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Medicine

2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Echokardiographie Protokolle für zwei- und dreidimensionale Bilderfassung des schlagenden Herzens der Axolotl Salamander (Z.B. geschieht), ein Modell-Arten im Herzen Regeneration. Diese Methoden ermöglichen längs-Beurteilung der Herzfunktion mit einer hohen räumlich-zeitliche Auflösung.

Abstract

Kardiale Funktionsstörung durch ischämische Herzkrankheit ist eine große Herausforderung, und regenerative Therapien für das Herz sind sehr gefragt. Ein paar Modell-Arten wie Zebrafisch und Salamander, die inneren Herzen regenerieren können Versprechen für zukünftige regenerative Therapien für menschliche Patienten. Um das Ergebnis des Cardioregenerative Experimente zu bewerten ist es unerlässlich, dass Herz-Funktion überwacht werden kann. Der Axolotl Salamander (A. geschieht) stellt eine etablierte Modell Spezies in Regenerationsbiologie erreichen Größen, die für die Beurteilung der Herzfunktion ermöglicht. Dieses Protokoll soll Methoden zur Messung der Herzfunktion in der Axolotl mit Echokardiographie reproduzierbar zu etablieren. Die Anwendung von verschiedenen Anästhetika (Benzocain, MS-222 und Propofol) gezeigt, und die Übernahme von zweidimensionalen (2D) echokardiographische Daten bei narkotisierten und unanesthetized Axolotl beschrieben. 2D Echokardiographie des Herzens dreidimensionale (3D) leiden kann Ungenauigkeiten und Subjektivität von Messungen und zur Linderung dieses Phänomens eine solide Methode, nämlich Intra/inter-operator/Beobachter Analyse, zu messen und zu minimieren diese Vorspannung ist unter Beweis gestellt. Schließlich bezeichnet man eine Methode, echokardiographische 3D-Daten des Axolotl schlagenden Herzens mit einer sehr hohen räumlich-zeitliche Auflösung und mit ausgeprägten Gewebeprobe-Kontrast zu erwerben. Dieses Protokoll sollte insgesamt bieten die notwendigen Methoden zur Bewertung der Herzfunktion und Modell Anatomie und Dynamik in der Axolotl mit Ultraschall-Bildgebung mit Anwendungen in der Regenerationsbiologie und allgemeine physiologische Experimente zu fließen.

Introduction

Ischämischer Herzkrankheit ist eine führende Ursache von Tod weltweit1,2. Obwohl viele einen Herzinfarkt durch schnelle und fein abgestimmte medizinische Intervention überleben, führen ischämische Ereignisse beim Menschen oft zu fibrotische Narben verbunden mit Hypertrophie, elektrische Fehlfunktion und eine verminderte Leistungsfähigkeit des Herzens . Dieser Mangel an regenerative Potential von Herzgewebe wird unter Säugetieren aufgeteilt und obwohl umstrittene Forderungen der Säugetier-kardialen Regeneration gemeldet worden sind, wurden diese beschränkt sich auf bestimmte murinen Stämme3,4 und Hypoxie behandelt Mäuse5. So beschränkt sich das Feld der kardialen regenerativen Medizin und Biologie in der Regel auf nicht-Säugetier-Tiermodellen, inneren Herzen regenerative Phänomene zu studieren. Der Zebrabärbling (Danio Rerio) entstand im letzten Jahrzehnt sehr gut charakterisierten Vorbild für inneren Herzen Regeneration6,7,8,9,10 . Aufgrund von Wartungsarbeiten leicht Labor eine kurze Generationszeit und eine breite Palette von molekulare Werkzeuge zur Verfügung, ist der Zebrabärbling gut geeignet als Modell für die genetischen und molekularen Mechanismen, die kardiale Entwicklung und Regeneration. Aber die winzigen Abmessungen des Zebrafisch Herzens machen ihn weniger geeignet für funktionale Bewertung und komplizierte chirurgische Eingriffe und der nicht-Tetrapoden Phylogenie der Zebrafisch schränkt somit die vernünftige Extrapolation der Ergebnisse bei dieser Art die Verwendung von anderen größeren tetrapod Modelle zu rechtfertigen. Eines der frühesten Modelle der vertebrate Herz Regeneration war ein caudatus Amphibien, die östlichen Newt (Notophthalmus Viridescens)11, eine Spezies, die ein wertvolles Modell12bleibt.

In den letzten Jahren trat ein weiteres caudatus Amphibie, die mexikanischen Axolotl (A. geschieht) die Szene als eine große (bis zu 100 g Körper Masse) und hoch Labor anpassungsfähig Tiermodell für eine breite Palette von regenerativen Disziplinen spanning Glied Regeneration, Verletzungen des Rückenmarks und kardialen Regeneration13,14,15,16,17. Der Axolotl ist höchst zugänglicher Funktionsmessungen auf das Herz mit Hochfrequenz-Echokardiographie und das Fehlen von verkalkten Strukturen auf der ventralen Seite des Herzens ermöglicht Ultraschall-Bildgebung mit einem viel niedrigeren Niveau der Bildartefakte (akustische Shadowing und Nachhall im besonderen) als bei anderen Tieren Modells mit verkalkter Brustbein und Rippen zu beobachten.

Das folgende Protokoll beschreibt mehrere unterschiedliche Methoden und Vorbereitungen (Abbildung 1, Abbildung 2), reproduzierbare echokardiographische Messungen auf das Axolotl Herz in beiden betäubt zu erwerben (drei verschiedene Anästhetika anwenden: Benzocain, MS-222 und Propofol) und Tiere in zwei unanesthetized (Abbildung 3, Abbildung 4, Abb. 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Ergänzende Dateien 1-12) und drei (Abbildung 8, Abbildung 9, Ergänzende Dateien 13-14) Raumdimensionen. Das Amphibien-Herz ist drei Kammern (zwei Atrien und einem einzigen Ventrikel). Die Vorhöfe sind mit einem großen Sinus Venosus versorgt und die Herzkammer mündet der Conus Arteriosus Ausflusstrakt (Abbildung 2). Da die meisten Schwerpunkt traditionell auf ventrikuläre Regeneration gelegt und weniger auf die Erholung der Vorhöfe6,7,8,9,10,11 liegt , 12 , 14 , 17, dieses Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Messungen der linksventrikulären Funktion.

Amphibien-Echokardiographie ist nicht gut in der Literatur beschrieben, und die Entwicklung der 2D in diesem Artikel beschriebenen Methoden vertrieben wurden durch die Notwendigkeit, am besten repräsentieren die Funktionalität des schlagenden Herzens Axolotl zu einem bestimmten Zeitpunkt und experimentelle Einstellung. Somit gelten die hier beschriebenen Methoden im Herzen regenerative Experimente wo Herzfunktion wiederholt im Laufe einer Regenerationsprozess überwacht werden. Darüber hinaus lassen sich die Methoden im Allgemeinen in den Cardiophysiological Experimenten auf der Axolotl angewendet oder leicht modifiziert, um andere caudatus oder Anurenarten Amphibien Modelle (e.g.,Xenopus) umfassen. Der Axolotl existiert in mehreren Sorten und Farbvarianten (z.B., Wildtyp, Melanoid, weiß, Albino, transgenen weiß mit grünen Fluoreszenz-Protein-Expression), jedoch diese Eigenschaften berührt nicht die Kompatibilität der Axolotl mit dem beschriebenen Protokoll. Die Methode, die hier beschriebenen um echokardiographische 3D-Daten zu erwerben ist eine modifizierte Version der raumzeitlichen Bild Korrelation (STIC) Technik für klinische Ultraschall und die quadratische Mittelung in der entwickelnden Huhn, oben beschriebene Methode entwickelt verbessern Sie das Signal von Blut Flecken in Weichteilen bei Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen18,19. Diese Methode ermöglicht erweiterte Modellierung von kardiale Kontraktion und berechnete Strömungsmechanik im Herzen Axolotl.

