Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

כאן אנו מציגים אקוקרדיוגרפיה פרוטוקולים עבור ייבוא תמונות דו-ממדיות ותלת -ממדיים של הלב הפועם של הסלמנדרה אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma mexicanum), זן מודל ב לב התחדשות. שיטות אלה מאפשרות האורך הערכה של תפקוד הלב ייתכן ברזולוציה גבוהה.

Abstract

תקלה הלב עקב מחלת לב איסכמית הוא אתגר גדול, טיפולים משובי ללב יש ביקוש גבוה. כמה מינים דגם כגון דג זברה, סלמנדרות המסוגלים התחדשות לב מהותי להחזיק הבטחה לעתיד טיפולים משובי עבור חולים אנושיים. כדי להעריך את התוצאה של הניסויים cardioregenerative זה הכרחי כי ניתן לנטר תפקוד הלב. הסלמנדרה אקסולוטל מקסיקני (mexicanum א) מייצגת זן ומבוססת מודל בביולוגיה regenerative להשיג בגדלים המאפשר להערכת תפקוד הלב. המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שיטות למדוד reproducibly תפקוד הלב אצל אקסולוטל מקסיקני בעזרת אקוקרדיוגרפיה. היישום של הרדמה שונים (בנזוקאין, MS-222 ו propofol) הוכח, הרכישה של מימדי בנתונים ומורדמת והן unanesthetized axolotls echocardiographic (2D) מתואר. אקוקרדיוגרפיה 2D של תלת מימד (3D) הלב יכול לסבול העוסקת, הסובייקטיביות של מדידות, וכדי להקל על תופעה זו שיטה מוצק, כלומר "אינטרה" / בין-operator/הצופה ניתוח, כדי למדוד ולצמצם את הנטיה הזו הפגינו. לבסוף, מתוארת שיטה להשיג נתונים תלת-ממדיים echocardiographic של הלב הפועם אקסולוטל מקסיקני ברזולוציה גבוהה מאוד ייתכן ועם ניגודיות דם-כדי-רקמת בולטת. בסך הכל, פרוטוקול זה צריך מספקים השיטות הדרושות כדי להעריך את תפקוד הלב ואת מודל אנטומיה, זרימה דינאמיקה של אקסולוטל מקסיקני באמצעות אולטראסאונד הדמיה עם יישומים בביולוגיה regenerative והן כללי הניסויים פיזיולוגיים.

Introduction

מחלת לב איסכמית הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. למרות רבים לשרוד אוטם שריר הלב עקב התערבות רפואית מהירה, מכויל, אירועים איסכמיים בבני לעיתים קרובות להוביל שהותירה הצטלקות המשויך היפרטרופיה תקלה חשמלית, קיבולת תפקודית מופחתת של הלב . חוסר פוטנציאל הרגנרציה של רקמת הלב משותף בקרב יונקים, למרות טענות שנויות במחלוקת של התחדשות לב בתרבית של דווחו, אלה היו מוגבלים זנים מאתר מסוים3,4 , היפוקסיה מטופלים עכברים5. לפיכך, בתחום של רפואה רגנרטיבית לב וביולוגיה מוגבל בדרך כלל מודלים בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור תופעות משובי הלב מהותי. דג זברה (רזבורה rerio) בעשור האחרון נוצרה כמו הדגם הכי טוב מאופיין הלב מהותי התחדשות6,7,8,9,10 . בשל תחזוקה קלה מעבדה, זמן דור קצר, מגוון רחב של כלים זמינים, דג זברה הוא מותאם כמודל עבור מנגנוני גנטית ומולקולרית שבבסיס לב התפתחות והתחדשות. עם זאת, ממדי הלב דג זברה דקה לעשות את זה שפחות מתאים להערכה תפקודית, פרוצדורות כירורגיות מסובכות ולא את האמיניות שאינם בעלי ארבע רגליים של דג זברה מגביל את אקסטרפולציה הגיונית של ממצאים של מין זה, ובכך המצדיקים את השימוש דגמים tetrapod גדולים אחרים. אחד המודלים המוקדמים של התחדשות לב חוליות היה על הידלדלות המזונבת, ניוט המזרחי (Notophthalmus viridescens)11, מין אשר נותר מודל ערך12.

בשנים האחרונות יש הידלדלות המזונבת אחר, אקסולוטל מקסיקני מקסיקני (mexicanum א) נכנס למקום כמו גדול (עד 100 גרם של הגוף מסה) ומודל מאוד מעבדה וישימה בבעלי חיים עבור מגוון רחב של משובי מתחומים שונים האיבר התחדשות, פגיעה בחוט השדרה, התחדשות לב13,14,15,16,17. אקסולוטל מקסיקני לבצע מדידות פונקציונלי על הלב בעזרת אקוקרדיוגרפיה בתדירות גבוהה ומאפשר העדר של מבנים מסויד בצד הגחוני של הלב סאונד הדמיה עם רמה נמוכה של התמונה חפצים (אקוסטי הוספת צל, ההד בפרט) מאשר אצל בעלי חיים אחרים דגם עם מסויד עצם החזה והצלעות.

פרוטוקול הבאה מתארת מספר שיטות שונות, ההכנות (איור 1, איור 2) לרכוש לשחזור מדידות echocardiographic על הלב אקסולוטל מקסיקני בשתי מרדימים (החלת שלושת הרדמה שונים: בנזוקאין, MS-222 ו propofol) ו- unanesthetized בעלי חיים שני (איור 3 איור 4, איור 5, 6 איור, איור 7, הקבצים המשלימים 1-12) ושלוש (איור 8, איור 9, הקבצים המשלימים 13-14) ממדים מרחביים. הלב דו-חיים הוא תלת תאיים (שני אטריה, של החדר ליחיד). אטריה מסופקים על-ידי venosus סינוס גדולים ונשפך הנוזלים אל מערכת יצוא כל arteriosus (איור 2). מאז רוב הדגש הוא באופן מסורתי שמוקם על התחדשות חדרית ופחות על החזרתה של אטריה6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר מדידות של תפקוד.

אקוקרדיוגרפיה דו-חיים אינה היטב תיאר בספרות, לפיתוח 2D בשיטות המתוארות במאמר זה גורשו על ידי הצורך לייצוג הטוב ביותר את הפונקציונליות של הלב הפועם אקסולוטל מקסיקני הגדרה ניסיוני ושעה נתון. לפיכך, בשיטות המתוארות כאן הינם חלים בניסויים משובי לב איפה תפקוד הלב ניתן שוב ושוב לנטר במהלך תהליך התחדשות. בנוסף, השיטות ניתן ליישם באופן כללי cardiophysiological ניסויים אקסולוטל מקסיקני או שונה במקצת כדי להתפרס המזונבת או anuran דו-חיים דגמים אחרים (e.g.,Xenopus). אקסולוטל מקסיקני קיים מספר זנים שונים, וריאציות צבע (למשל, wildtype, melanoid, לבן, לבקן, הטרנסגניים לבן עם ביטוי חלבון פלורסצנטיות ירוק), אולם מאפיינים אלו אינם משפיעים את התאימות של אקסולוטל מקסיקני עם פרוטוקול המתואר. השיטה המתוארת כאן כדי לרכוש נתונים תלת-ממדיים echocardiographic הוא גרסה מותאמת של טכניקת מתאם (STIC) התמונה ייתכן שפותחו עבור אולטרסאונד קלינית ואת הריבועית בממוצע בשיטה שתוארה לעיל התרנגולות המתפתח כדי להגביר את האות של דם ספאקלס ברקמות הרכות מינים המכיל תאי דם אדומים nucleated18,19. שיטה זו מאפשרת מידול מתקדמים של הידרודינמיקה מחושב בלב אקסולוטל מקסיקני להתכווצות הלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים ביצעו ב פרוטוקול זה היו בהתאם לחקיקה הלאומית הדנית טיפול ושימוש של חיות מעבדה, הניסויים אושרו על-ידי דנית הלאומית החיה ניסויים Inspectorate (פרוטוקול # 2015-15-0201-00615).

