) en figuur 5E (e1 vergroting)).

Voor kwalitatieve evaluatie van bloed stromingspatronen, kleuren Doppler en power Doppler imaging bieden visualisaties van stromingspatronen in verschillende kamers van de cardiale (ventrikel: afbeelding 3E-H, aanvullende bestand 4, Aanvullende bestand 5; Atria: Figuur 4 C, D, aanvullende bestand 7; uitstroom darmkanaal: figuur 4F Figuur 5 D, aanvullende bestand 9, aanvullende bestand 12).

Axolotls gebruikt voor laboratorium experimenten variëren in grootte van het vroege larvale stadium van de post van 2-4 g tot volle rijpheid op 10-30 g en grotere dieren met een gewicht > 100 g. nederbuigen, hartfunctie en sommige absolute waarden van functionele hier beschreven parameters is afhankelijk van op de grootte van de dieren. In het algemeen, fractionele gebied verandering is constant in verschillende grootte groepen met waarden variërend van 40-50% (scheef richting van lagere waarden voor grotere dieren). Beroerte volume is sterk afhankelijk van de grootte van het dier, dat wil zeggen, de grootte van het hart, variërend van bijvoorbeeld 20-30 µL in 5 g axolotls, 50-70 µL in 10 g axolotls en 250-300 µL in 50 g axolotls. Hartslag en aan enkele graad beroerte volume zijn sterk afhankelijk van de toegepaste verdoving en het niveau van de anesthesie (figuur 6A--F, Figuur 7).

Traditionele intra/intersite-operator/waarnemer analyse omvat grafische voorstellingen (Q-Q percelen en Bland-Altman percelen) en testen voor gelijke gemiddelde (t-test) en variantie (F-test) te evalueren van de normale verdeling van gegevens en te vergelijken nauwkeurigheid en precisie tussen twee personen (figuur 6G).

3D echocardiografie voegt een extra dimensie (z of diepte) tot de meer traditionele 2D acquisitie. Dit zorgt voor multi vlakke visualisatie van gegevens (figuur 9A), reslicing (figuur 9B), oppervlak en volume reconstructies (figuur 9C, aanvullende bestand 13en aanvullende bestand 14) en segmentatie en generatie van 3D-modellen (Figuur 9 C, aanvullende bestand 15).

