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ウーパールーパー (アホロートル メキシコマンネングサ) で 2 D および 3 D 心エコー検査

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

アホロートル サラマンダー (アホロートル メキシコマンネングサ)、心臓再生のモデル動物の心臓の鼓動の二次元および三次元イメージ獲得のため心エコー検査プロトコルをご紹介します。高時空間分解能で心機能の縦断的評価を可能にするこれらのメソッド。

Abstract

虚血性心疾患により心臓の故障は大きな課題と心に再生治療は、高需要。ゼブラフィッシュと本質的な心を再生できるは、サンショウウオなど、いくつかのモデル種は、人間の患者、将来の再生治療のための約束を保持します。Cardioregenerative 実験の結果を評価するため、心臓機能を監視できることが不可欠です。アホロートル サラマンダー (A. メキシコマンネングサ) は、サイズを達成するため心機能の評価、再生の生物学の確立モデル種を表します。このプロトコルの目的アホロートル エコーによる心機能を再現性をもって測定する方法を確立することです。異なる麻酔 (プロポ フォール、MS-222、ベンゾカイン) のアプリケーションは、示されて、麻酔と無麻酔ウーパールーパーは絶滅の二次元 (2 D) 心エコー法によるデータの取得を説明しました。三次元 (3 D) 心の 2 D 心エコー検査は不正確さから苦しむことができるし、主観測定と堅実な方法すなわち内/間 operator/オブザーバー分析、測定、このバイアスを最小にするから、この現象を軽減するためには、示した。最後に、顕著な血液-組織コントラストと非常に高い時空間分解能でウーパールーパー心臓の 3 D 心エコー データを集録する方法を説明します。全体的にみて、このプロトコル心機能とモデルの解剖を評価するための必要なメソッドを提供し、超音波画像を用いた再生生物学で一般的な生理学的な実験アプリケーション アホロートルにおけるダイナミクスの流れ。

Introduction

虚血性心疾患は、死世界中1,2の主要な原因です。人間で虚血性の事件がしばしば肥大、電気の故障、および心の減少機能に関連付けられている線維性瘢痕につながるが、多くは、迅速かつきめ細かな医療介入による心筋梗塞を生き残るため、.心筋組織の再生の潜在性のこの欠乏は哺乳類の間で共有される、哺乳類心筋再生の物議を醸すクレームが報告されているが、これらは特定のマウス由来株3,4に限られていると低酸素状態は、マウス5を扱われます。したがって、心臓の再生医療と生物学の分野は一般に本質的な心の再生現象を研究する非哺乳類動物モデルに限定。ゼブラフィッシュ (動脈分布) 過去 10 年間として確立されている本質的な心の再生6,7,8,9,10 の最もよく特徴付けられたモデル.簡単な実験室のメンテナンス、短い世代時間と、利用可能な分子ツールの広い配列のためゼブラフィッシュは心臓発生と再生および遺伝学的および分子メカニズムのモデルとして適しています。ただし、ゼブラフィッシュ心臓の微小寸法機能の評価のために適していないし複雑な手術と、ゼブラフィッシュの非テトラポッド系統したがってこの種の所見の賢明な外挿を制限他の大きい四肢動物モデルの使用を正当化します。脊椎動物の心臓再生の最も初期のモデルの 1 つだった尾両生類, 東イモリ (Notophthalmus viridescens)11, 残っている貴重なモデル12種。

近年メキシコ アホロートル (A. メキシコマンネングサ) 別尾両生類、大きなシーンに入っている (100 g までの体の質量) と高所適応動物モデル スパニング肢の再生に、再生の分野の広い配列を脊髄損傷、心臓再生13,14,15,16,17。アホロートルは中心部の腹側に石灰化構造の不在は、超音波像のアーチファクト (音響のはるかに低いレベルで、高周波エコーによる心臓の機能の測定にシャドウと特に残響) 石灰化胸骨と肋骨の他のモデル動物での観測より。

次のプロトコルは、いくつかの別の方法と準備 (図 1、図 2) 麻酔の両方でウーパールーパーの心に再現できる心エコー計測について説明します (3 つの異なる麻酔薬を適用します。ベンゾカイン、MS-222、およびプロポ フォール) と 2 つの動物無麻酔 (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7、補助ファイル 1-12) と 3 (図 8、図 9、 補助ファイル 13-14) 次元空間。両生類心臓は 3 chambered (2 つの心房、単心室)。大きなウナギ静脈洞によって心房と心室が動脈円錐流出路 (図 2) に注ぐ。最も重点を置いたが伝統的心室再生上に配置、アトリア6,7,8,9,10,11の回復が少ないので,12,14,17、このプロトコルは主に心機能の測定に焦点を当てください。

両生類の心エコー検査はよく文献に記載されている、本稿で説明している 2 D 法の開発によって駆動されている最高を表す必要アホロートル心臓の鼓動の機能与えられた時間と実験の設定で。したがって、ここで説明したメソッドは、心機能が繰り返し再生プロセスにわたって監視できます心臓再生実験に適用されます。さらに、メソッドをアホロートルの cardiophysiological 実験で一般に適用または他の尾または無尾両生類モデル (e.g.,Xenopus) をスパンするわずかに変更できます。アホロートル存在いくつかの異なる系統とカラー バリエーション (例えば、野生型、melanoid、白、アルビノ、緑色蛍光タンパク質の発現と形質転換白)、しかしこれらの特性の互換性を影響しません、記述のプロトコルとウーパールーパー。3 D 心エコーのデータを取得するここで説明する方法は臨床超音波と二次平均法にニワトリに記載されているために開発された時空間画像相関 (STIC) 法の修正版有核赤血球18,19を含む種の軟部組織に血の斑点の信号を強化します。このメソッドは、心筋収縮とウーパールーパーの心の計算の流体力学の高度なモデリングできます。

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Protocol

実験動物の管理と使用の国デンマークの法律に従ってこの議定書の実施手順、実験は、デンマークの国立動物実験局 (プロトコル番号 2015-15-0201-00615) によって承認されました。