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Protocol

In diesem Protokoll durchgeführten Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der dänischen Gesetzgebung zur Pflege und Verwendung von Labortieren und die Experimente des dänischen nationalen Tier Experimente Inspectorate (Protokoll Nr. 2015-15-0201-00615) angenommen wurden.

1. Vorbereitungen

  1. Vorbereiten der Axolotl Medium.
    1. Gelten Sie hohe Qualität, die nicht chemisch behandelt Leitungswasser als Axolotl Medium. Wenn dies nicht verfügbar ist, auftragen Sie 40 % Holtfreter Lösung.
    2. Bereiten Sie 40 % (wt/Vol) Holtfreter Lösung durch auflösen 15,84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O 1,11 g MgSO4·7H2O und 0,288 g KCl in gefiltertem und deionisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 L.
  2. Immersion Anästhetika zu machen.
    1. Bereiten Sie Benzocain (Ethyl 4-Aminobenzoate) Narkose Lösung von 200 mg Ethyl 4-Aminobenzoate in 3 mL Aceton auflösen und dann auflösen dieser Mischung in 1 L Wasser aus dem Wasserhahn oder 40 % Holtfreter Lösung vor.
    2. Bereiten Sie MS-222 (Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonic Säure, auch bekannt als Tricane) Narkose Lösung durch Auflösen von 200 mg Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonic Säure direkt in 1 L Wasser aus dem Wasserhahn oder 40 % Holtfreter Lösung vor.
    3. Bereiten Sie Narkosemittel Propofol (2,6-Diisopropylphenol) Lösung durch Auflösen von 3,3 mg 2,6-Diisopropylphenol in 1 L Wasser aus dem Wasserhahn oder 40 % Holtfreter Lösung vor. Alternativ verdünnten Sie kommerziell vorgefertigten Lösung bis 3,3 mg/L.
      Achtung: Propofol ist eine mächtige menschliche Narkose (intravenös verabreicht) und sollte mit Vorsicht, auch in verdünnter Form behandelt werden.
  3. Bereiten Sie Bett und Container für die Echokardiographie.
    1. Echokardiographie durch ein 70 x 55 cm Stück weichen Tuch einmal falten und dann Rollen sie in "Burrito Form" Lippe-förmigen Tier Bett vorbereiten (Abbildung 1A). Biegen Sie dann auf die Enden, bis sie sich treffen und kleben Sie diese zusammen (Abb. 1 b).
    2. Tauchen Sie die Lippe förmigen Struktur in Axolotl Medium um den narkotisierten Axolotl während der Ultraschall-Bildgebung unterzubringen. Das Tier, um die Struktur zu sichern und verhindern, dass schwimmende mit losen Gummibändern; Positionieren Sie diese Mitte-mandibuläre und über den sakralen Bereich (Abbildung 1).
      Hinweis: Die Gummibänder sollte das Tier nicht quetschen, da sonst Hämodynamik angegriffen wird.
    3. Eine Hängematte Vorbereitung auf 2D Echokardiographie auf unanesthetized Axolotl, carving, eine 16 x 8 cm x 5 cm Loch in eine 33 x 27 cm x 5 cm Block von Polystyrol-Hartschaum (z.B. einen Deckel aus einem mittelgroßen Polystyrol-Hartschaum-Container) (Abbildung 1).
    4. Schieben Sie ein 33 cm x 27 cm Stück Plastikfolie durch das Loch und sichern Sie die Kanten der Packung auf der Oberseite des Polystyrol-Hartschaum-Blocks (Abbildung 1E) erstelle ich eine Hängematte. 3 cm Tiefe in der Hängematte Axolotl Medium hinzufügen. Die unanesthetized Axolotl sinkt auf den Boden der Hängematte ermöglicht einfachen ventralen Zugang durch die Plastikfolie (Abb. 1F).

(2) zu betäuben Axolotl

  1. Axolotl in Narkose Wunschlösung (Benzocain, MS-222 oder Propofol) Tauchen.
  2. Überprüfen Sie auf erste Anzeichen einer Sedierung, reduzierte Bewegungen und zunehmenden Verlust der aufrichtenden Reflex erscheint innerhalb von 10 min bei Tieren < 10 g (< 10 cm) und innerhalb von 20 min bei Tieren zwischen 10 g und 50 g der Körpermasse (10-22 cm).
  3. Für völlige Fehlen von Körperbewegungen, Gill Lüftung Bewegungen und aufrichtenden Reflex zu inspizieren Sie, und stellen Sie sicher, dass das Tier nicht mehr reagiert auf mäßige Schmerzen Stimulation durch Kneifen das Gurtband zwischen Ziffern getestet ist.
    Hinweis: Trotz der Tatsache, dass allgemeine Anästhesie erfolgt innerhalb von 30 min im Benzocain betäubt Axolotl, Herzfunktion ist nicht stabilisiert, bis 1 h. Dies ist nicht der Fall in MS-222 oder Propofol betäubt Axolotl (Abbildung 6A-F).
  4. Um Axolotl unter Vollnarkose zu halten, halten Sie die Tiere in Narkose Lösung oder eingewickelt in nasses Papier Tücher in Anästhesie-Lösung benetzt.
    Hinweis: Anästhesie kann für 7 h ohne negative Auswirkungen auf das Wohlbefinden des Tieres aufrechterhalten werden, angesichts der Tatsache, dass die Haut und vor allem die Kiemen feucht gehalten werden.
  5. Um Axolotl Heidenfest, übertragen Sie das Tier auf Anästhesie-freies Medium.
    Hinweis: Die ersten Zeichen des Erwachens ist Gill Lüftung Bewegungen. Tier sollte aufrecht und reagiert auf die Stimulation innerhalb von 1 h.

