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Medicine

Ecocardiografia 2D e 3D nell'Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Qui presentiamo protocolli di ecocardiografia per acquisizione di immagini bidimensionali e tridimensionali del cuore pulsante della Salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), una specie di modello nella rigenerazione del cuore. Questi metodi consentono la valutazione longitudinale della funzione cardiaca ad alta risoluzione spazio-temporale.

Abstract

Disfunzione cardiaca a seguito di malattia di cuore ischemica è una sfida importante, e terapie rigenerative al cuore sono in forte domanda. Qualche specie di modello come zebrafish e salamandre che sono capaci di rigenerazione intrinseca cuore tengono la promessa per future terapie rigenerative per pazienti umani. Per valutare il risultato degli esperimenti di cardioregenerative che è di importanza fondamentale che la funzione del cuore possa essere monitorata. La Salamandra axolotl (a. mexicanum) rappresenta una specie di modella ben affermata in biologia rigenerativa raggiungendo dimensioni che permette per la valutazione della funzione cardiaca. Lo scopo del presente protocollo è quello di stabilire metodi per misurare riproducibile funzione cardiaca nell'axolotl usando l'ecocardiografia. L'applicazione di differenti anestetici (benzocaina, MS-222 e propofol) è dimostrato, e l'acquisizione di dati ecocardiografici (2D) bidimensionali in entrambi anestetizzati e non anestetizzata sveglia Axolotl è descritto. 2D ecocardiografia del cuore tridimensionale (3D) possa soffrire di imprecisione e soggettività delle misurazioni e per alleviare questo fenomeno un metodo solido, vale a dire analisi intra/inter-operator/osservatore, per misurare e ridurre al minimo questa polarizzazione è ha dimostrato. Infine, è descritto un metodo per acquisire dati 3D ecocardiografici del cuore pulsante axolotl a altissima risoluzione spazio-temporale e con marcato contrasto di sangue ai tessuti. Nel complesso, questo protocollo dovrebbe fornire i metodi necessari per valutare la funzione cardiaca e anatomia modello e dinamiche nell'axolotl usando la formazione immagine di ultrasuono con applicazioni in biologia rigenerativa ed esperimenti fisiologici generali di flusso.

Introduction

Cardiopatia ischemica è una causa principale di morte in tutto il mondo1,2. Anche se molti sopravvivono un infarto miocardico dovuto intervento medico rapido e messo a punto, episodi ischemici in esseri umani spesso portano a cicatrici fibrotiche associato a ipertrofia, malfunzionamento elettrico e una diminuita capacità funzionale del cuore . Questa mancanza di potenziale rigenerativo del tessuto cardiaco è condivisa tra mammiferi e sebbene affermazioni controverse di mammiferi rigenerazione cardiaca sono stati segnalati, questi sono stati limitati a ceppi murini specifici3,4 e ipossia trattato topi5. Così, il campo della biologia e della medicina rigenerativa cardiaca è generalmente limitato a mammiferi modelli animali per lo studio dei fenomeni rigenerativi cuore intrinseca. Nell'ultimo decennio il danio zebrato (Danio rerio) è stato stabilito come il modello più ben caratterizzato per cuore intrinseca rigenerazione6,7,8,9,10 . A causa di manutenzione facile di laboratorio, un tempo di generazione breve e una vasta gamma di strumenti molecolari disponibili, zebrafish è ben adattato come un modello per meccanismi genetici e molecolari alla base di sviluppo cardiaco e rigenerazione. Tuttavia, le dimensioni del cuore zebrafish rendono che meno adatti per valutazione funzionale e complicati interventi chirurgici e la filogenesi non tetrapodi di zebrafish limita la ragionevole estrapolazione dei risultati in questa specie, così che giustificano l'utilizzo di altri modelli più grandi tetrapodi. Uno dei primi modelli di rigenerazione di vertebrati cuore era un anfibio caudato, newt orientale (Notophthalmus viridescens)11, una specie che rimane un prezioso modello12.

Negli ultimi anni un altro anfibio caudato, l'axolotl messicano (a. mexicanum) è entrata in scena come un grande (fino a 100 g di corpo massa) e laboratorio altamente adattabile modello animale per una vasta gamma di discipline rigenerative che abbracciano la rigenerazione degli arti, ferita del midollo spinale e rigenerazione cardiaca13,14,15,16,17. L'axolotl è altamente suscettibile di misure funzionali sul cuore usando l'ecocardiografia ad alta frequenza e l'assenza di strutture calcificate sul lato ventrale del cuore permette per imaging con un livello molto più basso di artefatti dell'immagine (acustici a ultrasuoni shadowing e riverbero in particolare) rispetto a quanto osservato in altri modelli animali con calcificato sterno e costole.

Il seguente protocollo descrive diversi metodi e preparazioni (Figura 1, Figura 2) per acquisire misurazioni ecocardiografiche riproducibili sul cuore axolotl in entrambi anestetizzati (applicando tre anestetici differenti: benzocaina, MS-222 e propofol) e non anestetizzata sveglia animali in due (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, File supplementari 1-12) e tre (Figura 8, Figura 9, File supplementari 13-14) dimensioni spaziali. Il cuore di anfibio è Triplex (due atri e un ventricolo unico). Gli atri sono forniti da un grande seno venoso e il ventricolo sfocia nel tratto di efflusso del cono arterioso (Figura 2). Poiché la maggior parte enfasi è tradizionalmente collocato sulla rigenerazione ventricolare e meno sul recupero di atria6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, questo protocollo si concentra principalmente sulle misurazioni della funzione ventricolare.

L'ecocardiografia anfibio non è ben descritto nella letteratura, e lo sviluppo dei metodi 2D descritti in questa carta sono stati guidati dalla necessità rappresentare al meglio la funzionalità del cuore axolotl in un dato momento e impostazione sperimentale. Così, i metodi descritti qui sono applicabili negli esperimenti rigenerativa cuore dove la funzione cardiaca può essere controllata più volte nel corso di un processo di rigenerazione. Inoltre, i metodi possono essere applicati nella cardiophysiological esperimenti sull'axolotl in generale o modificati leggermente per estendersi su altri modelli di anfibio Caudati o anuri (e.g.,Xenopus). L'axolotl esiste in diversi ceppi diversi e variazioni di colore (ad es., wildtype, melanoid, bianco, albino, transgenico bianco con l'espressione della proteina di fluorescenza verde), tuttavia queste caratteristiche non influiscono sulla compatibilità della Axolotl con il protocollo descritto. Il metodo qui descritto per acquisire dati ecocardiografici 3D è una versione modificata della tecnica di correlazione (STIC) spatiotemporal immagine sviluppata per ecografia clinica e quadratica media metodo descritto in precedenza nel pollo in via di sviluppo a che permettono di migliorare il segnale delle macchioline di sangue nei tessuti molli nelle specie contenenti globuli rossi nucleati18,19. Questo metodo consente la modellazione avanzata di contrazione cardiaca e fluidodinamica computata nel cuore axolotl.

