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Medicine

Échocardiographie 2D et 3D chez l’Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Nous présentons des protocoles d’échocardiographie pour l’acquisition d’images bidimensionnelles et tridimensionnelles de battre le cœur de la salamandre axolotl (Ambystoma mexicanum), une espèce de modèle dans la régénération du cœur. Ces méthodes permettent une évaluation longitudinale de la fonction cardiaque en haute résolution spatio-temporelle.

Abstract

Dysfonctionnement cardiaque par suite de maladie cardiaque ischémique est un défi majeur, et thérapies régénératives de coeur sont en forte demande. Quelques espèces de modèles tels que le poisson-zèbre et les salamandres qui sont capables de la régénération cardiaque intrinsèque sont prometteurs pour futures thérapies régénératives pour des patients humains. D’évaluer les résultats des expériences de cardioregenerative qu'il est impératif que la fonction cardiaque peut être surveillée. La salamandre axolotl (a. mexicanum) représente une espèce de modèle bien établi en biologie régénérative atteindre des tailles qui permet une évaluation de la fonction cardiaque. Ce protocole vise à établir des méthodes pour mesurer la fonction cardiaque chez l’axolotl en utilisant l’échocardiographie reproductible. L’application de différents anesthésiques (benzocaïne, MS-222 et propofol) est démontrée, et l’acquisition de deux dimensions (2D) données échocardiographiques axolotl non anesthésiés et anesthésiés est décrite. Échocardiographie 2D du cœur en trois dimensions (3D) peut souffrir de l’imprécision et la subjectivité de mesures et d’atténuer ce phénomène une solide méthode, à savoir intra/inter-operator/observateur analyse, pour mesurer et réduire au minimum ce biais est démontré. Enfin, on décrit une méthode pour acquérir des données échocardiographiques 3D de cœur axolotl en très haute résolution spatio-temporelle et avec un contraste prononcé sang-de-tissu. Dans l’ensemble, ce protocole devrait fournir les méthodes nécessaires pour évaluer la fonction cardiaque et l’anatomie du modèle et flux dynamique chez l’axolotl à l’aide de l’échographie avec des applications en biologie régénératrice et expériences physiologiques générales.

Introduction

Cardiopathie ischémique est des principales causes de décès dans le monde1,2. Bien que beaucoup survécu à un infarctus du myocarde en raison de l’intervention médicale rapide et adaptée, incident ischémique chez les humains conduire souvent à des cicatrices fibreuses associée à une hypertrophie, panne électrique et une moindre capacité fonctionnelle du coeur . Ce manque de potentiel de régénération du tissu cardiaque est partagé chez les mammifères, et même si les revendications controversées de mammifères régénération cardiaque ont été signalées, ceux-ci ont été limités à certaines souches murines3,4 et hypoxie traité souris5. Donc, le domaine de la biologie et la médecine régénérative cardiaque est généralement limité aux modèles animaux non-mammifère pour étudier les phénomènes de régénération cardiaque intrinsèque. Le poisson zèbre (Danio rerio) a été créé durant la dernière décennie que le modèle plus bien caractérisé pour coeur intrinsèque régénération6,7,8,9,10 . En raison de la maintenance de laboratoire simple, un temps de génération court et un large éventail d’outils moléculaires disponibles, le poisson-zèbre est bien adapté comme un modèle pour les mécanismes génétiques et moléculaires qui sous-tendent le développement cardiaque et la régénération. Toutefois, les dimensions infimes du poisson-zèbre-coeur rendent que moins adaptée pour évaluation fonctionnelle et des interventions chirurgicales complexes et la phylogénie de non-tétrapode du poisson-zèbre limite l’extrapolation raisonnable des résultats dans cette espèce, ainsi justifiant le recours à d’autres modèles plus grands tétrapodes. Un des premiers modèles de régénération de coeur vertébrés est un amphibien noyau caudé, le Triton (Notophthalmus viridescens)11, une espèce qui reste un modèle précieux12.

Ces dernières années un autre noyau caudé amphibiens, l’axolotl mexicain (a. mexicanum) apparaisse comme un grand (jusqu'à 100 g du corps de masse) et hautement adaptable animal modèle de laboratoire pour un large éventail de disciplines régénératrices s’étendant sur la régénération des membres, la moelle épinière et la régénération cardiaque13,14,15,16,17. L’axolotl est hautement susceptible de mesures fonctionnelles sur le cœur à l’aide d’échocardiographie de haute fréquence et de l’absence de structures calcifiées sur la face ventrale du coeur permet d’imagerie avec un niveau beaucoup plus faible d’artefacts d’image (acoustiques ultrasonore l’occultation et la réverbération en particulier) que celle observée chez d’autres animaux de modèle avec calcifiés sternum et côtes.

Le protocole suivant décrit plusieurs différentes méthodes et préparations (Figure 1, Figure 2) en vue d’acquérir des mesures échocardiographiques reproductibles sur le cœur de l’axolotl dans les deux anesthésiés (appliquer trois différents anesthésiques : benzocaïne, MS-222 et propofol) et non anesthésiés animaux en deux (Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7, Les fichiers supplémentaires 1-12) et trois (Figure 8, Figure 9, Fichiers supplémentaires 13-14) dimensions spatiales. Au cœur d’amphibien est trois chambres (deux oreillettes et un ventricule unique). Les oreillettes sont fournis par un grand sinus d’Arantius et le ventricule se jette dans le tube d’écoulement conus arteriosus (Figure 2). Étant donné que la plupart l’accent est traditionnellement placé sur la régénération ventriculaire et moins sur le recouvrement des oreillettes6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, le présent Protocole se concentre principalement sur les mesures de la fonction ventriculaire.

Échocardiographie amphibien n’est pas bien décrit dans la littérature, et le développement des méthodes 2D décrites dans le présent document ont été chassés par la nécessité de mieux représenter les fonctionnalités du cœur battant axolotl à un moment donné et le paramètre expérimental. Ainsi, les méthodes décrites ici sont appliquent dans les expériences régénératrice de cœur où fonction cardiaque peut être surveillée de façon répétée au cours d’un processus de régénération. En outre, les méthodes peuvent être appliqués dans des expériences de cardiophysiological sur l’axolotl en général ou légèrement modifiées pour couvrir d’autres modèles d’amphibiens anoures ou de noyau caudés (e.g.,Xenopus). L’axolotl existe dans plusieurs différentes souches et les variations de couleur (par exemple, type sauvage, mélanoïde, blanc, albino, transgénique blanc avec l’expression de la protéine fluorescence verte), cependant, ces caractéristiques n’affectent pas la compatibilité de la axolotl avec le protocole décrit. La méthode décrite ici pour acquérir des données échocardiographiques 3D est une version modifiée de la technique de corrélation (STIC) image spatio-temporelle développée pour l’échographie clinique et la quadratique moyenne méthode décrite précédemment dans le poulet en développement à améliorer le signal de taches de sang dans les tissus mous chez les espèces contenant des hématies nucléées18,19. Cette méthode permet la modélisation avancée des contraction cardiaque et la dynamique des fluides calculée dans le coeur de l’axolotl.

