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Medicine

Axolotl (Ambystoma Mexicanum)에서 2 차원 및 3 차원 심장 초음파 검사

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

여기 axolotl 도롱뇽 (Ambystoma mexicanum), 심장 재생에 모델 종 뛰는 심장의 2 차원 및 3 차원 이미지 수집을 위한 심장 초음파 프로토콜 선물이. 이러한 메서드는 심장 기능 spatiotemporal 고해상도 경도 평가 대 한 수 있습니다.

Abstract

허 혈 성 심장 질환으로 인해 심장 고장 주요 도전 이며 마음에 재생 치료 높은 수요에 있습니다. Zebrafish, 본질적인 심장 재생 수 있는 도롱뇽 등 몇 가지 모델 종 인간 환자에 대 한 미래의 재생 치료를 위한 약속을 개최. Cardioregenerative 실험의 결과 평가 하는 심장 기능을 모니터링 할 수 있습니다 필수적입니다. Axolotl 도롱뇽 (A. mexicanum) 심장 기능의 평가 대 한 수 있도록 크기를 달성 재생 생물학에서 기초가 튼튼한 모델 종을 나타냅니다. 이 프로토콜의 목적은 reproducibly 심장 초음파를 사용 하 여 axolotl에 심장 기능을 측정 하는 방법을 설정 하는 것입니다. 다른 마 취약 (benzocaine, MS-222, 그리고 propofol)의 응용 프로그램 시연 및 마 취와 unanesthetized axolotls에서 2 차원 (2D) echocardiographic 데이터 수집 설명. 3 차원 (3D) 심장의 2D 심장 초음파 부정확성에서 고통을 수 있습니다 및 주관의 측정, 그리고이 현상 단단한 방법, 즉 내/남북 operator/관찰자 분석, 측정 하 고 최소화이 바이어스를 완화 하는 시연. 마지막으로, 발음된 혈액 조직 대비 매우 높은 spatiotemporal 해상도 뛰는 axolotl 심장의 3D echocardiographic 데이터를 수집 하는 방법을 설명 합니다. 전반적으로,이 프로토콜 심장 기능 및 모델 분석, 평가 하는 데 필요한 메서드를 제공 하 고 초음파 영상 재생 생물학 및 일반 생리 실험에서 응용 프로그램과 함께 사용 하 여 axolotl에서 역학 흐름 해야 합니다.

Introduction

허 혈 성 심장 질환 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 비록 많은 빠르고 미세 의료 개입으로 인해 심근 경색 생존, 인간에서 허 혈 성 사고 자주 이어질 fibrotic 흉터 비 대, 전기 고장 및 심장의 기능 저하 용량와 관련 된 . 심장 조직 재생 잠재력의이 부족 포유류 가운데 공유 되 고 있지만 포유류 심장 재생의 논란이 주장 보고 되었습니다, 이러한 특정 murine 긴장3,4 로 제한 되었습니다 및 hypoxia 쥐5취급. 따라서, 심장 재생 의학 및 생물학 분야의 본질적인 심장 재생 현상 연구에 비 포유류 동물 모델에 일반적으로 제한 됩니다. 제 브라 (Danio rerio) 지난 10 년에 설립 되었습니다 내장 심장 재생6,7,,89,10에 대 한 가장 잘 성격을 나타낸 모델 . 쉽게 실험실 유지 보수, 짧은 생성 시간 및 분자 도구를 사용할 수의 광범위는 zebrafish 심장 개발 및 재생 기본 유전 및 분자 메커니즘에 대 한 모델로 잘 적응은. 그러나, zebrafish 심장의 작은 크기 적은 기능 평가 적합 그것 만들고 복잡 한 수술 절차는 제 브라의 비 tetrapod 계통 제한 따라서이 종에 있는 발견의 합리적인 추정 다른 큰 tetrapod 모델의 사용을 정당화. 척추 심장 재생의 초기 모델 중 하나는 꼬리가 양서류, 동부 영원 (Notophthalmus viridescens)11, 남아는 귀중 한 모델12종 이었다.

최근 몇 년 동안에서 다른 꼬리가 양서류, 멕시코 axolotl (A. mexicanum)는 대형은 장면에 들어갔다 (최대 100 g 바디의 질량)와 높은 실험실 적응할 수 있는 동물 모델 사지 재생, 확장 재생 분야의 광범위 한 척수 부상, 고 심장 재생13,14,15,,1617. axolotl 매우 높은 주파수 심장 초음파를 사용 하 여 심장 기능 측정 의무가 이며 초음파 이미징 (음향 이미지 유물 훨씬 낮은 수준에 대 한 수의 심장의 복 부 측에 석 회 질된 구조 부재 숨기기와 특히에서 반향) 보다 석 회화 흉 골과 늑 골을 가진 다른 모델 동물에서 관찰.

다음 프로토콜에 설명 합니다 일부의 방법 및 준비 (그림 1, 그림 2) 취 둘 다에 axolotl 마음에 재현 echocardiographic 측정을 취득 (3 개의 다른 마 취약을 적용: benzocaine, MS-222, 그리고 propofol) 두 동물을 unanesthetized 하 고 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7, 보충 파일 1-12), 3 (그림 8, 그림 9, 보조 파일 13-14) 공간 차원. 수 륙 양용 마음은 3 연 발 (2 심 방 그리고 단일 심 실). 심 방 큰 공동 venosus에서 제공 하는 및 conus arteriosus 유출 관 (그림 2)에 심 실 빈. 때문에 대부분 강조는 전통적으로 심 실 재생에 배치 및 심 방6,7,8,9,,1011 의 회복에는 더 적은 , 12 , 14 , 17이 프로토콜은 주로 심 실 기능 측정에 집중 한다.

수 륙 양용 심장 초음파는 문학에서 잘 설명 그리고이 문서에서 설명 하는 2D 방법의 개발은 주도 되었습니다 최고의 대표 필요에 의해 구타 axolotl 심장의 기능 주어진 시간과 실험 설정에. 따라서, 여기에 설명 된 방법을 어디 심장 기능 모니터링 할 수 있습니다 반복 해 서 재생 프로세스의 과정을 통해 심장 재생 실험에 적용 됩니다. 또한, 메서드는 axolotl에 cardiophysiological 실험에서 일반적 적용 수 있습니다 또는 다른 꼬리가 또는 anuran 수 륙 양용 모델 (e.g.,Xenopus)에 걸쳐 약간 수정. 그러나 axolotl에 존재 하는 여러 다른 긴장 및 색상 변화 (예를 들어, wildtype, melanoid, 화이트, 흰둥이, 유전자 변형 흰색 녹색 형광 단백질 식),이 특성은 영향을 주지 않습니다의 호환성은 axolotl 설명 프로토콜입니다. 3D echocardiographic 데이터를 얻기 위해 여기에 설명 된 방법은 spatiotemporal 이미지 상관 (스틱) 기술 개발 임상 초음파 및 방법을 설명한 이전 개발 닭고기를 평균 하는 이차의 수정된 된 버전 종 nucleated 적혈구18,19를 포함 하는 부드러운 조직에 혈액 얼룩의 신호를 향상 시킵니다. 이 메서드는 심장 수축과 axolotl에 계산된 유체 역학의 고급 모델링에 대 한 수 있습니다.