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Protocol

Le procedure svolte in questo protocollo sono stati conformemente alla legislazione nazionale danese per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e gli esperimenti sono stati approvati dall'animale nazionale danese esperimenti Ispettorato (protocollo # 2015-15-0201-00615).

1. preparati

  1. Preparare axolotl medio.
    1. Applicare acqua di rubinetto di alta qualità non chimicamente trattati come mezzo di axolotl. Se questo non è disponibile, applicare la soluzione di 40% Holtfreter.
    2. Preparare la soluzione di 40% (wt/vol) Holtfreter sciogliendo 15,84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O e 0,288 g KCl in acqua deionizzata e filtrata fino a un volume di 1 L.
  2. Rendere gli anestetici ad immersione.
    1. Preparare soluzione anestetica di benzocaina (etil 4-aminobenzoato) sciogliendo 200mg etile 4-aminobenzoate in 3 mL di acetone e quindi sciogliere questo mix nella soluzione 1 L acqua del rubinetto o il 40% di Holtfreter.
    2. Preparare soluzione anestetica di MS-222 (etil 3-aminobenzoate Acido metansulfonico, anche comunemente noto come tricane) sciogliendo Acido metansulfonico 3-aminobenzoate di 200mg etilico direttamente nella soluzione 1 L acqua del rubinetto o il 40% di Holtfreter.
    3. Preparare soluzione anestetico propofol (2,6-diisopropylphenol) sciogliendo 3,3 mg 2,6-diisopropylphenol in soluzione 1 L acqua del rubinetto o il 40% di Holtfreter. In alternativa, diluire la soluzione commercialmente premade a 3,3 mg/L.
      Attenzione: Il Propofol è un potente anestetico umano (somministrato per via endovenosa) e deve essere maneggiato con cura, tra cui in forma diluita.
  3. Preparare il letto e contenitore per l'ecocardiografia.
    1. Preparare il letto animale a forma di labbra per ecocardiografia piegare un pezzo di cm 70 x 55 di panno morbido una volta e poi trasportandola in "forma burrito" (Figura 1A). Poi piegare sopra le estremità fino a quando non si incontrano e nastro questi insieme (Figura 1B).
    2. Immergere il labbro a forma di struttura nel mezzo di axolotl per ospitare l'axolotl anestetizzato durante la formazione immagine di ultrasuono. Proteggere l'animale alla struttura e per impedire galleggiante usando elastici allentati; Posizionare questi metà-mandibular e sopra la regione sacra (Figura 1).
      Nota: Le bande di gomma non dovrebbe spremere l'animale come questo influirà emodinamica.
    3. Per 2D ecocardiografia su non anestetizzata sveglia axolotl, preparare un'amaca di ritagliarsi un 16 cm x 8 cm x 5 cm buco in un 33 cm x 27 cm x blocco di 5 cm di polistirolo espanso (ad es., un coperchio da un contenitore di polistirolo espanso di medie dimensioni) (Figura 1).
    4. Infilare un pezzo di 33 x 27 cm di involucro di plastica attraverso il foro e fissare i bordi dell'involucro per la superficie superiore del blocco di polistirolo espanso (Figura 1E) per creare un'amaca. Aggiungere il terreno axolotl a 3 cm di profondità nell'amaca. L'axolotl non anestetizzata sveglia affonderanno alla parte inferiore dell'amaca che consente un facile accesso ventrale attraverso l'involucro di plastica (Figura 1F).

2. anestetizzare Axolotl

  1. Immergere axolotl in soluzione di anestetico desiderata (benzocaina, MS-222 o propofol).
  2. Ispezionare per primi segni di sedazione, ridotti movimenti e aumentare la perdita del riflesso di raddrizzamento, questo appare entro 10 min in animali < 10 g (< 10 cm) ed entro 20 min in animali tra 10 e 50 g di massa corporea (10-22 cm).
  3. Ispezionare per completa mancanza di movimenti del corpo, movimenti di ventilazione gill e riflesso di raddrizzamento e assicurarsi che l'animale è non-responsivi alla stimolazione moderata dolore provata pizzicando la tessitura tra cifre.
    Nota: nonostante il fatto che l'anestesia generale è compiuto entro 30 min in Axolotl benzocaina anestetizzato, funzione cardiaca non è stabilizzata fino a 1h. Questo non è il caso in MS-222 o propofol anestetizzati Axolotl (Figura 6A-F).
  4. Per mantenere axolotl in anestesia generale, mantenere l'animale in soluzione di anestesia o avvolto in carta bagnata salviette bagnate nella soluzione di anestesia.
    Nota: Dato che la pelle e soprattutto le branchie sono tenute umide, l'anestesia può essere mantenuto per 7 h senza effetti negativi sul benessere dell'animale.
  5. Per risvegliare axolotl, trasferire l'animale al medium senza anestesia.
    Nota: Il primo segno del risveglio è gill ventilazione movimenti. Animale deve essere in posizione verticale e sensibili alla stimolazione entro 1 h.