Figuur 1. Voorbereiding op bed en container voor echocardiografie van verdoofd en unanesthetized axolotl. (A) A zachte doek stuk is eenmaal gevouwen en gerold in "burrito" vorm. (B) de uiteinden zijn gebogen terug en geplakt een lip vormige bed voor de axolotl vormen tijdens het onderwater scannen. (C) voor 2D en 3D echocardiografie van een narcose axolotl, wordt het dier voorzichtig in een liggende positie in de spleet van de lip vormige bed en vaste met elastiekjes over de mid-mandibulaire en sacrale regio geplaatst. (D, E) Een hangmat wordt bereid door houtsnijwerk uit een vierkant gat in een stuk piepschuim en plastic omslag aan het bovenoppervlak taping. (F) voor 2D echocardiografie van een unanesthetized axolotl, is het dier in een natuurlijke liggend in de hangmat geplaatst en benaderd met een gel overdekte transducer tip van onder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Plaatsing van de transducer. (A, B) Model van het arterial netwerk in de axolotl met de benaderende positie van de transducer voor lange as en korte as (A) schuine paragill weergeven en (B). (C) Transillumination met een krachtige lichtbron voor koude kan helpen bij het vinden van de exacte locatie van de cardiale kamers alvorens de transducer (Zie aanvullende bestand 1). Anatomische afkortingen: A, atria; OFT, uitstroom tractus; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Representatieve lange as echocardiographic uitzicht op de ventrikel. (A, B) Typische lange as middellijn weergave in B-mode (gele lijn in figuur 2A) in de ventriculaire einde-diastolische (A) en einde-systolische (B) fasen (Zie aanvullende bestand 2 voor video weergave). (C, D) De weergave van de lange as van de ventrikel in de B-modus (zwarte lijn in figuur 2A) in de ventriculaire einde-diastolische (C) en de einde-systolische (D) fasen (Zie aanvullende bestand 3 voor video weergave). (E-H) Vergelijkbaar vliegtuig van de weergave zoals in (A) en (B) in kleur Doppler (CD) en modus power Doppler (PD) aantonen van bloed stromen (Zie aanvullende bestand 4 en aanvullende bestand 5 voor video weergave van CD - en PD-mode, respectievelijk). Rode kleuren in CD-modus beelden geven bloed stroomt naar de transducer en blauwe kleuren geven het tegenovergestelde. Cardiale chambers en doorbloeding zijn gemarkeerd met stippellijnen. Ingevoegde cartoons in (A) en (C) Toon plaatsing van transducer en vertaling ten opzichte van de middellijn van de lengteas bekijken. Anatomische afkortingen: A, atria; DC(L), links van de buis van Cuvier; OFT, uitstroom tractus; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Representatieve lange as echocardiographic uitzicht op de atria en de uitstroom tractus. (A, B) De weergave van de lange as van de atria in de B-modus (groene lijn in figuur 2A) in de atriale einde-diastolische (A) en einde-systolische (B) fasen (Zie aanvullende bestand 6 voor video weergave). (C, D) Vergelijkbaar vliegtuig van de weergave zoals in (A) en (B) in kleurmodus Doppler (CD) aantonen van bloed stromen (Zie aanvullende bestand 7 voor video weergave). (E) weergave van de lengteas van het darmstelsel van de uitstroom in B-modus (blauwe lijn in figuur 2A) in het midden uitwerpen fase (Zie aanvullende bestand 8 voor video weergave). F: Vergelijkbaar vliegtuig van de weergave zoals in (E) in CD-modus demonstrerende bloed stromen (Zie aanvullende bestand 9 voor video weergave). (G) soortgelijke weergave vliegtuig zoals in (E) en (F) in de pols golf Doppler (PW) modus waardoor warmte detectie en snelheid tijd integraal (VTI) Rudern voor beroerte volume berekening. Rode kleuren in CD-modus beelden geven bloed stroomt naar de transducer en blauwe kleuren geven het tegenovergestelde. Cardiale chambers en doorbloeding zijn gemarkeerd met stippellijnen. Gele en rode pijl hoofden geven halvemaanvormige kleppen in de hoofdmap van de uitstroom tractus en de klep van de spiraal in het darmkanaal van de uitstroom, respectievelijk. Ingevoegde cartoons in (A) en (E) Toon plaatsing van transducer en vertaling ten opzichte van de middellijn van de lengteas bekijken. Anatomische afkortingen: A(R), juiste atrium; A(L), liet atrium; OFT, uitstroom tractus; SinV, sinus venosus; V, ventrikel; VC, vena cava. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5. Representatieve korte as en schuine paragill echocardiographic uitzicht op de ventrikel en uitstroom tractus. (A, B) Korte axis Bekijk van de ventrikel in de B-modus (grijze lijn in figuur 2A) in de ventriculaire einde-diastolische (A) en einde-systolische (B) fasen (Zie aanvullende bestand 10 voor video weergave). (C) schuine paragill weergave van het darmstelsel van de uitstroom in B-modus (paarse lijn in figuur 2B) in het midden uitwerpen fase (Zie aanvullende bestand 11 voor video weergave). (D) soortgelijke weergave vliegtuig zoals in (C) in CD-modus demonstrerende bloed stromen (Zie aanvullende bestand 12 voor video weergave). (E) soortgelijke weergave vliegtuig zoals in (C) en (D) in de pols golf Doppler (PW) modus waardoor warmte detectie en snelheid tijd integraal (VTI) Rudern voor beroerte volume berekening. Rode kleuren in CD-modus beelden geven bloed stroomt naar de transducer en blauwe kleuren geven het tegenovergestelde. Cardiale chambers en doorbloeding zijn gemarkeerd met stippellijnen. Ingevoegde cartoons in (A) en (C) Toon plaatsing van transducer en vertaling ten opzichte van de middellijn van de lengteas bekijken. Anatomische afkortingen: A, atria; OFT, uitstroom tractus; SinV, sinus venosus; V, ventrikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6. Representatieve resultaten van hartslag- en lijnkenmerken volume metingen, het effect van anesthesie en representatieve intra/intersite-operator/waarnemer analyse. (A-C) Hartslag (HR) ten opzichte van unanesthetized basislijn uitgezet na verloop van tijd (0 h is aan volledige verdoving) voor zes axolotls verdoofd in benzocaïne (A), MS-222 (B) en propofol (C). (D--F) Volume (SV) ten opzichte van unanesthetized basislijn uitgezet na verloop van tijd (0 h is aan volledige verdoving) voor zes axolotls verdoofd in benzocaïne (D), MS-222 (E), een beroerte en propofol (F). (G) Intra/intersite-operator/waarnemer analyse van beroerte volume. Bland-Altman percelen [verschil (Dif) tussen exploitanten (Op) / waarnemers (Obs) uitgezet tegen de gemiddelde (Avg)] moeten onthullen geen systematische vertekening in de normaal verdeelde metingen (Q-Q percelen) verkregen door verschillende actoren en waarnemers. Testen voor gelijke gemiddelde (t-test) en gelijke variantie (F-test) moeten onthullen geen significante verschillen tussen exploitanten/waarnemers (tabel in rechterbenedenhoek). A - F werd vanaf materiaal beschikbaar onder de Creative Commons Attribution License (Figuur 1 van Thygesen et al. gewijzigd ²¹). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7. Vergelijking van lijn volume geschat door de geometrische en de Golf van de puls Doppler methode. De vergelijking van lijn volume (SV) geschat door tweedimensionale geometrische (geo) metingen van het B-modus of pols golf Doppler metingen op de snelheid van bloed verlaten de uitstroom tractus. SV(geo) en SV(pw) is opgenomen in de dezelfde zes dieren met seconden tussen de twee metingen typen en het gebruik van drie verschillende anesthetica, benzocaïne (blauwe gekanteld vierkantjes), MS-222 (rode vierkantjes), en propofol (groene driehoekjes) met één week van herstel tussen de de verschillende verdoving toe te passen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8. Representatieve Spatio afbeelding correlatie voor 3D echocardiografie. (A) representatie van leverde correlatie waarden van een correlatie operatie in een dataset cine 1.000 frame met 75 frames per cardiale cyclus Curve. Twee frames met slechts kleine verschillen, die aangeeft bijpassende cardiale fasen, zal een hoge correlatie waarde opleveren. Vervolgens kunnen een lokale maxima zoeken algoritme worden toegepast op de gegevens om te ontdekken alle overeenkomende frames. (B) grafische weergave van dezelfde gegevens als in (A). Wanneer correlatie waarden worden verkregen door het vergelijken van de eerste cardiale cyclus met de gehele cine-stack, diagonale lijnen van maximale correlatie aangeven overeenkomen met cardiale fasen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9. Representatieve 3D echocardiografie. (A) multi vlakke weergave van 3D gereconstrueerde axolotl hart. De spatio afbeelding correlatie procedure voorziet in de wederopbouw van een volledige cardiale cyclus met verschillende fasen (hier 70 fasen) in drie ruimtelijke dimensies die vervolgens kunnen worden gesneden als degenen voor gewenste onderzoek van Spatio verschijnselen in het kloppend hart. (B) drie transversale segmenten van de gereconstrueerde 115 plakjes 3D-gegevens. De kwadratische gemiddelde procedure verbetert het contrast van de bloed-naar-weefsel en verlaagt de signaal-ruisverhouding waardoor een betere waardering van de trabeculated aard van de axolotl ventrikel en een duidelijke visualisatie van het septum interatrial en de kleppen in het darmkanaal van de uitstroom. (C) oppervlakte en volume representaties van het kloppend hart in drie fasen langs een kleurcode gesegmenteerd model (Zie aanvullende bestand 13 en aanvullende bestand 14 voor video representaties van de oppervlakte en het volume gesmolten verslaan hart, en aanvullende bestand 15 voor een drie-fase gesegmenteerde interactieve 3D-model). Anatomische afkortingen: A, atria; Cau, caudal; CRA, Cranio; Dex, dexter (aan het dier rechts); Dor, dorsal; OFT, uitstroom tractus; Zonde, sinister (tot aan de dieren links); SinV, sinus venosus; V, ventrikel; Ven, ventrale. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1. Transillumination om te zoeken van cardiale kamers in deaxolotl. Zie figuur 2C. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2. Lange as, middellijn uitzicht, B-modus. Zie figuur 3A, B. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 3. Lengteas, ventriculaire uitzicht, B-modus. Zie Figuur 3 c, D. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 4. Lengteas, ventriculaire weergave, kleur Doppler-modus. Zie de 3E figuur, F. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 5. Lengteas, ventriculaire weergave, Power Doppler-modus. Zie Figuur 3 g, H. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 6. Lengteas, atriale uitzicht, B-modus. Zie figuur 4A, B. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 7. Lengteas, atriale uitzicht, Doppler kleur modus. Zie figuur 4C, D. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 8. Lengteas, uitstroom tract weergave, B-modus. Zie figuur 4E. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 9. Lengteas, uitstroom tract uitzicht, Doppler kleur modus. Zie figuur 4F. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 10. Korte as, ventriculaire weergave, B-modus. Zie figuur 5A, B. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 11. Schuine paragill, uitstroom tract uitzicht, B-modus. Zie figuur 5C. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 12. Schuine paragill, uitstroom tract uitzicht, Doppler kleur modus. Zie figuur 5D. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 13. Driedimensionale weergave van oppervlakte van het kloppend hart in 70 fasen (19.6 ms temporele resolutie). Zie figuur 9C. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 14. De weergave van de driedimensionale volume van het kloppend hart in 70 fasen (19.6 ms temporele resolutie). Zie figuur 9C. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 15. Driedimensionaal interactieve model van het kloppend hart in 3 fasen: ventriculaire einde-systole, ventriculaire midden uitwerpen en ventriculaire einde-systole. Zie Figuur 7 c. Het interactieve PDF-bestand moet worden weergegeven in Adobe Acrobat Reader 9 of hoger. Om de 3D-functie te activeren, klikt u op het model. Met behulp van de cursor, is het nu mogelijk om te roteren, zoomen, pannen van het model, en in de modelstructuur alle segmenten van het model kunnen worden in-/ uitgeschakeld of transparant gemaakt. De modelstructuur is een hiërarchie met verschillende sub-lagen die kunnen worden geopend (+). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 16. Vertegenwoordiger geannoteerde script voor de berekening van de waarde van de correlatie van de verwerving van een 1.000 frames met een hogere schatting van 75 frames/cardiale cyclus. Het script is geschreven in de macrotaal van IJ1 en kan worden uitgevoerd als een macro van de batch in ImageJ correlatie om waarden te berekenen (75.000 per acquisitie) over een gehele z-stack van 3D-gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 17. Representatieve script voor automatische peak detectie in een reeks van correlatie waarden uit een overname van 1.000 frames met een hogere schatting van 75 frames/cardiale cyclus. De reeks correlatie waarden (kolom B, duidelijk in geel) kunnen worden vervangen, en na het activeren van de macro (Ctrl + r) de lijst met opdrachten selecteert cardiale fasen en uitvoeren van kwadratische gemiddelde zal worden weergegeven (kolom Q, gemarkeerd in het groen). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 18. Vertegenwoordiger geannoteerde script selecteert cardiale fasen en het uitvoeren van kwadratische gemiddelde van een verwerving van 1.000 frames met een hogere schatting van 75 frames/cardiale cyclus (kolom Q in aanvullende bestand 17). Het script is geschreven in de macrotaal van IJ1 en kan worden uitgevoerd als een macro in ImageJ maken een ensemble gemiddeld één cyclus (75 fasen) 2D segment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 19. Vertegenwoordiger geannoteerde script voor de berekening van de waarde van de correlatie tussen een 70 frames referentie segment en een aangrenzende 75 frames test segment. Het script is geschreven in de macrotaal van IJ1 en kan worden uitgevoerd als een macro in ImageJ voor het berekenen van de waarden van de correlatie (5,250). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 20. Vertegenwoordiger Excel script voor automatische peak detectie in een reeks correlatie waarden uit een vergelijking tussen een 70 frames referentie segment en een aangrenzende 75 frames test segment. De reeks correlatie waarden (kolom C, duidelijk in geel) kunnen worden vervangen, en na het activeren van de macro (Ctrl + t) de lijst van segmenten worden geselecteerd als een substack in het segment van de test zal worden weergegeven (kolom L, rij 2, gemarkeerd in het groen). De test segment substack zal hebben ruimtelijk bijpassende frames aan de referentie-segment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Echocardiografie in de axolotl en andere soorten bij niet-zoogdieren levert fundamenteel verschillend gegevens dan zoogdieren echocardiografie vanwege het genucleëerde karakter van rode bloedcellen in alle gewervelden behalve volwassen zoogdieren. Dit resulteert in een uitgesproken bloed signaal en minder bloed-naar-weefsel contrast in axolotl echocardiographic beelden in vergelijking met bijvoorbeeld, muis of menselijke echocardiografie. Dit kan bemoeilijken beeldsegmentatie op onverwerkte één frame echografie beelden als het moeilijk worden kan te onderscheiden van bloed van weefsel. Echter, dit verschijnsel kan nuttig zijn wanneer gebruikt voor het maken van bloed signaal verbeterde beelden door het kwadratische gemiddelde procedure toe te passen eerder beschreven¹⁸ en aangepast voor axolotl echocardiografie in Protocol sectie 6. Aangezien bloed spikkels veel dynamischer dan die gevonden in de weke delen, zal kwadratische gemiddelde genereren uitgesproken contrast tussen deze twee compartimenten die vergemakkelijkt beeldsegmentatie in twee en drie dimensies.