(3) 2D Echokardiographie am narkotisierten Axolotl

  1. Platz betäubt Axolotl in Rückenlage im Lippe-förmigen Tier Bett (Schritte 1.3.1-1.3.2). Sichern von schwimmenden mit losen Gummibändern (Abbildung 1). Sicherstellen Sie, dass die thorakale Oberfläche von ca. 3-5 mm Medium bedeckt ist.
    Hinweis: Für eine kurze Akquisition (< 5 min) kann Narkose-freies Medium angewendet werden. Für längere Erwerb sollte Narkose Lösung als Ultraschall Medium um stabile Herzfunktion während Messungen sicherzustellen angewendet werden.
  2. Positionieren Sie den Schallkopf über der Mittellinie des Tieres in der Brustwirbelsäule parallel zur Längsachse des Tieres (Abb. 2A, Abbildung 3A-B, ergänzende Datei 2). Verwenden Sie Durchleuchtung mit einer Kaltlichtquelle auf weiß und Albino Axolotl, um die korrekte Platzierung des Wandlers (Abbildung 2 und ergänzende Datei 1) sicherzustellen.
    1. Verwenden Sie für Axolotl < 20 g wiegen einen 50 MHz-Wandler; für Axolotl > 20 g, einen 40 MHz-Wandler zu verwenden. Positionierung der kranialen/anterior Richtung auf der rechten Seite für die standardisierte Bildaufnahme zu gewährleisten. Wenn dies nicht der Fall ist die Wandler drehen 180° oder invertieren des Bildes.
  3. Stellen Sie sicher, dass in der Längsachse Mittellinie Ansicht, ein kleiner Teil des Ventrikels (angeordnet nach rechts in die Brusthöhle, Abb. 2A) in den Rahmen an ventricular Diastole und ein großer Teil der linken und rechten Vorhöfe angezeigt wird (in der Mitte positioniert / leicht nach links in die Brusthöhle, Abb. 2A) und die Sinus Venosus sind sichtbar in atriale Systole und Diastole (Abb. 3A, B).
  4. Übersetzen Sie den Schallkopf 1-3 mm in Richtung des Tieres Recht auf die ventrikuläre Längsachse Ansicht (Abbildung 2A). Die richtige Position ist erreicht, wenn die Querschnittsfläche des Ventrikels Ende Systole maximal (Abbildung 3-H) ist.
  5. Im B-Modus, erwerben ≥ 3 Herzzyklen mit > 50 Bilder/s in beiden 'allgemeine Bildgebung"(hohe räumliche/geringe zeitliche Auflösung) oder"Kardiologie"(niedrige räumliche/hohe zeitliche Auflösung) Modus.
    Hinweis: In dieser Ansicht kann für die Beurteilung der linksventrikulären Funktion. Linksventrikulären Funktion kann in zwei Dimensionen anhand der ventrikulären gebrochene Bereich Veränderung (FACv) aus den End-diastolischen und systolischen und Ende Querschnittsfläche des Ventrikels (CSAv) unter Verwendung der Gleichung berechnet ausgewertet werden:
    Equation 1(1)
    Der Axolotl Herzkammer nimmt die Form einer Kugel und einem Schlagvolumen Geometrie basiert [SV(geo)] kann unter Verwendung der Gleichung berechnet werden:
    Equation 2(2)
  6. Übersetzen Sie den Schallkopf entlang der Längsachse des Tieres, bis die Mitte des Ventrikels in der Mitte des Bildschirms ist. Drehen Sie den Schallkopf 90° im Uhrzeigersinn, um die Mitte ventrikuläre kurze Achse (Abb. 5A und B, ergänzende Datei 10) zu erhalten. Die Kreisform des Ventrikels durch die Übersetzung der Wandlers entlang der Längsachse des Herzens zu bewerten.
  7. Die Wandler zur Längsachse Ebene zurück und übersetzen, zurück in Richtung der Mittellinie oder leicht nach links von der Mittellinie die Vorhofflimmern Längsachse zwei Kammer Ansicht (Abbildung 2A) erhalten. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position erreicht wird, indem Sie bestätigt, dass die Querschnittsflächen der Ende-Systole Vorhöfe bei den Maxima sind und die beiden Vorhöfe zusammen die Umrisse der Zahl "8 übernehmen" gekippt ~ 45 ° nach links (Abb. 4A und B, Ergänzende Datei 6).
  8. Erwerben Sie im B-Modus ≥ 3 Herzzyklen mit > 50 Bilder/s in "allgemeine Bildgebung" oder "Kardiologie"-Modus.
    Hinweis: Der Axolotl Atrien sind unregelmäßig geformt und 3D-Funktion nicht direkt abgeleitet werden aus 2D-Daten, damit ihre Funktion als Index Maßnahme wie Vorhofflimmern gebrochene Bereich Chance (FACa) basierend auf den kombinierten Querschnittsfläche (CSAa) beider ausgewertet werden muss Vorhofflimmern Kammern in Systole und Diastole:
    Equation 3(3)
  9. Übersetzen die Wandler nach rechts, bis der Ausflusstrakt (Conus Arteriosus) (in der Nähe der ventrikulären Längsachse Ansicht) angezeigt wird (Abbildung 2A).
    Hinweis: Nach dem Ausscheiden aus dem Ventrikel in eine anteriore Richtung, den Ausflusstrakt eine scharfe Biegung macht und in einem kleinen Winkel in Richtung der ventralen Oberfläche läuft, bevor wieder eine anteriore Richtung vorausgesetzt und in Gill Zweige und systemische Schiffe aufzuteilen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die richtige Abfluss Trakt Ansicht erreicht wird, indem Sie bestätigt, dass der Durchmesser des Abflusses am höchsten bei ventrikulären End-Systole ist und zwei der drei Semilunar Ventile am Eingang des Abflusses am mittleren Auswurf (Abbildung 4E, sichtbar sind Ergänzende Datei 8).
      Hinweis: Die ventrale Direktionalität in Richtung der Wandler des mittleren Teils der Ausflusstrakt Geschwindigkeit und Flow Messungen mittels Doppler-Bildgebung ermöglicht.
  10. Wenden Sie Color Doppler-Modus, um Blut Fließgeschwindigkeiten in den Ausflusstrakt bei kardialen Auswurf (Abbildung 4F und ergänzende Datei 9) Karte an. Ebenso gelten Sie Color Doppler und Power Doppler imaging um zu visualisieren, Blutfluss in der ventrikulären und Vorhofflimmern (Abbildung 3E-H, Zusätzliche Dateien 4-5 und Abbildung 4-D, und zusätzliche Datei-7).
  11. Wenden Sie Pulse Wave (PW) Doppler-Modus an der Position des maximalen Blut Geschwindigkeit im Bereich der Ausflusstrakt laufen in Richtung der Wandlers.
    1. Verwenden Sie "Abstrahlwinkel" und "eckige Korrektur" bis zu 45° Anpassung für den Abfluss nicht völlig senkrecht zur Fläche des Wandlers (Abbildung 4). Stellen Sie sicher, dass die PW Doppler Position nicht durch das Ventil Spirale des Abflusses in keiner Phase des Herzzyklus (Abbildung 4E) überlappt wird.
  12. Erwerben Sie im PW-Doppler-Modus Geschwindigkeit/Zeit Daten über ≥ 3 Herzzyklen.
  13. Zurück zur B-Modus und erwerben ≥ 3 Herzzyklen auf exakt derselben Ebene, wie PWV erworben wurde.
  14. Messen der Geschwindigkeit Zeit integral (VTI) des Blutflusses in den Ausflusstrakt als die Fläche unter der Kurve Geschwindigkeit/Zeit für eine volle Herz Zyklus (Abbildung 4, g1).
    Hinweis: Das VTI und dem Durchmesser (d) der Ausflusstrakt am Ende Systole entnommen aus dem Erwerb von B-Modus, ein PW-Doppler-basierte Schlagvolumen [SV(pw)] unter Verwendung der Gleichung berechnet werden kann:
    Equation 4(4)
    Herzfrequenz (HF) wird von der Geschwindigkeit/Zeit-Kurve durch die Messung der Dauer einer gesamten Herzzyklus gemessen. [CO(pw)] das Herzzeitvolumen errechnet sich unter Verwendung der Gleichung:
    Equation 5(5)
  15. Erhalten Sie die schrägen Paragill Ansicht, eine Ansicht, die bietet eine Alternative zur Messung der Strömungsgeschwindigkeit in den Ausflusstrakt Blut durch Drehen der Axolotl 90 ° in die Lippe geformt Bett so, dass das richtige Teil des Tieres nach oben (Abb. 2 b) gegenübersteht. Winkel und den Schallkopf zu drehen und positionieren Sie es parallel und gerade hintere an den abstehenden Kiemen (Abb. 2 b). Stellen Sie sicher, dass die richtige Position erreicht wird, indem Sie bestätigt, dass die Ausflusstrakt nach unten läuft ~ 45° und dass die Vorhöfe unter den Ausflusstrakt beim Auswerfen (Abbildung 5 C, ergänzende Datei 11) angezeigt werden.
  16. Gelten Sie PW-Doppler-Modus an der Position des maximalen Blut Geschwindigkeit im Bereich der Ausflusstrakt auf der Flucht vor dem Wandler (Abbildung 5, ergänzende Datei 12). Verwenden Sie "Abstrahlwinkel" und "eckige Korrektur" bis zu 45° für den Abfluss nicht völlig senkrecht zur Fläche des Wandlers (Abb. 5E) anpassen.
  17. Erwerben Sie in der PW Doppler-Modus Blut Geschwindigkeit über ≥ 3 Herzzyklen.
  18. Zurück zur B-Modus und erwerben ≥ 3 Herzzyklen auf exakt derselben Ebene, wie PWV erworben wurde.
    Hinweis: SV(pw) und CO(pw) werden für die schrägen Paragill Ansicht mit Gleichung 4 und 5 der Gleichung , wie oben für die Längsachse Ansicht beschrieben berechnet.