3. 2D ecocardiografia su anestetizzati Axolotl

  1. Axolotl anestetizzati posto in posizione supina nel letto animale a forma di labbra (passi 1.3.1-1.3.2). Proteggere da galleggiante usando elastici sciolti (Figura 1). Assicurarsi che la superficie toracica è coperta da 3-5 mm del mezzo.
    Nota: Per un breve acquisizione (< 5 min) medium senza anestetico può essere applicato. Per acquisizione prolungato, soluzione anestetica deve essere applicato come mezzo di ultrasuono per garantire la funzione cardiaca stabile durante le misurazioni.
  2. Il trasduttore di posizione sopra la linea mediana dell'animale nella regione toracica parallelo all'asse lungo dell'animale (Figura 2A, Figura 3A-B, complementare File 2). Utilizzare la transilluminazione con una sorgente di luce fredda su bianco e albino Axolotl per garantire il corretto posizionamento del trasduttore (Figura 2 e complementare File 1).
    1. Per Axolotl < 20 g di peso, utilizzare un trasduttore 50 MHz; per Axolotl > 20g, utilizzare un trasduttore di 40 MHz. Posizionamento il senso cranico/anteriore a destra per acquisizione immagine standardizzata. Se questo non è il caso del trasduttore di rotazione 180 ° o invertire l'immagine.
  3. Assicurarsi che nella visualizzazione asse lungo della linea mediana, una piccola porzione del ventricolo (posizionato a destra nella cavità toracica, Figura 2A) visualizzato nel frame a diastole ventricolare e una grande porzione degli atri destro e sinistro (posizionato al centro / leggermente verso sinistra nella cavità toracica, Figura 2A) e il seno venoso sono visibili sia in sistole atriale e diastole (Figura 3A, B).
  4. Tradurre il trasduttore 1-3 mm verso destra dell'animale per ottenere la visualizzazione asse lungo ventricolare (Figura 2A). La posizione corretta è raggiunta quando l'area della sezione trasversale del ventricolo fine sistole è al suo massimo (Figura 3-H).
  5. In B-mode, acquisire ≥ 3 cicli cardiaci con > 50 fotogrammi/s in entrambi 'general imaging' (alta risoluzione temporale spaziale/basso) o in modalità 'cardiologia' (bassa risoluzione temporale spaziale/alto).
    Nota: Questa visualizzazione consente per la valutazione della funzione ventricolare. Funzione ventricolare può essere valutata in due dimensioni mediante la modifica dell'area di frazionaria ventricolare (FACv) calcolata dalla fine-diastolico e telesistolico croce componibile zona del ventricolo (CSAv) utilizzando l'equazione:
    Equation 1(1)
    Ventricolo di axolotl assume la forma di una sfera e un volume sistolico di geometria basata [SV(geo)] può essere calcolato utilizzando l'equazione:
    Equation 2(2)
  6. Tradurre il trasduttore lungo l'asse dell'animale fino a quando il centro del ventricolo è al centro dello schermo. Ruotare il trasduttore di 90 ° in senso orario per ottenere la vista di metà di-ventricolare asse corto (Figura 5A e B, 10 File supplementari). Valutare la forma circolare del ventricolo traducendo il trasduttore lungo l'asse del cuore.
  7. Tornare il trasduttore all'aereo di asse lungo e tradurlo indietro verso la linea mediana o leggermente a sinistra della linea mediana per ottenere la visualizzazione di due camera atriale asse lungo (Figura 2A). Assicurarsi che la posizione corretta è raggiunto confermando che le sezioni trasversali degli atrii fine sistole sono al loro maxima e gli due atri combinati assumono il contorno del numero '8' inclinato ~ 45 ° verso sinistra (fig. 4A e B, File complementare 6).
  8. In modalità B acquisire ≥ 3 cicli cardiaci con > 50 fps in modalità di 'imaging generale' o 'cardiologia'.
    Nota: Atrii di axolotl sono irregolari nella forma e funzione 3D non è possibile dedurre direttamente dai dati 2D, così la loro funzione dovrà essere valutata come una misura di indice come possibilità zona frazionale atriale (FACa) basata sull'area della sezione trasversale (CSAa) combinato di entrambi atriale chambers in sistole e diastole:
    Equation 3(3)
  9. Tradurre il trasduttore verso destra fino a quando il tratto di efflusso (cono arterioso) appare (vicino la vista di asse lungo ventricolare) (Figura 2A).
    Nota: Dopo aver lasciato il ventricolo verso l'anteriore, il tratto di efflusso fa una curva a gomito e viene eseguito in un piccolo angolo verso la superficie ventrale prima ancora assumendo un senso anteriore e frazionamento in branchiali e vasi sistemici.
    1. Assicurarsi che la vista del tratto di deflusso corretto viene raggiunto confermando che il diametro del deflusso è al suo massimo a fine-sistole ventricolare e due delle tre valvole semilunari all'ingresso del deflusso sono visibili alle Mid-espulsione (Figura 4E, File supplementari 8).
      Nota: La direzionalità ventrale verso il trasduttore della parte intermedia dell'efflusso permette misurazioni di velocità e flusso usando formazione immagine di Doppler.
  10. Applicare il colore Doppler-modalità per eseguire le velocità di flusso sanguigno nel tratto di uscita durante l'eiezione cardiaca (Figura 4F e complementare File 9). Allo stesso modo applicare colore Doppler e Power Doppler imaging per visualizzare il flusso di sangue nelle viste ventricolare e atriale (Figura 3E-H, File supplementari 4-5 e Figura 4-De 7 File supplementari).
  11. Applicare modalità Doppler Pulse Wave (PW) dalla posizione di velocità massima sanguigno nella porzione del tratto di uscita che corre verso il trasduttore.
    1. Utilizzare 'angolo a fascio' e 'correzione angolare' fino a 45 ° per regolare il deflusso non essendo completamente perpendicolare alla faccia del trasduttore (Figura 4). Assicurarsi che la posizione PW Doppler non è sovrapposta dalla valvola a spirale del deflusso durante qualsiasi fase del ciclo cardiaco (Figura 4E).
  12. In modalità Doppler PW acquisiscono dati di velocità/tempo sopra ≥ 3 cicli cardiaci.
  13. Tornare alla modalità di B e acquisire ≥ 3 cicli cardiaci all'aereo dello stesso esatto come PWV è stata acquisita.
  14. Misura il velocità tempo integrale (VTI) del flusso sanguigno nel tratto di uscita come l'area sotto la curva di velocità/tempo per uno cardiaco completo ciclo (Figura 4, g1).
    Nota: Dal VTI e il diametro (d) dell'efflusso al fine-sistole mediante l'acquisizione di B-mode, un Doppler PW volume sistolico base [SV(pw)] può essere calcolata utilizzando l'equazione:
    Equation 4(4)
    Frequenza cardiaca (HR) è misurata dalla curva velocità/tempo misurando la durata di un intero ciclo cardiaco. Gittata cardiaca [CO(pw)] viene calcolata utilizzando l'equazione:
    Equation 5(5)
  15. Ottenere la visualizzazione di paragill obliquo, una vista che offre un'alternativa per la misurazione della velocità di flusso sanguigno nel tratto di efflusso, ruotando l'axolotl 90 ° nel labbro a forma di letto in modo tale che la parte destra dell'animale sia rivolta verso l'alto (Figura 2B). Angolo e ruotare il trasduttore e la posizione parallela e appena posteriormente alle branchie sporgente (Figura 2B). Assicurarsi che la posizione corretta è raggiunto confermando che il tratto di efflusso esegue verso il basso a ~ 45 ° e che gli atri vengono visualizzati sotto il tratto di efflusso durante l'espulsione (Figura 5 C, 11 File supplementari).
  16. Applicare modalità Doppler PW dalla posizione di velocità massima sanguigno nella porzione del tratto di efflusso del scappando dal trasduttore (Figura 5, complementare File 12). Utilizzare 'angolo a fascio' e 'correzione angolare' fino a 45 ° per regolare il deflusso non essendo completamente perpendicolare alla faccia del trasduttore (Figura 5E).
  17. In modalità Doppler PW acquisire velocità sanguigno sopra ≥ 3 cicli cardiaci.
  18. Tornare alla modalità di B e acquisire ≥ 3 cicli cardiaci all'aereo dello stesso esatto come PWV è stata acquisita.
    Nota: SV(pw) e CO(pw) vengono calcolati per la vista obliqua paragill utilizzando l'equazione 4 e 5 di equazione come descritto sopra per la visualizzazione dell'asse lungo.