Dit protocol beschrijft drie verschillende verdoving voor de axolotl die grondig zijn getest eerder²¹. Benzocaïne zowel MS-222 stimuleren een toename van de hartslag, wat wenselijk kan zijn bij het testen van de hartfunctie onder stress-omstandigheden. Propofol induceert minder stress naar het hart tijdens anesthesie en kan worden gebruikt als een vervanging voor unanesthetized echocardiografie in situaties waar Acquisitietijd de grenzen van sedentair gedrag in unanesthetized axolotls overschrijdt.

2D echocardiografie beschrijven het 3D hart wordt beïnvloed door subjectiviteit. Daarom is het noodzakelijk om gedrag en intra/intersite-operator/waarnemer analyse voor het uitvoeren van een werkelijke experiment, zoals beschreven in sectie 5 van Protocol. Ook moeten echocardiographic metingen beschouwd worden meer indexwaarden die kunnen worden toegepast om te onderzoeken potentiaalverschillen in hartfunctie onder verschillende omstandigheden in plaats van absolute waarden. Het volume van de lijn bepaald door de geometrische vergelijking (vergelijking 2) zelden levert de dezelfde absolute waarde als de Golf van de puls Doppler vergelijking (vergelijking 4; Figuur 7), en het moet worden besloten die meten aan te houden gedurende een reeks van experimenten. De SV(geo) kan sneller dan de SV(pw), worden verkregen, maar de sferische veronderstelling van de ventriculaire vorm is alleen van toepassing op gezonde uniform verdragsluitende harten, en in ziekte en regeneratie modellen, SV(pw) moeten worden beschouwd voor een betere weerspiegeling van het volume van de echte beroerte.