1. תכשירים

  1. להכין אקסולוטל מקסיקני בינוני.
    1. החל במי ברז באיכות גבוהה טיפול שאינו כימי כמו אקסולוטל מקסיקני בינוני. אם זו אינה זמינה, להחיל הפתרון של 40% Holtfreter.
    2. להכין הפתרון של 40% (wt/כרך) Holtfreter על ידי המסת 15.84 g NaCl, 0.54 g CaCl2·2H2O, 1.11 g MgSO4·7H2O ו- g 0.288 אשלגן כלורי במים מסוננות ולא יונים עד נפח של 1 ל'
  2. לבצע הרדמה טבילה.
    1. הכן בנזוקאין (אתיל 4-aminobenzoate) פתרון הרדמה על ידי המסת 200 מ ג אתיל 4-aminobenzoate ב- 3 מ ל אצטון, ואז המסת בשילוב זה ב 1 ליטר מים מהברז או 40% Holtfreter של הפתרון.
    2. להכין את MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonic חומצה, הידוע גם בכינויו tricane) פתרון הרדמה על ידי המסת אתיל 200 מ ג 3-aminobenzoate methanesulfonic חומצה ישירות בהפתרון של 1 ליטר מים מהברז או 40% Holtfreter.
    3. להכין פתרון הרדמה propofol (2, 6-diisopropylphenol) על ידי המסת 3.3 מ ג 2, 6-diisopropylphenol ב- 1 ליטר מים מהברז או 40% Holtfreter של פתרון. לחלופין, לדלל מסחרית premade לפתרון 3.3 מ ג/ל'
      התראה: Propofol הרדמה אנושי חזק (דרך הווריד מנוהל), צריך להיות מטופל טיפול, כולל בדמות מדולל.
  3. היכונו אקוקרדיוגרפיה מיטה, מיכל.
    1. להתכונן בצורת שפתיים מיטה חיות אקוקרדיוגרפיה על ידי קיפול חתיכת בד רך 70 ס"מ 55 ס"מ פעם אחת ומגלגלים אותה ואז "לכושר בוריטו" (איור 1 א'). ואז תתכופף הקצוות עד שהם נפגשים ותדביקי האלה ביחד (איור 1B).
    2. להטביע את השפה בצורת מבנה בינוני אקסולוטל מקסיקני כדי להכיל את אקסולוטל מקסיקני anesthetized במהלך אולטראסאונד הדמיה. לאבטח את החיה למבנה ולמנוע צף באמצעות גומיות חופשי; הצב אלה אמצע-הלסת, השתלטה על האזור סאקרל (איור 1C).
      הערה: גומיות צריך לא לסחוט את החיה כמו פעולה זו תשפיע על ספיקת הדם.
    3. עבור אקוקרדיוגרפיה 2D על unanesthetized axolotls, הכן ערסל באמצעות גילוף את 16 ס"מ 8 ס"מ x ס מ 5, חור 33 ס"מ 27 ס"מ x ס מ 5, גוש פוליסטירן מוקצף (למשל, מכסה ממכל פוליסטירן מוקצף בגודל בינוני) (איור 1D).
    4. חתיכת ניילון נצמד 33 ס"מ, 27 ס"מ דרך החור וטעינה לאבטח את הקצוות של הגלישה השטח העליון של הרחוב פוליסטירן מוקצף (איור 1E) כדי ליצור ערסל. אקסולוטל מקסיקני בינוני להוסיף 3 ס"מ עומק בערסל. אקסולוטל מקסיקני unanesthetized ישקעו לתחתית של הערסל ומאפשר גישה קלה הגחון דרך ניילון נצמד (איור 1F).

2. עזים ומתנגד Axolotls

  1. לטבול אקסולוטל מקסיקני בפתרון הרדמה הרצוי (בנזוקאין, MS-222 או propofol).
  2. . ולבדוק אם סימנים ראשונים של הרגעה, תנועות מופחת ואובדן הגוברת של רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים, זה מופיע בתוך 10 דקות אצל בעלי חיים < 10 גרם (< 10 ס מ), במרחק 20 דקות בבעלי חיים בין 10 גרם, 50 גרם של מסת הגוף (10-22 ס מ).
  3. . ולבדוק אם העדר מוחלט של תנועות גוף, גיל אוורור תנועות רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים, וודא כי בעל-החיים שאינם מגיבים לגירוי כאב מתון נבדק על ידי צובט הקור בין ספרות.
    הערה: למרות העובדה שהרדמה כללית מושגת תוך 30 דקות ב- axolotls בנזוקאין מרדימים, תפקוד הלב לא התייצב עד 1 h. זה לא המקרה MS-222 או propofol מרדימים axolotls (איור 6A-F).
  4. כדי לשמור על אקסולוטל מקסיקני בהרדמה כללית, לשמור את החיות פתרון הרדמה או עטוף נייר רטוב מגבונים שנרטבו בפתרון הרדמה.
    הערה: הרדמה יכול להישמר במשך 7 שעות ללא השפעות שליליות על רווחתם של בעלי החיים בהתחשב בכך את העור, במיוחד הזימים נשמרים לח.
  5. כדי reawake אקסולוטל מקסיקני, להעביר את החיה בינונית ללא הרדמה.
    הערה: הסימן הראשון של התעוררות היא גיל אוורור תנועות. בעל חיים צריך להיות זקוף מגיבים לגירוי בתוך 1 h.