(4) 2D Echokardiographie auf Unanesthetized Axolotl

  1. Legen Sie die unanesthetized Axolotl in Bauchlage in der Hängematte (Schritt 1.3.3).
  2. Lassen Sie das Tier ungestört für 30-60 min, von Umgang mit Stress zu erholen.
  3. Positionieren Sie die Ultraschall-Wandler mit dem Schallkopf Kopf nach oben in Richtung der Axolotl in der Hängematte.
  4. Ultraschall-Gel auf den Schallkopf auftragen.
  5. Positionieren Sie sanft und ohne zu stören das Tier den Schallkopf über der Mittellinie des Tieres in der Brustwirbelsäule parallel zur Längsachse des Tieres.
    Hinweis: Dies ist der gleiche, aber invertiert, Stellung wie bei narkotisierten Axolotl (Schritt 3.2).
  6. Erhalten Sie B-Modus, Color Doppler-Modus, PW-Modus Daten in der Längsachse und kurze Achse Ansicht wie in 3.2-3.14 beschrieben.
    Hinweis: Eine schräge Paragill Ansicht ist in der unanesthetized Axolotl unerreichbar. Die echokardiographischen Daten in unanesthetized Axolotl sollte zwischen Gill Lüftung Bewegungen (10-20 s Punkt für eine ruhende Tier) erworben werden. Bewegt sich die Axolotl bei Akquisition, müssen Messungen wiederholt werden.

(5) 2D Echokardiographie Daten auswerten und Subjektivität zu minimieren

  1. Vermeiden Sie Betreiber/Beobachter Bias in 2D Ultraschall Bildgebung und 3D Auswertung der Herzfunktion basierend auf 2D-Daten durch Subjektivität in der Datenerfassung und der Daten-Analyse-Phase durch die Durchführung der Analyse Intra/inter-operator/Beobachter20verursacht.
    Hinweis: In der Inbetriebnahme von Studien und bei der Ausbildung neuer Mitarbeiter diese Subjektivität muss quantifiziert werden und minimiert mit Intra/inter-operator/Beobachter Analyse.
  2. Initiieren der Intra/inter-operator/Beobachter-Analysis in einem Zweipersonen-Setup mit Operator/Beobachter 1 (weniger erfahrenen) getestet gegen Betreiber/Beobachter 2 (mehr erfahren) von ≥ 6 Konsens Messungen musizieren, einschließlich beide Bank Arbeit an Das Ultraschallsystem (Betrieb) und anschließende Analyse der relevanten Parameter (Beobachtung).
  3. Konsens zwischen den Betreibern und Beobachter und betreiben (Betreiber/Beobachter 1) das Ultraschallsystem, um relevante Daten über ≥ 6 Tiere (1,1-Betrieb).
  4. Direkt nach betreiben Sie (Betreiber/Beobachter 2) Ultraschall-System relevante Daten über die gleichen Tiere (2.1-Betrieb) zu erwerben.
  5. Lassen Sie die Tiere für 3 Tage zu erholen. Danach wiederholen Sie (Betreiber/Beobachter 1) (Betrieb 1.2).
  6. Analysieren Sie (Betreiber/Beobachter 1) alle gemessene Daten (Betrieb 1.1/Beobachtung 1.1; Betrieb 2.1/Beobachtung 1.1 Betrieb 1.2/Beobachtung 1.1) zu und nach 24 Stunden wiederholen Sie die Analyse der Operator/Beobachter 2 Daten (2.1 Betrieb/1.2 Beobachtung).
  7. Analysieren Sie (Betreiber/Beobachter 2) die Daten von sich selbst (2.1 Betrieb/2.1 Beobachtung) erworben. Beachten Sie, dass bei dieser Analyse ermittelten Werte als am nächsten an die wahren Werte gelten.
  8. Bewertung von Variation, Tendenzen und Voreingenommenheit bei Vergleichen zwischen alle erfassten Parameter mit Bland-Atman zu plotten, QQ Plotten, t-Test (gleich Mittelwert) und F-Test (gleicher Varianz) (Abbildung 6).
    1. Beachten Sie, dass die Betrieb 1.1/Beobachtung 1.1 versus Betrieb 2.1/Beobachtung 1.1 Vergleich die Inter-Operator-Variante zeigt.
    2. Beachten Sie, dass die Betrieb 2.1/Beobachtung 1.1 versus Betrieb 2.1/Beobachtung 2.1 Vergleich die inter-Observer-Variante zeigt.
    3. Beachten Sie, dass die Betrieb 1.1/Beobachtung 1.1 versus Betrieb 1.2/Beobachtung 1.1 Vergleich die Intra-Betreiber-Variante zeigt.
    4. Beachten Sie, dass die Betrieb 2.1/Beobachtung 1.1 versus Betrieb 2.1/Beobachtung 1.2 Vergleich die Intra-Beobachter-Variante zeigt.
  9. Stellen Sie sicher, dass Mittel und Variation der verschiedenen Maßeinheiten unterscheiden sich nicht wesentlich für die vier Vergleiche; der Unterschied zwischen Messwerten in ± 1,96 Standardabweichungen fallen sollten, und keine Tendenzen in Richtung geringerer Genauigkeit weder kleine noch große Werte erscheinen soll.