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Protocol

Les procédures menées dans le présent protocole étaient conformes à la législation danoise nationale pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et les expériences ont été approuvées par l’inspection d’expériences des animaux nationale danoise (protocole # 2015-15-0201-00615).

1. les préparatifs

  1. Préparer l’axolotl moyen.
    1. Appliquer l’eau du robinet non chimiquement traitée de haute qualité comme support de l’axolotl. Si ce n’est pas disponible, appliquer la solution de Holtfreter de 40 %.
    2. Préparer la solution de Holtfreter de 40 % (wt/vol) en dissolvant 15,84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O et 0,288 g KCl dans de l’eau filtrée et désionisée jusqu'à un volume de 1 L.
  2. Faire des anesthésiques immersion.
    1. Préparer la benzocaïne (4-aminobenzoate d’éthyle) solution anesthésique en dissolvant 200 mg 4-aminobenzoate d’éthyle dans 3 mL d’acétone et dissoudre ensuite ce mélange dans une solution de 1 L eau du robinet ou 40 % Holtfreter.
    2. Préparer MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate acide méthanesulfonique, également connu comme tricane) solution anesthésique en dissolvant 200 mg éthyl 3-aminobenzoate d’acide méthanesulfonique directement dans la solution de 1 L eau du robinet ou 40 % Holtfreter.
    3. Préparer la solution anesthésique propofol (2, 6-diisopropylphénol) en dissolvant 3,3 mg 2, 6-diisopropylphénol en solution de 1 L eau du robinet ou 40 % Holtfreter. Vous pouvez également diluer la solution commercialement premade à 3,3 mg/L.
      ATTENTION : Le Propofol est un puissant anesthésique humain (administré par voie intraveineuse) et doit être manipulé avec soin, y compris sous forme diluée.
  3. Préparer le lit et conteneur d’échocardiographie.
    1. Préparer en forme de lèvres animaux lit échocardiographie en pliant un morceau de 70 cm x 55 cm de tissu doux une fois et puis il rouler en « forme de burrito » (Figure 1 a). Puis courber les extrémités jusqu'à ce qu’ils rencontrent et tape ces ensemble (Figure 1 b).
    2. Submerger la lèvre en forme de structure dans le milieu de l’axolotl pour accueillir l’axolotl anesthésiés au cours de l’échographie. D’assurer l’animal à la structure et éviter flottant à l’aide d’élastiques lâches ; Placez ces mi-mandibulaires et sur la région sacrée (Figure 1).
      Remarque : Les élastiques doivent comprimez pas l’animal car cela aura une incidence sur l’hémodynamique.
    3. Pour l’échocardiographie 2D sur axolotl non anesthésiés, préparer un hamac en taillant une 16 x 8 cm x 5 cm trou dans un 33 cm x 27 cm x 5 cm blocs de mousse de polystyrène (par exemple, un couvercle d’un contenant de mousse de polystyrène de taille moyenne) (Figure 1).
    4. Pousser un morceau de 33 cm x 27 cm de film plastique dans le trou et fixer les bords de l’écharpe sur la surface supérieure du bloc de polystyrène expansé (Figure 1E) pour créer un hamac. Ajouter moyen axolotl à 3 cm de profondeur dans le hamac. L’axolotl non anesthésiés va couler au fond du hamac permettant un accès facile ventral par le biais de la pellicule plastique (Figure 1F).

2. anesthésier axolotl

  1. Immergez l’axolotl en solution anesthésique souhaitée (benzocaïne, MS-222 ou propofol).
  2. Recherchez les premiers signes de sédation, mouvements réduites et une perte croissante de réflexe de redressement, cela apparaît dans les 10 min chez les animaux < 10 g (< 10 cm) et moins de 20 min chez les animaux entre 10 g et 50 g de masse corporelle (10-22 cm).
  3. Inspecter pour absence totale de mouvements du corps, les mouvements ventilation gill et réflexe de redressement et assurez-vous que l’animal est irrecevable à la stimulation de douleurs modérées testée en pinçant la sangle entre les chiffres.
    NOTE : malgré le fait que l’anesthésie générale s’effectue dans les 30 minutes dans l’axolotl benzocaïne anesthésiée, fonction cardiaque n’est pas stabilisée jusqu'à 1 h. Ce n’est pas le cas dans MS-222 ou propofol anesthésiés axolotl (Figure 6 a-F).
  4. Pour maintenir l’axolotl sous anesthésie générale, garder les animaux dans la solution d’anesthésie ou enveloppés dans des lingettes en papier humide mouillées dans la solution d’anesthésie.
    Remarque : L’anesthésie peut être maintenue pendant 7 h sans effets négatifs sur le bien-être de l’animal étant donné que la peau et surtout les branchies sont gardés humides.
  5. Pour suffirait axolotl, transférer l’animal dans un milieu sans anesthésie.
    Remarque : Le premier signe d’éveil est mouvements ventilation gill. Animaux doivent être dressées et sensible à la stimulation moins de 1 h.