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Protocol

이 프로토콜에서 수행 하는 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가의 덴마크 법률에 따라 되었고 실험 덴마크 국가 동물 실험 검사자 (프로토콜 # 2015-15-0201-00615)에 의해 승인 했다.

1입니다. 준비

  1. Axolotl 준비 중.
    1. Axolotl 매체 비 화학적으로 처리 하는 고품질 수돗물을 적용 합니다. 이 사용할 수 없는 경우에, 40 %Holtfreter 솔루션을 적용 합니다.
    2. 15.84 g NaCl, 0.54 g CaCl2·2H2O, 1.11 g MgSO4·7H2O, 그리고 0.288 g 1 나의 볼륨까지 필터링 및 이온을 제거 된 물에서 KCl 용 해 하 여 40% (wt/vol) Holtfreter의 솔루션을 준비
  2. 침수 마 취약을 확인 합니다.
    1. 200mg 에틸 4-aminobenzoate 3 mL 아세톤에 용 해 하 고 다음 1 L 수돗물 또는 40 %Holtfreter 솔루션에이 혼합을 용 해 하 여 benzocaine (에틸 4-aminobenzoate) 마 취 솔루션을 준비 합니다.
    2. 200mg 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonic 1 L 수돗물 또는 40 %Holtfreter 솔루션에서 직접 산을 용 해 하 여 MS-222 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonic 산, 또한 일반적으로 tricane로 알려진) 마 취 솔루션을 준비 합니다.
    3. 3.3 mg 2, 6-diisopropylphenol에서 1 L 수돗물 또는 40 %Holtfreter 솔루션에 용 해 하 여 (2, 6-diisopropylphenol) propofol 마 취 솔루션을 준비 합니다. 3.3 mg/l.에 상업적으로 premade 해결책 또는 희석
      주의: Propofol 강력한 인간의 마 취 (정 맥 투여) 이며 주의 희석된 양식을 포함 하 여 처리 해야 합니다.
  3. 심장 초음파에 대 한 침대와 컨테이너를 준비 합니다.
    1. 부드러운 헝겊 조각의 70 cm x 55 cm를 한번 접는 하 고 다음 "버 리 토 모양"에 그것을 압 연 하 여 심장 초음파에 대 한 입술 모양의 동물 침대를 준비 (그림 1A). 다음 만날 때까지이 함께 (그림 1B) 테이프 끝에 벤드.
    2. 립 된 초음파 이미징 동안 마 취 axolotl에 맞게 axolotl 매체에 구조 잠수함 구조에 동물을 보호 하 고 느슨한 고무 밴드;를 사용 하 여 부유 방지 이러한 중간 악의 성 례의 영역 (그림 1C)에 배치 합니다.
      참고: 고무 밴드 해야 하지, 짠 다 동물을이 hemodynamics에 영향을 미칠 것입니다.
    3. Unanesthetized axolotls에 2D 심장 초음파, 16 c m x 8 cm x 33 cm x 27 cm (예를 들어, 중간 크기 발포 폴리스 티 렌 용기에서 뚜껑) 폴리스 티 렌 거품의 5 cm 블록 x 5 c m 구멍을 조각 하 여 해먹 준비 (그림 1D).
    4. 해먹 만들려고 스티로폼 블록 (그림 1E)의 윗 표면에 랩의 가장자리를 확보 하 고 구멍을 통해 플라스틱 랩의 33 cm x 27 cm 조각을 밀어. 해먹에서 깊이의 3 cm axolotl 매체를 추가 합니다. Unanesthetized axolotl 플라스틱 랩 (그림 1 층)을 통해 쉽게 복 부 액세스할 수 있도록 해먹의 하단 싱크대 것입니다.

2. anesthetize Axolotls

  1. Axolotl 원하는 마 취 솔루션 (benzocaine, MS-222, 또는 propofol)에 담가.
  2. 이 동물에서 10 분 이내 나타나는 진정, 감소 움직임과 righting 반사의 증가 손실의 첫 번째 징후에 대 한 검사 < 10 g (< 10 cm) 및 동물 10 g과 신체 질량 (10-22 cm) 50 g 사이에서 20 분 이내.
  3. 신체 움직임, 길 환기, 움직임과 righting 반사의 완전 한 부족에 대 한 검사 하 고 동물 자리 헐 곤란 하 여 테스트 중간 통증 자극에 응답 하지 않는 것을 확인.
    참고:에 불구 하 고 사실 그 전신 마 취 benzocaine axolotls에서 30 분 이내 수행 됩니다, 심장 기능 1 시간까지 안정 하지는. 이것은 MS-222 또는 propofol 경우 axolotls (그림 6A-F)을 취.
  4. 전신 마 취 아래 axolotl을 유지 하기 위해 마 취 솔루션에서 동물 또는 마 취 솔루션에 젖는 젖은 종이 잎사귀에 싸여 유지.
    참고: 마 취는 피부와 특히 아가미를 축축한 유지 7 h 동물의 웰빙에 부작용 없이 유지할 수 있습니다.
  5. Axolotl reawake, 마 취 없는 매체에 동물을 전송.
    참고: 깨달음의 첫 징후는 길 환기 움직임. 동물 강 직 하 고 1 시간 이내 자극에 반응 해야 합니다.