De correlatie en kwadratisch gemiddelde procedure van punt 6 van Protocol kunnen worden geïmplementeerd in verscheidene verschillende beeldvorming en mathematische pakketten. Aangezien programmering vaardigheden en toegang tot softwarepakketten sterk binnen biowetenschappen onderzoekers variëren, hebben we gestreefd naar het verstrekken van representatieve scripts voor de methoden in softwarepakketten dat de meeste onderzoekers vertrouwd met (bijvoorbeeld Excel zijn) die zijn gemakkelijk benaderd en vrij beschikbaar (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Aanvullende bestanden 16 - 20 bieden geannoteerde voorbeeldige scripts die zijn geschreven in de macrotaal van IJ1 en als .xlsm macro's die begrijpelijk zelfs met minimale ervaring in codering moeten.

Intrinsieke hart regeneratie is een fenomeen dat uitsluitend gevonden in de harten van kleine soorten (ten opzichte van de mens), en dus de metingen en beeldvorming van basislijn hartfunctie en functionele vooruitgang tijdens regeneratie wordt uitgedaagd door de grootte van het hart en de ruimtelijke resolutie van de beeldvorming modaliteit toegepast. Hoge frequentie echografie imaging biedt een wenselijk trade-off tussen een hoge ruimtelijke resolutie van in-plane (~ 30 x 30 µm² bij 50 MHz) die vergelijkbaar is met in vivo µCT imaging en veel hoger dan in vivo µMRI, die heeft een diepte van penetratie (~ 1 cm bij 50 MHz) verschillende vouwen groter dan confocale microscopie, en een zeer hoge temporele resolutie (50-300 frames/s van 50 MHz, 1 cm diepte). In combinatie met manuele of geautomatiseerde z dimensionale verkeer van de transducer, kunt echografie een ongeëvenaarde wederopbouw van hartfunctie en anatomische modellen in vier dimensies. Bovendien voorziet de niet-invasieve karakter van de techniek in lengterichting experimenten. Om onze kennis zijn er momenteel geen matrix matrix omvormers beschikbaar voor hoogfrequente micro echografie imaging. De ontwikkeling van deze technologie zou sterk de steun van de acquisities van 3D-gegevens van kleine harten zoals die van de axolotl in een snellere procedure dan mechanisch bewegende de transducer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.