3. 2D échocardiographie sur Axolotl anesthésiés

  1. Place anesthésiés axolotl dans une position couchée dans le lit d’animaux en forme de lèvres (pas 1.3.1-1.3.2). Fixez-le de flotter à l’aide des bandes de caoutchouc (Figure 1). S’assurer que la surface thoracique est couverte par 3 à 5 mm du support.
    Remarque : Pour une acquisition brève (< 5 min) un milieu sans anesthésie peut s’appliquer. Pour acquisition prolongée, solution anesthésique doit être appliquée comme support de l’échographie pour assurer la fonction cardiaque stable dans l’ensemble de mesures.
  2. Placer le transducteur sur la ligne médiane de l’animal dans la région thoracique parallèle à l’axe longitudinal de l’animal (Figure 2 a, Figure 3 a-B, 2 de fichier supplémentaire). Utilisez la transillumination avec une source de lumière froide sur axolotl blanc et albinos afin d’assurer le placement correct de la sonde (Figure 2 et 1 de fichier supplémentaire).
    1. Pour axolotl < 20 grammes, utiliser un transducteur 50 MHz ; pour axolotl > 20 g, utiliser un transducteur de 40 MHz. Assurer le positionnement de la direction crânienne/antérieur vers la droite pour l’acquisition d’images standardisées. Si ce n’est pas le cas faites pivoter le transducteur 180 ° ou inverser l’image.
  3. Veillez à ce que, selon la ligne médiane de grand axe, une petite portion du ventricule (située à droite dans la cavité thoracique, Figure 2 a) apparaît dans le cadre à la diastole ventriculaire et une grande partie de l’oreillette gauche et droite (positionné au centre / légèrement vers la gauche dans la cavité thoracique, Figure 2 a) et le sinus venosus sont visibles en atrial systole et diastole (Figure 3 a, B).
  4. Traduire le transducteur 1-3 mm vers la droite de l’animal pour obtenir la vue ventriculaire long axe (Figure 2 a). La position correcte est atteinte lorsque la section transversale du ventricule systole-fin est à son maximum (Figure 3-H).
  5. En mode B, acquérir ≥ 3 cycles cardiaques avec > 50 images/s en soit « imaging général » (haute résolution temporelle spatiale/basse) ou en mode « cardiologie » (faible résolution spatiale/haut temporelle).
    Remarque : Cette vue permet d’évaluation de la fonction ventriculaire. La fonction ventriculaire peut être évaluée en deux dimensions, en utilisant le changement ventriculaire fractionnelle (FACv) calculé à partir de la télédiastoliques et télésystoliques section transversale du ventricule (CSAv) selon l’équation suivante :
    Equation 1(1)
    Ventricule de l’axolotl assume la forme d’une sphère et une cylindrée de géométrie en fonction [SV(geo)] peut être calculée à l’aide de l’équation :
    Equation 2(2)
  6. Traduire la sonde le long de l’axe longitudinal de l’animal jusqu'à ce que le centre du ventricule se trouve au milieu de l’écran. Faire pivoter le transducteur de 90 ° vers la droite pour obtenir l’affichage de l’axe court-ventriculaire (Figure 5 a et B, 10 de fichier supplémentaire). Évaluer la forme circulaire du ventricule en traduisant le transducteur le long de l’axe longitudinal du cœur.
  7. Retourner le transducteur à l’avion de l’axe le plus long et le traduire vers la ligne médiane ou légèrement à gauche de la ligne médiane pour obtenir l’affichage de deux chambre auriculaire long axe (Figure 2 a). Assurez-vous que la position correcte est atteinte en confirmant que les surfaces transversales des oreillettes fin-systole courent leurs maxima et deux oreillettes combinés imagine le contour du nombre "8" incliné ~ 45 ° vers la gauche (Figure 4 a et B, Fichier supplémentaire 6).
  8. En mode B acquérir ≥ 3 cycles cardiaques avec > 50 images/s en mode « imagerie générale » ou « cardiologie ».
    Remarque : Les oreillettes de l’axolotl sont de forme irrégulière et fonction 3D ne peut pas être directement déduite des données 2D, donc leur fonction doit être évaluée comme une mesure d’indice comme chance auriculaire fractionnelle (FACa) basée sur la section transversale combinée (CSAa) des deux oreillettes en systole et diastole :
    Equation 3(3)
  9. Traduire le capteur vers la droite jusqu'à ce que le tube de sortie (conus arteriosus) apparaisse (à proximité de l’affichage de l’axe long ventriculaire) (Figure 2 a).
    Remarque : Après avoir quitté le ventricule en direction antérieure, les voies de sortie fait un virage et s’exécute sous un petit angle vers la surface ventrale avant encore en supposant une direction antérieure et scission en branches de gill et vaisseaux systémiques.
    1. Assurez-vous que la vue de voies de sortie correcte est atteinte en confirmant que le diamètre de l’écoulement est à son maximum à la fin-systole ventriculaire et deux des trois valvules semilunaires à l’entrée de l’écoulement sont visibles au milieu d’éjection (Figure 4E, Dossier complémentaire 8).
      Remarque : La directionnalité ventrale vers le transducteur de la partie intermédiaire du tractus sortie permet pour les mesures de vitesse et le débit à l’aide de l’imagerie Doppler.
  10. Appliquez le mode Doppler couleur pour faire correspondre les vitesses d’écoulement de sang dans le tube d’écoulement pendant l’éjection cardiaque (Figure 4F et supplémentaires fichier 9). S’applique plus le Doppler couleur et Doppler puissance d’imagerie afin de visualiser le flux sanguin dans les vues ventriculaires et auriculaires (Figure 3E-H, Fichiers supplémentaire 4-5 et Figure 4-Det 7 de fichier supplémentaire).
  11. Appliquez le mode Doppler Pulse Wave (PW) à la position de la vitesse maximale de sang dans la portion du tube sortie courant vers le transducteur.
    1. Utilisez « angle de faisceau » et « correction angulaire » jusqu'à 45 ° pour tenir compte de l’écoulement n’étant ne pas complètement perpendiculaire à la face du transducteur (Figure 4). Assurez-vous que la position PW Doppler n’est pas recouvertes par la valvule spiralée de l’écoulement pendant toute phase du cycle cardiaque (Figure 4E).
  12. En mode Doppler PW acquérir des données vitesse/temps pendant ≥ 3 cycles cardiaques.
  13. Revenir en mode B et acquérir ≥ 3 cycles cardiaques à l’exact même plan comme PWV a été acquise.
  14. Mesure le temps de vitesse intégré (VTI) du débit sanguin dans les voies de sortie comme l’aire sous la courbe de vitesse/temps pour un cardiaque complet du cycle (Figure 4, g1).
    Remarque : De la VTI et le diamètre (d) des voies sortie à fin-systole provenant de l’acquisition de mode B, un PW Doppler fonction systolique [SV(pw)] peut être calculée à l’aide de l’équation :
    Equation 4(4)
    Fréquence cardiaque (FC) est mesurée à partir de la courbe de vitesse/temps en mesurant la durée d’un cycle cardiaque complet. Débit cardiaque [CO(pw)] est calculé selon l’équation suivante :
    Equation 5(5)
  15. Obtenir la vue oblique paragill, une vue qui offre une alternative pour la mesure de la vitesse d’écoulement de sang dans les voies de sortie, en tournant l’axolotl 90 ° au niveau de la lèvre en forme de lit de telle sorte que la partie droite de l’animal fait face à la hausse (Figure 2 b). Angle et tourner le transducteur et positionnez-le parallèle et juste derrière les branchies qui dépasse (Figure 2 b). Assurez-vous que la position correcte est atteinte en confirmant que les voies de sortie tourne vers le bas à ~ 45 ° et que les oreillettes apparaissent sous les voies de sortie pendant l’éjection (Figure 5 C, 11 de fichier supplémentaire).
  16. Appliquer PW Doppler-mode à la position de la vitesse maximale de sang dans la partie du tube sortie fuyant le transducteur (Figure 5, 12 de fichier supplémentaire). Utilisez « angle de faisceau » et « correction angulaire » jusqu'à 45 ° pour tenir compte de l’écoulement n’étant ne pas complètement perpendiculaire à la face du transducteur (Figure 5E).
  17. En mode Doppler PW acquérir vitesse sang sur ≥ 3 cycles cardiaques.
  18. Revenir en mode B et acquérir ≥ 3 cycles cardiaques à l’exact même plan comme PWV a été acquise.
    Remarque : SV(pw) et CO(pw) sont calculés pour la vue oblique paragill en utilisant l’équation 4 et 5 de l’équation comme décrit ci-dessus pour l’affichage de l’axe le plus long.