1. 準備

  1. ウーパールーパーを準備中。
    1. アホロートル媒体として非化学的に扱われる質の高い水道水を適用します。このオプションが利用できない場合は、40 %holtfreter のソリューションを適用します。
    2. 0.288 g フィルター処理および脱イオン水を 1 L のボリュームまでの KCl、1.11 g MgSO4·7H2O、0.54 g CaCl2·2H2O 15.84 g 塩化ナトリウムを溶解することにより 40% (重量/巻) Holtfreter ソリューションを準備します。
  2. 浸漬麻酔薬を作る。
    1. ベンゾカイン (4-アミノ安息香酸エチル) 麻酔液を準備するには、200 mg 4-アミノ安息香酸エチル 3 mL のアセトンで溶解し、1 リットルの水道水または 40 %holtfreter のソリューションでこのミックスを溶解します。
    2. 1 L の水道水または 40 %holtfreter のソリューションに直接 200 mg エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸を溶解することにより MS 222 (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸、tricane としてもよく知られている) 麻酔液を準備します。
    3. 3.3 mg 2, 6-事実及び私の 1 リットルの水道水または 40 %holtfreter の溶液中に溶解することにより (2, 6-事実及び私) プロポ フォール麻酔液を準備します。また、商業的既成ソリューション 3.3 mg/l を希釈します。
      注意: プロポ フォールは、強力な人間麻酔 (静脈内投与) 希薄化後の形式で含む注意して処理する必要があります。
  3. 心エコー検査のベッドとコンテナーを準備します。
    1. 70 × 55 cm 一枚の柔らかい布を一度折ると、"ブリトー"形に圧延によってエコーの唇の形をした動物のベッドを準備 (図 1 a)。彼らを満たすこれら一緒に (図 1 b) をテープまで、両端を曲げます。
    2. 超音波検査の時に麻酔のアホロートルに合わせてアホロートルの中の構造の形をしたリップが水没します。構造体には、動物をセキュリティ保護し、緩いのゴム製バンドを使用して浮動小数点を防止これら半ば下顎と仙骨部 (図 1) に配置します。
      注: ゴム製バンドを締め付けてはいけない動物血行動態に影響します。
    3. 無麻酔ウーパールーパーは絶滅に 2 D エコーは、16 cm × 8 cm × 33 cm × 27 cm × 5 cm ブロック発泡スチロール (例えば中型の発泡ポリスチレン容器から蓋) に 5 cm の穴を彫刻してハンモック、準備 (図 1)。
    4. 穴をプラスチック製のラップの 33 × 27 cm 作品をプッシュし、ハンモックを作成する発泡スチロール ブロック (図 1E) の上面にラップの端を固定します。ハンモックで深さ 3 cm アホロートルの中に追加します。無麻酔のアホロートルは、プラスチック製のラップ (図 1 f) を通して容易な腹側アクセスを可能にするハンモックの底に沈みます。

2. 麻酔ウーパールーパーは絶滅

  1. 必要な麻酔液 (ベンゾカイン、MS-222 またはプロポ フォール) でウーパールーパーを浸します。
  2. 動物の 10 分のように鎮静、減らされた動き、立ち直り反射の増加する損失の最初の兆候の検査 < 10 g (< 10 cm) と 10 g と 50 g の体重 (10-22 cm) の動物で 20 分以内です。
  3. 身体の動き、ギル換気運動と立ち直り反射の完全な欠如を点検し、動物は数字の間ウェビングをつまんでテスト中程度の痛み刺激に敏感かどうかを確認します。
    注: 事実にもかかわらず全身麻酔麻酔ベンゾカイン ウーパールーパーは絶滅で 30 分以内達成は、心機能が 1 h まで安定していません。これは MS 222 またはプロポ フォールの事例ではありません (図 6A-F) ウーパールーパーは絶滅を麻酔します。
  4. 全身麻酔下でウーパールーパーを維持するために麻酔薬投与で動物や麻酔液で湿らしたウェット ペーパー ワイパーに包まれたを維持します。
    注: 皮膚やエラ特に水分保持があることを考える、麻酔は動物の健康に悪影響を及ぼすことがなく 7 時間維持できます。
  5. ウーパールーパーを reawake に動物を麻酔無料媒体に転送します。
    注: 覚醒の最初の兆候は、ギル換気運動です。動物は、直立し、1 時間以内の刺激に応答する必要があります。