6. 3D Echokardiographie am narkotisierten Axolotl

  1. 3D Erfassung
    1. Platzieren Sie den narkotisierten Axolotl in Rückenlage in der Lippe-förmigen Tier Bett (Schritt 1.3.1). Sichern von schwimmenden mit losen Gummibändern (Abbildung 1) und stellen Sie sicher, dass die thorakale Oberfläche von ca. 3-5 mm Medium fällt. 3D Akquisition ist ein langwieriges Verfahren, daher gelten Narkose Lösung als Ultraschall Medium um stabile Herzfunktion während Messungen zu gewährleisten.
    2. Positionieren Sie den Schallkopf über der Mittellinie des Tieres in der Brustwirbelsäule entweder parallel zur Längsachse des Tieres (für eine sagittale 3D Aufnahme) oder senkrecht zur Längsachse (transversale 3D Aufnahme).
    3. Übersetzen Sie den Schallkopf in die in der Ebene (X und y) und der Out-of-Plane-Dimension (Z oder Scheibe) um sicherzustellen, dass die gesamte kardiale Region in den nachfolgenden 3D-Erfassung abgedeckt werden.
    4. Passen Sie die Frame-Rate und räumliche Auflösung beliebig wählen Sie entweder "allgemeine Bildgebung" (hohe räumliche/geringe zeitliche Auflösung) oder "Kardiologie" (niedrige räumliche/hohe zeitliche Auflösung) Modus. Für 0,33 Hz < HR < 1 Hz verwenden eine zeitliche Auflösung von 50 Bilder/s erzielt bei hoher räumlicher Auflösung ("general Imaging"), die für den Herzzyklus in 50-150 verschiedene Phasen rekonstruiert werden kann.
    5. "2D Gain" auf ein Niveau, wo anatomische Strukturen kaum erkennbar in raw B-Mode-Bild sind, anpassen (~ 5 dB), Signal-zu-Rausch-Verhältnis in den letzten Umbauten zu erhöhen.
    6. Zeichnen Sie für jedes Segment (Z Schritt) ≥ 1.000 Bildern auf
    7. Übersetzen Sie Wandler einen Z Schritt zu einem Zeitpunkt, zum Beispiel, 20 µm oder 50 µm zu, und wiederholen Sie die Aufnahme, bis die gesamte kardiale Region bedeckt ist.
  2. 3D Rekonstruktion (ergänzende Dateien 13 und 14).
    1. Exportieren Sie übernahmen in Digital Imaging and Communications in Medicine DICOM (little Endian).
      Hinweis: Jede Scheibe mit einer festgelegten Anzahl von Frames wird eine einzelne Datei schreiben.
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der Frames in einer vollen Herzzyklus. Wie HR im Laufe der Zeit variieren kann, bestimmen Sie das für die erste und die letzte Scheibe. Legen Sie die höchste Anzahl der Frames pro Zyklus, wie der erste obere Schätzung der Phase Auflösung, die später sein kann (Schritt 6.2.8.) reduziert.
    3. Bestimmen Sie Ernte-Grenzen zu und Verbrauchsteuern Sie irrelevant Raum rund um das Fenster B-Modus.
      Hinweis: Diese Grenzen sollten Scheiben konstant sein.
    4. Wandeln Sie RGB Farbbild in 32-Bit.
    5. Der Korrelationswert (C) für jeden Frame in der Stack und die Anzahl der Frames enthalten in dem ersten Herzzyklus mit Hilfe der Formel zu berechnen:
      Equation 6(6)
      Hinweis: Hier Equation 7 ist die Signalintensität des Pixels an Koordinate (Ich, j) in das erste Bild Equation 8 und entspricht dem im zweiten Bild, Equation 9 , Equation 10 und Equation 11 , Equation 12 sind die mittlere Intensität und Standard Abweichung, jeweils die erste und zweite Bild im Vergleich, und ich und J sind die Anzahl der Spalten und Zeilen im Bild. Das resultierende Array von Korrelationswerte haben die Größe des das Produkt aus der Anzahl der Frames pro Herzzyklus und die Gesamtzahl der Frames pro Scheibe (z. B.75 × 1.000 = 75.000 in Abbildung 8) (siehe beispielhafte Skript in ergänzende 16-Datei). Der Korrelationswert kann nicht berechnet werden, wenn eine oder beide der Bilder im Vergleich eine Standardabweichung der Pixelwerte von Null haben, dies ist jedoch höchst unwahrscheinlich in ultrasonographische Bilder.
    6. Erkennen Sie lokale Maxima in das Array von Korrelationswerte (Abbildung 8A, siehe beispielhafte Skript in ergänzende Datei 17 zur automatischen Erkennung lokaler Maxima).
    7. Quadratische durchschnittliche Q(AVG) von Frames mit Spitzenwerten Korrelation zu berechnen (d.h., passende kardiale Phasen) mit der Formel:
      Equation 14(7)
      wo N die Gesamtzahl der Frames ist mit passenden kardiale Phasen, Equation 15 ist die Intensität des Pixels an Koordinate (Ich, j) von der n-th -Bild und Equation 16 ist das zeitliche arithmetische Mittel der Equation 17 des n-th -Bildes (siehe beispielhafte Skript in zusätzliche Datei-18).
    8. Wiederholen Sie Schritt 6.2.3-6.2.7 für alle Scheiben.
    9. Markieren Sie ein Slice (Referenz Scheibe) mit leicht erkennbaren anatomischen Strukturen (z.B.Mitte ventrikuläre) und überprüfen Sie, wenn das rekonstruierte Ensemble im Durchschnitt eines Herzzyklus entspricht genau einem Zyklus (d.h., wenn gibt es zusätzliche Phasen, wodurch mehrere Herzzyklus). Löschen Sie zusätzliche Phasen um genau ein Herzzyklus (z. B.gehen von einem überschätzt 75 Phasen/Zyklus (in Wirklichkeit, 1,07 Zyklus) in Abbildung 8 zu genau einem Zyklus mit 70 Phasen in Abbildung 8) zu erbringen.
    10. Auf der benachbarten Slice (Test Scheibe), gemittelt Art das Ensemble eines Herzzyklus t-Stack in passender kardiale Phasen mit der Referenz-Scheibe mit der Korrelation-Wert-Formel (Gleichung 6) (siehe beispielhafte Skripte in ergänzende Datei 19 und ergänzende Datei 20).
      Hinweis: Obwohl zwei nicht identische Scheiben nicht ganz ähnlich zu jedem Zeitpunkt während des Herzzyklus erscheint, angrenzende Scheiben mit einer hinreichend kleine Schrittweite (z. B.20 µm und 50 µm) werden Ähnlichkeiten was Korrelation ausgesprochen haben Wert Maxima, die in passenden Phasen übersetzt werden können.
    11. Wiederholen Sie Schritt 6.2.9-6.2.10 für alle Scheiben.
    12. Reduzieren Sie die gesamte 3D Rekonstruktion, in einem einzigen 3D Tagged Image-Datei Format (TIF) mit Z -Scheiben und t -Frames oder in einen Stapel von DICOM-Dateien.
      Hinweis: Daten können in jeder Dimension zu verkleinern, Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und isotrope Daten generieren klassifiziert werden (in-Plane Auflösung ist in der Regel höher als Out-of-Plane Auflösung mehrere Falten).

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Representative Results

Intraperikardiale Raum in der Axolotl ist abhängig von der Größe des Tieres. Kleinere Tiere (2-20 g, 7-15 cm) haben ein Übermaß an Herzbeutel Flüssigkeit (erscheinen dunkel in der Echokardiographie) umgeben, die kardialen Kammern, während bei größeren geschlechtsreifen Tieren (> 20 g, > 15 cm) die Kammern der Großteil der intrapericardial beschäftigen wird Raum. Um die beste Übersicht für repräsentative Ergebnisse der echokardiographischen Ansichten des Herzens Axolotl bereitzustellen, wurde eine kleinere Tier (10 g, 10 cm) für Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 9angewendet.

Die lange Achse Ansicht bietet im Allgemeinen eine gute Übersicht über kardiale Anatomie in der Axolotl. Eingabe an der Mittellinie Flugzeug mit Sinus Venosus, Atrien und Teil des Ventrikels im Flugzeug (Abb. 3A, B, ergänzende Datei 2), der linksventrikulären Ebene (Abbildung 3–H) oder das Vorhofflimmern Flugzeug (Abbildung 4A –D) kann durch die Übersetzung der Wandlers nach rechts oder links des Tieres, bzw. erreicht werden. Die Ventrikel erscheint sphärische und hoch trabekulierte (Abbildung 3, zusätzliche Dateien 3–5), während die Vorhöfe eine unregelmäßige Form und fast keine Trabeculation (Abbildung 4A, haben Ergänzende Datei 6, ergänzende Datei 7). Die kurze Achse Ansicht (Abbildung 5A, B, ergänzende Datei 10) Überblick über weniger leicht interpretierbare kardiale Anatomie der Axolotl Herz, aber es zur Bewertung der richtige kardiale Kontraktion (z.B. trägt Infarzierte oder nicht-contracting Zonen des kreisförmigen Ventrikels sind übersichtlich visualisiert in diesem Ansichtsebene). In der Längsachse Ansichtsebene ist das Zentrum der Ausflusstrakt eng in die Mitte des Ventrikels (Abbildung 2A, und vergleichen Sie Abbildung 3 mit Abbildung 4E und ergänzende Datei 3 mit ergänzende Datei 8 positioniert. ). Da das Weichgewebe der Ausflusstrakt beweglichen auf Blut-Auswurf, high-Intensity-Blut-Signal während eines Herzzyklus Pulswelle Doppler in der Längsachse und der schrägen Paragill Ebene gemessen wird von geringer Intensität Lärm von angegrenzt werden die Bewegungen der umgebenden Weichteile (graue Umgebung weiße Fläche in der Geschwindigkeit/Zeit-Kurve in Abbildung 4 und Abbildung 5E). Im Allgemeinen sollte der Kontrast zwischen Blut und Weichgewebe Lärm groß genug, um Segment Signal nur Blut, bei der Messung der Geschwindigkeit Zeitintegral (Abbildung 4 (g1 Vergrößerung) und Abbildung 5E (e1 Vergrößerung)).

Für die qualitative Bewertung der Blut Strömungsmuster, Farbe Doppler und Power-Doppler-Bildgebung bieten Visualisierungen von Strömungsmuster in verschiedenen Herzkammern (Ventrikel: Abbildung 3E–H, ergänzende Datei 4, Ergänzende Datei 5; Vorhöfe: Abbildung 4 C, D, ergänzende Datei 7; Ausflusstrakt: Abbildung 4F Abbildung 5 D, ergänzende Datei 9, zusätzliche Datei-12).