4. 2D échocardiographie sur Axolotl non anesthésiés

  1. Placer l’axolotl non anesthésiés dans une position couchée dans le hamac (étape 1.3.3).
  2. L’animal laisser reposer pendant 30 à 60 min récupérer du stress de manipulation.
  3. Placer le transducteur à ultrasons avec la tête du capteur vers le haut vers l’axolotl dans le hamac.
  4. Appliquez le gel-échographie sur le transducteur.
  5. Doucement et sans déranger l’animal, positionnez le transducteur sur la ligne médiane de l’animal dans la région thoracique parallèle à l’axe longitudinal de l’animal.
    NOTE : Ceci est la position même, mais inversée, en ce qui concerne l’axolotl anesthésiés (étape 3.2).
  6. Obtenir le mode B, en mode Doppler couleur, les données en mode PW dans l’axe le plus long et la vue de l’axe court comme décrit aux points 3.2-3.14.
    Remarque : Une vue oblique paragill est impossible à obtenir chez l’axolotl non anesthésiés. Les données échocardiographiques axolotl non anesthésiés doivent être acquis entre les mouvements ventilation gill (une période de 10-20 s pour un animal au repos). Si l’axolotl se déplace lors de l’acquisition, des mesures doivent être répétées.

5. évaluer les données de l’échocardiographie 2D et minimiser la subjectivité

  1. Éviter les biais de l’opérateur/observateur en échographie 2D imagerie 3D évaluation et de la fonction cardiaque basée sur des données 2D causées par la subjectivité en l’acquisition de données et la phase d’analyse de données en effectuant l’analyse intra/inter-operator/observateur20.
    Remarque : Dans le démarrage des études et lorsque la formation du nouveau personnel cette subjectivité doit être quantifiée et réduit au minimum en utilisant l’analyse intra/inter-operator/observateur.
  2. Lancer l’analyse intra/inter-operator/observateur dans une configuration de deux personnes avec opérateur/observateur 1 (moins expérimentés) testée contre le travail d’opérateur d’observation 2 (plus connue) en effectuant des mesures ≥ 6 consensus ensemble, y compris les deux banc à l’échographe (opération) et une analyse ultérieure des paramètres pertinents (observation).
  3. Parvenir à un consensus entre les opérateurs et observateurs et exploiter (opérateur/observateur 1) le système à ultrasons pour acquérir des données pertinentes sur ≥ 6 animaux (opération 1.1).
  4. Directement après, exploitée (opérateur/observateur 2) le système à ultrasons pour acquérir des données pertinentes sur les mêmes animaux (opération 2.1).
  5. Laisser les animaux à récupérer pendant 3 jours. Par la suite, procéder de même (opérateur/observateur 1) (opération 1.2).
  6. Analyser (opérateur/observateur 1) toutes les données (opération 1.1/observation 1.1 ; opération 2.1/observation 1.1 ; 1.2 opération/observation 1.1) et après 24h, répéter l’analyse des données de l’opérateur/observateur de 2 (opération 2.1/observation 1.2).
  7. Analyser (opérateur/observateur 2) les données acquises par elle-même (opération 2.1/observation 2.1). Notez que les valeurs obtenues par cette analyse sont considérés comme plus proche de vous pour les vraies valeurs.
  8. Évaluer la variation, tendances et préjugés dans les comparaisons entre tous les paramètres acquis à l’aide de traçage Bland-Atman, QQ comploter, t-test (moyenne égale) et F-test (variance égale) (Figure 6).
    1. Notez que l’opération 1.1/observation 1.1 versus comparaison 2.1/observation 1.1 opération illustre la variation entre opérateurs.
    2. Notez que l’opération 2.1/observation 1.1 versus comparaison 2.1/observation 2.1 fonctionnement montre la variation inter observateur.
    3. Notez que l’opération 1.1/observation 1.1 versus comparaison 1.2/observation 1.1 opération illustre la variation intra-opérateur.
    4. Notez que l’opération 2.1/observation 1.1 versus comparaison 2.1/observation 1.2 opération illustre la variation intra-observateur.
  9. Assurez-vous que la moyenne et la variation des mesures différentes sont non significativement différents pour les quatre comparaisons ; la différence entre les valeurs mesurées doit se situer dans les écarts ± 1,96 et il ne devrait apparaître aucune tendances à moins de précision des valeurs ni petits ni grands.