4. 2D ecocardiografia su Axolotl non anestetizzata sveglia

  1. Posto l'axolotl non anestetizzata sveglia in posizione prona sull'amaca (punto 1.3.3).
  2. L'animale. lasciare riposare per 30-60 min a recuperare dalla gestione dello stress.
  3. Posizionare il trasduttore di ultrasuono con la testa di trasduttore rivolta verso l'alto verso l'axolotl in amaca.
  4. Applicare gel per ultrasuoni sul trasduttore.
  5. Delicatamente e senza disturbare l'animale, posizionare il trasduttore sopra la linea mediana dell'animale nella regione toracica parallelo all'asse lungo dell'animale.
    Nota: Questa è la posizione stessa, ma invertita, per quanto riguarda l'axolotl anestetizzato (punto 3.2).
  6. Ottenere B-mode, modalità colore Doppler, dati in modalità PW in asse lungo e asse corto Mostra come descritto nei passaggi 3.2-3.14.
    Nota: Una vista obliqua paragill è introvabile nell'axolotl non anestetizzata sveglia. I dati ecocardiografici in Axolotl non anestetizzata sveglia dovrebbero essere acquisiti tra i movimenti di ventilazione gill (un periodo di 10-20 s per un animale che riposo). Se l'axolotl si muove durante l'acquisizione, le misurazioni devono essere ripetute.

5. valutare i dati 2D ecocardiografia e ridurre al minimo la soggettività

  1. Evitare bias di operatore/osservatore nella valutazione di formazione immagine e 3D ecografia 2D della funzione cardiaca basata su dati 2D causati dalla soggettività sia l'acquisizione di dati che la fase di analisi dei dati eseguendo analisi intra/inter-operator/osservatore20.
    Nota: Nell'avvio di studi e quando la formazione di nuovo personale questa soggettività deve essere quantificata e minimizzato usando l'analisi intra/inter-operator/osservatore.
  2. Avviare l'analisi intra/inter-operator/osservatore in una configurazione di due persona con operatore/osservatore 1 (meno esperti) viene testata su lavoro operatore/osservatore 2 (più esperto) eseguendo misurazioni di ≥ 6 consenso insieme, compreso entrambi panca presso il sistema a ultrasuoni (operazione) e la successiva analisi di parametri rilevanti (osservazione).
  3. Raggiungere un consenso tra gli operatori e osservatori e operare (operatore/osservatore 1) il sistema a ultrasuoni per acquisire dati rilevanti su ≥ 6 animali (funzionamento 1,1).
  4. Subito dopo, operare (operatore/osservatore 2) il sistema a ultrasuoni per acquisire dati rilevanti sugli animali stessi (operazione 2.1).
  5. Lasciano gli animali recuperare per 3 giorni. In seguito, ripetere (operatore/osservatore 1) la procedura (operazione 1.2).
  6. Analizzare (operatore/osservatore 1) dati tutti misurati (operazione 1.1/osservazione 1.1; operazione 2.1/osservazione 1.1; operazione 1.2/osservazione 1.1) e dopo 24 ore ripetere l'analisi dei dati operatore/osservatore di 2 (operazione 2.1/osservazione 1.2).
  7. Analizzare (operatore/osservatore 2) i dati acquisiti da lei/lui stesso (operazione 2.1/osservazione 2.1). Si noti che i valori ottenuti da questa analisi sono considerati più vicini ai valori veri.
  8. Valutare la variazione, tendenze e pregiudizio nei confronti tra tutti i parametri acquisiti utilizzando Bland-Atman tramando, QQ tramando, t-test (media uguale) e F-prova (varianza) (Figura 6).
    1. Si noti che l'operazione 1.1/osservazione 1.1 contro confronto 2.1/osservazione 1.1 operazione dimostra la variazione inter-operatore.
    2. Si noti che l'operazione 2.1/osservazione 1.1 contro confronto 2.1/osservazione 2.1 operazione dimostra la variazione inter-osservatore.
    3. Si noti che l'operazione 1.1/osservazione 1.1 contro il confronto di 1.2/osservazione 1.1 operazione dimostra la variazione intra-operatore.
    4. Si noti che l'operazione 2.1/osservazione 1.1 contro confronto 2.1/osservazione 1.2 operazione dimostra la variazione intra-osservatore.
  9. Assicurarsi che la media e la variazione delle diverse misurazioni sono non-significativo diversi per i quattro confronti; la differenza tra i valori misurati deve rientrare ± 1,96 deviazioni standard, e non ci dovrebbe apparire le tendenze verso meno precisione dei valori né piccoli né grandi.