3. 2D אקוקרדיוגרפיה על ומורדמת אקסולוטל מקסיקני

  1. המקום ומורדמת אקסולוטל מקסיקני במצב פרקדן מיטה בצורת שפתיים בעלי חיים (צעדים 1.3.1-1.3.2). . אבטחו לרחף בעזרת גומיות רופף (איור 1C) ודא כי פני בית החזה מכוסה על ידי 3-5 מ מ בינוני.
    הערה: עבור רכישת קצר (< 5 דקות) ללא הרדמה בינוני יכול להיות מיושם. עבור רכישת ממושך, הרדמה פתרון צריך להיות מוחל כמו אולטרסאונד בינוני כדי להבטיח תפקוד הלב יציב לאורך כל המדידות.
  2. מקם המתמר מעל האמצע של החיה באזור בית החזה במקביל לציר הארוך של החיה (2A איור, איור 3 א-ב, 2 הקבצים המשלימים). השתמש transillumination עם מקור אור קר על axolotls לבן, לבקן כדי לוודא את המיקום הנכון של המתמר (איור 2C ו 1 קובץ משלים).
    1. לשימוש axolotls במשקל < 20 גר', מתמר 50 מגה-הרץ; עבור axolotls > 20 גרם, להשתמש מתמר 40 מגה-הרץ. ודא מיצוב של הגולגולת הקדמי לכיוון ימינה עבור רכישת תמונה סטנדרטית. אם זה לא המקרה סיבוב המתמר 180 ° או ' היפוך ' התמונה.
  3. ודא כי בתצוגה קו האמצע ' ציר זמן ', חלק קטן של החדר (ממוקם בצד ימין בחלל בית החזה, איור 2A) מופיע במסגרת diastole חדרית, חלק גדול של אטריה ימין ועל שמאל (ממוקם במרכז / מעט לכיוון צד שמאל בחלל בית החזה, איור 2A) והם venosus סינוס גלויים הן סיסטולה פרפור והן diastole (איור 3 א, ב').
  4. לתרגם את מתמר 1-3 מ מ לעבר של החיה זכאי לקבל את תצוגת ציר זמן חדרית (איור 2 א). התנוחה הנכונה מושגת כאשר האזור חתך הרוחב של החדר קצה-סיסטולה מקסימום שלה (איור 3C-H).
  5. B-מצב, לרכוש ≥ 3 מחזורים לב עם > 50 מסגרות/s בגם 'דימות כללי' (רזולוציה טמפורלית המרחבי/נמוך גבוה) או במצב 'קרדיולוגיה' (רזולוציה טמפורלית המרחבי/גבוהה נמוך).
    הערה: תצוגה זו מאפשרת הערכה של תפקוד. ניתן להעריך תפקוד בשני מימדים באמצעות השינוי באזור השבר חדרית (FACv) שמחושבים הדיאסטולי סוף סוף סיסטולי קרוס חתך אזור הנוזלים (CSAv) באמצעות המשוואה:
    Equation 1(1)
    החדר של אקסולוטל מקסיקני ההנחה היא צורת כדור, נפח פעימה גיאומטריה מבוסס [SV(geo)] ניתן לחשב בעזרת המשוואה:
    Equation 2(2)
  6. לתרגם את מתמר לאורך הציר הארוך של החיה עד מרכז החדר נמצא במרכז המסך. סובב ב- 90 ° עם כיוון השעון כדי להשיג את תצוגת ציר קצר באמצע-חדרית (איור 5 א ו- B, 10 הקבצים המשלימים) המתמר. להעריך את הצורה המעגלית של החדר על ידי מתרגם מתמר לאורך הציר הארוך של הלב.
  7. לחזור המתמר המטוס ציר זמן, לתרגם את זה חזרה לכיוון האמצע או מעט משמאל האמצע כדי לקבל את התצוגה שני קאמרית פרפור ציר זמן (איור 2 א). ודא כי המיקום הנכון מושגת על-ידי המאשר כי האזורים חתך הרוחב של אטריה הקצה-סיסטולה הם במלון maxima שלהם ולא אטריה שני בשילוב להניח את קווי המתאר של הספרה "8" מוטה ~ 45 ° לכיוון צד שמאל (איור 4A ו- B, הקבצים המשלימים 6).
  8. B-מצב רוכשים ≥ 3 מחזורים לב עם > 50 מסגרות לשנייה 'כללי הדמיה' או במצב 'קרדיולוגיה'.
    הערה: אטריה של אקסולוטל מקסיקני רגולרי, פונקציית תלת-ממד לא ישירות מהמשמעת מנתוני דו-מימדית, ובכך הערכת תפקוד שלהם כאמצעי אינדקס כגון פרפור אזור השבר הזדמנות (FACa) המבוסס על האזור חתך צלב משולב (CSAa) של שניהם צ'יימברס פרפור סיסטולה, diastole:
    Equation 3(3)
  9. לתרגם את מתמר כלפי זכותם להופעת מערכת יצוא (כל arteriosus) (קרוב תצוגת ציר זמן חדרית) (איור 2 א).
    הערה: לאחר שעזב את הנוזלים לכיוון הקדמי, מערכת יצוא עיקול חד הנסיעה מפעיל בזווית קטנה לכיוון פני השטח הגחון לפני שוב בהנחה של כיוון הקדמי, מתפצלים לתוך ענפים גיל וכלי מערכתית.
    1. ודא כי התצוגה בדרכי יצוא הנכונה מושגת על-ידי המאשר כי הקוטר של זרימה החוצה. הוא על מקסימום שלה-סוף חדרית-סיסטולה, שניים של השסתומים semilunar שלושה בכניסה של זרימה החוצה גלויים-אמצע הפליטה (איור 4E, הקבצים המשלימים 8).
      הערה: הכיוון הגחון לכיוון המתמר של החלק ביניים של מערכת יצוא מאפשר מדידות מהירות וזרימה באמצעות הדמיה דופלר.
  10. החלת מצב דופלר צבע כדי למפות מהירויות זרימת דם במערכת העיכול יצוא במהלך הוצאה הלב (איור 4F ו 9 הקבצים המשלימים). כמו כן החל דופלר צבע כוח דופלר הדמיה כדי להמחיש את זרימת הדם בתצוגות חדרית, פרפור (3E איור-H, הקבצים המשלימים 4-5 ו- 4C איור-D, ו- 7 הקבצים המשלימים).
  11. החל גל הדופק (PW) דופלר-מצב במיקום של מהירות מקסימלית דם בחלק של מערכת יצוא רץ לעבר המתמר.
    1. להשתמש 'זווית הקרן' ו- 'תיקון זוויתי של עד 45 ° כדי לכוונן יצוא לא להיות בניצב לחלוטין פניו של המתמר (איור 4G). ודא כי המיקום PW דופלר היא לא חפפו ידי השסתום ספירלה של זרימה החוצה במהלך כל שלב של מחזור הלב (איור 4E).
  12. במצב-PW דופלר לרכוש נתוני מהירות/שעה מעל ≥ 3 מחזורים הלב.
  13. לחזור למצב-B ולרכוש ≥ 3 מחזורים הלב על אותו מישור המדויק כפי PWV נרכשה.
  14. למדוד מהירות הזמן נפרד (VTI) של זרימת הדם במערכת העיכול יצוא כמו השטח מתחת לעקומה מהירות/שעה עבור הלב מלא אחד מחזור (איור 4G, g1).
    הערה: מן VTI את הקוטר (d) של מערכת יצוא-סוף-סיסטולה המתקבל רכישת B-מצב, PW דופלר נפח פעימה מבוסס [SV(pw)] ניתן לחשב בעזרת המשוואה:
    Equation 4(4)
    קצב הלב (HR) נמדד העקומה מהירות/שעה על ידי מדידת משך מחזור לב שלם. תפוקת הלב [CO(pw)] מחושבת באמצעות המשוואה:
    Equation 5(5)
  15. להשיג את התצוגה paragill עקיפה, תצוגה המציע אלטרנטיבה לשקילת מהירות זרימת הדם במערכת יצוא, על ידי סיבוב אקסולוטל מקסיקני של 90 °, השפה בצורת מיטה בצורה כזאת, כי החלק הנכון של החיה פונה כלפי מעלה (איור 2B). זווית, סיבוב המתמר ומקם אותה במקביל, רק האחורי עד הגג הבולטות (איור 2B). ודא כי התנוחה הנכונה מושגת על-ידי המאשר כי מערכת יצוא פועל כלפי מטה ב ~ 45 °, כי אטריה יופיעו תחת מערכת יצוא במהלך הפליטה (איור 5 C, 11 הקבצים המשלימים).
  16. להחיל PW דופלר-מצב במיקום של מהירות מקסימלית דם בחלק של מערכת יצוא בורח המתמר (איור 5D, 12 הקבצים המשלימים). להשתמש 'זווית הקרן' ו- 'תיקון זוויתי של עד 45 ° כדי לכוונן יצוא לא להיות בניצב לחלוטין פניו של המתמר (איור 5E).
  17. במצב PW דופלר-לרכוש דם מהירות מעל ≥ 3 מחזורים הלב.
  18. לחזור למצב-B ולרכוש ≥ 3 מחזורים הלב על אותו מישור המדויק כפי PWV נרכשה.
    הערה: SV(pw) ו- CO(pw) מחושבים עבור התצוגה paragill עקיפה באמצעות משוואה 4 ו- 5 משוואת כמתואר לעיל עבור תצוגת ציר זמן.