6. 3D échocardiographie sur Axolotl anesthésiés

  1. Acquisition 3D
    1. Placez l’axolotl anesthésiés en position couchée dans le lit d’animaux en forme de lèvres (étape 1.3.1). Fixez-le de flotter à l’aide des bandes de caoutchouc (Figure 1) et s’assurer que la surface thoracique est couverte par 3 à 5 mm du support. Acquisition 3D est une longue procédure, donc appliquer la solution anesthésique comme support de l’échographie pour assurer la fonction cardiaque stable dans l’ensemble de mesures.
    2. Placer le transducteur sur la ligne médiane de l’animal dans la région thoracique soit parallèle à l’axe longitudinal de l’animal (pour un enregistrement 3D sagittal) soit orthogonale à l’axe longitudinal (enregistrement 3D transversal).
    3. Traduire le transducteur dans la dimension dans le plan (x et y) et la dimension hors-plan (z ou tranche) pour s’assurer que l’ensemble de la région cardiaque est couverts dans la capture 3D subséquente.
    4. Régler la fréquence d’images et la résolution spatiale comme vous le souhaitez en sélectionnant soit « imaging général » (haute résolution temporelle spatiale/basse) ou en mode « cardiologie » (faible résolution spatiale/haut temporelle). Pour 0,33 Hz < HR < 1 Hz utilisent une résolution temporelle de 50 images/s obtenues à haute résolution spatiale (« général imaging ») qui permet le cycle cardiaque être reconstruite en phases distinctes de 50-150.
    5. Régler « 2D » à un niveau où les structures anatomiques sont à peine reconnaissables dans l’image de B-mode raw (~ 5 dB) d’augmenter à-rapport signal bruit dans les reconstructions finales.
    6. Pour chaque tranche (étape de z), enregistrer les 1.000 images ≥.
    7. Traduire une étape de z transducteur à la fois, par exemple, 20 µm ou 50 µm et répéter jusqu'à ce que l’ensemble de la région cardiaque est couvert d’enregistrement.
  2. Reconstruction 3D (supplémentaire fichiers 13 et 14).
    1. Exporter des acquisitions en Digital Imaging and Communications in Medicine DICOM (petit-boutiste).
      Remarque : Chaque tranche contenant un nombre défini d’images composent un seul fichier.
    2. Déterminer le nombre d’images dans un cycle cardiaque complet. Comme HR peut varier au fil du temps, déterminer cela pour la première et la dernière tranche. Définir le plus grand nombre d’images par cycle que l’estimation initiale supérieure de résolution phase qui peut être ultérieurement réduite (étape 6.2.8).
    3. Déterminer les limites de récolte et d’accise espace non pertinent entourant la fenêtre de mode B.
      Remarque : Ces limites doivent être constants tout au long des tranches.
    4. Convertir l’image en couleurs RVB en 32 bits.
    5. Calculer la valeur de corrélation (C) pour chaque trame dans la pile et le nombre d’images inclus dans le premier cycle cardiaque selon la formule suivante :
      Equation 6(6)
      NOTE : Ici Equation 7 est l’intensité du signal du pixel à coordonnées (i, j) dans la première image Equation 8 et est le même dans la seconde image, Equation 9 , Equation 10 et Equation 11 , Equation 12 sont la norme et la densité moyenne déviation, respectivement, de l’image première et la deuxième dans la comparaison et I et J sont les numéros des colonnes et des lignes dans l’image. Le tableau résultant de valeurs corrélées aura la taille du produit du nombre d’images par cycle cardiaque et le nombre d’images par tranche (p. ex., 75 × 1 000 = 75 000 à la Figure 8) (voir le texte exemplaire en supplémentaire Fichier 16). La valeur de corrélation ne peut être calculée si un ou les deux des images lors de la comparaison ont un écart-type des valeurs de pixel de zéro, mais cela est fort peu probable dans les images échographiques.
    6. Détecter les maxima locaux dans le tableau de valeurs de corrélation (Figure 8 a, voir script exemplaire dans 17 de fichier supplémentaire pour détecter automatiquement des maxima locaux).
    7. Calculer la moyenne quadratique Q(AVG) de cadres aux pics de corrélation (c'est-à-direcorrespondant à des phases cardiaques) en utilisant la formule :
      Equation 14(7)
      où N est le nombre total d’images assortis cardiaques phases, Equation 15 est l’intensité du pixel à coordonnées (i, j) de l’image deth net Equation 16 est la moyenne arithmétique temporelle de Equation 17 de l’image deth n(voir le texte exemplaire supplémentaire fichier18).
    8. Répétez l’étape 6.2.3-6.2.7 pour toutes les tranches.
    9. Sélectionnez une tranche (slice référence) avec des structures anatomiques facilement reconnaissables (par exemple, mi-ventriculaire) et vérifiez que l’ensemble reconstituée en moyenne un cycle cardiaque correspond à exactement un cycle (c'est-à-dires’il existe d’autres phases, ce qui entraîne plus d’un cycle cardiaque). Supprimer les phases additionnelles pour obtenir exactement un cycle cardiaque (p. ex., passant un surestimées 75 phases/cycle (en réalité, le cycle de 1,07) Figure 8 à exactement un cycle contenant 70 phases dans la Figure 8).
    10. Sur la tranche de voisine (essai tranche), trier l’ensemble en moyenne un cycle cardiaque t-pile dans les correspondants des phases cardiaques avec la tranche de référence à l’aide de la formule d’évaluation de corrélation (équation 6) (voir exemplaire de scripts dans 19 de fichier supplémentaire et fichier supplémentaire 20).
      Remarque : Bien que deux tranches non identiques n’apparaîtra pas tout à fait semblables à n’importe quel moment au cours du cycle cardiaque, tranches adjacentes avec une taille suffisamment petite étape (par exemple, 20 µm ou 50 µm) seront ont prononcé similitudes résultant en corrélation maxima de valeur qui peuvent être traduites dans les correspondants des phases.
    11. Répétez l’étape 6.2.9-6.2.10 pour toutes les tranches.
    12. L’effondrement de l’entière reconstruction 3D dans un format Tagged Image File 3D unique (TIF) contenant des tranches de z et t cadres ou dans une pile de fichiers DICOM.
      NOTE : Données peuvent être mis en cellule dans chaque dimension pour réduire la taille, augmenter le rapport signal-sur-bruit et générer des données isotropes (résolution dans le plan est habituellement plus élevés que la résolution hors-plan plusieurs plis).

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Representative Results

Espace d’administration chez l’axolotl dépend de la taille de l’animal. Les animaux plus petits (2-20 g, 7 à 15 cm) aura un excès de liquide péricardique (qui apparaissent sombres en échocardiographie) entourant que le cardiaque chambers tandis que chez les plus grands animaux sexuellement matures (> 20 g, > 15 cm) les chambres occupera la plus grande partie de l’intrapericardial espace. Pour assurer la meilleure vue d’ensemble des résultats représentatifs d’échocardiographiques vues du cœur axolotl, un petit animal (10 g, 10 cm) a été appliqué pour la Figure 3, Figure 4, Figure 5et Figure 9.

La vue de l’axe le plus long fournit généralement un bon aperçu de l’anatomie cardiaque chez l’axolotl. Entrer sur le plan de la ligne médiane avec le sinus venosus, oreillettes et partie du ventricule en avion (Figure 3 a, B, 2 de fichier supplémentaire), soit le plan ventriculaire (Figure 3–H) ou en l’avion auriculaire (Figure 4 a –D) peut être atteint en traduisant le transducteur à droite ou à gauche de l’animal, respectivement. Le ventricule apparaîtra sphériques et hautement trabéculé (Figure 3, supplémentaire 3 fichiers–5), alors que les oreillettes ont une forme plus irrégulière et presque aucun trabeculation (Figure 4 a, Le dossier complémentaire de 6, dossier complémentaire 7). La vue de l’axe court (Figure 5 a, B, 10 de fichier supplémentaire) donne un aperçu moins facilement interprétable de l’anatomie cardiaque de l’axolotl cœur, mais elle contribue à l’évaluation de la contraction cardiaque correcte (par exemple zones infarcis ou non contractante du ventricule circulaire sont clairement visualisés dans ce plan de la vue). Dans le plan de vue axe long, le Centre des voies sortie est positionné près au centre du ventricule (Figure 2 aet comparer Figure 3 avec Figure 4E et supplémentaire 3 fichier avec 8 de fichier supplémentaire ). Puisque les tissus mous du tractus de sortie sera émouvante sur le sang est éjecté, le signal de sang de haute intensité durant un cycle cardiaque mesuré par l’onde de pouls Doppler dans l’axe le plus long et le plan oblique paragill sera être touché par des bruits de faible intensité de la mouvements des tissus mous environnants (zone grise qui entoure la zone blanche dans la courbe de vitesse/temps dans la Figure 4 et Figure 5E). Généralement, le contraste entre le signal du sang et du bruit des tissus mous doit être assez grand pour segment seulement le signal de sang lors de la mesure de l’intégrale de temps de vitesse (Figure 4 (grossissement g1) et Figure 5E (grossissement e1)).

Pour une évaluation qualitative des modèles d’écoulement de sang, couleur Doppler et l’imagerie Doppler puissance offrent des visualisations des modèles d’écoulement dans les différentes cavités cardiaques (ventricule : 3E Figure–H, 4 de fichier supplémentaire, Fichier supplémentaire 5; oreillettes : Figure 4 C, D, 7 de fichier supplémentaire; sortie du : Figure 4F, Figure 5 D, supplémentaires fichier 9, 12 de fichier supplémentaire).