6. 3D ecocardiografia su anestetizzati Axolotl

  1. Acquisizione 3D
    1. Posto l'axolotl anestetizzato in posizione supina nel letto animale a forma di labbra (punto 1.3.1). Proteggere da galleggiante usando elastici sciolti (Figura 1) e assicurarsi che la superficie toracica è coperto da 3-5 mm del mezzo. Acquisizione 3D è una procedura lunga, quindi applicare la soluzione anestetica come mezzo di ultrasuono per garantire la funzione cardiaca stabile in tutto misure.
    2. Il trasduttore di posizione sopra la linea mediana dell'animale nella regione toracica sia parallela all'asse lungo dell'animale (per una registrazione 3D sagittale) o ortogonale all'asse longitudinale (registrazione 3D trasversale).
    3. Tradurre il trasduttore nella dimensione nel piano (x e y) e la dimensione di fuori-di-piano (z o fetta) per garantire che l'intera regione cardiaca sarà coperto nella successiva cattura 3D.
    4. Regolare il frame rate e risoluzione spaziale come desiderato selezionando entrambi 'general imaging' (alta risoluzione temporale spaziale/basso) o in modalità 'cardiologia' (bassa risoluzione temporale spaziale/alto). Per 0,33 Hz < HR < 1 Hz utilizzare una risoluzione temporale di 50 fotogrammi/s ottenuto a elevata risoluzione spaziale ('general imaging') che consente il ciclo cardiaco deve essere ricostruito in fasi distinte di 50-150.
    5. Regolare '2D guadagno' ad un livello dove le strutture anatomiche sono a malapena riconoscibile nell'immagine di B-modalità raw (~ 5 dB) per aumentare il rapporto segnale-rumore nelle ricostruzioni finale.
    6. Per ogni sezione (passo z), registra ≥ 1.000 fotogrammi.
    7. Tradurre un passo z trasduttore alla volta, per esempio, 20 µm o 50 µm e ripetere la registrazione fino a coperta l'intera regione cardiaca.
  2. Ricostruzione 3D (complementare file 13 e 14).
    1. Esportare le acquisizioni in Digital Imaging and Communications in Medicine DICOM (little endian).
      Nota: Ogni fetta contenente un determinato numero di frame avrà a comporre un unico file.
    2. Determinare il numero di fotogrammi in un ciclo cardiaco completo. HR può variare nel tempo, determinare questo per la prima e la fetta finale. Impostare il maggior numero di fotogrammi al ciclo come la stima iniziale superiore di risoluzione di fase che può essere successivamente ridotto (passo 6.2.8).
    3. Determinare i confini delle colture e accise irrilevante spazio che circonda la finestra B-mode.
      Nota: Questi limiti devono essere costanti in tutto fette.
    4. Convertire l'immagine a colori RGB in 32 bit.
    5. Calcolare il valore di correlazione (C) per ogni frame nello stack e il numero di fotogrammi inclusi nel primo ciclo cardiaco utilizzando la formula:
      Equation 6(6)
      Nota: Qui Equation 7 è l'intensità di segnale del pixel alla coordinata (i, j) nella prima immagine Equation 8 ed è lo stesso nella seconda immagine, Equation 9 , Equation 10 e Equation 11 , Equation 12 sono l'intensità media e standard deviazione, rispettivamente, dell'immagine prima e la seconda nel confronto e io e J sono i numeri di colonne e righe nell'immagine. Matrice di valori di correlazione risultante avrà le dimensioni del prodotto del numero di fotogrammi al ciclo cardiaco e il numero totale di fotogrammi per fetta (per esempio, 75 × 1.000 = 75.000 in Figura 8) (vedere esemplare script in integrativa Il file 16). Il valore di correlazione non può essere calcolato se una o entrambe le immagini nel confronto hanno una deviazione standard dei valori dei pixel pari a zero, tuttavia questo è altamente improbabile in immagini ecografiche.
    6. Rilevare massimi locali nella matrice di valori di correlazione (Figura 8A, Vedi script esemplare supplementare File 17 per rilevare automaticamente i massimi locali).
    7. Calcolare la media quadratica Q(medio) dei telai con i valori di correlazione di picco (cioè, corrispondenti fasi cardiache) utilizzando la formula:
      Equation 14(7)
      dove N è il numero totale di fotogrammi con corrispondenti fasi cardiache, Equation 15 è l'intensità del pixel alla coordinata (i, j) dell'immagine nth e Equation 16 è la media aritmetica temporale di Equation 17 dell'immagine nth (vedere script esemplare in 18 File supplementari).
    8. Ripetere il passaggio 6.2.3-6.2.7 per tutte le sezioni.
    9. Selezionare una sezione (fetta di riferimento) con strutture anatomiche facilmente riconoscibili (ad es., metà di-ventricolare) e verifica se l'ensemble ricostruito in media un ciclo cardiaco corrisponde esattamente un ciclo (vale a dire, se ci sono ulteriori fasi con conseguente più di un ciclo cardiaco). Eliminare ulteriori fasi per produrre esattamente un ciclo cardiaco (ad esempio, passando da un sopravvalutato 75 fasi/ciclo (in realtà, ciclo di 1,07) nella Figura 8 a esattamente un ciclo che contiene 70 fasi nella Figura 8).
    10. Sulla vicina slice (fetta di prova), sorta l'ensemble ha stato in media un ciclo cardiaco t-stack in corrispondenti fasi cardiache con la fetta di riferimento utilizzando la formula del valore di correlazione (equazione 6) (Vedi esemplare script in supplementari File 19 e File supplementari 20).
      Nota: Anche se non identici due fette non apparirà completamente simile in qualsiasi punto durante il ciclo cardiaco, fette adiacenti con una dimensione sufficientemente piccolo passo (per esempio, 20 µm o 50 µm) saranno pronunziato somiglianze conseguente correlazione maxima di valore che può essere tradotto in corrispondenza di fasi.
    11. Ripetere il passaggio 6.2.9-6.2.10 per tutte le sezioni.
    12. Comprimere l'intera ricostruzione 3D in un unico formato di Tagged Image File 3D (TIF) contenenti fette di z e t fotogrammi o in una pila di file DICOM.
      Nota: I dati possono essere cestinati in ogni dimensione per ridurre le dimensioni, aumentare il rapporto segnale-rumore e generare dati isotropici (in-plane risoluzione è di solito diverse pieghe superiori risoluzione fuori del piano).

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Representative Results

Spazio intrapericardico nell'axolotl è dipendono dalla dimensione dell'animale. Animali più piccoli (2-20 g, 7-15 cm) avrà un eccesso di liquido pericardico (che appare scuro in ecocardiografia) che circondano che il cardiaco chambers considerando che in animali sessualmente maturi più grandi (> 20 g, > 15cm) gli alloggiamenti occuperà la maggior parte dell'intrapericardica spazio. Per fornire la migliore panoramica per risultati rappresentativi delle viste ecocardiografiche del cuore axolotl, un animale più piccolo (10 g, 10 cm) è stato applicato per Figura 3, Figura 4, Figura 5e Figura 9.

La visualizzazione dell'asse lunga generalmente fornisce una buona panoramica dell'anatomia cardiaca nell'axolotl. Immettere sul piano della linea mediana con il seno venoso, atria e parte del ventricolo in aereo (Figura 3A, B, 2 File supplementari), l'aereo ventricolare (Figura 3–H) o l'aereo atriale (Figura 4A –D) può essere raggiunto, traducendo il trasduttore a destra o a sinistra dell'animale, rispettivamente. Il ventricolo apparirà sferica e altamente trabecolazioni (Figura 3, complementare Files 3–5), mentre gli atri hanno una forma più irregolare e quasi nessun trabeculation (Figura 4A, File complementare 6, File supplementari 7). La vista di asse corto (Figura 5A, B, 10 File supplementari) fornisce una panoramica meno facilmente interpretabile dell'anatomia cardiaca dell'axolotl cuore, tuttavia contribuisce alla valutazione della corretta contrazione cardiaca (ad es. colpito da infarto o non contraenti zone del ventricolo circolare siano chiaramente visibili in questo piano di vista). Nel piano della vista di asse lungo, al centro del tratto di efflusso sia posizionato vicino al centro del ventricolo (Figura 2Ae confronta Figura 3 con Figura 4E e complementare 3 File con supplementare File 8 ). Poiché i tessuti molli dell'efflusso saranno in movimento all'espulsione del sangue, il segnale di sangue ad alta intensità durante un ciclo cardiaco misurato di onda di impulso Doppler in sia l'asse lungo e il piano obliquo paragill verrà essere affiancato da rumore di bassa intensità dalla movimenti del tessuto molle circostante (area grigia che circonda l'area bianca della curva velocità/tempo in Figura 4 e Figura 5E). Generalmente, il contrasto tra segnale di sangue e dei tessuti molli rumore dovrebbe essere grande abbastanza per segmento solo il segnale di sangue quando si misura l'integrale di tempo di velocità (Figura 4 (g1 ingrandimento) e Figura 5E (ingrandimento e1)).

Per la valutazione qualitativa dei modelli di flusso di sangue, color Doppler e formazione immagine di Doppler di potere fornire visualizzazioni di modelli di flusso in diverse camere cardiache (ventricolo: Figura 3E–H, 4 File supplementari, File supplementari 5; Atri: Figura 4 C, D, 7 File supplementari; tratto di efflusso: Figura 4F, Figura 5 D, complementare File 9, 12 File supplementari).