4. 2D אקוקרדיוגרפיה על Unanesthetized אקסולוטל מקסיקני

  1. מקם את אקסולוטל מקסיקני unanesthetized במצב של שכיבה בערסל (שלב 1.3.3).
  2. פשוט להשאיר ללא הפרעה במשך 30-60 דקות להתאושש טיפול מתח.
  3. מקם את מתמר אולטרסאונד עם הראש מתמר פונה כלפי מעלה לכיוון אקסולוטל מקסיקני בערסל.
  4. החל אולטרסאונד-ג'ל על המתמר.
  5. בעדינות, מבלי להפריע החיה, מקם המתמר מעל האמצע של החיה באזור בית החזה במקביל לציר הארוך של החיה.
    הערה: זהו המיקום אותו, אבל הפוך, באשר אקסולוטל מקסיקני anesthetized (שלב 3.2).
  6. להשיג את B-מצב, מצב דופלר צבע, PW נתונים במצב ציר זמן, תצוגת ציר קצרה כמתואר בצעדים 3.2-3.14.
    הערה: מבט paragill עקיפה לא ניתנת להשגה ב unanesthetized אקסולוטל מקסיקני הנתונים echocardiographic unanesthetized axolotls כדאי לרכוש בין גיל אוורור תנועות (10-20 s תקופה על חיה בזמן מנוחה). אם אקסולוטל מקסיקני זז במהלך הרכישה, יש לחזור על המדידות.

5. הערכת הנתונים אקוקרדיוגרפיה 2D ולצמצם את הסובייקטיביות

  1. למנוע הטיה אופרטור/הצופה בהערכה אולטרסאונד 2D ו 3D הדמיה של תפקוד הלב על סמך נתונים 2D הנגרמת על ידי הסובייקטיביות רכישת נתונים והן שלב הניתוח נתונים על-ידי ביצוע ניתוח אינטרה/בין-operator/הצופה20.
    הערה: ההפעלה של מחקרים וכאשר הכשרת כוח אדם חדש הסובייקטיביות הזאת בטח ניתן לכמת, למזער באמצעות ניתוח אינטרה/בין-operator/הצופה.
  2. ליזום ניתוח אינטרה/בין-operator/הצופה בהגדרת אדם שני עם אופרטור/הצופה 1 (פחות מנוסים) שכנגדו אופרטור/הצופה 2 (יותר מנוסה) על-ידי ביצוע מדידות קונצנזוס 6 ≥ יחד, כולל שני הספסלים לעבודה מערכת סאונד (פעולה), לאחר מכן ניתוח של פרמטרים רלוונטיים (תצפית).
  3. להגיע להסכמה כללית בין מפעילי משקיפים ופועלים (אופרטור/המתבונן 1) מערכת סאונד לרכוש נתונים רלוונטיים על ≥ 6 חיות (פעולה 1.1).
  4. ישירות לאחר, פועלים (אופרטור/המתבונן 2) מערכת סאונד לרכוש נתונים רלוונטיים על החיות באותה (פעולה 2.1).
  5. תנו לחיות להתאושש במשך 3 ימים. לאחר מכן, חזור (אופרטור/המתבונן 1) ההליך (פעולה 1.2).
  6. ניתוח (אופרטור/המתבונן 1) הכל מדוד נתונים (פעולה 1.1 תצפית 1.1; מבצע 2.1 תצפית 1.1 מבצע תצפית 1.2 1.1) וחזור אחרי 24 שעות הניתוח של נתוני המפעיל/הצופה של 2 (מבצע 2.1 תצפית 1.2).
  7. לנתח (אופרטור/המתבונן 2) הנתונים שרכשה לה/עצמו (מבצע 2.1 תצפית 2.1). שימו לב כי הערכים שהתקבלו על-ידי ניתוח זה נחשבים הקרוב ערכי אמת.
  8. להעריך וריאציה, נטיות, ההטיה בתחום השוואות בין כל הפרמטרים הנרכש באמצעות התוויית בלאנד-אטמן, התוויית QQ, t-test (ממוצע שווה), ו- F-מבחן (סטיה שווה) (איור 6G).
    1. שימו לב כי פעולת 1.1 תצפית 1.1 נגד מבצע 2.1 תצפית 1.1 השוואה מדגים את הווריאציה של inter-מפעיל.
    2. שימו לב כי פעולת 2.1 תצפית 1.1 לעומת 2.1 תצפית 2.1 מבצע השוואה מדגים את הווריאציה של inter-הצופה.
    3. שימו לב כי פעולת 1.1 תצפית 1.1 נגד מבצע תצפית 1.2 1.1 השוואה מדגים את הווריאציה אינטרה-מפעיל.
    4. שימו לב כי פעולת 2.1 תצפית 1.1 לעומת 2.1 תצפית 1.2 מבצע השוואה מדגים את הווריאציה אינטרה-הצופה.
  9. ודא כי זה אומר, וריאציה של המדידות שונים שאינם-שונים באופן משמעותי להשוואות ארבע; ההבדל בין ערכים נמדד צריכה לרדת תוך סטיות תקן ± 1.96, שם אמור להופיע אין נטיות בכיוון פחות הדיוק של ערכי לא קטן ולא גדול.