Axolotl utilisés pour l’expérimentation en laboratoire varie en taille de stade larvaire précoce post de 2 à 4 g à pleine maturité à 10-30 g et plus grands animaux d’un poids > 100 g. de même, la fonction cardiaque et certaines valeurs absolues des paramètres fonctionnels décrits ici dépendent la taille des animaux. Généralement, les fractionnelle changement est constant dans les groupes de taille différente avec des valeurs allant de 40 à 50 % (biaisé vers des valeurs plus basses pour les plus gros animaux). Le volume systolique dépend fortement de la taille de l’animal, par exemple, la taille du cœur, allant par exemple, 20-30 µL dans axolotl 5 g, 50-70 µL dans axolotl 10 g et 250-300 µL dans axolotl 50 g. Fréquence cardiaque et le volume systolique de quelques degrés sont fortement tributaires de l’anesthésique appliquée et le niveau de l’anesthésie (Figure 6 a–F, Figure 7).

Analyse intra/inter-operator/observateur traditionnelle implique des représentations graphiques (graphes Q-Q placettes et de Bland-Altman) et l’essai pour une moyenne égale (t-test) et la variance (F-test) pour évaluer la distribution normale des données et de comparer précision et justesse entre deux personnes (Figure 6).

Échocardiographie 3D ajoute une dimension supplémentaire (z ou profondeur) à l’acquisition 2D plus traditionnelle. Cela permet pour Multiplan visualisation de données (Figure 9 a), reslicing (Figure 9 b), les reconstructions de volume et de surface (Figure 9, supplémentaires fichier 13et 14 de fichier supplémentaire) et la segmentation et génération de modèles 3D (Figure 9 C, 15 de fichier supplémentaire).