Axolotl utilizzato per la sperimentazione di laboratorio variano in dimensioni da fase larvale post iniziale di 2-4 g alla piena maturità a 10-30 g e più grandi animali del peso > 100 g. allo stesso modo, la funzione cardiaca e alcuni valori assoluti dei parametri funzionali descritti qui dipendono dimensioni degli animali. In generale, modifica dell'area di frazionario è costante in gruppi di diverse dimensioni con valori che vanno al 40-50% (asimmetrica verso valori più bassi per gli animali più grandi). Volume sistolico è fortemente dipendente dalle dimensioni dell'animale, cioè, la dimensione del cuore, che vanno da per esempio, 20-30 µ l in Axolotl 5g, 50-70 µ l in Axolotl 10g e 250-300 µ l in Axolotl 50g. Frequenza cardiaca e a qualche volume sistolico di grado sono fortemente dipendenti l'anestetico applicata e il livello di anestesia (Figura 6A–F, Figura 7).

Analisi intra/inter-operator/osservatore tradizionale prevede rappresentazioni grafiche (Q-Q trame e Bland-Altman trame) e test per media uguale (t-test) e varianza (F-test) per valutare la distribuzione normale dei dati e confrontare accuratezza e precisione tra due persone (Figura 6).

Ecocardiografia 3D aggiunge una dimensione supplementare (z o profondità) per l'acquisizione di 2D più tradizionale. Questo consente per la visualizzazione multi-planari di dati (Figura 9A), reslicing (figura 9B), ricostruzioni di superficie e volume (Figura 9, 13 File complementarie supplementari File 14) e la segmentazione e generazione di modelli 3D (Figura 9 C, 15 File supplementari).