3. 2D 심장 초음파 마 취 Axolotl에

  1. 장소는 axolotl 입술 모양의 동물 침대 (단계 1.3.1-1.3.2)에서 부정사 위치에 취. 느슨한 고무 밴드 (그림 1C)을 사용 하 여 부유에서 그것을 확보. 흉부 표면 매체의 3-5 m m로 덮여 있는지 확인 합니다.
    참고: 간단한 수집 (< 5 분)에 대 한 마 취 무료 매체 적용할 수 있습니다. 장기 수집에 대 한 측정을 통해 안정적인 심장 기능을 보장 하기 위해 초음파 매체로 마 취 솔루션을 적용 한다.
  2. 놓고 변환기 흉부 지역에서 동물의 중간 선 (그림 2A, 그림 3A-B, 보충 파일 2) 동물의 긴 축에 평행. 흰색과 흰둥이 axolotls에 감기 빛 소스와 transillumination를 사용 하 여 변환기 (그림 2C 와 보충 파일 1)의 정확한 위치를 확인 하십시오.
    1. Axolotls < 20 g 무게, 사용 50 MHz 변환기; axolotls에 대 한 > 20 g, 40 MHz 변환기를 사용 하 여. 표준화 된 이미지 수집을 위한 오른쪽 두개골/앞쪽 방향으로의 위치를 확인 합니다. 이 경우가 변환기 회전 180 ° 또는 반전 이미지.
  3. 긴 축 중간 보기 심 (흉 강, 그림 2A에서 오른쪽에 위치)의 작은 부분에서 상당 부분의 왼쪽 및 오른쪽 심 방 및 심 실 심장 프레임에 나타납니다 있는지 확인 (중앙에 위치 / 흉 강, 그림 2A에서 왼쪽)으로 약간 공동 venosus atrial systole와 심장 (그림 3A, B)에서 볼 수 있습니다.
  4. 변환기 1-3 m m 심 실 긴 축 보기 (그림 2A)를 동물의 오른쪽으로 번역 합니다. 정확한 위치는 때 끝 systole 심의 단면적 (그림 3C-H) 최대에 달성 했다.
  5. B 모드에서 취득 ≥ > 50 프레임/s 중 '제너럴 이미징'에 3 심장 주기 (높은 공간/낮은 시간적 해상도) 또는 '심장학' (낮은 공간/높은 시간 해상도) 모드.
    참고:이 보기는 심 실 기능 평가 대 한 수 있습니다. 심 실 기능 끝 확장기 및 끝 심장 수축 교차 단면 영역에서 심 실 (CSAv)의 방정식을 사용 하 여 계산 된 심 실 소수 지역 변경 (FACv)를 사용 하 여 두 가지 차원에서 평가 될 수 있습니다.
    Equation 1(1)
    Axolotl의 심 가정 구형 모양 및 형상 기반 선 볼륨 [SV(geo)] 방정식을 사용 하 여 산출 될 수 있다:
    Equation 2(2)
  6. 우 심 실의 센터 화면 때까지 동물의 긴 축 따라 변환기를 번역 합니다. 트랜스듀서(그림 5A 와 B, 보충 파일 10) 중반 심 실 짧은 축 보기를 시계 방향으로 90 ° 회전 합니다. 심장의 긴 축 따라 변환기를 변환 하 여 우 심 실의 원형 형태를 평가 합니다.
  7. 긴 축 평면에 변환기를 반환 하 고 그것을 번역 하는 중간 선 또는 다시 심 긴 축 두 챔버 보기 (그림 2A)를 중간의 왼쪽에 약간. 올바른 위치 끝 systole atria의 횡단면 지역에 그들의 맥시 마는 고 두 심 방 결합 가정 숫자 '8' 기울이면의 개요를 확인 하 여 얻을 다는 것을 확인 ~ (그림 4A 와 B, 왼쪽으로 45 ° 보조 파일 6)입니다.
  8. B 모드 인수 ≥ > 50 프레임/s '일반적인 이미징' 또는 '심장' 모드에서 3 심장 주기.
    참고: axolotl의 atria는 모양에서 일정 및 3D 기능 유추할 수 없습니다 직접 2D 데이터에서 그들의 기능 둘 다의 결합된 교차 단면 면적 (CSAa)에 따라 심 방 소수 지역 기회 (FACa) 같은 인덱스 측정으로 평가 되어야 합니다 따라서 systole에 심장 심 실:
    Equation 3(3)
  9. 유출 관 (conus arteriosus) (심 실 긴 축 보기) 가까이 나타날 때까지 오른쪽으로 변환기 변환 (그림 2A).
    참고: 떠난 후 앞쪽 방향으로 심, 유출 관 날카로운 벤드 만들고 다시 앞쪽 방향으로 가정 하 고 길 지점과 조직의 혈관 분할 하기 전에 복 부 표면으로 작은 각도로 실행 합니다.
    1. 정확한 유출으로 보기 유출의 직경은 실의 끝-systole에서 최대 및 유출 입구에 3 개의 semilunar 밸브의 2 개는 중간 방출 (그림 4E에서 볼 수를 확인 하 여 얻을 다는 것을 확인합니다 보조 파일 8)입니다.
      참고: 변환기 유출 관의 중간 부분으로 복 부 방향 도플러 이미지를 사용 하 여 속도 및 흐름 측정 할 수 있습니다.
  10. (그림 4 층 및 보충 파일 9) 심장 방출 동안 유출 관에서 혈액 흐름 속도 매핑할 컬러 도플러 모드를 적용 합니다. 마찬가지로 컬러 도플러 및 파워 도플러 심 실 및 심 방 보기 (그림 3E-H, 보충 파일 4-5 및 그림 4C-D및 보충 파일 7)에서 혈액의 흐름을 시각화 하기 위해 이미징 적용 됩니다.
  11. 펄스 파 (비밀 번호) 도플러 모드 변환기 향해 실행 유출 관의 부분에서 최대 혈액 속도의 위치에 적용 됩니다.
    1. '빔 각도'와 '각도 보정'을 사용 하 여 최대 45 ° 트랜스듀서 (그림 4G)의 면에 완전히 수직이 되지 유출에 대 한 조정. PW 도플러 위치 (4E 그림) 심장 주기의 모든 단계는 유출의 나선형 밸브에 의해 하지 중첩 되 다는 것을 확인 하십시오.
  12. PW 도플러 모드 획득 속도/시간 데이터 ≥에 3 심장 주기.
  13. 정확한 동일한 평면에 3 심장 주기 ≥ 습득 하는 것 PWV 획득 및 B 모드로 돌아갑니다.
  14. 측정 속도 시간 정수 (VTI) 1 전체 심장에 대 한 속도/시간 곡선 아래 면적으로 유출 관에 혈액 흐름의 주기 (그림 4G, g1).
    참고:는 VTI를 최종 systole에서 유출 관의 직경 (d)는 PW 도플러 기반된 선 볼륨 [SV(pw)] 방정식을 사용 하 여 산출 될 수 있다 B 모드 인수에서 얻은:
    Equation 4(4)
    심장 박동 (인사)는 전체 심장 주기의 기간을 측정 하 여 속도/시간 곡선에서 측정 됩니다. 심장 출력 [CO(pw)] 방정식을 사용 하 여 계산 됩니다.
    Equation 5(5)
  15. 오블리크 paragill 보기를, axolotl 입술 모양의 동물의 오른쪽 부분 상승 (그림 2B)를 직면 하는 방식으로 침대에서에서 90 ° 회전 하 여 유출 관에서 혈액 흐름 속도의 측정에 대 한 대안을 제공 하는 보기를 가져옵니다. 각도 회전 변환기와 병렬 고 그냥 튀어나온 아가미 (그림 2B)에 후부에 위치. 정확한 위치 확인 유출 관에 아래로 실행 하 여 얻을 다는 것을 확인 ~ 45 °와는 atria 방출 (그림 5 C, 보충 파일 11) 동안 유출 관 아래 나타납니다.
  16. PW 도플러 모드 변환기 (그림 5D, 보충 파일 12)에서 실행 하는 유출 관의 부분에서 최대 혈액 속도의 위치에 적용 됩니다. '빔 각도'와 '각도 보정'을 사용 하 여 최대 45 ° 트랜스듀서 (그림 5E)의 면에 완전히 수직이 되지 유출에 대 한 조정.
  17. PW 도플러 모드 인수 혈액 속도 ≥에 3 심장 주기.
  18. 정확한 동일한 평면에 3 심장 주기 ≥ 습득 하는 것 PWV 획득 및 B 모드로 돌아갑니다.
    참고: SV(pw) 및 CO(pw) 긴 축 보려면 위에서 설명한 대로 식 4 와 방정식 5 를 사용 하 여 비스듬한 paragill 보기에 대 한 계산 됩니다.