6. 3D אקוקרדיוגרפיה על ומורדמת אקסולוטל מקסיקני

  1. רכישת תלת-ממד
    1. מקם את אקסולוטל מקסיקני anesthetized במצב פרקדן מיטה בצורת שפתיים בעלי חיים (שלב 1.3.1). לאבטח לרחף בעזרת גומיות רופף (איור 1C) וודא כי פני בית החזה מכוסה על ידי 3-5 מ מ בינוני. רכישת 3D הוא הליך ממושך, ולכן להחיל פתרון הרדמה כמו אולטרסאונד בינוני כדי להבטיח תפקוד הלב יציב לאורך כל המדידות.
    2. מקם המתמר מעל האמצע של החיה באזור בית החזה או מקביל לציר הארוך של החיה (עבור הקלטה 3D הסאגיטלי) או אורתוגונלית לציר זמן (הקלטה 3D ואלכסוני).
    3. לתרגם את המתמר הממד בתוך המטוס (x ו- y) ואת הממד out-של-plane (z או פרוסה) כדי להבטיח כי האזור כולו לב יהיה מכוסה ב לכידת תלת-ממד עוקבות.
    4. להתאים את קצב המסגרות והרזולוציה המרחבית לפי הצורך על-ידי בחירה או 'דימות כללי' (רזולוציה טמפורלית המרחבי/נמוך גבוה) או במצב 'קרדיולוגיה' (רזולוציה טמפורלית המרחבי/גבוהה נמוך). עבור הרץ 0.33 < HR < 1 הרץ להשתמש ברזולוציה הטמפורלית של 50 מסגרות לשנייה שהושג ברזולוציה גבוהה המרחבי ('דימות כללי') המאפשר מחזור הלב מחדש לשלבים ברורים 50-150.
    5. התאמת 'רווח 2D' לרמה שבו מבנים אנטומיים הם בקושי לזיהוי בתמונה B-מצב raw (~ 5 dB) כדי להגדיל את האות ל רעש-יחס-בתוך המרתף הסופי.
    6. לכל פרוסה (שלב z), להקליט ≥ מסגרות 1,000.
    7. לתרגם מתמר צעד z אחד בכל פעם, למשל, 20 מיקרומטר, או 50 מיקרומטר, וחזור הקלטה עד לב האזור כולו מכוסה.
  2. שחזור תלת-ממד (הקבצים המשלימים 13 ו- 14).
    1. ייצוא רכישות לתוך הדמיה דיגיטלית ותקשורת ב רפואה DICOM (endian הקטן).
      הערה: כל פרוסה המכיל מספר מוגדר של מסגרות להלחין קובץ בודד.
    2. קובעים מספר המסגרות במחזור הלב מלא. כפי HR יכולים להשתנות לאורך זמן, לקבוע זה גם את הראשון וגם את הפרוסה האחרונה. להגדיר את המספר הגבוה ביותר של מסגרות לכל מחזור כפי הערכת העליון הראשונית של החלטה בשלב זה יכול להיות מאוחר יותר מופחת (שלב 6.2.8).
    3. לקבוע גבולות החיתוך, בלו שטח לא רלוונטי סביב החלון B-מצב.
      הערה: גבולות אלה צריכה להיות קבועה לאורך כל פרוסות.
    4. להמיר תמונת צבע RGB 32 סיביות.
    5. לחשב את ערך הקורלציה (ג) לכל אחת מהמסגרות הערימה, מספר המסגרות כלולה במחזור הראשון של הלב באמצעות הנוסחה:
      Equation 6(6)
      הערה: כאן Equation 7 הוא עוצמת האות של הפיקסל ב קואורדינטות (אני, j) בתמונה הראשונה Equation 8 והיא זהה בתמונה השנייה, Equation 9 , Equation 10 , Equation 11 , Equation 12 בעוצמה מרושע, תקן סטייה, בהתאמה, של התמונה הראשונה והשניה השוואה, ו- I ו- J נמצאים המספרים של עמודות ושורות בתמונה. מערך כתוצאה של ערכי המתאם יהיה בגודל של המכפלה של מספר המסגרות בכל מחזור הלב ואת המספר הכולל של מסגרות לכל פרוסה (למשל, 75 × 1000 = 75,000 באיור8) (ראה לדוגמא קובץ ה-script Supplementary קובץ 16). הערך המתאם אין אפשרות לחשב אם אחד או שני של תמונות להשוואה יש סטיית תקן של ערכי פיקסלים של אפס, אך זה מאוד לא סביר בתמונות ultrasonographic.
    6. לזהות מקומית מקסימה מערך הערכים קורלציה (איור 8A, ראה למופת קובץ ה-script 17 הקבצים המשלימים לזהות באופן אוטומטי maxima המקומי).
    7. לחשב ממוצע ריבועי Q(AVG) של מסגרות עם ערכי המתאם שיא (קרי, התאמת שלבי הלב) תוך שימוש בנוסחה:
      Equation 14(7)
      כאשר N הוא המספר הכולל של מסגרות עם התאמת שלבים הלב, Equation 15 זה את העוצמה של הפיקסל ב קואורדינטות (אני, j) של תמונתה nו- Equation 16 הוא הממוצע האריתמטי הטמפורלי של Equation 17 של תמונתה n(ראה script למופת 18 הקבצים המשלימים).
    8. חזור על שלב 6.2.3-6.2.7 עבור כל הפרוסות.
    9. בחרו פרוסה (הפניה פרוסה) עם לזיהוי מבנים אנטומיים (למשל, אמצע-חדרית) ולבדוק אם ההרכב המשוחזרת בממוצע מחזור לב אחד מקביל מחזור אחד בדיוק (כלומר, אם יש נוספת שלבים וכתוצאה מכך מחזור לב אחד או יותר). מחק שלבים נוספים להניב מחזור הלב בדיוק אחד (למשל, הולך מן overestimated 75 שלבים/מחזור (במציאות, מחזור 1.07) באיור 8 מחזור אחד המכיל 70 שלבים באיור8).
    10. על הפרוסה שכנות (מבחן פרוסה), סוג ההרכב בממוצע מחזור לב אחד t-מחסנית לתוך התאמה שלבים לב עם הפרוסה הפניה באמצעות הנוסחה ערך הקורלציה (משוואת 6) (ראה למופת סקריפטים ב- 19 קובץ משלים ואת קובץ משלים 20).
      הערה: למרות שתי פרוסות לא זהים לא יופיעו דומה לחלוטין בשלב כלשהו במהלך מחזור הלב, סמוך פרוסות עם גודל צעד קטן מספיק (למשל, מיקרומטר 20 או 50 מיקרומטר) יש מבטאים את הדמיון וכתוצאה מכך המתאם maxima ערך זה יכול להיות מתורגם תואם שלבים.
    11. חזור על שלב 6.2.9-6.2.10 עבור כל הפרוסות.
    12. לכווץ את השיקום כולו 3D תלת-ממד מתויג קובץ תמונה בתבנית יחידה (. TIF) המכיל z פרוסות ומסגרות t או לתוך ערימה של קובצי DICOM.
      הערה: הנתונים יכול להיות מנופה בכל ממד כדי להקטין, להגדיל את יחס אות לרעש ולהפיק נתונים isotropic (רזולוציה בתוך המטוס הוא בדרך כלל גבוה יותר מרזולוציית out-של-מטוס מספר קיפולים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שטח Intrapericardial אקסולוטל מקסיקני תלויה בגודל של החיה. חיות קטנות יותר (2-20 גרם, 7-15 ס מ) יהיה עודף של נוזלים סביב הלב (הופעה בחושך אקוקרדיוגרפיה) המקיפים שהלב צ'יימברס ואילו בבעלי בגרו גדול (> 20 גרם, > 15 ס מ) התאים לכבוש את רוב intrapericardial שטח. כדי לספק סקירה הטוב ביותר עבור התוצאות נציג של נופים echocardiographic של הלב אקסולוטל מקסיקני, חיים קטן יותר (10 גרם, 10 ס מ) הוחל עבור איור 3, איור 4, איור 5 איור 9.

תצוגת ציר זמן בדרך כלל מספק תמונה כללית של הלב אנטומיה ב אקסולוטל מקסיקני. הנכנסים המטוס קו האמצע עם סינוס venosus, אטריה, חלק הנוזלים במישור (איור 3 א, ב, 2 הקבצים המשלימים), המטוס חדרית (איור 3C–H) או המטוס פרפור (איור 4A –D) ניתן להגיע באמצעות תרגום מתמר ימינה או שמאלה של החיה, בהתאמה. הנוזלים יופיע כדורית, והוא מאוד trabeculated (איור 3C, 3 הקבצים המשלימים–5), ואילו אטריה יש צורה יותר סדיר, כמעט אין trabeculation (איור 4A, הקבצים המשלימים 6, הקבצים המשלימים 7). תצוגת ציר קצר (איור 5A, ב', 10 הקבצים המשלימים) מספק סקירה פחות בקלות interpretable של האנטומיה הלב של אקסולוטל מקסיקני הלב, אולם היא תורמת ההערכה של התכווצות הלב הנכון (למשל אזורי infarcted או אי-מתקשרת הנוזלים מעגלית הם דמיינו בבירור במטוס הזה תצוגה). בתוך המטוס תצוגת ציר זמן, המרכז של מערכת יצוא ממוקם צמוד למרכז הנוזלים (איור 2 א, והשווה 3C איור עם איור 4E ו- 3 קובץ משלים עם 8 הקבצים המשלימים ). מאז הרקמות הרכות של מערכת יצוא יהיה מרגש ברגע הפליטה דם, האות דם בעוצמה גבוהה במהלך מחזור לב נמדדת גל הדופק דופלר לציר הארוך והן את המטוס paragill עקיפה להיות adjoined על ידי רעש בעצימות נמוכה תנועות של הרקמות הרכות שמסביב (התחום האפור שמסביב לבן בתוך עקומת מהירות/שעה 4G איור , איור 5E). באופן כללי, הניגוד בין אות הדם לבין רקמות רכות רעש וצריכה להיות מספיק גדולה פלח החוצה רק את האות דם כאשר מודדים את מהירות זמן האינטגרל (איור 4G (g1 הגדלה), דמות 5E (e1 הגדלה)).

עבור הערכה איכותית של דפוסי זרימת דם, דופלר צבע ולספק כוח הדמיה דופלר חזותיים של תבניות זרימה בתאי הלב שונה (החדר: איור 3E–H, 4 קובץ משלים, הקבצים המשלימים 5; אטריה: איור 4 C, D, 7 הקבצים המשלימים; מערכת יצוא: 4F איור, איור 5 D, 9 הקבצים המשלימים, 12 הקבצים המשלימים).