Figure 1
Figura 1. Preparazione del letto e contenitore per ecocardiografia di anestetizzati e non anestetizzata sveglia axolotl. (A), A parte morbida del panno è piegato una volta e rotolato in forma di "burrito". (B) le estremità sono piegate all'indietro e nastrate per formare un letto a forma di labbro per l'axolotl durante la scansione subacquea. (C) per ecocardiografia 2D e 3D di un axolotl anestetizzato, l'animale viene delicatamente inserito in posizione supina nella fenditura del labbro a forma di letto e fisso con bande di gomma sopra la regione sacra e metà-mandibolare. (D, E) Un'amaca è preparata da ritagliandosi un foro quadrato in un pezzo di polistirolo espanso e taping involucro di plastica alla superficie superiore. (F) per ecocardiografia 2D di un axolotl non anestetizzata sveglia, l'animale è collocato in posizione prona naturale nell'amaca e si avvicinò con una punta di trasduttore coperto di gel da sotto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Posizionamento del trasduttore. (A, B) Modello della rete arteriosa nell'axolotl con la posizione approssimativa del trasduttore per asse lungo e visualizzazione dell'asse corto (A) e vista obliqua paragill (B). La transilluminazione (C) con una sorgente di luce fredda potente può aiutare a trovare la posizione esatta delle camere cardiache prima di applicare il trasduttore (Vedi supplementari File 1). Abbreviazioni anatomiche: A, atria; OFT, tratto di efflusso; SinV, seno venoso; V, ventricolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Viste ecocardiografiche rappresentante asse lungo del ventricolo. (A, B) Asse lungo tipico del midline vista in modalità B (linea gialla nella Figura 2A) nelle telesistolico (B) fasi di fine-diastolica ventricolare (A) e (Vedi 2 File supplementari per la rappresentazione dei video). (C, D) Visualizzazione dell'asse lungo del ventricolo in B-mode (linea nera nella Figura 2A) nella fine-diastolica ventricolare (C) e telesistolico (D) fasi (Vedi 3 File supplementari per la rappresentazione dei video). (E–H) Piano vista simile come in (A) e (B) in color Doppler (CD) e modalità di power Doppler (PD) dimostrando sangue flusso (Vedi complementare File 4 e 5 File supplementari per la rappresentazione dei video della modalità CD e PD, rispettivamente). Colori rossi nelle immagini CD-modalità indicano sangue che fluisce verso il trasduttore e colori blu indicano il contrario. Camere cardiache e del flusso sanguigno sono state evidenziate con linee tratteggiate. Cartoni animati inseriti in (A) e (C) Visualizza posizionamento del trasduttore e della traduzione rispetto alla linea mediana asse lungo Mostra. Abbreviazioni anatomiche: A, atria; DC(L), a sinistra del condotto di Cuvier; OFT, tratto di efflusso; SinV, seno venoso; V, ventricolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Viste ecocardiografiche asse lungo rappresentativo degli atrii e del deflusso delle vie. (A, B) Visualizzazione dell'asse lunga degli atrii in B-mode (linea verde nella Figura 2A) nella fine diastole atriale (A) e telesistolico (B) fasi (Vedi 6 File supplementari per la rappresentazione dei video). (C, D) Piano vista simile come in (A) e (B) in modalità di colore Doppler (CD) dimostrando sangue flusso (Vedi 7 File supplementari per la rappresentazione dei video). Vista (E) asse lungo il tratto di efflusso in modalità B (linea blu nella Figura 2A) nella fase di espulsione metà (Vedi 8 File supplementari per la rappresentazione dei video). F: Piano di vista simile come in (E) nel sangue dimostrando CD-modalità flusso (veda supplementari File 9 per la rappresentazione dei video). (G) piano di vista simile come in (E) e (F) in modalità Doppler (PW) onda di impulso consentendo calore rilevamento e velocità tempo integrale (VTI) misurazione della frequenza per il calcolo del volume di colpo. Colori rossi nelle immagini CD-modalità indicano sangue che fluisce verso il trasduttore e colori blu indicano il contrario. Camere cardiache e del flusso sanguigno sono state evidenziate con linee tratteggiate. Punte di freccia giallo e rosso indicano valvole semilunari alla radice del tratto di uscita e la valvola a spirale nel tratto di uscita, rispettivamente. Cartoni animati inseriti in (A) e (E) Visualizza posizionamento del trasduttore e della traduzione rispetto alla linea mediana asse lungo Mostra. Abbreviazioni anatomiche: A(R), atrio di destra; A(L), lasciato atrio; OFT, tratto di efflusso; SinV, seno venoso; V, ventricolo; VC, della vena cava. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Rappresentante asse corto e paragill obliquo viste ecocardiografiche del tratto ventricolo e deflusso. (A, B) Visualizzazione dell'asse corto del ventricolo in B-mode (linea grigia nella Figura 2A) nella fine-diastolica ventricolare (A) e telesistolico (B) fasi (Vedi 10 File supplementari per la rappresentazione dei video). (C) paragill obliquo vista dell'efflusso in B-mode (linea viola nella Figura 2B) in fase di espulsione metà (Vedi 11 File supplementari per la rappresentazione dei video). (D) piano di vista simile come in (C) nel sangue dimostrando CD-modalità flusso (Vedi 12 File supplementari per la rappresentazione dei video). (E) piano di vista simile come in (C) e (D) in modalità Doppler (PW) onda di impulso consentendo calore rilevamento e velocità tempo integrale (VTI) misurazione della frequenza per il calcolo del volume di colpo. Colori rossi nelle immagini CD-modalità indicano sangue che fluisce verso il trasduttore e colori blu indicano il contrario. Camere cardiache e del flusso sanguigno sono state evidenziate con linee tratteggiate. Cartoni animati inseriti in (A) e (C) Visualizza posizionamento del trasduttore e della traduzione rispetto alla linea mediana asse lungo Mostra. Abbreviazioni anatomiche: A, atria; OFT, tratto di efflusso; SinV, seno venoso; V, ventricolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Risultati rappresentativi della frequenza cardiaca ed il colpo misurazioni del volume, l'effetto dell'anestesia e analisi rappresentativa intra/inter-operator/osservatore. (A–C) Frequenza cardiaca (HR) rispetto al basale non anestetizzata sveglia tracciati nel corso del tempo (0 h è a completa anestesia) per sei Axolotl anestetizzato in benzocaina (A), MS-222 (B) e (C) il propofol. (D–F) Volume (SV) rispetto al basale non anestetizzata sveglia tracciata nel corso del tempo (0 h è a completa anestesia) per sei Axolotl anestetizzato in benzocaina (D), MS-222 (E), corsa e propofol (F). (G) analisi Intra/inter-operator/osservatore del volume sistolico. Trame di Bland-Altman [differenza (Dif) tra gli operatori (Op) / osservatori (Obs) tramato contro media (Avg)] non dovrebbe rivelare nessun pregiudizio sistematico nelle misurazioni distribuite normalmente (terreni di Q-Q) ottenuta da diversi operatori e osservatori. Test per media uguale (t-test) e varianza uguale (F-prova) non dovrebbe rivelare nessuna differenza significativa tra operatori/osservatori (tabella in basso a destra). A - F è stata modificata da materiale disponibile sotto la licenza Creative Commons Attribuzione (Figura 1 di Thygesen et al. 21). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Confronto del volume sistolico stimati da geometrica e l'onda di impulso Doppler metodo. Confronto del volume sistolico (SV) stimato da misurazioni di geometrica (geo) B-modalità bidimensionale o misure Doppler pulse wave sulla velocità di uscita del tratto di efflusso del sangue. SV(GEO) e SV(pw) è registrata negli stessi sei animali con secondi tra i tipi di misurazione e utilizzando tre differenti anestetici, benzocaina (quadratini blu inclinati), MS-222 (quadrati rossi) e propofol (triangoli verdi) con una settimana di recupero tra applicando i diversi anestetici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Correlazione di immagine rappresentativa spatiotemporal per ecocardiografia 3D. (A) curva di rappresentazione dei valori di correlazione fruttato di un'operazione di correlazione in un dataset di cine 1.000 telaio con 75 fotogrammi al ciclo cardiaco. Due cornici con solo piccole differenze, che indica corrispondenti fasi cardiache, produrrà un valore di alta correlazione. Successivamente un massimi locali algoritmo di ricerca possono essere applicato ai dati per rilevare tutti i fotogrammi corrispondenti. (B) rappresentazione grafica degli stessi dati come in (A). Quando i valori di correlazione sono ottenuti confrontando il primo ciclo cardiaco con lo stack intero cine, linee diagonali di massima correlazione indicano fasi cardiache di corrispondenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Nella figura 9. L'ecocardiografia 3D rappresentanza. (A) vista multi-planare del cuore 3D axolotl ricostruito. La procedura di correlazione spazio-temporale immagine permette per la ricostruzione di un ciclo cardiaco completo con varie fasi ben distinte (qui 70 fasi) in tre dimensioni spaziali che possono essere tagliati come quelli per la desiderata indagine dei fenomeni spazio-temporale in il cuore pulsante. (B), tre fette trasversali dei ricostruito 115 sezioni dati 3D. Quadratica media procedura migliora il contrasto di sangue ai tessuti e abbassa il rapporto segnale-rumore permettendo per un migliore apprezzamento della natura trabecolazioni del ventricolo axolotl e una chiara visualizzazione del setto interatriale e la valvole nel tratto di uscita. Rappresentanze di superficie e volume (C) del cuore alle tre fasi lungo un colore codificato segmentato modello (vedere complementare File 13 e 14 di File supplementari per rappresentazioni video della superficie e volume rendering battendo cuore e 15 File supplementari per un modello 3D interattivo segmentato trifase). Abbreviazioni anatomiche: A, atria; Cau, caudale; CRA, cranica; Dex, dexter (a destra l'animale); Dor, dorsale; OFT, tratto di efflusso; Peccato, sinistro (per gli animali di sinistra); SinV, seno venoso; V, ventricolo; Ven, ventrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari 1. Transilluminazione di localizzare alloggiamenti cardiaci nellaaxolotl. Vedere la Figura 2. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File complementare 2. Asse lungo, vista del midline, modalità B. Vedi Figura 3A, B. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare File 3. Asse lungo, vista ventricolare, modalità B. Vedere Figura 3, D. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 4. Asse lungo, vista ventricolare, modalità colore Doppler. Vedi Figura 3E, F. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 5. Asse lungo, vista ventricolare, modalità Power Doppler. Vedere la Figura 3, H. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 6. Asse lungo, vista atriale, modalità B. Vedi Figura 4A, B. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 7. Asse lungo, vista atriale, modalità colore Doppler. Vedere la Figura 4, D. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 8. Asse lungo, vista del tratto di efflusso, B-mode. Vedi Figura 4E. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 9. Asse lungo, vista del tratto di efflusso, modalità colore Doppler. Vedere Figura 4F. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 10. Asse corto, vista ventricolare, B-mode. Vedi Figura 5A, B. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 11. Paragill obliquo, vista del tratto di deflusso, modalità B. Vedere Figura 5. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 12. Paragill obliquo, vista del tratto di efflusso, modalità colore Doppler. Vedere Figura 5. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 13. Resa superficie tridimensionale di battere il cuore a 70 fasi (19,6 ms risoluzione temporale). Vedi Figura 9. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare File 14. Rappresentazione tridimensionale del volume del cuore pulsante in 70 fasi (19,6 ms risoluzione temporale). Vedi Figura 9. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 15. Modello tridimensionale interattiva del cuore pulsante in 3 fasi: fine-sistole ventricolare, eiezione ventricolare di metà e fine-sistole ventricolare. Vedere Figura 7. Il file PDF interattivo dovrebbe essere visualizzato in Adobe Acrobat Reader 9 o superiore. Per attivare la funzionalità 3D, fare clic sul modello. Utilizzando il cursore, ora è possibile ruotare, zoomare, traslare il modello e nell'albero del modello, tutti i segmenti del modello possono essere acceso/spento o reso trasparenti. Nell'albero del modello è una gerarchia contenente diversi strati di sub che possono essere aperto (+). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 16. Rappresentante annotato script per il calcolo del valore di correlazione di un'acquisizione di 1.000 telai con una stima superiore del ciclo di fotogrammi/cardiaco 75. Lo script è scritto in linguaggio macro di IJ1 e può essere implementato come una macro di batch in ImageJ per calcolare i valori di correlazione (75.000 per acquisizione) in un intero z-pila di dati 3D. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 17. Rappresentante script per il rilevamento automatico dei picchi in una serie di valori di correlazione da un'acquisizione di 1.000 telai con una stima superiore del ciclo di 75 fotogrammi/cardiaco. La serie di valori di correlazione (colonna B, segnato in giallo) può essere sostituita e dopo l'attivazione della macro (Ctrl + r) l'elenco dei comandi per selezionare corrispondenti fasi cardiache ed eseguire una media quadratica sarà visualizzata (colonna Q., contrassegnati in verde). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 18. Rappresentante annotata script per selezionare corrispondenti fasi cardiache ed eseguire una media quadratica di un'acquisizione di 1.000 telai con una stima superiore del ciclo di 75 fotogrammi/cardiaco (colonna Q 17 File supplementari). Lo script è scritto in linguaggio macro di IJ1 e può essere implementato come una macro in ImageJ per creare un ensemble una media di un ciclo (75 fasi) 2D fetta. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 19. Rappresentante annotato script per il calcolo del valore di correlazione tra una fetta di riferimento 70 fotogrammi e una fetta di prova adiacenti 75 frame. Lo script è scritto in linguaggio macro di IJ1 e può essere implementato come una macro in ImageJ per calcolare i valori di correlazione (5.250). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 20. Script per il rilevamento automatico dei picchi in una serie di valori di correlazione da un confronto tra una fetta di riferimento 70 fotogrammi e una fetta di prova adiacenti 75 fotogrammi di rappresentante Excel. La serie di valori di correlazione (colonna C, segnato in giallo) può essere sostituita e dopo l'attivazione della macro (Ctrl + t) l'elenco delle fette per essere selezionato come un substack nella sezione test sarà visualizzato (colonna L, riga 2, contrassegnati in verde). Il substack di fetta di prova avranno spazialmente corrispondenti fotogrammi per la sezione di riferimento. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