Figure 1
Figure 1. Échocardiographie de préparation de lit et conteneur anesthésiés et non anesthésiés axolotl. (A) A tendre morceau de tissu est plié une fois et roulé en forme de « burrito ». (B) les extrémités sont pliées en arrière et collées pour former un lit en forme de lèvre pour l’axolotl lors de la numérisation sous-marine. (C) d’échocardiographie 2D et 3D d’un axolotl anesthésié, l’animal est doucement placé dans une position en décubitus dorsal dans la crevasse de la lèvre en forme de lit et fixe avec des élastiques par rapport à la région mid-mandibulaire et sacrée. (D, E) Un hamac est préparé par tailler un trou carré dans un morceau de mousse de polystyrène et ruban de pellicule de plastique sur l’extrados. (F) pour une échocardiographie 2D d’un axolotl non anesthésié, l’animal est placé dans une position couchée naturelle dans le hamac et approché avec une pointe de transducteur couverte de gel de dessous. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Placement de transducteur. (A, B) Modèle du réseau artériel chez l’axolotl avec la position approximative du transducteur pour axe le plus long et axe court (A) et paragill oblique (B). Transillumination (C) avec une source de lumière froide peut aider à trouver l’emplacement exact des cavités cardiaques avant d’appliquer le transducteur (voir supplémentaire 1 fichier). Les abréviations anatomiques : A, oreillettes ; OFT, des voies de sortie ; SinV, sinus venosus ; V, ventricule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Vues échocardiographiques représentatif d’axe long du ventricule. (A, B) Axe long typique ligne médiane vue en mode B (ligne jaune en Figure 2 a) à la fin de diastole ventriculaire (A) et télésystolique (B) phases (voir dossier complémentaire 2 représentation vidéo). (C, D) Vue d’axe long du ventricule en mode B (ligne noire dans la Figure 2 a) dans la fin de diastole ventriculaire (C) et télésystolique (D) phases (voir 3 de fichier supplémentaire pour représentation vidéo). (E–H) Plan de vue similaires comme dans (A) et (B) en color Doppler (CD) et en mode Doppler (DP) de puissance démontrant le sang couler (voir supplémentaires fichier 4 et 5 de fichier supplémentaire pour représentation vidéo de mode CD et PD, respectivement). Couleurs rouges dans les images de CD mode indiquent le sang qui coule vers le transducteur et couleurs bleues indiquent le contraire. Cavités cardiaques et la circulation sanguine ont été soulignés en pointillés. Caricatures insérés dans (A) et (C) Voir la mise en place du transducteur et traduction par rapport à la médiane de l’axe le plus long vue. Les abréviations anatomiques : A, oreillettes ; DC(L), gauche conduit de Cuvier ; OFT, des voies de sortie ; SinV, sinus venosus ; V, ventricule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Vues échocardiographiques axe long représentant des oreillettes et des sorties des voies. (A, B) Vue du grand axe de l’oreillette en mode B (ligne verte dans la Figure 2 a) à la fin de diastole auriculaire (A) et télésystolique (B) phases (voir dossier complémentaire 6 pour représentation vidéo). (C, D) Plan de vue similaires comme dans (A) et (B) en mode Doppler (CD) de couleur montrant le sang débit (voir dossier supplémentaire de 7 représentation vidéo). Vue sur axe Long (E) les voies de sortie en mode B (ligne bleue dans la Figure 2 a) dans la phase intermédiaire d’éjection (voir 8 de fichier supplémentaire pour représentation vidéo). F: Plan de vue similaires comme dans (E) dans le sang qui manifestaient CD mode débit (voir supplémentaires fichier 9 représentation vidéo). Plan de vue similaires (G) comme dans (E) et (F) en mode Doppler (PW) de vague impulsion permettant de taux détection et vitesse temps intégral (VTI) mesure de la chaleur pour le calcul de volume de course. Couleurs rouges dans les images de CD mode indiquent le sang qui coule vers le transducteur et couleurs bleues indiquent le contraire. Cavités cardiaques et la circulation sanguine ont été soulignés en pointillés. Flèches jaunes et rouges indiquent les valves semilunaires à la racine les voies d’écoulement et la valvule spiralée dans les voies de sortie, respectivement. Caricatures insérés dans (A) et (E) Voir la mise en place du transducteur et traduction par rapport à la médiane de l’axe le plus long vue. Les abréviations anatomiques : A(R), oreillette droite ; Capteur, laissé atrium ; OFT, des voies de sortie ; SinV, sinus venosus ; V, ventricule ; VC, veine cave supérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Représentant axe court et oblique paragill échocardiographiques vues du tractus ventricule et l’exutoire. (A, B) Vue d’axe court du ventricule en mode B (ligne grise en Figure 2 a) à la fin de diastole ventriculaire (A) et télésystolique (B) phases (voir 10 de fichier supplémentaire pour représentation vidéo). (C) Oblique paragill vue sur les voies de sortie en mode B (ligne violette dans la Figure 2 b) dans la phase intermédiaire d’éjection (voir dossier complémentaire 11 représentation vidéo). (D) du plan de vue similaires comme en (C) dans le sang qui manifestaient CD mode débit (voir 12 de fichier supplémentaire pour représentation vidéo). Plan de vue similaires (E) comme en (C) et (D) en mode Doppler (PW) de vague impulsion permettant de taux détection et vitesse temps intégral (VTI) mesure de la chaleur pour le calcul de volume de course. Couleurs rouges dans les images de CD mode indiquent le sang qui coule vers le transducteur et couleurs bleues indiquent le contraire. Cavités cardiaques et la circulation sanguine ont été soulignés en pointillés. Caricatures insérés dans (A) et (C) Voir la mise en place du transducteur et traduction par rapport à la médiane de l’axe le plus long vue. Les abréviations anatomiques : A, oreillettes ; OFT, des voies de sortie ; SinV, sinus venosus ; V, ventricule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Les résultats représentatifs des mesures de volume de la fréquence cardiaque et d’AVC, l’effet de l’anesthésie et représentant intra/inter-operator/observateur analyse. A–(C) Fréquence cardiaque (FC) par rapport à non anesthésiés tracés au fil du temps (0 h est à anesthésie totale) pour six axolotl anesthésiés à la benzocaïne (A), MS-222 (B) et (C) le propofol. (D–F) Volume (SV) par rapport à non anesthésiés tracées au fil du temps (0 h est à anesthésie totale) pour six axolotl anesthésiés à la benzocaïne (D), MS-222 (E), de course et propofol (F). (G) analyse Intra/inter-operator/observateur du volume systolique. Parcelles de Bland-Altman [différence (Dif) entre opérateurs (Op) / observateurs (Obs) complotèrent contre moyenne (Avg)] ne devrait révéler aucun biais systématique dans les mesures normalement distribués (parcelles de Q-Q) obtenues par les différents opérateurs et observateurs. Essais pour une moyenne égale (t-test) et de variance égale (F-test) ne devrait révéler aucune différence significative entre les opérateurs/observateurs (table en bas à droite). A - F modification de matériel disponible sous la licence Creative Commons (Figure 1 de Thygesen et al. 21). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Comparaison du volume systolique estimé par la moyenne géométrique et l’onde du pouls méthode Doppler. Comparaison du volume systolique (SV) estimée par des mesures géométriques (geo) B-mode bidimensionnels ou mesures Doppler onde pulsée sur la vitesse du sang sortant du tube de sortie. SV(GEO) et SV(pw) est enregistré chez les mêmes six animaux secondes entre les types de deux mesure et en utilisant trois différents anesthésiques, benzocaïne (cases bleues inclinées), MS-222 (carrés rouges) et avec une semaine de récupération entre le propofol (triangles verts) appliquant les différents anesthésiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Corrélation d’image spatio-temporelle représentative d’échocardiographie 3D. (A) représentation de corrélation ont donné des valeurs d’une opération de corrélation dans un dataset de cine 1 000 châssis avec 75 images par cycle cardiaque de la courbe. Deux cadres avec seulement de petites différences, indiquant la correspondance cardiaques phases, produira une valeur forte corrélation. Par la suite un maxima locaux la recherche algorithme peut être appliqué sur les données pour détecter toutes les trames correspondants. (B) une représentation graphique des mêmes données que dans (A). Lorsque les valeurs de corrélation sont obtenus en comparant le premier cycle cardiaque avec la pile entière cine, les lignes diagonales de corrélation maximale indiquent correspondant à des phases cardiaques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Échocardiographie 3D représentatif. (A) vue Multiplan de cœur 3D axolotl reconstruit. La procédure de corrélation d’image spatio-temporelle permet la reconstruction d’un cycle cardiaque complet avec plusieurs phases distinctes (ici 70 phases) en trois dimensions spatiales qui peuvent ensuite être tranchées comme ceux d’enquête souhaitée des phénomènes spatio-temporels dans le cœur battant. (B) trois tranches transversales de 115 reconstituées tranches de données 3D. Le quadratique moyenne procédure améliore le contraste de la sang-de-tissu et abaisse le rapport signal-bruit, permettant une meilleure appréciation de la nature trabéculée du ventricule axolotl et une visualisation claire du septum interatrial et le vannes dans les voies de sortie. (C) des représentations Surface et le volume du cœur battant à trois phases le long d’une couleur segmenté modèle (voir dossier supplémentaire de 13 et 14 de fichier supplémentaire pour des représentations vidéo de la surface et le volume rendu battant cœur et 15 de fichier supplémentaire pour un modèle 3D interactif segmenté de triphasé). Les abréviations anatomiques : A, oreillettes ; Cau, caudale ; Arc, crânienne ; DEX, dextre (à l’animal juste) ; Dor, dorsale ; OFT, des voies de sortie ; Sin, sinistre (pour les animaux à gauche) ; SinV, sinus venosus ; V, ventricule ; Ven, ventrale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fichier complémentaire 1. Transillumination pour localiser les cavités cardiaques dans leaxolotl. Voir la Figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. Axe long, vue sur la ligne médiane, mode B. Voir la Figure 3 a, B. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3. Axe long, vue ventriculaire, mode B. Voir Figure 3, D. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4. Axe long, vue ventriculaire, en mode Doppler couleur. Voir Figure 3E, F. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5. Axe long, mode Doppler puissance, vue ventriculaire. Voir la Figure 3, H. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 6. Axe long, vue auriculaire, mode B. Voir Figure 4 a, B. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7. Axe long, vue auriculaire, en mode Doppler couleur. Voir la Figure 4, D. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 8. Axe long, vue de sorties de voies, mode B. Voir Figure 4E. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 9. Axe long, vue des voies de sortie, en mode Doppler couleur. Voir Figure 4F. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