4. Unanesthetized Axolotl에 2D 심장 초음파

  1. Unanesthetized axolotl 해먹 (1.3.3 단계)에서 발생 하기 쉬운 위치에 배치 합니다.
  2. 동물 스트레스 처리에서 복구에 30-60 분 동안 그대로 둡니다.
  3. 해먹에서 axolotl으로 위쪽으로 직면 하는 트랜스듀서 머리와 초음파 트랜스듀서를 놓습니다.
  4. 변환기에 초음파 젤을 적용 합니다.
  5. 부드럽게, 그리고 동물을 방해 하지 않고 놓고 변환기 흉부 지역에서 동물의 중간 동물의 긴 축에 평행.
    참고: 이것은 마 취 axolotl (3.2 단계)에 대해서 같은, 하지만 거꾸로, 위치입니다.
  6. B-모드, 컬러 도플러 모드, 긴 축에 짧은 축 보기 단계 3.2 3.14에에서 설명 된 대로 비밀 번호 모드 데이터를 가져옵니다.
    참고: 경사 paragill 보기는 unanesthetized axolotl에서 얻을 수 없습니다. 길 환기 움직임 (휴식 동물에 대 한 10-20의 기간) 사이 unanesthetized axolotls에서 echocardiographic 데이터를 인수 한다. 경우는 axolotl 중 이동, 측정을 반복 해야 합니다.

5. 2D 심장 초음파 데이터를 평가 하 고 주관 최소화

  1. 연산자/관찰자 편견을 2D 초음파 이미징 및 3D 2D 데이터 내/남북 operator/관찰자 분석20을 수행 하 여 데이터 수집 및 데이터 분석 단계에서 주관으로 인 한 심장 기능의 평가 하지 마십시오.
    참고:에서 연구 하 고 새로운 직원을 훈련 할 때 시동이이 주관 계량 해야 합니다 하 고 내부/남북 operator/관찰자 분석을 사용 하 여 최소화.
  2. 연산자/관찰자 2 (더 경험) 함께, ≥ 6 합의 측정을 수행 하 여 모두 벤치를 포함 하 여 작업에 대해 테스트 연산자/관찰자 1 (경험)이 하와 두 사람이 설치에 내/남북 operator/관찰자 분석 시작 초음파 시스템 (작업) 및 관련 된 매개 변수 (관찰)의 후속 분석.
  3. 연산자와 관찰자 사이의 합의 도달 하 고 운영 (연산자/관찰자 1) ≥ 6에 관련 데이터를 얻기 위해 초음파 시스템 동물 (작업 1.1).
  4. 직접 후 (연산자/관찰자 2) 같은 동물 (2.1 작업)에 관련 된 데이터를 얻기 위해 초음파 시스템을 작동 합니다.
  5. 동물 3 일 동안 복구 하자. 그 후, 반복 (연산자/관찰자 1) 절차 (작업 1.2).
  6. 모든 측정된 데이터 (작업 1.1/관찰 1.1; 작업 2.1/관찰 1.1 작업 1.2/관찰 1.1) (연산자/관찰자 1)를 분석 하 고 24 시간 후 반복 연산자/관찰자 2의 데이터 (작업 2.1/관찰 1.2)의 분석.
  7. (연산자/관찰자 2) 혼자서 그녀 / (작업 2.1/관찰 2.1) 인수 데이터 분석. 참고가이 분석 하 여 얻은 값 true 값에 가장 가까운 간주 됩니다.
  8. 변형, 추세, 및 영 남자 플롯, QQ 플롯, t를 사용 하 여 모든 인수 매개 변수 사이 비교에서 바이어스 평가-테스트 (동등한 평균), 그리고 F-테스트 (동일한 분산) (그림 6G).
    1. Note 작업 1.1/관찰 1.1 작업 2.1/관찰 1.1 비교 대 간 연산자 변화를 보여 줍니다.
    2. Note 작업 2.1/관찰 1.1 작업 2.1/관찰 2.1 비교 대 간 관찰자 변화를 보여 줍니다.
    3. Note 작업 1.1/관찰 1.1 작업 1.2/관찰 1.1 비교 대 내부 연산자 변화를 보여 줍니다.
    4. Note 작업 2.1/관찰 1.1 작업 2.1/관찰 1.2 비교 대 내부 관측 편차를 보여 줍니다.
  9. 그 뜻을 확인 하 고 다른 측정의 4 개의 비교; 비 크게 다르다 측정 된 값의 차이 한다 ± 1.96 표준 편차 내에서을 그리고 작은 큰 값의 더 적은 정밀도 향해 아무 추세 표시 되어야 합니다.