L'ecocardiografia nell'axolotl e altre specie di mammiferi produce dati fondamentalmente diversi da quelli dei mammiferi ecocardiografia a causa della natura nucleata dei globuli rossi in tutti i vertebrati mammiferi adulti. Ciò si traduce in un segnale di sangue pronunciate e meno sangue al tessuto contrasto nelle immagini ecocardiografiche axolotl rispetto a per esempio, mouse o l'ecocardiografia umana. Questo può rendere segmentazione di immagini su immagini ecografiche non trasformati singolo fotogramma più difficile in quanto può essere difficile distinguere il sangue dal tessuto. Tuttavia, questo fenomeno può essere vantaggioso quando utilizzato per creare sangue segnale immagini migliorato applicando la quadratica media procedura descritta precedentemente18 e modificate per ecocardiografia axolotl in protocollo sezione 6. Poiché le macchioline di sangue sono molto più dinamiche rispetto a quelli trovati nei tessuti molli, con una media quadratica genererà marcato contrasto tra questi due compartimenti che facilita la segmentazione di immagini a due e tre dimensioni.

Questo protocollo descrive tre differenti anestetici per l'axolotl che è stati accuratamente testati in precedenza21. Benzocaina sia MS-222 stimolare un aumento della frequenza cardiaca, che può essere desiderabile quando si verifica la funzione cardiaca in condizioni di stress. Propofol induce meno stress al cuore durante l'anestesia e può essere usato come una sostituzione per l'ecocardiografia non anestetizzata sveglia in situazioni dove il tempo di acquisizione eccede i limiti di comportamento sedentario in Axolotl non anestetizzata sveglia.

2D ecocardiografia che descrive il cuore 3D è influenzata dalla soggettività. Pertanto, è imperativo per condotta e intra/inter-operator/osservatore analisi prima di condurre un esperimento vero e proprio come descritto nel protocollo sezione 5. Allo stesso modo, misurazioni ecocardiografiche dovrebbero essere visto più come valori di indice che possono essere applicati per studiare le differenze di potenziale nella funzione cardiaca in circostanze diverse, anziché valori assoluti. Lo stroke volume determinato dall'equazione del geometrico (equazione 2) raramente produce lo stesso valore assoluto come l'onda di impulso Doppler equazione (equazione 4; Figura 7), e dovrebbe essere deciso che misurano di aderire a tutta una serie di esperimenti. Il SV(geo) può essere ottenuta più rapidamente rispetto alla SV(pw), tuttavia il presupposto sferico della forma ventricolare si applica solo ai contraenti uniformemente cuori sani, e nei modelli di malattia e rigenerazione, SV(pw) dovrebbe essere considerato per un riflesso migliore della il volume di vero colpo.

La correlazione e quadratica media procedura di protocollo sezione 6 può essere implementati in diversi differenti immagini e pacchetti di matematiche. Poiché le competenze di programmazione e accesso ai pacchetti software variano notevolmente all'interno di ricercatori di Scienze della vita, abbiamo cercato verso la fornitura di script rappresentativo per i metodi in pacchetti software che la maggior parte dei ricercatori hanno familiarità con (ad esempio, Excel) che sono liberamente disponibili e facilmente avvicinato (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). File supplementari 16 - 20 forniscono con annotazioni esemplare script scritti in linguaggio macro di IJ1 e come xlsm macro che devono essere comprensibile anche con minima esperienza nella codifica.

Rigenerazione del cuore intrinseca è un fenomeno esclusivamente trovato nei cuori di specie di piccole dimensioni (rispetto umano), e così misurazioni e imaging della funzione cardiaca basale e del progresso funzionale durante la rigenerazione è sfidato dalla dimensione del cuore e la risoluzione spaziale di modalità di formazione immagine applicata. Formazione immagine di ultrasuono ad alta frequenza fornisce un auspicabile compromesso tra un'elevata risoluzione spaziale nel piano (~ 30 x 30 µm2 a 50 MHz) che è paragonabile al µCT in vivo imaging e molto superiore in vivo µMRI, che ha una profondità di penetrazione (~ 1 cm a 50 MHz) molteplice maggiore di microscopia confocale e una risoluzione temporale molto alta (50-300 fotogrammi/s a 50 MHz, 1 cm di profondità). Accoppiato con il movimento tridimensionale manuale o automatizzato z del trasduttore, ultrasuono permette impareggiabile ricostruzione della funzione cardiaca e modellazione anatomica in quattro dimensioni. Inoltre, la natura non invasiva della tecnica permette per la sperimentazione longitudinale. A nostra conoscenza non ci sono attualmente nessun trasduttori di matrice di matrice disponibili per micro di ecografia ad alta frequenza. Lo sviluppo di questa tecnologia sarebbe di grande aiuto le acquisizioni di dati 3D di piccoli cuori come quello dell'axolotl in una procedura più veloce più meccanicamente spostando il trasduttore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere Kasper Hansen, Istituto per le scienze biologiche, Università di Aarhus per fornire accesso e assistenza con il micromanipolatore elettronico per acquisizione ecocardiografica 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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Ecocardiografia 2D e 3D nell'Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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