10 du dossier complémentaire. Axe court, vue ventriculaire, mode B. Voir Figure 5 a, B. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 11. Paragill oblique, sortie voies vue, mode B. Voir la Figure 5. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 12. Paragill oblique, vue des voies de sortie, en mode Doppler couleur. Voir la Figure 5. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 13. Rendu de surface tridimensionnel du battement de cœur en 70 phases (19,6 ms résolution temporelle). Voir la Figure 9. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 14. Rendu de volume en trois dimensions du battement de cœur en 70 phases (19,6 ms résolution temporelle). Voir la Figure 9. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 15. Modèle interactif en trois dimensions du battement de cœur en 3 phases : fin-systole ventriculaire, éjection ventriculaire de mi-parcours et fin-systole ventriculaire. Voir la Figure 7. Le fichier PDF interactif doit être considéré dans Adobe Acrobat Reader 9 ou supérieur. Pour activer la fonction 3D, cliquez sur le modèle. L’aide du curseur, il est maintenant possible de faire pivoter, zoom, pan le modèle, et dans l’arborescence du modèle, tous les segments du modèle peuvent être activées/désactivée ou rendues transparentes. L’arbre du modèle est une hiérarchie contenant plusieurs couches de sub qui peuvent être ouvert (+). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 16. Représentant annoté script pour calculer la valeur de corrélation d’une acquisition de 1.000 images comportant une estimation supérieure du cycle de cadres/cardiaque 75. Le script est écrit en langage de macro IJ1 et peut être implémenté comme une macro lot dans ImageJ pour calculer les valeurs de corrélation (75 000 par acquisition) à travers un ensemble z-pile de données 3D. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 17. Script de représentatif pour la détection automatique de pointe dans une série de valeurs de corrélation d’une acquisition de 1.000 images comportant une estimation supérieure des 75 cycle frames/cardiaque. La série de valeurs corrélées (colonne B, marquée en jaune) peut être remplacée, et après l’activation de la macro (Ctrl + r), la liste des commandes pour sélectionner correspondant à des phases cardiaques et effectuer la moyenne quadratique sera affiché (colonne Q, marquée en vert). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 18. Représentant annoté script pour sélectionnez la correspondance des phases cardiaques et effectuer une moyenne quadratique d’une acquisition de 1.000 images comportant une estimation supérieure des 75 cycle frames/cardiaque (colonne Q 17 de fichier supplémentaire). Le script est écrit en langage de macro IJ1 et peut être implémenté comme une macro en ImageJ pour créer un ensemble en moyenne une tranche 2D cycle (75 phases). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 19. Représentant annoté script pour calculer la valeur de corrélation entre une tranche de référence 70 cadres et une tranche d’essai adjacents 75 frames. Le script est écrit en langage de macro IJ1 et peut être implémenté comme une macro en ImageJ pour calculer les valeurs de corrélation (5 250). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 20. Script Excel représentant pour la détection automatique de pointe dans une série de valeurs de corrélation d’une comparaison entre une tranche de référence 70 cadres et une tranche d’essai adjacents 75 frames. La série de valeurs corrélées (colonne C, marqués en jaune) peut être remplacée, et après l’activation de la macro (Ctrl + t) la liste des tranches d’être sélectionné comme un substack dans la tranche de test sera affichée (L colonne, ligne 2, marquée en vert). La substack tranche de test aura correspondant dans l’espace cadres à la tranche de référence. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Échocardiographie chez l’axolotl et autres espèces de non-mammifère donne des données fondamentalement différentes échocardiographie chez les mammifères en raison du caractère nucléé de globules rouges chez tous les vertébrés à l’exception des mammifères adultes. Il en résulte un signal sang prononcé et moins de sang-de-tissu contraste en images échocardiographiques axolotl par rapport à la souris par exemple, ou échocardiographie humaine. Cela peut rendre segmentation d’image sur les échographies non transformés seule image plus difficile, car il peut être difficile de distinguer le sang des tissus. Toutefois, ce phénomène peut être avantageux, lorsqu’il est utilisé pour créer le sang du signal améliorés images en appliquant le quadratique moyenne procédure décrite précédemment18 et modifié pour l’échocardiographie axolotl en protocole 6 de la Section. Comme des taches de sang sont beaucoup plus dynamiques que celles trouvées dans les tissus mous, avec une moyenne quadratique générera contraste prononcé entre ces deux compartiments qui facilite la segmentation d’images en deux et trois dimensions.

Ce protocole décrit trois différents anesthésiques pour l’axolotl qui ont été soigneusement testés précédemment21. Fois la benzocaïne et MS-222 stimulent une augmentation du rythme cardiaque, qui peut être souhaitable lors du test de la fonction cardiaque en conditions de stress. Propofol induit moins de stress pour le coeur durant l’anesthésie et peut être utilisé comme un remplacement pour non anesthésié échocardiographie dans les situations où le temps d’acquisition dépasse les limites d’un comportement sédentaire chez l’axolotl non anesthésiés.

Échocardiographie 2D décrivant le coeur 3D dépend de la subjectivité. Par conséquent, il est impératif de conduite et intra/inter-operator/observateur analyse avant d’effectuer une expérience réelle, comme décrit dans la Section 5 de protocole. De même, des mesures échocardiographiques devraient être considérés plus comme des valeurs d’index qui peuvent être appliquées pour étudier les différences de potentiel fonction cardiaque sous différentes circonstances plutôt que des valeurs absolues. La cylindrée déterminée par l’équation géométrique (équation 2) rarement donne la même valeur absolue que l’onde de pouls équation Doppler (équation 4; La figure 7), et il devrait être décidé qui mesurent d’adhérer à toute une série d’expériences. Le SV(geo) peut être obtenu plus rapidement que le SV(pw), cependant, l’hypothèse sphérique de la forme ventriculaire s’applique uniquement aux sains contractantes uniformément les cœurs, et dans les modèles de la maladie et de la régénération, SV(pw) devrait être envisagée pour une meilleure prise de le volume de la vraie course.

La corrélation et quadratique moyenne procédure du Protocole N° 6 de la Section peuvent être implémentés dans plusieurs différent imagerie et paquets mathématiques. Étant donné que les compétences et l’accès à des logiciels de programmation varient grandement au sein des chercheurs en sciences de la vie, nous nous sommes efforcés vers prévoyant des scripts représentant les méthodes dans les logiciels que la plupart des chercheurs sont familiers avec (par exemple, Excel) qui sont approchés facilement et librement disponibles (ImageJ : https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Fichiers supplémentaires 16 - 20 fournissent des scripts exemplaires annotés écrits en langage macro IJ1 et .xlsm macros qui devrait être compréhensible même avec une expérience minimale dans le codage.

La régénération cardiaque intrinsèque est un phénomène exclusivement trouvé dans le cœur des petites espèces (par rapport à l’homme), et ainsi les mensurations et l’imagerie de la fonction cardiaque de base et les progrès fonctionnels pendant la régénération est attaqué par la taille du cœur et la résolution spatiale de la modalité d’imagerie appliquée. Imagerie par ultrasons haute fréquence fournit un équilibre souhaitable entre une haute résolution spatiale dans le plan (~ 30 x 30 µm2 à 50 MHz) qui est comparable à µCT in vivo d’imagerie et beaucoup plus élevée que dans vivo µMRI, qui a une profondeur de pénétration (~ 1 cm à 50 MHz) plusieurs fois supérieures à la microscopie confocale et une très haute résolution temporelle (50-300 images/s à 50 MHz, 1 cm d’épaisseur). Couplé avec manuel ou automatisé z mouvement tridimensionnel du transducteur, l’échographie permet inégalée de reconstruction de la fonction cardiaque et de la modélisation anatomique en quatre dimensions. En outre, le caractère non invasif de la technique permet d’expérimentation longitudinale. À notre connaissance il n’existe actuellement aucun transducteurs de tableau matrice pour échographie micro haute fréquence. Le développement de cette technologie serait grandement aider les acquisitions de données 3D des petits coeurs comme celui de l’axolotl dans une procédure plus rapide que le déplacement mécanique du transducteur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Kasper Hansen, Institut des sciences biologiques, Université d’Aarhus pour fournir l’accès à et assistance avec le micromanipulateur électronique acquisition échocardiographique 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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References

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Échocardiographie 2D et 3D chez l’Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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