6. 3 차원 심장 초음파 마 취 Axolotl에

  1. 3D 취득
    1. 마 취 axolotl 입술 모양의 동물 침대 (1.3.1 단계)에서 부정사 위치에 놓습니다. 느슨한 고무 밴드 (그림 1C)을 사용 하 여 부동에서 장악 하 고 흉부 표면 매체의 3-5 m m로 덮여 있는지 확인 하십시오. 3D 취득 긴 절차, 따라서 측정을 통해 안정적인 심장 기능을 보장 하기 위해 초음파 매체로 마 취 솔루션을 적용.
    2. 변환기 (화살 3D 기록)에 대 한 동물의 긴 축에 평행 또는 직교 긴 축 (횡단 3D 녹음) 흉부 지역에서 동물의 중간에 놓으십시오.
    3. 비행기에서 차원 (x , y) 및 전체 심장 지역 후속 3D 캡처에 적용 됩니다 보장 하기 위해 밖으로의 비행기 차원 (z 또는 슬라이스)에 변환기를 번역 합니다.
    4. 중 '일반 이미지'를 선택 하 여 원하는 대로 공간 해상도 프레임 속도 조정 (높은 공간/낮은 시간적 해상도) 또는 '심장학' (낮은 공간/높은 시간 해상도) 모드. 0.33 Hz에 대 한 < HR < 1 Hz 심장 주기 50-150 가지 단계로 개축 될 수 있습니다 높은 공간 해상도 ('일반 영상')에서 50 프레임/s의 시간 해상도 사용.
    5. 해 부 구조는 거의 원시 B 모드 이미지에서 인식할 수 있는 수준에 조정 하는 '2D 이득' (~ 5 dB) 신호--노이즈-비율에 마지막 개조에서 증가.
    6. 각 슬라이스 (z 단계), ≥ 1000 프레임을 기록 합니다.
    7. 변환기 한 z 단계에 한 번, 예를 들어, 20 µ m 또는 50 µ m, 번역 그리고 녹음 심장 지역 전체를 커버 때까지 반복.
  2. 3 차원 재구성 (보충 파일 13 와 14)
    1. 디지털 이미징 및 통신 의학 DICOM (리틀 엔디안)으로 인수를 내보냅니다.
      참고: 프레임의 일련된 번호를 포함 하는 각 슬라이스 단일 파일 작성 됩니다.
    2. 전체 심장 주기에서 프레임 수를 결정 합니다. 로 시간 시간이 지남에 따라 다를 수 있습니다, 첫 번째 및 마지막 조각에 대 한 이것을 결정 합니다. 나중 수 있는 위상 해상도의 초기 위 추정 (6.2.8 단계)으로 높은 사이클 당 프레임 수를 설정 합니다.
    3. 자르기 경계를 결정 하 고 B 모드 창 주변 없는 공간을 삭제할.
      참고: 이러한 경계 분할 영역에 걸쳐 일정 해야 합니다.
    4. 32 비트에 RGB 컬러 이미지를 변환 합니다.
    5. 계산 스택 및 수식을 사용 하 여 첫 번째 심장 주기에서 포함 하는 프레임의 수에 각 프레임에 대 한 상관 관계 값 (C):
      Equation 6(6)
      참고: 여기 Equation 7 첫 번째 이미지에서 픽셀 좌표 (i, j)의 신호 강도 Equation 8 이며 두 번째 이미지에 동일 Equation 9 , Equation 10 , Equation 11 , Equation 12 평균 강도 및 표준 편차, 각각,에 비교, 및 I 및 J 에서 첫 번째 및 두 번째 이미지의 이미지에서 행과 열 번호입니다. 상관 관계 값의 결과 배열 심장 주기 당 프레임 수 및 프레임 조각 (예를 들어, 75 × 1000 = 75000 그림8에서)의 총 수의 제품의 크기는 것입니다 (참조 보충에에서 모범적인 스크립트 16 파일). 그러나 이것은 매우 ultrasonographic 이미지에 상관 관계 값 비교에서 이미지 중 하나 또는 둘 경우, 0의 픽셀 값의 표준 편차 계산 될 수 없습니다.
    6. (그림 8A, 자동으로 검색 하는 로컬 맥시 마를 보충 파일 17 참조 모범 스크립트) 하는 상관 관계 값의 배열에서 로컬 맥시 마를 감지.
    7. 상관 관계 값이 최대 프레임의 이차 평균 Q(평균)을 계산 (즉, 심장 단계 일치) 수식을 사용 하 여:
      Equation 14(7)
      N 은 심장의 단계를 일치 하는 프레임의 총 수 Equation 15 좌표 (i, j) n번째 이미지의 픽셀의 강도 및 Equation 16 는 Equation 17의 임시 산술 평균 n번째 이미지의 ( 보충 파일 18에 모범적인 스크립트 참조).
    8. 모든 분할 영역에 대 한 6.2.3-6.2.7 단계를 반복 합니다.
    9. 쉽게 인식할 수 있는 해부학 적 구조 (예를 들어, 중반 심 실)와 조각 (조각 참조)을 선택 하 고 확인 경우 재건축된 앙상블 평균 하나의 심장 주기 정확히 하나의 주기 (즉, 추가 경우에 해당 단계 하나 이상의 심장 주기 결과로). 정확히 하나의 심장 주기 (예를 들어, 정확히 하나의 사이클을 그림 8에 70 단계를 포함 하는 대 평가 75 단계/사이클 (현실에서 1.07 주기) 그림 8에서에서)를 추가 단계를 삭제 합니다.
    10. 슬라이스에 이웃 (테스트 슬라이스), 정렬 앙상블 평균 하나의 심장 주기 t-심장 단계를 일치 하는 상관 관계 값 수식 (방정식 6)를 사용 하 여 참조 조각으로 스택 ( 보조 파일 19에에서 모범적인 스크립트 참조 및 보조 파일 20).
      참고: 두 비 동일 조각 심장 주기 동안 어느 시점에서 완전 하 게 유사한 나타나지 것입니다, 하지만 충분히 작은 스텝 크기 (예:20 µ m, 50 µ m)와 인접 한 조각 것가지고 발음 유사성 상관 관계의 결과 단계 일치로 번역 될 수 있는 값 최대
    11. 모든 분할 영역에 대 한 6.2.9-6.2.10 단계를 반복 합니다.
    12. Z 슬라이스 및 t 프레임 포함 된 단일 3D 태그 이미지 파일 형식 (TIF) 또는 DICOM 파일의 스택 전체 3D 개조를 축소 합니다.
      참고: 데이터 각 차원 크기를 줄이고, 신호 대 잡음 비율을 증가 하 고 등방성 데이터 생성에 범주화 될 수 있다 (비행기에서 해상도 일반적으로 여러 겹 밖으로의 비행기 해상도 보다 더 높은).

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Representative Results

axolotl에서 Intrapericardial 공간 동물의 크기에 따라 달라 집니다. 작은 동물 (2-20 g, 7-15 cm) pericardial 유체 (심장 초음파에서 어두운 표시)는 심장 챔버 (> 20 g, > 15 cm) 큰 성적으로 성숙한 동물에 실은 intrapericardial의 대부분을 차지할 것입니다 반면 주변의 초과 있을 것 이다 공간입니다. Axolotl의 echocardiographic 뷰의 대표 결과 대 한 좋은 개요를 제공 하는 작은 동물 (10 g, 10 cm) 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 9에 대 한 적용 되었습니다.

긴 축 보기는 일반적으로 axolotl에서 심장 해부학의 좋은 개요를 제공합니다. 심 실 평면 (그림 3C-H) 또는 심 방 평면 (그림 4A 비행기 (그림 3A, B, 보충 파일 2), 공동 venosus, 심 방, 우 심 실의 부분 중간 비행기에 입력 -D)를 오른쪽 이나 왼쪽, 동물의 변환기를 각각 번역 하 여 도달 될 수 있다. 심 구형 및 높은 trabeculated 나타납니다 (그림 3C, 보충 파일 3-5), 반면에 심 방 더 불규칙 한 형태와 거의 없는 trabeculation (그림 4A, 보조 파일 6, 보충 파일 7). 그러나 짧은 축 보기 (그림 5A, B, 보충 파일 10) 개요를 제공 합니다 덜 쉽게 해석할 수는 axolotl의 심장 해부학 심장을, 그것은 정확한 심장 수축 (예: 평가에 기여 원형 심의 infarcted 또는 비 계약 영역이 뷰 평면에 명확 하 게 시각화 됩니다). 유출 관의 중심 심 (그림 2A, 그리고 비교 그림 4E 와 그림 3C 와 보충 파일 8 보충 파일 3 의 센터에 밀접 하 게 위치는 긴 축 뷰 평면에 ). 긴 축과 비스듬한 paragill 비행기에서 펄스 파 도플러에 의해 측정 심장 주기 동안 강도 높은 혈액 신호에서 낮은 강도 소음에 의해로 접한 유출 관의 부드러운 조직 혈액 방출에 이동 될 것입니다, 이후는 주변의 부드러운 조직 (회색 주변 그림 4G 에 그림 5e 호야속도/시간 곡선에 흰색 영역)의 운동. 일반적으로, 혈액 신호 사이의 부드러운 조직 소음 대비 (그림 4G (g1 확대) 및 그림 5E (e1 확대)) 속도 시간 전체를 측정할 때만 혈액 신호 세그먼트 수 이어야 한다.

혈액 흐름 패턴의 질적 평가, 색 도플러 및 다른 심장 챔버의 흐름 패턴의 시각화를 제공 하는 파워 도플러 영상 (심 실: 그림 3E-H, 보충 파일 4, 보조 파일 5; 심 방: 그림 4 C, D, 보조 파일 7; 유출 관: 그림 4 층, 그림 5 D, 보충 파일 9, 보충 파일 12).