Axolotl verwendet für Labor-Experimente variieren in der Größe von den frühen Post Larvenstadium von 2-4 g volle Reife bei 10-30 g und größere Tiere mit einem Gewicht von > 100 g. ebenso, Herzfunktion und einige Absolutwerte der funktionelle Parameter, die hier beschriebenen auf die Größe der Tiere. Im Allgemeinen ist gebrochene Bereich Veränderung konstant in verschiedenen Größenklassen mit Werten bis hin zu 40-50 % (verzerrt auf niedrigere Werte für größere Tiere). Schlagvolumen ist stark abhängig von der Größe des Tieres, d. h., die Größe des Herzens, angefangen bei z.B. 20-30 µL in 5 g Axolotl, 50-70 µL in 10 g Axolotl und 250-300 µL in 50 g Axolotl. Herzfrequenz und um einige Grad Schlagvolumen sind stark abhängig von der angewandten Narkose und das Niveau der Anästhesie (Abbildung 6A–F, Abbildung 7).

Traditionelle Intra/inter-operator/Beobachter Analyse umfasst grafische Darstellungen (QQ-Plots und Bland-Altman-Plots) und Tests für gleich Mittelwert (t-test) und Varianz (F-testen) Normalverteilung der Daten auswerten und vergleichen Genauigkeit und Präzision zwischen zwei Personen (Abbildung 6).

3D Echokardiographie fügt eine weitere Dimension (Z oder Tiefe) zu den eher traditionellen 2D Erwerb. Dies ermöglicht Multi-planar Visualisierung von Daten (Abbildung 9A), reslicing (Abbildung 9 b), Oberfläche und Volumen Rekonstruktionen (Abbildung 9, ergänzende Datei 13und ergänzende Datei 14) und Segmentierung und Generation von 3D Modellen (Abbildung 9 C, ergänzende Datei 15).