Axolotls משמש מעבדה לניסויים להשתנות בגודלו פוסט בשלב הזחל של 2-4 גרם לבגרות מלאה ב 10-30 g, חיות גדולות שקילה > 100 g. בדומה לכך, מספר הערכים המוחלטים של תפקודי הפרמטרים המתוארים כאן ותפקוד הלב תלויות על הגודל של בעלי החיים. בדרך כלל, שינוי אזור השבר הוא קבוע בקבוצות גודל שונה בערכים החל ב- 40-50% (מוטה כלפי ערכים נמוכים יותר לבעלי-חיים גדולים יותר). נפח פעימה תלויה מאוד בגודל של החיה, קרי, בגודל של הלב, הנע בין , למשל , µL 20-30 ב 5 g axolotls 50-70 µL ב- 10 גרם axolotls, 250-300 µL ב 50 גרם axolotls. קצב הלב, לאמצעי אחסון שבץ תואר הם תלויים במידה רבה ההרדמה יישומית ורמת הרדמה (איור 6A–F, איור 7).

ניתוח אינטרה/בין-operator/הצופה מסורתי כוללת ייצוגים גרפיים (Q-Q מגרשים, בלאנד-אלטמן מתווה) ובדיקה עבור ממוצע שווה (t-מבחן) ואת השונות (F-מבחן) כדי להעריך את התפלגות נורמלית של נתונים וכדי להשוות דיוק ונכונות בין שני אנשים (איור 6G).

אקוקרדיוגרפיה תלת-ממד מוסיף מימד נוסף (z או עומק) רכישת דו-ממדית מסורתית יותר. דבר זה מאפשר ורב מישורי ויזואליזציה של נתונים (איור 9 א), reslicing (איור 9B), שטח ונפח שחזורים (איור 9C 13 הקבצים המשלימים, 14 הקבצים המשלימים) פילוח ו דור של דגמי תלת-ממד (איור 9 ג, 15 הקבצים המשלימים).