실험실 실험을 위해 사용 하는 axolotls 전체 만기 10 ~ 30 g에 2-4 g의 초기 포스트 애벌레 단계에서 크기에서 다르며 큰 동물 > 100 g. 마찬가지로 무게, 심장 기능 및 기능 매개 변수를 여기에 설명 된 일부 절대적 가치 의존 에 동물의 크기입니다. 일반적으로, 소수 지역 변경 값은 40-50% (더 큰 동물에 대 한 낮은 값으로 기울어짐)으로 다른 크기 그룹에서 상수 이다. 뇌졸중 볼륨 매우 동물, 즉, 심장에서 범위의 예를 들어, 5 g axolotls µ L 20-30, 50-70 µ L 10 g axolotls에서 50 g axolotls에 250-300 µ L의 크기의 크기에 따라 달라 집니다. 속도 심장 고 어느 정도 선 볼륨을 높게 적용 된 마 취 제 및 마 취 (그림 6A-F, 그림 7)의 수준에 따라.

전통적인 내/남북 operator/관찰자 분석 포함 그래픽 표현 (플롯 Q Q 플롯과 개성이 Altman)와 동일한 의미에 대 한 테스트 (t-테스트) 및 분산 (F-테스트) 데이터의 정규 분포를 평가 하 고 비교 하 정확도 정밀도 (그림 6G) 두 사람 사이의

3 차원 심장 초음파 전통적인 2D 수집z (깊이)는 추가 차원을 추가합니다. 이로써 데이터 (그림 9A), 재분할 (그림 9B), (그림 9C, 보충 파일 13및 보충 파일 14), 표면 및 볼륨 복원 및 세분화의 다중 평면 시각화 및 (그림 9 C, 보충 파일 15) 3D 모델의 세대.