Figure 1
Abbildung 1: Vorbereitung von Bett und Container für die Echokardiographie der betäubt und Axolotl unanesthetized. (A) A weichen Stück Stoff wird einmal gefaltet und in "Burrito" Form gerollt. (B) die Enden sind zurückgebogen und mit Klebeband um eine Lippe geformt-Bett für die Axolotl während des Scannens Unterwasser zu bilden. (C) für 2D und 3D Echokardiographie von einem narkotisierten Axolotl, das Tier sanft befindet sich in Rückenlage in den Spalt der Lippe Bett geformt und über die Region Mitte-mandibuläre und sakralen mit Gummibändern fixiert. (D, E) Eine Hängematte ist bereit, durch Ausgliederung ein quadratisches Loch in ein Stück Styropor und Plastikfolie auf der oberen Fläche taping. (F) für 2D Echokardiographie eine unanesthetized Axolotl, das Tier in einem natürlichen Bauchlage in der Hängematte gelegt und näherte sich mit Gel bedeckt Wandler Spitze von unterhalb. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Wandler Platzierung. (A, B) Modell des arteriellen-Netzes in der Axolotl mit der ungefähren Position des Wandlers für lange Achse und kurze Achse (A) und schrägen Paragill Ansicht (B). (C) Durchleuchtung mit einem leistungsfähigen Kaltlichtquelle kann Hilfe bei der Suche nach den genauen Standort der Herzkammern vor dem Auftragen der Wandlers (siehe ergänzende Datei 1). Anatomische Abkürzungen: A, Atrien; OFT, Ausflusstrakt; SinV, Sinus Venosus; V, Ventrikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Repräsentative Längsachse echokardiographische Ansichten des Ventrikels. (A, B) Typische Längsachse Mittellinie Blick im B-Modus (gelbe Linie in Abbildung 2A) in der ventrikulären End-diastolischen (A) und End-systolischen (B) Phase (siehe ergänzende Datei 2 video Darstellung). (C, D) Längsachse Ansicht des Ventrikels im B-Modus (schwarze Linie in Abbildung 2A) in der ventrikulären End-diastolischen (C) und End-systolischen (D)-Phase (siehe ergänzende Datei 3 video Darstellung). (E–H) Ähnliche Ansichtsebene wie in (A) und (B) in der Farbe Doppler (CD) und Power-Doppler (PD)-Modus zeigt Blut fließen (siehe ergänzende Datei 4 und ergänzende Datei 5 für video Darstellung der CD und PD-Modus beziehungsweise). Rottöne im CD-Modus Bilder zeigen Blut fließt auf den Schallkopf und blaue Farben zeigen das Gegenteil. Herzkammern und die Durchblutung wurden mit gepunkteten Linien hervorgehoben. Eingefügte Karikaturen in (A) und (C) zeigen Platzierung der Wandler und Übersetzung im Verhältnis zu der langen Achse Mittellinie anzeigen. Anatomische Abkürzungen: A, Atrien; DC(L), Leitung des Cuvier links; OFT, Ausflusstrakt; SinV, Sinus Venosus; V, Ventrikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Repräsentative Längsachse echokardiographische Blick auf die Vorhöfe und Abfluss Trakt. (A, B) Längsachse Blick auf die Vorhöfe im B-Modus (grüne Linie in Abbildung 2A) in den Vorhofflimmern End-diastolischen (A) und End-systolischen (B) Phasen (siehe ergänzende Datei 6 video Darstellung). (C, D) Ähnliche Ansichtsebene wie in (A) und (B) im Farbmodus Doppler (CD) demonstrieren Blut fließen (siehe ergänzende Datei 7 für video Darstellung). (E) langen Achse Blick auf den Ausflusstrakt im B-Modus (blaue Linie in Abbildung 2A) in der Mitte Auswurf-Phase (siehe ergänzende Datei 8 video Darstellung). F: Ähnliche Ansichtsebene wie in (E) im CD-Modus zeigt Blut fließen (siehe ergänzende Datei 9 video Darstellung). (G) ähnliche Ansichtsebene wie in (E) und (F) im Pulsbetrieb Welle Doppler (PW) für Wärme Rate Erkennung und Velocity integral (VTI) Zeitmessung für Schlaganfall Volumenberechnung. Rottöne im CD-Modus Bilder zeigen Blut fließt auf den Schallkopf und blaue Farben zeigen das Gegenteil. Herzkammern und die Durchblutung wurden mit gepunkteten Linien hervorgehoben. Gelbe und rote Pfeilspitzen zeigen bzw. Semilunar Ventile an der Wurzel der Ausflusstrakt und die Spirale-Ventil in den Ausflusstrakt. Eingefügte Karikaturen in (A) und (E) anzeigen Platzierung der Wandler und Übersetzung im Verhältnis zu der langen Achse Mittellinie anzeigen. Anatomische Abkürzungen: wSke, rechten Vorhof; A(L), links Atrium; OFT, Ausflusstrakt; SinV, Sinus Venosus; V, Ventrikel; VC, Vena Cava. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Repräsentative kurze Achse und schrägen Paragill echokardiographische Ansichten des Ventrikels und Abfluss Trakt. (A, B) Kurze Achse Ansicht des Ventrikels im B-Modus (graue Linie in Abbildung 2A) in der ventrikulären End-diastolischen (A) und End-systolischen (B) Phasen (siehe ergänzende Datei 10 für video Darstellung). (C) schräg Paragill Blick auf den Ausflusstrakt im B-Modus (violette Linie in Abbildung 2 b) in der Mitte Auswurf-Phase (siehe ergänzende Datei 11 video Darstellung). (D) ähnliche Ansichtsebene wie in (C) im CD-Modus zeigt Blut fließen (siehe ergänzende Datei 12 video Darstellung). (E) ähnliche Ansichtsebene wie in (C) und (D) im Pulsbetrieb Welle Doppler (PW) für Wärme Rate Erkennung und Velocity integral (VTI) Zeitmessung für Schlaganfall Volumenberechnung. Rottöne im CD-Modus Bilder zeigen Blut fließt auf den Schallkopf und blaue Farben zeigen das Gegenteil. Herzkammern und die Durchblutung wurden mit gepunkteten Linien hervorgehoben. Eingefügte Karikaturen in (A) und (C) zeigen Platzierung der Wandler und Übersetzung im Verhältnis zu der langen Achse Mittellinie anzeigen. Anatomische Abkürzungen: A, Atrien; OFT, Ausflusstrakt; SinV, Sinus Venosus; V, Ventrikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse der Herzfrequenz und Schlaganfall Volumen-Messungen, die Wirkung der Anästhesie und repräsentative Intra/inter-operator/Beobachter Analyse. (A–C) Herzfrequenz (HF) relativ unanesthetized Basislinie für sechs Axolotl in Benzocain (pro), MS-222 (B) und (C) Propofol betäubt im Laufe der Zeit (0 h ist bei Vollnarkose) dargestellt. (D–F) Volumen (SV) relativ unanesthetized Basislinie geplottet im Laufe der Zeit (0 h ist bei Vollnarkose) für sechs Axolotl betäubt in Benzocain (D), MS-222 (E), Schlaganfall und Propofol (F). (G) Intra/inter-operator/Beobachter Analyse des Schlagvolumen. Bland-Altman Grundstücke [(Dif) Unterschied zwischen den Betreibern (Op) / Beobachter (Obs) aufgetragen gegen Durchschnitt (Avg)] keine systematische Verzerrungen bei normalverteilten Messungen (QQ-Plots) von verschiedenen Akteuren und Beobachtern zeigen sollte. Tests für gleich Mittelwert (t-test) und gleicher Varianz (F-testen) sollte zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen Betreibern/Beobachter (Tabelle in der rechten unteren Ecke). A - F wurde von Material verfügbar unter der Creative Commons Attribution License (Abbildung 1 von Thygesen Et Al. modifiziert. 21). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7. Vergleich der Schlagvolumen geschätzt durch die geometrische und die Pulswelle Doppler Methode. Vergleich der Schlagvolumen (SV) durch zweidimensionale B-Modus (Geo) geometrische Messungen oder Puls Welle Doppler Messungen auf die Geschwindigkeit des Blutes verlassen den Ausflusstrakt geschätzt. SV(Geo) und SV(pw) in den gleichen sechs Tieren mit Sekunden zwischen den beiden Messarten und mit drei verschiedenen Anästhetika, Benzocain (blaue schräge Quadrate), MS-222 (rote Quadrate), aufgezeichnet und Propofol (grüne Dreiecke) mit einer Woche der Erholung zwischen den die Anwendung der verschiedenen Anästhetika. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Repräsentative raumzeitlichen Bildkorrelation für 3D Echokardiographie. (A) Kurve Darstellung ergab Korrelationswerte einer Korrelation Operation in einem 1.000 Frame Cine Dataset mit 75 Bildern pro Herzzyklus. Zwei Frames mit nur kleinen Unterschieden, zeigt passende kardiale Phasen ergeben einen hohe Korrelationswert. Anschließend können eine lokale Maxima Suche Algorithmus auf die Daten zu erkennen, alle passenden Rahmen angewendet werden. (B) grafische Darstellung die gleichen Daten wie in (A). Wenn Korrelationswerte erhalten werden, durch den Vergleich der ersten Herzzyklus mit dem gesamten Cine-Stack, geben Diagonale Linien der maximale Korrelation passende kardiale Phasen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9. Repräsentative 3D Echokardiographie. (A) Multi-planare Ansicht 3D rekonstruierten Axolotl Herzens. Das räumlich-zeitliche Bild Korrelation Verfahren ermöglicht für den Wiederaufbau des vollen Herzzyklus mit mehreren Phasen (hier 70 Phasen) in drei Raumdimensionen, die dann als diejenigen für die gewünschte Untersuchung der räumlich-zeitliche Phänomene in gekappt werden können das schlagende Herz. (B) drei transversale Scheiben der rekonstruierten 115 Scheiben 3D-Daten. Die quadratische Mittelung Verfahren erhöht den Kontrast von Blut, Gewebe und senkt das Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht ein besseres Verständnis der trabekulierte Natur des Axolotl Ventrikels und eine klare Visualisierung der interatrialen Septum und der Ventile in den Ausflusstrakt. (C) Oberfläche und Volumen Darstellungen des schlagenden Herzens in drei Phasen entlang eine farbcodierte segmentiert Modell (siehe ergänzende Datei 13 und ergänzende Datei 14 für video Darstellungen von Oberfläche und Volumen gerendert schlagen Herz und ergänzende Datei 15 für einen Drehstrom-segmentierte interaktives 3D-Modell). Anatomische Abkürzungen: A, Atrien; CAU, kaudalen; CRA, Schädel; DEX dexter (für das richtige Tier); Dor, dorsal; OFT, Ausflusstrakt; Sünde, finsteren (für die Tiere links); SinV, Sinus Venosus; V, Ventrikel; Ven, ventralen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1. Durchleuchtung Auffinden Herzkammern in dieAxolotl. Abbildung 2zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 2. Langen Achse, Mittellinie Ansicht, B-Modus. Siehe Abbildung 3A, B. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 3. Längsachse, ventrikuläre Ansicht, B-Modus. Siehe Abbildung 3, D. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 4. Längsachse, ventrikuläre Ansicht, Color Doppler-Modus. Siehe Abbildung 3E, F. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 5. Längsachse, ventrikuläre Ansicht, Power Doppler-Modus. Siehe Abbildung 3, H. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 6. Längsachse, Vorhofflimmern Ansicht, B-Modus. Siehe Abbildung 4A, B. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 7. Längsachse, Vorhofflimmern Ansicht, Color Doppler-Modus. Siehe Abbildung 4, D. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 8. Längsachse, Abfluss-Darm-Trakt Ansicht, B-Modus. Siehe Abbildung 4E. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 9. Längsachse, Abfluss-Darm-Trakt Ansicht, Color Doppler Modus. Siehe Abbildung 4F. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 10. Kurze Achse, ventrikuläre Ansicht, B-Modus. Siehe Abbildung 5A, B. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 11. Schräge Paragill, Abfluss-Darm-Trakt Ansicht, B-Modus. Abbildung 5zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 12. Schräge Paragill, Abfluss-Darm-Trakt Blick, Color Doppler Modus. Abbildung 5zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 13. Dreidimensionale Oberfläche Darstellung des schlagendes Herz in 70 Phasen (19,6 ms Zeitauflösung). Siehe Abbildung 9. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 14. Dreidimensionale Volumen-Rendering von schlagendes Herz in 70 Phasen (19,6 ms Zeitauflösung). Siehe Abbildung 9. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 15. Dreidimensionale interaktive Modell des schlagendes Herz in 3 Phasen: ventrikuläre Ende Systole, ventrikuläre Mid Auswurf und ventrikuläre Ende Systole. Abbildung 7zu sehen. Die interaktive PDF-Datei sollte in Adobe Acrobat Reader 9 oder höher betrachtet werden. Um die 3D Funktion zu aktivieren, klicken Sie auf das Modell. Mit dem Cursor, es ist nun möglich, drehen, zoomen, schwenken Sie das Modell, und in der Modellhierarchie alle Segmente des Modells/ausgeschaltet oder transparent gemacht werden können. Der Modell-Struktur ist eine Hierarchie, enthält mehrere Unterebenen, die sein können (+) eröffnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 16. Vertreter kommentierte Skript zur Berechnung der Korrelation einer 1.000 Bildern Akquisition mit einer oberen Schätzung des 75 Bilder/Herz-Kreislauf. Das Skript ist in IJ1-Makro-Sprache geschrieben und umgesetzt werden können, als ein Batch-Makro in ImageJ zur Berechnung der Korrelationswerte (75.000 pro Akquisition) über eine gesamte Z-Stapel von 3D-Daten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 17. Repräsentative Skript für automatische Peak Erkennung in einer Reihe von Korrelationswerte aus einem 1.000 Bildern Akquisition mit einer oberen Schätzung des 75 Bilder/Herz-Kreislauf. Baureihe Korrelationswerte (Spalte B, gelb markiert) ersetzt werden kann und nach der Aktivierung des Makros (Strg + R) die Liste der Befehle zum auswählen, passende kardiale Phasen und führen Sie quadratische Mittelung wird angezeigt (Spalte Q, grün markiert). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 18. Vertreter kommentierte Skript, wählen passende kardiale Phasen und führen quadratische Mittelung einer 1.000 Bildern Akquisition mit einer oberen Schätzung des 75 Bilder/Herz-Kreislauf (Spalte Q in zusätzliche Datei-17). Das Skript ist in IJ1-Makro-Sprache geschrieben und umgesetzt werden können, da ein Makro in ImageJ zu einem Ensemble eine Zyklus (75 Phasen) 2D Scheibe gemittelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 19. Vertreter kommentierte Skript zur Berechnung der Korrelation zwischen eine 70 Rahmen Referenz Scheibe und einem angrenzenden 75 Frames Test Scheibe. Das Skript ist in IJ1-Makro-Sprache geschrieben und als Makro in ImageJ zur Berechnung der Korrelationswerte (5.250) umgesetzt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 20. Vertreter Excel-Skript für automatische Peak Erkennung in einer Reihe von Korrelationswerte aus einem Vergleich zwischen einer 70 Frames Referenz Scheibe und einer angrenzenden 75 Frames Test Scheibe. Die Reihe der Korrelationswerte (Spalte C, gelb markiert) ausgetauscht werden und nach der Aktivierung des Makros (Strg + t) die Liste der Scheiben ausgewählt werden wie ein Substack in dem Test-Segment werden angezeigt (Spalte L, Zeile 2, grün markiert). Die Test-Slice-Substack müssen räumlich passenden Rahmen, um die Referenz-Scheibe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Echokardiographie in der Axolotl und anderen nicht-Säugetier-Arten ergibt sich grundlegend andere Daten als Säugetier Echokardiographie aufgrund der kernhaltigen Natur der roten Blutkörperchen bei allen Wirbeltieren außer Erwachsene Säugetiere. Dies führt zu eine ausgeprägte Blut-Signal und weniger Blut, Gewebe-Kontrast in Axolotl echokardiographischen Bilder im Vergleich zu z. B. Maus oder menschlichen Echokardiographie. Dies kann erschweren Bild Segmentierung auf unverarbeitete Einzelbild Ultraschallbilder wie es sein kann, schwer Blut von Gewebe zu unterscheiden. Dieses Phänomen kann jedoch vorteilhaft, wenn zur Erstellung von Blut verbesserte Bilder durch die Anwendung der quadratische Mittelung Verfahren beschriebenen18 und modifiziert für Axolotl Echokardiographie in Abschnitt 6 dieses Protokolls zu signalisieren. Da Blut Flecken viel dynamischer als die in Weichgewebe sind, erzeugt quadratische Mittelung ausgeprägte Kontrast zwischen diese beiden Fächer Bild Segmentierung in zwei und drei Dimensionen ermöglicht.

Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Anästhetika für Axolotl, die gründlich wurden bisher21getestet. Benzocain und MS-222 stimulieren eine Zunahme der Herzfrequenz, was beim Testen der Herzfunktion unter Stressbedingungen wünschenswert sein kann. Propofol induziert weniger Stress auf das Herz während der Narkose und kann als Ersatz für die unanesthetized Echokardiographie in Situationen wo Erfassungszeit die Grenzen der sesshaften Verhalten in unanesthetized Axolotl überschreitet verwendet werden.

Subjektivität ist 2D Echokardiographie, beschreibt das 3D Herz betroffen. Daher ist es zwingend erforderlich, Durchführung und Analyse Intra/inter-operator/Beobachter vor der Durchführung einer tatsächlichen Experiment, wie im Protokoll Abschnitt 5 beschrieben. Ebenso sollte die echokardiographische Messungen mehr als Indexwerte angesehen werden, die angewendet werden können, um mögliche Unterschiede in der Herzfunktion unter verschiedenen Umständen eher als Absolute Werte zu untersuchen. Das Schlagvolumen, bestimmt durch die geometrischen Gleichung (Gleichung 2) selten ergibt den gleichen absoluten Wert wie die Pulswelle Doppler Gleichung (Gleichung 4; ( Abbildung 7), und es sollte entschieden, die Messen, während eine Reihe von Experimenten einzuhalten. Die SV(geo) schneller als die SV(pw) erhalten Sie jedoch die sphärische Annahme der ventrikulären Form gilt nur für gesunde einheitlich contracting Herzen, und in Krankheit und Regeneration Modelle, SV(pw) für eine bessere Reflexion von betrachtet werden sollten Das wahre Schlagvolumen.

Die Korrelation und quadratische Mittelung Verfahren des Protokolls § 6 können in mehreren verschiedenen Bildgebung und mathematische Pakete implementiert werden. Da Programmier Kenntnisse und Zugang zu Software-Pakete im Life-Science-Forscher sehr unterschiedlich sind, haben wir uns bemüht in Richtung der Methoden in der Software-Pakete repräsentative Skripte vorsieht, dass die meisten Forscher (z. B. Excel) kennen einfach näherte und frei zugänglich sind (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Ergänzende Dateien 16 - 20 bieten kommentierte beispielhafte Skripte in IJ1-Makro-Sprache und als .xlsm Makros, die auch mit wenig Erfahrung in Programmierung verständlich sein sollte.

Intrinsische Herz Regeneration ist ein Phänomen, das ausschließlich in die Herzen der kleinen Arten (bezogen auf Mensch) gefunden und somit Messungen und Bildgebung der Grundlinie Herzfunktion und funktionalen Fortschritt während der Regeneration wird in Frage gestellt durch die Größe des Herzens und die räumliche Auflösung der bildgebenden Modalität angewendet. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung bietet einen wünschenswerten Kompromiss zwischen einer hohen räumlichen Auflösung in der Ebene (~ 30 x 30 µm2 bei 50 MHz), das ist vergleichbar mit in Vivo µCT bildgebenden und viel höher als in Vivo µMRI, die hat eine Tiefe von Eindringen (~ 1 cm bei 50 MHz) mehrere Falten größer als konfokalen Mikroskopie und sehr hoher zeitlicher Auflösung (50-300 Bilder/s mit 50 MHz, 1 cm Tiefe). Gepaart mit manuellen oder automatisierten Z -dimensionale Bewegung des Wandlers, ermöglicht Ultraschall unerreichte Rekonstruktion der Herzfunktion und anatomische Modellierung in vier Dimensionen. Darüber hinaus ermöglicht die nicht-invasive Art der Technik längs experimentieren. Unseres Wissens gibt es derzeit keine Matrix-Array-Sensoren für Hochfrequenz-micro Ultraschall-Bildgebung zur Verfügung. Die Entwicklung dieser Technologie würde die Akquisitionen von 3D-Daten von Herzchen wie derjenigen der Axolotl in ein schnelleres Verfahren als mechanisch bewegte den Schallkopf stark unterstützen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir würden gerne anerkennen, Kasper Hansen, Institut für Biowissenschaften, Universität Aarhus für die Zugang zu und Unterstützung bei der elektronischen Mikromanipulator 3D echokardiographische Erwerb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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Medizin Ausgabe 141 Echokardiographie Ultraschall Herz Herz Ultraschall Regeneration Axolotl Z.B. geschieht räumlich-zeitliche Bildkorrelation
2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (<em>Z.B. geschieht</em>)
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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