Figure 1
איור 1. הכנה של המיטה, מיכל אקוקרדיוגרפיה של מרדימים, unanesthetized אקסולוטל מקסיקני. פיסת בד רך (א) A מקופלים פעם אחת והתגלגל לכושר "בוריטו". (B) הקצוות נטוי לאחור והדביקו כדי ליצור מיטה בצורת שפתיים עבור אקסולוטל מקסיקני במהלך סריקה מתחת למים. (ג) עבור אקוקרדיוגרפיה 2D and 3D של אקסולוטל מקסיקני anesthetized, החיה הוא הניח בעדינות במצב פרקדן על האתר של השפה בצורת מיטה ו קבוע עם גומיות השתלטה על האזור אמצע-הלסת, עצם העצה. (יח, E) ערסל מוכן לחתוך חור מרובע. חתיכת פוליסטירן מוקצף, מקליטה ניילון נצמד למשטח העליון. (F) עבור אקוקרדיוגרפיה 2D של אקסולוטל מקסיקני unanesthetized, החיה הוא הניח במצב שכיבה טבעי בערסל ו ניגש עם טיפ מתמר מקורה ג'ל מ מתחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. מתמר מיקום. (A, B) מודל של רשת עורקים ב אקסולוטל מקסיקני המיקום המשוער של המתמר על ציר זמן, תצוגת ציר קצר (A) ותצוגת paragill עקיפה (B). (ג) Transillumination עם מקור אור חזק קר יוכלו לסייע לך למצוא את המיקום המדויק של חדרי הלב לפני החלת המתמר (ראה 1 קובץ משלים). קיצורים אנטומיים: A, אטריה; OFT, יצוא בדרכי; SinV, סינוס venosus; V, החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. ציר זמן נציג נופים echocardiographic הנוזלים. (A, B) ציר זמן אופייני קו האמצע תצוגה במצב B (קו צהוב איור2 א) חדרית דיאסטולי (A), סוף סיסטולי שלבים (B) (ראה את 2 הקבצים המשלימים עבור ייצוג וידאו). (C, D) תצוגת ציר זמן של החדר במצב B (קו שחור איור2 א) חדרית דיאסטולי (C) ו סוף סיסטולי שלבים (D) (ראה את 3 הקבצים המשלימים עבור ייצוג וידאו). (HE–) המטוס נוף דומה כמו (A) ו- (B) בצבע דופלר (CD), בחשמל דופלר (PD) הממחיש את הדם לזרום (ראה משלים קובץ 4 ו- 5 הקבצים המשלימים עבור ייצוג וידאו של CD ו- PD-מצב, בהתאמה). הצבעים אדום בתמונות CD-מצב מצביעים על דם זורם לכיוון המתמר ולציין צבעים כחולים ההפך. תאי הלב וזרימת הדם הודגשו עם קווים מנוקדים. קריקטורות שנוספו ב- (א) והמיקום של הצג (C) של מתמר ותרגום ביחס האמצע ציר זמן הצג. קיצורים אנטומיים: A, אטריה; DC(L), נשאר צינור הלבלב Cuvier; OFT, יצוא בדרכי; SinV, סינוס venosus; V, החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. נוף echocardiographic נציג ציר זמן של אטריה יצוא בדרכי. (A, B) ציר זמן מבט אטריה במצב B (קו ירוק איור2 א) פרפור דיאסטולי (A), סוף סיסטולי שלבים (B) (ראו 6 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). (C, D) המטוס נוף דומה כמו (A) ו- (B) במצב דופלר (CD) צבע הממחיש את הדם לזרום (ראו 7 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). תצוגת ציר זמן (E) של מערכת יצוא במצב B (קו כחול איור2 א) בשלב אמצע הפליטה (ראו 8 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). F: המטוס נוף דומה כמו (E) בדם המפגינים CD-מצב זרימה (ראו 9 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). (G) המטוס נוף דומה כמו (E) ו- (F) במצב דופק גל דופלר (PW) המאפשר חום קצב מהירות וזיהוי נפרד (VTI) ומדידת זמן לחישוב נפח שבץ. הצבעים אדום בתמונות CD-מצב מצביעים על דם זורם לכיוון המתמר ולציין צבעים כחולים ההפך. תאי הלב וזרימת הדם הודגשו עם קווים מנוקדים. ראשי חץ צהוב ואדום עולה semilunar שסתומים בספריית הבסיס של מערכת יצוא ועל השסתום ספירלה במערכת יצוא, בהתאמה. קריקטורות שנוספו ב- (א) והמיקום של הצג (E) של מתמר ותרגום ביחס האמצע ציר זמן הצג. קיצורים אנטומיים: A(R), אטריום ימין; A(L), עזב אטריום; OFT, יצוא בדרכי; SinV, סינוס venosus; V, החדר; VC, הנבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. ציר קצר נציג ונוף echocardiographic paragill עקיפה של החדר ואת תזרים דרכי. (A, B) מבט קצר ציר הנוזלים במצב B (קו אפור איור2 א) חדרית דיאסטולי (A), סוף סיסטולי שלבים (B) (ראו 10 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). (ג) תצוגה paragill עקיפה של מערכת יצוא במצב B (קו סגול באיור 2B) בשלב אמצע הפליטה (ראו 11 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). (ד) המטוס נוף דומה כמו (C) בדם המפגינים CD-מצב זרימה (ראו 12 הקבצים המשלימים ייצוג וידאו). (E) המטוס נוף דומה כמו (ג) ו- (ד) במצב דופק גל דופלר (PW) המאפשר חום קצב מהירות וזיהוי נפרד (VTI) ומדידת זמן לחישוב נפח שבץ. הצבעים אדום בתמונות CD-מצב מצביעים על דם זורם לכיוון המתמר ולציין צבעים כחולים ההפך. תאי הלב וזרימת הדם הודגשו עם קווים מנוקדים. קריקטורות שנוספו ב- (א) והמיקום של הצג (C) של מתמר ותרגום ביחס האמצע ציר זמן הצג. קיצורים אנטומיים: A, אטריה; OFT, יצוא בדרכי; SinV, סינוס venosus; V, החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. נציג תוצאות מדידות נפח קצב לב ושבץ, השפעת ההרדמה, וניתוח פנימי/בין-operator/הצופה נציג. (A–C) קצב הלב (HR) ביחס unanesthetized בסיסית להתוות לאורך זמן (הו הוא-הרדמה מלאה) עבור שישה axolotls ומורדמת בנזוקאין (), MS-222 (B) ו propofol (C). (נד–) קו אמצעי (SV) ביחס unanesthetized בסיסית המותווים לאורך זמן (הו הוא-הרדמה מלאה) עבור שישה axolotls ומורדמת ב בנזוקאין (D), MS-222 (E), ואת propofol (F). (G) ניתוח אינטרה/בין-operator/הצופה של נפח פעימה. מתווה בלאנד-אלטמן [(Dif) לבין מפעילי (Op) / משקיפים (מכשול) להתוות נגד ממוצע (Avg)] צריך לחשוף את האפליה השיטתית אין במידות בדרך כלל מבוזרים (Q-Q מתווה) מתקבל על ידי מפעילי שונים הרב-לאומי. בדיקות עבור ממוצע שווה (t-מבחן), שונות שווה (F-מבחן) לחשוף אין הבדלים משמעותיים בין מפעילי/משקיפים (הטבלה השמאלית התחתונה). A - F שונה מחומר זמין תחת רישיון ייחוס מלאי יצירתי (איור 1 של Thygesen. et al. 21)- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. השוואה של נפח פעימה העריך את גיאומטריים, גל הדופק שיטת דופלר. השוואה של נפח פעימה (SV) מוערך על ידי מדידות גיאומטריות (geo) B-מצב דו מימדי או דופק גל דופלר מדידות על המהירות של דם יציאה מערכת יצוא. SV(geo), SV(pw) מובא בספר החיות באותה שש שניות בין סוגי מדידה שני באמצעות שלושה חומרי הרדמה שונים, בנזוקאין (ריבועים מוטה כחול), MS-222 (ריבועים אדומים), ואת propofol (משולשים ירוקים) עם שבוע אחד של התאוששות בין החלת את חומרי הרדמה שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8. נציג תמונה ייתכן מיתאם עבור תלת-ממד אקוקרדיוגרפיה. (א) עקומת ייצוג ערכי המתאם לא הניבה של פעולת המתאם ב- dataset cine 1,000 מסגרת עם מסגרות 75 לכל מחזור הלב. שתי מסגרות עם הבדלים קטנים בלבד, המציין תואם שלבים הלב, תניב ערך קורלציה גבוהה. לאחר מכן maxima מקומיים אלגוריתם חיפוש יכול להיות מיושם על נתונים כדי לזהות כל מסגרות תואמות. (B) ייצוג גרפי של אותם נתונים כמו (A). כאשר מיתאם הערכים מתקבלים על-ידי השוואת מחזור הלב הראשון עם הערימה כולה cine, קווים אלכסוניים של המתאם המרבי להצביע על התאמת שלבי הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9. אקוקרדיוגרפיה 3D נציג. (א) תצוגה רב מישורי לב תלת-ממד אקסולוטל מקסיקני המשוחזרת. ההליך המתאם ייתכן התמונה מאפשרת את שיקומה של מחזור מלא לב עם מספר שלבים ברורים (כאן 70 שלבים) בשלושה ממדים מרחביים זה יכול ואז נפרס כמו אלה לחקירה הרצוי התופעות ייתכן ב הלב הפועם. (B) 3 פרוסות חציה של 115 המשוחזרת פרוסות נתוני תלת-ממד. ריבועית ממוצע של הליך משפרת את החדות דם-כדי-רקמות, מוריד את יחס אות לרעש המאפשרות הערכה טובה יותר של הטבע trabeculated הנוזלים אקסולוטל מקסיקני, פריט חזותי ברור של מחצה interatrial ו שסתומים במערכת העיכול יצוא. (ג) פני שטח ונפח ייצוגים של הלב הפועם על שלושה שלבי לאורך צבע מקודד מקוטע מודל (ראה משלים קובץ 13 ו -14 הקבצים המשלימים עבור וידאו ייצוגים של השטח ושל נפח שניתנו פועם לב ו- 15 הקבצים המשלימים עבור תלת-פאזי מקוטע אינטראקטיביים דגם תלת-ממד). קיצורים אנטומיים: A, אטריה; Cau, סימטרית; Cra, הגולגולת; דקס, דקסטר (אל החיה נכון); דור, הגבי; OFT, יצוא בדרכי; חטא, מרושע (לבעלי משמאל); SinV, סינוס venosus; V, החדר; אני כאן, הגחון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1. Transillumination לאיתור תאי הלב,אקסולוטל מקסיקני. ראה איור 2C. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2. ציר זמן, קו האמצע תצוגה, B-מצב. ראה איור 3. א., B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 3. ציר זמן, תצוגה חדרית, B-מצב. ראה איור 3C, D. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 4. ציר זמן, תצוגה חדרית, מצב דופלר צבע... ראה איור 3E, F. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 5. ציר זמן, תצוגה חדרית, מצב כוח דופלר. ראה איור 3G, H. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 6. ציר זמן, תצוגה פרפור, B-מצב. ראה איור 4A, B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 7. ציר זמן, תצוגת פרפור, דופלר צבע מצב. ראה איור 4C, D. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 8. . ציר זמן, יצוא בדרכי נוף, B במצב ראה איור 4E. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 9. ציר זמן, יצוא בדרכי נוף, דופלר צבע במצב. ראה איור 4F. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 10. קצר ציר, תצוגת חדרית, B-מצב. ראה איור 5A, B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 11. Paragill עקיפה, יצוא בדרכי נוף, B-מצב. ראה איור 5C. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 12. Paragill עקיפה, יצוא בדרכי נוף, דופלר צבע במצב. ראה איור 5D. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 13. עיבוד פני שטח תלת-ממדי בלב פועם 70 שלבים (19.6 ms רזולוציה טמפורלית). ראה איור 9C. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 14. נפח תלת מימדי עיבוד בלב פועם 70 שלבים (19.6 ms רזולוציה טמפורלית). ראה איור 9C. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 15. מודל תלת-ממדי אינטראקטיבי בלב פועם ב-3 שלבים: סוף חדרית-סיסטולה, הוצאה ventricular אמצע סוף חדרית-סיסטולה. ראה איור 7C. צריך להיות שנצפו בקובץ PDF אינטראקטיביים ב- Adobe Acrobat Reader 9 ומעלה. כדי להפעיל את התכונה ' תלת-ממד ', לחצו על הדגם. באמצעות הסמן, עכשיו זה אפשרי לסובב, להגדיל, פאן המודל, בעץ הדגם כל המקטעים של המודל יכול להיות הפך הפעלה/כיבוי או גרם שקוף. עץ הדגם הוא הירארכיה המכיל מספר שכבות משנה זה יכול להיות פתח (+). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 16. נציג מבואר script לחישוב הערך המתאם של רכישת 1,000 מסגרות עם הערכה העליון של מחזור 75 מסגרות/לב. התסריט נכתב בשפה מאקרו IJ1, יכול להיות מיושם של מאקרו אצווה ב- ImageJ לחישוב ערכי המתאם (75,000 לכל רכישה) על פני כולו z-ערימה של נתוני תלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 17. התסריט נציג לצורך זיהוי אוטומטי שיא בסדרה של המתאם ערכים מ רכישת 1,000 מסגרות עם הערכה העליון של מחזור 75 מסגרות/לב. הסדרה של ערכי המתאם (עמודה B, מסומן בצהוב) יכול להיות מוחלף, לאחר הפעלת המאקרו (Ctrl + r) תהיה הרשימה של פקודות בחר התאמה שלבים לב ולבצע חישוב ממוצע ריבועי מוצגים (Q עמודה, מסומן בירוק). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 18. נציג מבואר script כדי לבחור תואם שלבים לב ולבצע בממוצע ריבועית רכישת 1,000 מסגרות עם הערכה העליון של מסגרות/לב 75 מחזור (Q עמודה 17 הקבצים המשלימים). התסריט נכתב בשפה מאקרו IJ1, יכול להיות מיושם כפי מאקרו ב ImageJ להקים אנסמבל בממוצע פרוסה אחת של 2D מחזור (75 שלבים). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 19. נציג מבואר script לחישוב הערך קורלציה בין פרוסה הפניה מסגרות 70 פרוסה מבחן סמוכים מסגרות 75. התסריט נכתב בשפה מאקרו IJ1, יכול להיות מיושם של מאקרו ב- ImageJ לחישוב ערכי המתאם (5,250). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 20. נציג Excel script עבור זיהוי אוטומטי שיא בסדרה של המתאם ערכים מהשוואה בין פרוסה הפניה מסגרות 70 פרוסה מבחן סמוכים מסגרות 75. הסדרה של ערכי המתאם (בעמודה C, מסומן בצהוב) יכול להיות מוחלף ומוצגים לאחר הפעלת המאקרו (Ctrl + t) הרשימה של פרוסות שייבחר כמו substack בתוך הפרוסה המבחן יהיה (עמודה L, שורה 2, מסומן בירוק). Substack פרוסה הבדיקה תהיה במרחב התאמה למסגרות הפרוסה הפניה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אקוקרדיוגרפיה את אקסולוטל מקסיקני, מינים אחרים שאינם מידע יונקים מניבה נתונים שונים באופן מהותי מאשר אקוקרדיוגרפיה יונקים בגלל אופיו nucleated של תאי דם אדומים גולגולת כל פרט יונקים בוגרים. התוצאה ב אות הדם בולטת ופחות דם-כדי-רקמת ניגודיות בתמונות echocardiographic אקסולוטל מקסיקני בהשוואה למשל, עכבר או אקוקרדיוגרפיה אנושי. זה יכול להקשות סגמנטציה על תמונות אולטרסאונד פריים אחד לא מעובד כפי שהוא יכול להיות קשה להבחין דם מרקמות. עם זאת, תופעה זו יכולה להיות יתרון כאשר נעשה שימוש ליצירת דם אות משופרת על-ידי החלת את ריבועית ממוצע של ההליך שתואר לעיל18 ותמונות שונה עבור אקסולוטל מקסיקני אקוקרדיוגרפיה פרוטוקול סעיף 6. מאז דם ספאקלס דינמית יותר מאלה שנמצאו רקמה רכה, חישוב ממוצע ריבועי יפיק ניגוד בולט בין אלה שני תאים אשר מקלה על סגמנטציה שניים או שלושה מימדים.