3 麻酔のアホロートルの 2 D 心エコー検査

  1. 場所は麻酔 (手順 1.3.1-1.3.2) 唇の形をした動物のベッドで仰臥位でウーパールーパーです。ゆるいゴムバンド (図 1) を使用して浮動小数点から固定します。胸部の表面が媒体の 3 〜 5 mm で覆われていることを確認します。
    注: 短い集録 (< 5 分) 麻酔無料媒体適用できます。長時間の集録、麻酔液は測定を通して安定した心機能を確保するため超音波媒体として適用してください。
  2. 動物の胸部の正中線以上探触子位置 (図 2 a図 3 a・ B、補助ファイル 2) 動物の長軸に平行。(図 2および附則ファイル 1) 探触子の正しい配置を確保するため、白、アルビノ ウーパールーパーは絶滅の冷や光のソースと透視を使用します。
    1. < 20 グラムの重量を量るウーパールーパーは絶滅、50 MHz の探触子; を使用します。ウーパールーパーは絶滅の > 20 g、40 MHz の探触子を使用します。標準化されたイメージ獲得のため右に頭蓋/前方方向の位置決めを確認します。これはそうではない場合、探触子を回転 180 ° または反転イメージ。
  3. 軸正中断面で心室拡張期で左と右心房の大部分のフレーム (胸腔内、図 2 aの右側に配置) 心室の一部が表示されるを確認 (中心に位置/胸腔内、図 2 aの左側) に向かって少し、ウナギ静脈洞が心房収縮期と拡張期 (図 3 a, B) の両方に表示されます。
  4. 探触子動物の右心室の長い軸のビュー (図 2 a) を取得する 1-3 mm に変換します。正しい位置は、エンド収縮期心室の断面積が最大 (図 3-H) ときに達成されます。
  5. B モードの取得 ≥ > 50 フレーム/秒のいずれかの '一般的なイメージング' で 3 心臓サイクル (高/低空間時間分解能) または '心臓病' (低空間/高時空間解像度) モード。
    注: このビューは、心機能の評価ができます。末期と収縮末期断面積 (CSAv) 心室の式を使用して計算される心室小数領域の変更 (FACv) を使用して 2 つの次元で心機能を評価できます。
    Equation 1(1)
    アホロートルの心室が球の形を仮定し、に基づいてジオメトリのストローク量 [SV(geo)] は、式を使って計算することができます。
    Equation 2(2)
  6. 心室の中心が画面の真ん中にまで動物の長い軸に沿って変換器に変換します。トランスデューサー中旬心室短軸ビュー (図 5 a と B、補助ファイル 10) を取得する時計回りに 90 度回転します。心臓の長軸に沿ってトランスデューサー変換することによって、心室の円形の形状を評価します。
  7. 長い軸平面に探触子を戻り、正中線に向かって戻るまたは心房の長い軸 2 商工会議所ビュー (図 2 a) を取得する正中線の左にわずかにそれを翻訳します。最後収縮アトリアの断面積は、そのマキシマと組み合わせる 2 つの心房と仮定数 '8' 傾斜の概要を確認することにより、正しい位置は達成を確認 〜 (図 4 a と B、左に向かって 45 °6 の補足ファイル)。
  8. B モードで ≥ > 50 フレーム/秒の '一般的なイメージング' または '心臓病' モードで 3 心臓サイクルを取得します。
    注: ウーパールーパーの心房が規則的に形成と 3 D 機能を直接推論できません、2 D データからこうして彼らの機能は、両方の結合の断面積 (CSAa) に基づく心房小数エリア チャンス (不思議) などインデックス対策として評価されなければなりません。心房の収縮伸展商工会議所:
    Equation 3(3)
  9. (心室の長い軸のビュー) に近い流出路 (動脈円錐) が表示されるまで右方向探触子を翻訳 (図 2 a)。
    注: 前方方向で心室を出た後は、流出路が急カーブを作り、再び前方方向を仮定とギルの枝と全身の血管分割前に腹側の表面に向かって小さな角度で実行されます。
    1. 流出の直径が心室の終わりを収縮期に最大で、流出の入り口に 3 つの半月弁の 2 つが半ば放出 (図 4Eで表示されますを確認することにより正しい流出管表示を達成したことを確認してください。補足ファイル 8)。
      メモ: 流出路の中間部分の探触子に向かって腹側方向は速度と流れを用いたドップラー イメージング測定できます。
  10. (図 4 階と補足ファイル 9) 心臓の駆出時流出路の血流速を割り当てる色ドップラー モードを適用します。カラードプラ、心室と心房ビュー (図 3E-H、補助ファイル 4-5および図 4-D、および補助ファイル 7) の血流を可視化するイメージング力ドップラー、同様とします。
  11. 探触子に向かって走って流出路の部分に最大血流速度の位置にあるパルス波 (PW) ドップラー モードを適用します。
    1. 「ビーム角度」と「角度補正」を使用して 45 ° まで完全に垂直探触子 (図 4) の顔にされていない流出を調整します。PW ドプラの位置が (図 4E) 心臓のサイクルのあらゆる段階でない流出のスパイラル弁に重なっていることを確認します。
  12. PW ドプラ モードで ≥ 上 3 心臓サイクル速度/時間のデータを取得します。
  13. B モードに戻り、PWV を取得したため、正確な同じ平面で 3 心臓サイクル ≥ を取得します。
  14. 測定、速度積分 (VTI) 1 つにおける心の速度/時間曲線下面積として流出路の血流の循環 (図 4g1) します。
    注: VTI と終わり収縮で流出路の直径 (d) から、B モードの買収は、PW のドップラー ベース ストローク ボリューム [SV(pw)] は、式を使って計算することができますから得られます。
    Equation 4(4)
    心拍数 (HR) は、速度/時間カーブから心臓サイクル全体の持続時間を測定することによって測定されます。心臓出力 [CO(pw)] は、方程式を使って計算されます。
    Equation 5(5)
  15. 斜め paragill ビュー アホロートル動物の右側の部分が上向き (図 2 b) に直面しているような方法でベッドの形をしたリップで 90 ° を回転させることにより流出路の血流速度の測定のための代替を提供するを取得します。 角度し探触子を回転させるし、平行および突出のえら (図 2 b) にちょうど後部に配置。流出路が下方に実行されていることを確認することにより、正しい位置は達成を確認 〜 45 ° と取り出し (図 5 C、補助ファイル 11) 中に流出路の下には、心房が表示されます。
  16. (図 5、補足ファイル 12) 探触子から逃げて流出路の部分に最大血流速度の位置にある PW ドップラー モードを適用します。「ビーム角度」と「角度補正」を使用して最大 45 ° (図 5E) 探触子の顔完全垂直になるされていない流出を調整します。
  17. PW のドップラー モードで ≥ 上 3 心臓サイクル血流速度を取得します。
  18. B モードに戻り、PWV を取得したため、正確な同じ平面で 3 心臓サイクル ≥ を取得します。
    注: SV(pw) と CO(pw) は、長い軸のビュー前述式 4と式 5を使用して、斜め paragill ビュー計算されます。

4 無麻酔のアホロートルの 2 D 心エコー検査

  1. ハンモック (ステップ 1.3.3) で腹臥位で無麻酔のアホロートルを配置します。
  2. 動物を行わないで処理ストレスから回復する 30-60 分のため。
  3. ハンモックでウーパールーパーに向かって上向きトランスデューサ ヘッドと超音波探触子を配置します。
  4. 探触子で超音波ゲルを適用します。
  5. 優しく、そして動物を乱すことがなく、動物の胸部の正中線に探触子を動物の長軸に平行ように置きます。
    注: これは麻酔アホロートル (ステップ 3.2) に関しては、同じですが、逆位置です。
  6. B モード、カラードプラ モード、長軸と短軸ビュー 3.2 3.14 の手順で説明するように PW モードのデータを取得します。
    注: 斜め paragill ビューは無麻酔のウーパールーパーで得られるです。ギル換気動き (安静時の動物の 10-20 の期間) の間無麻酔ウーパールーパーは絶滅の心エコー検査データの取得する必要があります。アホロートルは、集録時に移動する場合は、測定を繰り返す必要があります。

5. 2 D 心エコー検査データを評価し、主観を最小限に抑える

  1. 内/間 operator/オブザーバー分析20を実行するデータ集録とデータ分析フェーズの両方で主観による 2次元データに基づく心機の 2D 超音波イメージングおよび 3 D 評価の演算子/観察者バイアスを避けるため。
    注: 新しい人材の育成と研究のスタートアップでこの主観定量化する必要があります、内/間 operator/オブザーバーを用いた最小化します。
  2. 演算子/オブザーバー 1 (少ない経験) で演算子/オブザーバー 2 (より経験豊富な) ≥ 6 コンセンサス測定を一緒に実行することによって両方のベンチを含む仕事に対してテストされ二人の内/間 operator/オブザーバーの分析を開始します。超音波診断装置 (操作) と関連するパラメーター (観測) の後続の分析。
  3. 演算子と観測者の間で合意に達するし、動作 (オペレーター/オブザーバー 1) ≥ 6 に関連するデータを取得する超音波システム動物 (操作 1.1)。
  4. 直後、(オペレーター/オブザーバー 2) 同じ動物 (操作 2.1) の関連性の高いデータを集録する超音波システムを動作します。
  5. 動物が 3 日間の回復をしましょう。その後、プロシージャ (操作 1.2) (オペレーター/オブザーバー 1) を繰り返します。
  6. (オペレーター/オブザーバー 1) (操作 1.1/観測 1.1; 操作 2.1/観測 1.1 操作 1.2/観測 1.1) の全測定データを分析し、24 h 後オペレーター/オブザーバー 2 のデータ (操作 2.1/観測 1.2) の分析を繰り返します。
  7. (オペレーター/オブザーバー 2) 自分 (操作 2.1/観測 2.1) で取得したデータを分析します。この解析によって得られる値が真の値に近いと見なされますことに注意してください。
  8. 変化、傾向、およびブランド アートマン プロット、QQ プロット、 tを使用して取得したパラメーターはすべての比較でバイアスを評価・ テスト (等しい平均) とF-テスト (等分散) (図 6)。
    1. 操作 1.1/観測 1.1 対操作 2.1/観測 1.1 比較オペレーター間の変化を示しているに注意してください。
    2. 操作 2.1/観測 1.1 対操作 2.1/観察 2.1 比較検者間の変化を示しているに注意してください。
    3. 操作 1.1/観測 1.1 操作 1.2/観測 1.1 比較対内オペレーター変化を示しているに注意してください。
    4. 操作 2.1/観測 1.1 操作 2.1/観察 1.2 比較対内オブザーバー変化を示しているに注意してください。
  9. さまざまな測定値の変化と平均が 4 の比較; 非有意差を確認します。測定値の差が ± 1.96 標準偏差内に収まるように、小さくも大きな値の精度が低い傾向がない表示されます。

6 麻酔のアホロートルの 3次元心エコー法

  1. 3次元計測
    1. (ステップ 1.3.1) 唇の形をした動物のベッドで仰臥位に麻酔のアホロートルを配置します。ゆるいゴムバンド (図 1) を使用して浮動小数点から固定し、中の 3-5 mm で胸部の表面が覆われているかどうかを確認します。3 D の買収は、長い手順、測定を通して安定した心機能を確保するため超音波媒体として麻酔液とします。
    2. (矢状 3 D の記録) のための動物の長い軸に平行または直交軸 (横 3 D 記録) を胸部に動物の正中線に探触子を置きます。
    3. 面内寸法 (xとy) とそれ以降の 3 D キャプチャで心臓領域全体が覆われることを確保するための面外寸法 (zまたはスライス) の探触子を変換します。
    4. いずれかの '一般的な画像」を選択することによってフレーム レートと必要に応じて、空間分解能を調整 (高/低空間時間分解能) または '心臓病' (低空間/高時空間解像度) モード。0.33 Hz の < HR < 1 Hz 50-150 段階に再構築する心臓のサイクルでは、高分解能 ('一般的なイメージング') で得られた 50 フレーム/秒の時間分解能を使用します。
    5. 解剖学的構造がほとんど生の B モード画像の認識レベルに '2 D ゲイン' を調整 (~ 5 dB) 信号-に-ノイズ比を高める - 最終的な再建でします。
    6. 各スライス (z ステップ)、≥ 1000 フレームを記録します。
    7. 時間、例えば、20 μ m または 50 μ m で探触子 z 一歩を翻訳し、心臓領域全体が覆われるまでの記録を繰り返します。
  2. 3 D 再構成 (補足ファイル 13および14)。
    1. デジタル画像と通信医学 DICOM (リトル エンディアン) に買収をエクスポートします。
      注: フレームのセット数を含む各スライスは 1 つのファイルを作成します。
    2. 全心周期内のフレーム数を決定します。HR は、時間とともに変化することができますとこれは、最初と最終のスライスか。後でことができる段階の解像度の初期上層推定減少 (ステップ 6.2.8)、サイクルあたりのフレーム数の最大数を設定します。
    3. トリミング境界を決定して、B モード ウィンドウの周囲の無関係なスペースをします。
      注: これらの境界は、スライス全体で一定にする必要があります。
    4. 32 ビット RGB カラー画像に変換します。
    5. スタックと式を使用して最初の心臓サイクルに含まれるフレーム数で各フレームの相関値 (C) を計算します。
      Equation 6(6)
      注: ここでEquation 7(i、 j) 座標にあるピクセルの信号強度は、最初の画像Equation 8、2 番目のイメージでは、同じEquation 9、 Equation 10 、 Equation 11 、Equation 12平均強度と標準偏差、それぞれ、比較、およびIとJの最初と 2 番目の画像の画像の行と列の番号です。相関値の結果の配列が心周期あたりのフレーム数と (例えば図 8で 75 × 1,000 = 75,000) スライスあたりのフレーム数の合計数の積のサイズ (補助で模範的なスクリプトを参照してください。ファイルの 16)。しかし、これは超音波画像の可能性が高いではない相関値を比較のイメージの一方または両方が 0 の画素値の標準偏差計算できません。
    6. 相関値 (図 8 a、極大を自動的に検出する補助ファイル 17模範的なスクリプトを参照) の配列の局所的な極大値を検出します。
    7. 相関のピーク値のフレームの二次平均Q(AVG) を計算する (すなわち、心臓フェーズと一致する) 数式を使用して。
      Equation 14(7)
      N心臓フェーズに一致するフレームの合計数は、Equation 15は、 n番目のイメージの座標 (i、 j) のピクセルの輝度とEquation 16Equation 17の時間の算術平均は、 n番目画像の (補足のファイル 18で模範的なスクリプトを参照してください)。
    8. すべてのスライスのステップ 6.2.3-6.2.7 を繰り返します。
    9. わかりやすい解剖学的構造 (例えば、半ば心室) スライス (参照スライス) を選択し、再構築されたアンサンブル平均心拍、1 サイクル (すなわち、追加がある場合に対応1 つ以上の心周期の段階)。1 つの心臓サイクル (例えばから、過大評価 75 フェーズ/サイクル (現実には、1.07 サイクル) で図8図8 70 フェーズを含む 1 つのサイクルに行く) を生成するための追加のフェーズを削除します。
    10. 隣接スライス (テスト スライス)、並べ替えアンサンブル平均 1 つの心周期t-相関値式 (式 6) を使用して参照スライスと心臓のフェーズに一致するスタック (補足ファイル 19 で模範的なスクリプトを参照してください。と20 の補足ファイル)。
      注: 2 つの非同一スライスしない表示されますが任意の時点で完全に似ている心臓のサイクル中に、十分に小さいステップ サイズ (例えば、20 μ m または 50 μ m) と隣接するスライスが発音している類似点相関の結果値マキシマ フェーズに一致するのに変換することができます。
    11. すべてのスライスのステップ 6.2.9-6.2.10 を繰り返します。
    12. Zスライスとtフレームを含む単一の 3 D タグ付きのイメージファイル形式 (TIF) または DICOM ファイルのスタックには、全体の 3 D 再構成を折りたたみます。
      注: データは、サイズを小さく、信号対雑音比の増加、等方性のデータを生成するには、各ディメンションのビニングできます (平面内の解像度は通常いくつかのひだの面外の解像度よりも高い)。

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Representative Results

アホロートルの心膜内領域は動物のサイズに依存しています。(2-20 g、7-15 cm) のより小さい動物が心嚢液 (暗い心エコー法で表示される) を取り巻く心臓チャンバー室に、心膜内の大部分を占める大きな性的に成熟した動物 (> 20 g、> 15 cm) で、超過分があります。スペース。アホロートル心観心エコーの代表的な結果を得るのため最善の概要を提供するために (10 g、10 cm) より小さな動物は図 3図 4図 5図 9に適用されました。

長い軸のビューは一般的に、ウーパールーパーの心臓解剖学の概要を提供します。心室の平面 (図 3-H) または心房の平面 (図 4 a 面 (図 3 aB、補助ファイル 2)、ウナギ静脈洞、心房、心室の一部と正中面で入力 -D) 動物の左右方向に探触子をそれぞれ変換することによってアクセスできます。心室が球と高 trabeculated に表示されます (図 3、補助ファイル 3-5)、心房が不規則形状とほとんどない肉 (図 4 a, 補足ファイル 6、 7 の補足ファイル)。短い軸のビュー (図 5 a, B、補助ファイル 10) の概要をより簡単に解釈アホロートルの心臓の解剖の心しかし、それは正しい心筋収縮 (例えばの評価に貢献します。、循環心室の梗塞や非契約のゾーンは、明らかにこのビュー平面で可視化)。長い軸ビュー平面の流出路の中心は (図 2 a、および比較図 3と図 4 eと補足ファイル 3 補足ファイル 8 室の中央に密接に配置されます。).パルス波ドップラー長い軸と斜め paragill 平面の両方を用いて心臓サイクル中に高強度の血液信号をから低雑音で隣接、流出路の軟部組織は、血液の駆出時に移動されます、ので、周囲の軟部組織 (図 4および図 5Eの速度/時間カーブの白い領域を囲む灰色の領域) の動き。(図 4 (g1 倍率) および図 5E (e1 倍率)) の速度の時間積分を測定するとき一般的に、血液信号とノイズ軟部組織間のコントラストが血液信号のみをセグメントに十分な大きさにする必要があります。

血流パターンの質的評価のため色ドップラーと力ドップラー イメージングを提供異なる心室内流れの可視化 (心室:図 3E-H、補助ファイル 4、 補足ファイル 5;アトリア:図 4 C、D、補助ファイル 7;流出路:図 4 f 5 D を図、補足のファイル 9、補助ファイル 12)。

ウーパールーパーは絶滅研究室実験用 10-30 g で完全な成熟に 2-4 g の初期のポスト幼虫の段階からサイズが異なるし、同様に > 100 g. の重量を量るより大きい動物、心機能やここで説明した機能のパラメーターのいくつか絶対値は異なります動物のサイズ。一般的には、小数の領域の変更は (より大きい動物が低値の方に偏って) 40-50% までの値の異なるサイズのグループで一定です。ストローク量は動物、すなわち、例えばからまで 5 g ウーパールーパーは絶滅で 20-30 μ L、10 g ウーパールーパーは絶滅の 50-70 μ、50 g ウーパールーパーは絶滅で 250-300 μ L、心臓の大きさのサイズに大きく依存します。心拍数およびいくつか程度ストローク ボリュームに適用される麻酔薬および麻酔 (図 6A-F図 7) のレベルに大きく依存します。

伝統的な内/間 operator/オブザーバーを分析するグラフィカルな表現 (Q-Q プロットと継ぎプロット) と等しい平均のテスト (t-テスト) と分散 (F-テスト) データの正規分布を評価し、比較するには精度と二人 (図 6) の間の精度。

3 D 心エコー検査より伝統的な 2 D 買収に (zまたは深さ) は、追加のディメンションを追加します。これにより、分割、表面および容積の再構成 (図 9、補助ファイル 13、および補助ファイル 14) 作成 (図 9 b) データ (図 9 a) の多平面の可視化と3 D モデル (図 9 C、補助ファイル 15) の世代。

Figure 1
図 1。心エコー検査のベッドとコンテナーの準備麻酔とウーパールーパー無麻酔。(A) A ソフト一枚の布を一度折り畳まれ、「ブリトー」形状に圧延します。(B) 両端を曲げてし、水中のスキャン中に、ウーパールーパーの唇の形をしたベッドを形成するテープします。(C) 麻酔アホロートルの 2 D と 3 D エコー動物は優しくベッドの形し、半ば下顎と仙骨領域にゴムバンドで固定の唇の隙間に仰臥位で配置されます。(D, E)ハンモックは、発泡スチロールの部分に四角い穴を切り開くと、上面にラップをテーピングによって準備されます。(F) 無麻酔アホロートルの 2 D 心エコー検査、動物はハンモックで自然発生しやすい位置に配置、下からゲル屋根付き探触子の先端に接近します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2。探触子の配置。(A, B)長軸と短軸ビュー (A) と斜め paragill ビュー (B) 用トランスデューサーのおおよその位置と、ウーパールーパーの幹線ネットワークのモデル。冷たい光の強力なソースで (C) 透視は探触子を適用する前に、心室の正確な位置を見つけることで助けることができる (補足のファイル 1を参照してください)。解剖学的略語: A、アトリア。OFT、流出路;SinV 洞静脈;V、心室。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3。心室の代表的な長い軸心エコー ビュー 。(A, B)典型的な長い軸正中線ビュー B モード (図 2 aの黄色線) を心室末期 (A) と (B) の収縮末期段階で (映像表現の補足のファイル 2を参照)。(C、 D)B モード (図 2 aの黒い線) を心室 (C) 末期と収縮末期 (D) フェーズ (映像表現の補足のファイル 3を参照) で心室の長い軸のビュー。(E-H)(A) のように同様のビュー平面と (B) 色ドップラー (CD) と血を示す力ドップラー (PD) モードでフロー (映像表現の CD と PD-モードの補足ファイル 4と補足ファイル 5を参照それぞれ)。CD モードの画像で赤い色を示す探触子に向かって流れる血と青い色が反対を示します。心室と血流は、点線で示されています。(A) の挿入漫画と探触子と長い軸正中線を基準にして翻訳の (C) を配置を表示します。解剖学的略語: A、アトリア。DC(L)、キュビエ; のダクトを左OFT、流出路;SinV 洞静脈;V、心室。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4。代表的な長い軸心エコー観アトリアと流出路。(A, B)B モード (図 2 aでグリーン ライン) を心房 (A) 末期と収縮末期 (B) フェーズ (映像表現の補足ファイル 6を参照) で心房の長い軸のビュー。(C、 D)(A) のように同様のビュー平面と (B) の血を示す色ドップラー (CD) モードでフロー (映像表現の補足ファイル 7を参照)。中間排出段階で B モード (図 2 aの青線) の流出路 (E) 長い軸のビュー (映像表現の補足ファイル 8を参照)。F:CD モード示す血液中 (E) のように同様のビュー平面の流れ (映像表現の補足ファイル 9を参照)。(G) と同様のビュー平面 (E) のように (F) とパルス波ドップラー (PW) モード熱速度検出と速度時間積分 (VTI) 測定ストローク ボリューム計算を可能にします。CD モードの画像で赤い色を示す探触子に向かって流れる血と青い色が反対を示します。心室と血流は、点線で示されています。黄色と赤の矢印は、流出路と流出路でスパイラル バルブの根元の半月弁をそれぞれ示します。(A) の挿入漫画と探触子と長い軸正中線を基準にして翻訳の (E) を配置を表示します。解剖学的略語: A(R)、右房;左心房; A(L)OFT、流出路;SinV 洞静脈;V、心室;VC、上大静脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5。代表的な短い軸と心室と流出管の斜め paragill 心エコー ビュー 。(A, B)B モード (図 2 aの灰色線) を心室 (A) 末期と収縮末期 (B) フェーズ (映像表現の補足ファイル 10を参照) で心室短軸ビュー。中間排出段階で B モード (図 2 bの紫線) 流出路 (C) 斜め paragill ビュー (映像表現の補足ファイル 11を参照)。(C) のように CD モード示す血中同様ビュー平面を (D) の流れ (映像表現の補足ファイル 12を参照)。(C) のように同様のビュー平面を (E) (D) 熱速度検出と速度時間積分 (VTI) 測定ストローク ボリューム計算を可能にするパルス波ドップラー (PW) モードで。CD モードの画像で赤い色を示す探触子に向かって流れる血と青い色が反対を示します。心室と血流は、点線で示されています。(A) の挿入漫画と探触子と長い軸正中線を基準にして翻訳の (C) を配置を表示します。解剖学的略語: A、アトリア。OFT、流出路;SinV 洞静脈;V、心室。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6。心拍数とストローク ボリュームの測定、麻酔と代表の内/間 operator/オブザーバー分析の効果の代表の結果。(A-C)無麻酔ベースラインを基準として心拍数 (HR) は (A) ベンゾカイン、MS-222 (B)、(C) プロポ フォール麻酔 6 ウーパールーパーは絶滅の時刻 (0 h は完全麻酔で) にプロットされます。(D-F)行程容積 (SV) 時間 (0 h は完全麻酔) 6 ウーパールーパーは絶滅ベンゾカイン (D)、(E) の MS-222 では麻酔をかけてプロット無麻酔ベースラインを基準として、プロポ フォール (F)。(G) ストローク ボリュームの内/間 operator/オブザーバー分析。継ぎプロット [演算子 (Op) の違い (Dif)/オブザーバー (Obs) 平均 (平均) に対してプロット] さまざまな演算子とオブザーバーによって得られる (Q-Q プロット) 正規分布の測定で組織的な先入観を明らかにする必要があります。同じ意味のテスト (t-テスト) と等しい分散 (F-テスト) 演算子/オブザーバー (右下にテーブル) 間で有意差を明らかにする必要があります。A-Fはクリエイティブ ・ コモンズ表示ライセンス (図 1 Thygesenらの下で利用できる材料から変更されました。21).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7。幾何学的とパルス波ドップラー法によって推定されるストローク ボリュームの比較。二次元 B モード (geo) 幾何学的な測定または血流出路を終了する速度のパルス波ドップラー測定によって推定量 (SV) の比較。SV(geo) と SV(pw) は同じ 6 動物の間に 2 つの測定の種類と 3 つ異なる麻酔薬、ベンゾカイン (青い傾斜正方形)、MS-222 (赤い四角形) を使用して秒単位で記録および回復の間の一週間 (緑の三角形) プロポ フォール別の麻酔薬を適用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8。3 D 心エコーの代表的な時空間画像相関します。(A) 曲線の心周期あたり 75 フレーム 1,000 フレーム シネ データセットで, 相関演算のもたらした相関値の表示。心臓のフェーズに一致するを示す小さい相違だけで 2 つのフレームは、高い相関値を得られます。その後局所的な極大値探索アルゴリズムはすべての一致するフレームを検出するデータに適用できます。(B) (A) のように同じデータのグラフィカル表現。相関関係の値を取得するには、全体のシネ ・ スタックで最初の心臓サイクルの比較、相関関係を最大限の斜めの線は心臓フェーズに一致するを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9。代表的な 3 D 心エコー検査します。(A) 3 D 再構成アホロートル心の多平面のビュー。時空間画像の相関手順完全心拍数明瞭な段階の再構築が可能 (ここでは 70 の段階) における時空間現象の目的の調査のためのものとして、スライスできる 3 次元の空間で心臓の鼓動。(B) 3 横スライス再構成 115 の 3 D データをスライスします。プロシージャの平均二次血液-組織のコントラストを高め、trabeculated アホロートル心室性および心房中隔の明確に可視化のより良い理解を可能にする信号対雑音比を下げると、流出路の弁。色分けされたに沿って 3 つのフェーズでの心臓の鼓動の (C) 表面および体積表現モデルをセグメント化 (表面および体積レンダリング暴行の映像表現の補足ファイル 13と補足ファイル 14を参照心、三相セグメント化されたインタラクティブな 3 D モデルの補足ファイル 15 )。解剖学的略語: A、アトリア。カウ、尾;Cra、頭蓋;デックス、デクスター (動物に右);ドールの背。OFT、流出路;罪、不吉な (動物に左);SinV 洞静脈;V、心室;Ven、腹側。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

の補足ファイル 1。透視で心室を検索する、アホロートル。図 2を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

2 の補足ファイル。長い軸、正中線表示、B モード。図 3 a Bを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 3。長い軸、心室ビュー、B モード。図 3は、Dを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 4。長い軸、心室ビュー、カラードプラ モード。図 3 eFを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 5。長い軸、心室ビュー、力ドップラー モード。図 3Hを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 6。長い軸、心房ビュー、B モード。図 4 a, Bを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 7。長い軸、心房の眺め、カラードプラ モード。図 4は、Dを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 8。長い軸、流出管ビュー B モード。図 4 eを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 9。長い軸、流出管ビュー、カラードプラ モード。図 4 階を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 10。短い軸、心室ビュー B モード。図 5 a, Bを参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 11。斜め paragill、流出管表示、B モード。図 5を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 12。斜め paragill、流出管ビュー、カラードプラ モード。図 5を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 13。70 の段階 (19.6 ms 時間分解能) で心臓の三次元表面のレンダリング。図 9を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 14。70 の段階 (19.6 ms 時間分解能) で心臓の三次元ボリュームレンダ リング。図 9を参照してください。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 15。3 段階で心臓の三次元インタラクティブ モデル: 心室の終わり収縮、半ば心室および心室の終わり収縮。図 7を参照してください。インタラクティブな PDF ファイルは、アドビ アクロバット リーダー 9 以上に表示必要があります。3 D 機能を有効にするには、モデルをクリックします。カーソルを使用して、回転、ズーム、モデルをパンすることが可能です今、モデル ツリー モデルのすべてのセグメントをオン/オフまたは透明にできます。モデルツリーは、することができますいくつかのサブ層を含む階層を開く (+) です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 16。代表者注釈 75 フレーム/心臓サイクルの上層推定 1000 フレーム集録の相関値を計算するスクリプト。スクリプト IJ1 マクロ言語で書かれているし、全体のzの間相関値 (獲得あたり 75,000) を計算する ImageJ でバッチ マクロとして実装することができます-3 D データのスタック。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 17。75 フレーム/心臓サイクルの上層推定 1000 フレーム取得から相関値の一連の自動ピーク検出の代表的なスクリプトです。相関の値 (列 B、黄色でマークされた) のシリーズを置き換えることができます、マクロ (Ctrl + r) の活性化後心臓フェーズに一致するを選択し、二次の平均を実行するコマンドの一覧になります (列 Q、緑色でマーク) を表示します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 18。代表は注釈心臓フェーズに一致するを選択し、75 フレーム/心臓サイクル (補足ファイル 17 列 Q) の上層推定 1000 フレーム集録の二次平均を実行するスクリプトです。スクリプト IJ1 マクロ言語で書かれているし、アンサンブルを作成する ImageJ でマクロ平均 1 サイクル (75 フェーズ) の 2D スライス、実装できます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 19。代表者注釈 70 フレーム参照スライスと、隣接する 75 フレーム テスト スライスとの間の相関値を計算するスクリプト。スクリプトは、IJ1 マクロ言語で書かれている、相関値 (5,250) を計算する ImageJ でマクロとして実装することができます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

の補足ファイル 20。一連の 70 フレーム参照スライスと、隣接する 75 フレーム テスト スライス間の比較から相関値の自動ピーク検出の代表 Excel スクリプト。一連の相関値 (列 C、黄色でマークされている) を置き換えることができます、マクロ (Ctrl + t) の活性化後テスト スライスで substack になるように選択するスライスの一覧表示 (列 L、行 2、緑でマークされて)。テスト スライス substack、空間参照のスライスにフレームを一致しています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

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Discussion

心エコー図、ウーパールーパーや他の非哺乳類種で大人の哺乳類を除くすべての脊椎動物の赤血球の核の性質のため哺乳類のエコーとは根本的に異なるデータが得られます。これは、結果、顕著な血信号と血液-組織コントラストはアホロートル心エコー画像などマウスまたは人間の心エコー図と比較して少ない。これできます画像の領域分割未処理の単一フレーム超音波画像上より難しく組織から血液を区別するは難しいこと。ただし、この現象は血液を作成するために使用する場合することができます信号手順を平均二次を適用することによって強化された画像18を前述し、プロトコルのセクション 6 でウーパールーパーを心エコー法の変更します。血斑点は軟部組織であるものよりもはるかにダイナミックなので二次平均 2 つと 3 つの次元の画像の領域分割を容易にこれらの 2 つのコンパートメント間の顕著なコントラストが生成されます。

このプロトコルでは、徹底的にされているウーパールーパーは21でテスト以前の 3 つの異なる麻酔について説明します。ベンゾカインと MS 222 は、ストレス条件下における心機能をテストするとき望ましいできる心拍数の増加を刺激します。プロポ フォールは麻酔中に心にストレスの少ないを誘発し、集録時間が無麻酔ウーパールーパーは絶滅で座りがちな動作の限界を超える状況に耐える心エコー検査の置換として使用可能性があります。

3 D の中心を記述する 2D のエコーは、主観に影響されます。したがって、それはプロトコル セクション 5 で説明されているように実際の実験を行う前に実施や内/間 operator/オブザーバー解析することが不可欠です。同様に、心エコー測定は、絶対値ではなく、さまざまな状況下における心機能の潜在的な違いを調査する適用することができますインデックス値としてより表示すべき。幾何学的方程式 (式 2) によってほとんど決まりますストローク ボリューム パルス波ドップラー式 (式 4; として同じ絶対値が得られます図 7) べきだと一連の実験中に付着する測定することを決めた。しかし心室形状の球形仮定が健康な心を均一に契約にのみ適用され、SV(pw) のよりよい反射に考慮すべき疾患と再生のモデルに、SV(geo) を SV(pw) より迅速に得ることができます。真のストローク ボリューム。

相関と二次平均プロトコル セクション 6 の手順は、いくつかの異なる画像と数学パッケージに実装できます。ほとんどの研究者は (たとえばExcel) に精通しているソフトウェア パッケージのメソッド代表的なスクリプトを提供することに向かって図りプログラミングのスキルやソフトウェア パッケージへのアクセスは、生命科学研究者の内で大きく異なる、ので自由に利用できると簡単に近づいている (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。補助ファイル 16-20は、コーディングで最小の経験がなくても理解する必要があります .xlsm のマクロとして IJ1 マクロ言語で書かれた注釈付きの模範的なスクリプトを提供します。

小さな種 (人間) を基準にしての心の中にのみ見られる現象であり、心臓の大きさによって測定と再生時にベースライン心機能と機能的な進歩のイメージングに挑戦したがって本質的な心臓再生と適用されるイメージ投射様相の空間分解能。高周波超音波画像化により、高い面内空間分解能との間の望ましいトレードオフ (~ 30 x 30 μ m2 50 MHz で) イメージングおよび生体内のµMRI よりはるかに高い生体内のµCT に匹敵するであるの深さを持っています。浸透 (〜 50 MHz で 1 cm) いくつかを共焦点顕微鏡と非常に高い時間分解能 (50 MHz、1 cm の深さで 50-300 フレーム/秒) より大きい折る。超音波探触子の手動または自動のz次元の動きと相まって、心機能と 4 つのディメンションで解剖学的モデリングの比類のない再建ができます。さらに、技術の非侵襲的な性質は縦実験のためことができます。我々 の知識がない現在マトリックス アレイ探触子高周波マイクロ超音波イメージングのために利用できます。この技術の開発は、機械的に探触子を移動するよりも高速な手順でアホロートルのような小さな心の 3 D データの取得を助けるだろう大幅.

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

カスパー ・ ハンセン、バイオ サイエンス研究所、3 D 心エコー取得へのアクセスと電子のマニピュレーターに援助を提供するためオーフス大学を認識したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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医学、問題 141、心エコー検査、超音波、心臓、心臓超音波検査、再生、アホロートル、アホロートル メキシコマンネングサ、時空間画像相関法
ウーパールーパー (<em>アホロートル メキシコマンネングサ</em>) で 2 D および 3 D 心エコー検査
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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