Figure 1
그림 1입니다. 심장 초음파의 침대와 컨테이너의 준비 마 취 및 axolotl unanesthetized. (A) A 부드러운 헝겊 조각을 한 번 접혀 이며 "버 리 토" 모양으로 압 연. (B) 끝 다시 구 부 러와 수 중 검사 중는 axolotl에 대 한 입술 모양의 침대를 녹화. (C) 마 취 axolotl의 2D 및 3D 심장 초음파, 동물 부드럽게 입술 모양 침대와 중반에 악의 성 례의 지역 이상의 고무 밴드와 고정은 틈새에 부정사 위치에 저장 됩니다. (D, E) 해먹은 폴리스 티 렌 거품의 조각에 있는 정연 한 구멍을 조각 하 고 상부 표면에 플라스틱 포장을 녹화 하 여 준비가 되어 있습니다. (F)는 unanesthetized axolotl의 2D 심장 초음파, 동물 해먹에서 자연 발생 하기 쉬운 위치에 배치 이며 밑에서 젤 커버 변환기 팁 접근. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 트랜스듀서 배치. (A, B) 긴 축과 짧은 축 보기 (A)와 간접 paragill 보기 (B)에 대 한 변환기의 대략적인 위치는 axolotl에 간선 네트워크의 모델. 강력한 냉 광원으로 (C) Transillumination 변환기를 적용 하기 전에 심장 챔버의 정확한 위치를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다 ( 보조 파일 1참조). 해부학 약어: A, 심 방; 자주, 유출 관; SinV, 공동 venosus; V, 심입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 우 심 실의 대표적인 긴 축 echocardiographic 조회. (A, B) 전형적인 긴 축 중간 보기 B 모드 ( 그림 2A에서 노란 선) 심 실 끝 심장 확장 (A) 및 끝 심장 수축 (B) 단계에서에서 (영상 표현에 대 한 보충 파일 2 참조). (C, D) B 모드 ( 그림 2A에서 검은 선) 심 실 끝 심장 확장 (C) 및 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 3 참조) 끝 심장 수축 (D) 단계에서에서 심 실의 긴 축 보기. (HE-) (A)와 같이 비슷한 뷰 평면 및 (B) 컬러 도플러 (CD)와 혈액을 보여주는 파워 도플러 (PD) 모드에서 흐름 (비디오 표현의 CD 및 PD 모드, 보충 파일 4 및 보충 파일 5 참조 각각). CD 모드 이미지에 붉은 색 표시는 트랜스듀서를 향해 흐르는 혈액 이며 블루 색상 반대. 심장 약 실 및 혈액 흐름 점선으로 강조 되었다. (A)에 삽입 된 만화 및 변환기 및 긴 축 중간을 기준으로 번역 (C) 표시 배치 보기. 해부학 약어: A, 심 방; DC(L), 덕트 어;의 왼쪽 자주, 유출 관; SinV, 공동 venosus; V, 심입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. Atria 유출의 대표적인 긴 축 echocardiographic 조회로. (A, B) B 모드 ( 그림 2A에서 녹색 라인) 심 방 끝 확장기 (A) 및 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 6 참조) 끝 심장 수축 (B) 단계에서에서 심 방의 긴 축 보기. (C, D) (A)와 같이 비슷한 뷰 평면 및 (B) 피를 보여주는 컬러 도플러 (CD) 모드로 흐름 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 7 참조). 중간 방출 단계에서 B 모드 ( 그림 2A에서 파란 선)에서 유출 관의 (E) 긴 축 보기 (영상 표현에 대 한 보충 파일 8 참조). F: CD 모드 설명 혈액에 (E)에서 비슷한 뷰 평면 흐름 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 9 참조). (G) 비슷한 뷰 평면 (E)에서 (F) 펄스 파 도플러 (비밀 번호) 모드 측정을 위한 열 속도 감지 및 속도 시간 정수 (VTI) 뇌졸중 볼륨 계산에 대 한 허용. CD 모드 이미지에 붉은 색 표시는 트랜스듀서를 향해 흐르는 혈액 이며 블루 색상 반대. 심장 약 실 및 혈액 흐름 점선으로 강조 되었다. 노란색, 빨간색 화살표 머리 semilunar 유출 관, 유출 관에서 나선형 밸브의 밸브를 각각 나타냅니다. (A)에 삽입 된 만화 및 변환기 및 긴 축 중간을 기준으로 번역 (E) 표시 배치 보기. 해부학 약어: A(R), 오른쪽 아 트리 움; A(L), 왼쪽 아 트리 움; 자주, 유출 관; SinV, 공동 venosus; V, 심 실; VC, 베 나 정 맥 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 대표 짧은 축 및 심 실 및 유출 관의 비스듬한 paragill echocardiographic 보기. (A, B) 짧은 축 B 모드 ( 그림 2A에 회색 라인) 심 실 끝 심장 확장 (A) 및 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 10 참조) 끝 심장 수축 (B) 단계에서에서 심 실 보기 중간 방출 단계에서 B 모드 (보라색 라인 그림2b에서)에 유출 관의 (C) 간접 paragill 보기 (영상 표현에 대 한 보충 파일 11 참조). (D) 비슷한 뷰 평면 (C)에서 CD 모드 설명 혈액에서 흐름 (비디오 표현에 대 한 보충 파일 12 를 참조). (E) 비슷한 뷰 평면에서 (C)와 (D) 펄스 파 도플러 (비밀 번호) 모드 측정을 위한 열 속도 감지 및 속도 시간 정수 (VTI) 뇌졸중 볼륨 계산에 대 한 허용에. CD 모드 이미지에 붉은 색 표시는 트랜스듀서를 향해 흐르는 혈액 이며 블루 색상 반대. 심장 약 실 및 혈액 흐름 점선으로 강조 되었다. (A)에 삽입 된 만화 및 변환기 및 긴 축 중간을 기준으로 번역 (C) 표시 배치 보기. 해부학 약어: A, 심 방; 자주, 유출 관; SinV, 공동 venosus; V, 심입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. 심장 박동 및 선 량 측정, 마 취, 그리고 대표 내/남북 operator/관찰자 분석의 효과의 대표적인 결과. A-(C) Unanesthetized 기준선을 기준으로 심장 박동 (인사) (0 h는 전체 마 취에서) 시간이 지남에 6 axolotls (A) benzocaine, MS-222 (B), 그리고 propofol (C)에 마 취에 대 한 플롯. (-DF) 볼륨 (SV) 6 axolotls benzocaine (D), MS-222 (E)에 마 취에 대 한 (0 h는 전체 마 취에서) 시간이 지남에 표시 하는 unanesthetized 기준선을 기준으로 스트로크 및 propofol (F). (G) 뇌졸중 볼륨의 내부/남북 operator/관찰자 분석. 영-알트 플롯 [연산자 (Op) 간의 차이 (Dif) / 관찰자 (Obs) 평균 (평균)에 대 한 플롯] 다른 연산자와 관측 하 여 얻은 (Q Q 플롯) 일반적으로 분산된 측정에 있는 아무 체계적인 바이어스를 계시 해야 한다. 동등한 평균에 대 한 테스트 (t-테스트)와 동등한 차이 (F-테스트) 연산자/관찰자 (오른쪽 아래에 테이블) 간의 중요 한 차이가 계시 해야 한다. A - F 는 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 (Thygesen 그 외 여러분 의그림 1 에서 제공 되는 자료에서 수정 된 21). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. 선 양의 비교 기 및 펄스 파 도플러 방법에 의해 추정. 2 차원 B 모드 형상 (geo) 측정 또는 펄스 파 도플러 측정 속도에 혈액 유출 관 종료의 추정 치기 양 (SV)의 비교. SV(geo)와 SV(pw) 두 측정 유형 및 3 개의 다른 마 취약, benzocaine (파란색 기울어진된 사각형), MS-222 (빨간색 사각형)을 사용 하 여 사이 초 같은 6 동물에 기록 되 고 1 주일 사이 복구와 propofol (녹색 삼각형) 다른 마 취약을 적용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8입니다. 3 차원 심장 초음파 검사에 대 한 상관 관계 대표 spatiotemporal 이미지. (A) 주어진된 상관 관계 값 75 프레임 심장 주기 1000 프레임 씨 네 데이터 집합의 상관 관계 작업의 곡선. 일치 하는 심장 단계, 나타내는 작은 차이와 두 프레임 높은 상관 관계 값을 얻을 것입니다. 그 후 알고리즘 검색 로컬 맥시 마를 일치 하는 모든 프레임을 감지 데이터에 적용할 수 있습니다. (B) (A)와 같이 동일한 데이터의 그래픽 표현입니다. 상관 관계 값 전체 씨 네 스택에 첫 번째 심장 주기를 비교 하 여 얻을 수 있습니다, 최대 상관 관계의 대각선 표시 심장 단계 일치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9입니다. 대표적인 3 차원 심장 초음파. (A) 3 차원 복원된 axolotl 심장의 다중 평면 보기. Spatiotemporal 이미지 상관 관계 프로시저 여러 가지 단계와 전체 심장 주기의 재건에 대 한 수 있습니다 (여기 70 단계) spatiotemporal 현상에서 원하는 조사에 대 한 것 들로 썬 다음 수 3 개의 공간 차원에 뛰는 심장. (B) 3 횡단 조각 복원된 115의 3D 데이터 조각. 절차를 평균 하는 이차 혈액 조직 대조를 강화 하 고 axolotl 심의 trabeculated 자연과 interatrial 심장의 명확한 시각화에 대 한 더 나은 이해를 허용 신호 대 잡음 비율을 낮춘 다 고 유출 관에 밸브입니다. (C) 표면 및 볼륨 표현을 뛰는 심장의 색상 코드를 따라 3 단계에서 모델을 통폐합 (표면 및 볼륨 렌더링 구타 영상 표현에 대 한 보충 파일 13 및 보충 파일 14 참조 심장, 그리고 3-단계 세그먼트 인터랙티브 3D 모델에 대 한 보충 파일 15 ). 해부학 약어: A, 심 방; Cau, 꼬리; Cra, 두개골; 덱 스, 덱스터 (동물에 오른쪽); 도 르, 등 쪽; 자주, 유출 관; 죄, 불길 한 (동물에 왼쪽); SinV, 공동 venosus; V, 심 실; 하지 마, 복 부입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 1입니다. 심장 챔버를 찾으려고 transillumination는axolotl. 그림 2C참조. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 2입니다. 긴 축, 중간 선 보기, B 모드. 그림 3A, B를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 3입니다. 긴 축, 심 실 보기, B 모드. 그림 3C, D를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 4입니다. 긴 축, 심 실 보기, 색 도플러 모드. 그림 3E, F를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 5입니다. 긴 축, 심 실 보기, 파워 도플러 모드. 그림 3G, H를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 6입니다. 긴 축, 심 보기, B 모드. 그림 4A, B를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 7입니다. 긴 축, 심 보기, 색 도플러 모드. 그림 4C, D를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 8입니다. 긴 축, 유출 관 보기, B 모드 그림 4E를 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 9입니다. 긴 축, 유출 관 보기, 색 도플러 모드. 그림 4 층을 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 10입니다. 짧은 축, 심 실 보기, B 모드 그림 5A, B를참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 11입니다. 오블리크 paragill, 유출 관 보기, B 모드. 그림 5C를 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 12입니다. 오블리크 paragill, 유출 관 보기, 색 도플러 모드. 그림 5D를 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 13입니다. 70 단계 (19.6 ms 시간적 해상도)에서 심장 박동의 3 차원 표면 렌더링입니다. 그림 9C를 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 14입니다. 3 차원 볼륨 렌더링 70 단계 (19.6 ms 시간적 해상도)에서 심장 박동. 그림 9C를 참조 하십시오. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 15입니다. 3 단계에서 심장 박동의 3 차원 인터랙티브 모델: 실의 끝-systole, 심 실 중 방출, 및 심 실 끝-systole. 그림 ℃를 참조 하십시오. 대화형 PDF 파일은 어도비 아크로 벳 리더 9에 또는 더 높은 전망 되어야 한다. 3D 기능을 활성화 하려면 모델을 클릭 합니다. 커서를 사용 하 여 회전, 확대/축소, 모델, 팬 수 고 모델 트리에서 모델의 모든 세그먼트 수 있습니다 온/오프 설정 또는 투명 하 게. 모델 트리에서 여러 하위 레이어 수를 포함 하는 계층 구조 열 (+)입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 16입니다. 대표 75 프레임/심장 주기의 위 추정 된 1000 프레임 수집의 상관 관계 값을 계산 하기 위한 스크립트 주석. 스크립트 IJ1 매크로 언어로 작성 된 및 전체 z에서 상관 관계 값 (수집 당 75000)를 계산 하기 위해 ImageJ에서 일괄 처리 매크로로 구현 될 수 있습니다-3D 데이터의 스택. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 17입니다. 자동 피크 검출 75 프레임/심장 주기의 위 추정 된 1000 프레임 수집에서 상관 관계 값의 일련에 대표적인 스크립트입니다. (Ctrl + r) 매크로의 활성화 이후 심장 단계 일치를 선택 하 여 이차 평균 수행 명령 목록 것 이며 일련의 상관 관계 값 (열 B, 노란색으로 표시)을 대체 될 수 있다 (열 Q, 녹색으로 표시)을 표시. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 18입니다. 대표적인 심장 단계 일치를 선택 하 고 75 프레임/심장 주기 (보충 파일 17에서 열 Q)의 위 추정 된 1000 프레임 수집의 이차 평균 수행 하는 스크립트 주석 처리 됩니다. 스크립트 IJ1 매크로 언어로 작성 된 및 앙상블 만들려고 ImageJ 매크로 평균 한 주기 (75 단계) 2D 조각으로 구현 될 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 19입니다. 대표 70 프레임 참조 조각과 인접 75 프레임 테스트 조각 사이의 상관 관계 값을 계산 하기 위한 스크립트 주석. 스크립트에서 IJ1 매크로 언어로 작성 된 고 ImageJ 상관 관계 값 (5250)를 계산 하는 매크로로 구현 될 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 20입니다. 자동 피크 검출 일련의 70 프레임 참조 조각과 인접 75 프레임 테스트 조각 사이 비교에서 상관 관계 값에 대표 Excel 스크립트. 일련의 상관 관계 값 (열 C, 노란색으로 표시)을 대체 될 수 있다 고 (Ctrl + t) 매크로의 활성화 후 테스트 조각에 substack 될 것입니다 선택할 수 조각의 목록 표시 (열 L, 행 2, 녹색으로 표시). 테스트 슬라이스 substack 공간 참조 슬라이스를 프레임을 일치 해야 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

심장 초음파는 axolotl 및 다른 비 포유류 종 성인 포유류를 제외한 모든 척추 동물의 적혈구의 nucleated 성격상 포유류 심장 초음파 보다 근본적으로 다른 데이터를 생성합니다. 발음된 혈액 신호에서 및 혈액 조직 대비 axolotl echocardiographic 이미지 예를 들어, 마우스 또는 인간의 심장 초음파 검사에 비해 덜 발생 합니다. 이 어려울 수 있습니다 이미지 세분화 초음파 이미지 처리 되지 않은 단일 프레임에 더 많은 조직에서 혈액을 구별 하는 것이 어려울 수 있습니다로. 그러나, 이러한 현상은 혈액을 만드는 데 사용 하는 경우 유리한 수 신호 절차를 평균 하는 이차를 적용 하 여 향상 된 이미지18 위에서 설명한 프로토콜 섹션 6 심장 초음파 axolotl에 대 한 수정. 혈액 얼룩 부드러운 조직에서 발견 보다 훨씬 더 동적 이기 때문에, 이차 평균 2, 3 차원에서 이미지 세분화를 용이 하 게이 2 개의 구획 사이 뚜렷한 대조를 생성 합니다.

이 프로토콜 철저 하 게 된 axolotl 테스트 이전21에 대 한 세 가지 다른 마 취약을 설명 합니다. Benzocaine와 MS-222 스트레스 조건 하에서 심장 기능을 테스트할 때 바람직한 수 있는 심장 박동 증가 자극. Propofol 마 취 동안 마음에 더 적은 긴장을 유도 하 고 획득 시간 unanesthetized axolotls에 앉아 있는 행동의 한계를 초과 하는 경우에 unanesthetized 심장 초음파에 대 한 대체로 사용할 수 있습니다.

2D 심장 초음파 3D 마음을 설명 하는 주관에 의해 영향을. 따라서, 그것은 절대적 행위 및 내/남북 operator/관찰자 분석 프로토콜 섹션 5에 설명 된 대로 실제 실험을 수행 하기 전에. 마찬가지로, echocardiographic 측정 절대 값 보다는 다른 상황에서 심장 기능에 잠재적인 차이 조사 하기 위해 적용 될 수 있는 인덱스 값으로 더 전망 되어야 한다. 기하학적 인 공식 (공식 2)에 의해 거의 결정 선 볼륨 생성 펄스 파 도플러 식 (식 4;와 같은 절대 값 그림 7), 그리고 그것은 해야는 일련의 실험을 통해 준수 측정을 결정 했다. 그러나 심 실 모양의 구형 가정은 건강 한 마음, 균일 하 게 계약에 적용 됩니다 및 질병 및 재생 모델에서 SV(pw)의 더 나은 반사에 대 한 고려 한다는 SV(geo)는 SV(pw) 보다는 더 빠르게 얻을 수 있습니다. 진정한 선 볼륨입니다.

상관 관계와 프로토콜 섹션 6의 절차를 평균 하는 이차 여러 다른 이미징 및 수학 패키지에서 구현할 수 있습니다. 우리는 대부분 연구원은 (예를 들어, Excel) 익숙한 소프트웨어 패키지에서 방법에 대 한 대표적인 스크립트를 제공 향해 노력 하 고 프로그래밍 기술 및 소프트웨어 패키지에 액세스 생활 과학 연구원 내에서 크게 다르므로, 그는 쉽게 접근 하 고 자유롭게 사용할 수 있는 (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). 보조 파일 16 - 20 IJ1 매크로 언어로 코딩에 최소 경험으로도 이해할 수 있어야 하는.xlsm 매크로로 작성 된 주석이 모범 스크립트를 제공 합니다.

기본 심장 재생 독점적으로 작은 종 (인간), 기준의 마음에서 발견 하는 현상이 며 따라서 측정 및 재생성 하는 동안 초기 심장 기능과 기능 진행의 이미징 심장의 크기에 의해 도전 이다 고 공간 해상도 적용 이미징 적임입니다. 바람직한 절충 높은 비행기에 공간 해상도 제공 하는 높은 주파수 초음파 이미징 (~ 50 MHz에서 30 x 30 µ m2 ) 하는 비보에 µCT 이미징 및 비보에 µMRI 보다 훨씬 높은 비교의 깊이가지고 있는 침투 (~ 50 MHz에서 1 cm) 여러 confocal 현미경 검사 법, 그리고 매우 높은 시간 해상도 (50 mhz, 1 cm 깊이 50-300 프레임/s) 보다 더 큰 배. 수동 또는 자동 z 차원 운동의 변환기와 결합 하 여, 초음파는 심장 기능과 해 부 학적 모델링 4 차원에서의 뛰어난된 재건 수 있습니다. 또한, 비-침략 적 성격의 기술은 경도 실험 수 있습니다. 우리의 지식에 현재 있다 아무 매트릭스 배열 트랜스듀서 고주파 마이크로 초음파 이미징에 사용할 수 있는. 이 기술 개발 기계적 변환기를 이동 보다 빠른 절차는 axolotl의 같은 작은 하트의 3D 데이터의 인수 보조 크게 것 이다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 카 스퍼 센, 생명과학 연구소, 3D echocardiographic 인수에 대 한 액세스 하 고 전자 micromanipulator와 원조를 제공 하기 위한 오르후스 대학 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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References

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의학 문제점 141 심장 초음파 검사 초음파 심장 심장 초음파 중생 axolotl Ambystoma mexicanum spatiotemporal 이미지 상관 관계
Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)에서 2 차원 및 3 차원 심장 초음파 검사
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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