פרוטוקול זה מתאר שלושה הרדמה שונים עבור אקסולוטל מקסיקני שעברו ביסודיות נבדק בעבר21. בנזוקאין והן MS-222 לעורר עלייה בקצב הלב, אשר יכול להיות רצוי בעת בדיקת הלב תפקוד בתנאי לחץ. Propofol גורם פחות מתח אל הלב במהלך ההרדמה, עשוי לשמש החלפה עבור אקוקרדיוגרפיה unanesthetized במצבים איפה רכישת זמן חורג ממגבלות התנהגות בישיבה ב- unanesthetized axolotls.

אקוקרדיוגרפיה 2D המתארת את הלב 3D מושפע הסובייקטיביות. לכן, זה הכרחי כדי התנהגות וניתוח פנימי/בין-operator/הצופה לפני ביצוע ניסוי בפועל כפי שמתואר פרוטוקול סעיף 5. באופן דומה, מדידות echocardiographic צריך להיות שנצפו יותר כערכים אינדקס שניתן להחיל לחקור פוטנציאליים הבדלים בתפקוד הלב תחת נסיבות שונות מאשר הערכים המוחלטים. נפח פעימה נקבעים על-ידי המשוואה גיאומטריים (משוואה 2) לעיתים רחוקות התשואות זהה לערך המוחלט הגל פולס דופלר המשוואות (משוואה 4; איור 7), וזה צריך להיות החליט אשר למדוד לדבוק לאורך סדרה של ניסויים. SV(geo) ניתן להשיג במהירות רבה יותר מאשר SV(pw), אולם ההנחה כדורית של הצורה חדרית חל רק בריא בצורה אחידה קבלנות לבבות, ויש דגמים מחלות והתחדשות, להתייחס SV(pw) עבור השתקפות טובה יותר על אמצעי האחסון קו נכון.

ניתן להטמיע את המתאם ואת ריבועית ממוצע של נוהל של הפרוטוקול סעיף 6 מספר הדמיה שונים וחבילות מתמטית. מאחר תיכנות מיומנויות וגישה חבילות תוכנה להשתנות במידה רבה בתוך חוקרי מדעי החיים, לנו יש חתרו לעבר מתן סקריפטים נציג השיטות בחבילות תוכנה כי רוב החוקרים מוכרים (למשל, Excel) כי הם בקלות התקרב וזמין באופן חופשי (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). הקבצים המשלימים 16 - 20 מספקים המבואר המופת שנכתבו בשפה מאקרו IJ1 וכן פקודות מאקרו. xlsm, צריכה להיות מובנת אפילו עם ניסיון מינימלי קידוד.

התחדשות לב מהותי הוא תופעה אך ורק מצא בליבם של מינים קטנים (ביחס האדם), ובכך ומדידות, הדמיה של תפקוד הלב בסיסית והתקדמות תפקודית במהלך התחדשות קוראים תיגר על ידי גודל הלב, הרזולוציה המרחבית של המודאליות הדמיה מוחל. תדר גבוה אולטראסאונד הדמיה מספקת פשרה רצוי בין רזולוציה מרחבית גבוהה בתוך המטוס (~ 30 x 30 מיקרומטר2 -50 מגה-הרץ) זה להשוות ויוו µCT הדמיה, גבוהה בהרבה מזו ויוו µMRI, אשר יש עומק של חדירה (~ 1 ס מ- 50 מגה-הרץ) כמה לקפל גדול יותר מיקרוסקופיה קונפוקלית, רזולוציה טמפורלית גבוהה מאוד (50-300 מסגרות/s-50 מגה-הרץ, 1 ס מ עומק). יחד עם תנועת מימד ידנית או אוטומטית z המתמר, סאונד מאפשר שחזור ללא תחרות של תפקוד הלב ועיצוב אנטומי ב-4 מימדים. בנוסף, הטבע לא פולשנית של הטכניקה מאפשר לניסויים האורך. לידע שלנו זמינים כעת לא מתמרים מערך מטריקס עבור הדמיה מיקרו אולטרסאונד בתדירות גבוהה. ההתפתחות של הטכנולוגיה הזו לסייע מאוד את הרכישות של נתוני תלת-ממד של לבבות קטנים כמו זה של אקסולוטל מקסיקני בהליך מהיר יותר מאשר מכנית העברה המתמר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות קספר הנסן, מכון Bioscience, אוניברסיטת אהרחוס למתן גישה, בסיוע micromanipulator אלקטרוניים עבור רכישת echocardiographic תלת-ממד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

רפואה גיליון 141 אקוקרדיוגרפיה אולטרסאונד לב לב בדיקת אולטרה סאונד התחדשות אקסולוטל מקסיקני Ambystoma mexicanum ייתכן התמונה המתאם
אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter