Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

2D- og 3D-Echocardiography i Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Her presenterer vi echocardiography protokoller for todimensjonal og tredimensjonale image vinningen av det bankende hjertet av axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), en modell Art i hjertet gjenfødelse. Disse metodene tillater langsgående evaluering av hjertefunksjon høy spatiotemporal oppløsning.

Abstract

CARDIAC funksjonsfeil som følge av iskemisk hjertesykdom er en stor utfordring, og regenerativ Therapy til hjertet er i høy etterspørsel. Noen modell arter som sebrafisk og Salamandere som kan iboende hjertet gjenfødelse avholde Love for fremtidige regenerativ Therapy for menneskelige pasienter. Å vurdere utfallet av cardioregenerative eksperimenter er det viktig at hjertefunksjon kan overvåkes. Axolotl salamander (A. mexicanum) representerer en veletablert modell Art i regenerativ biologi oppnå størrelser som tillater evaluering av hjertefunksjon. Formålet med denne protokollen er å etablere metoder for å måle reproduserbar hjertefunksjon i axolotl med echocardiography. Bruk av ulike bedøvelse (benzocaine, MS-222 og propofol) er vist, og oppkjøpet av todimensjonal (2D) echocardiographic data i både bedøvet og unanesthetized axolotls er beskrevet. 2D echocardiography av tredimensjonale (3D) hjertet kan lide av upresisjonsverdier og subjektivitet av målinger, og å lindre dette fenomenet en heldekkende metode, nemlig intra/inter-operator/observatør analyse, å måle og minimere denne skjevhet er vist. Til slutt, en metode for å få 3D echocardiographic data av det bankende axolotl hjertet med en svært høy spatiotemporal oppløsning og med uttales blod til vev kontrast er beskrevet. Samlet bør denne protokollen gi nødvendig metodene for å evaluere hjertefunksjon og modell anatomi, og flyte dynamikk i axolotl med ultralyd imaging programmer både regenererende biologi og generell fysiologiske eksperimenter.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom er en ledende årsak til død verdensomspennende1,2. Selv om mange overleve et hjerteinfarkt på grunn av rask og finjustert medisinsk intervensjon, føre iskemiske hendelser i mennesker ofte til fibrotiske arrdannelse tilknyttet hypertrofi, elektriske feil og en redusert fysisk kapasitet av hjertet . Denne mangelen på regenerativ potensialet i cardiac vev er delt blant pattedyr og selv kontroversielle påstander om pattedyr cardiac gjenfødelse er rapportert, disse er begrenset til spesifikke murine stammer3,4 og hypoksi behandlet mus5. Dermed er cardiac regenerativ medisin og biologi vanligvis begrenset til ikke-pattedyr dyremodeller å studere iboende hjertet regenerativ fenomener. Sebrafisk (Danio rerio) har i det siste tiåret etablert seg som den mest godt preget modellen for indre hjertet gjenfødelse6,7,8,9,10 . Enkelt laboratorium vedlikehold, en kort generasjonstid og et bredt utvalg av molekylære verktøy er sebrafisk godt tilrettelagt som en modell for genetiske og molekylære mekanismer underliggende hjerte utvikling og regeneration. Imidlertid minutt dimensjonene av sebrafisk hjertet gjør det mindre egnet for funksjonell evaluering, og komplisert kirurgiske prosedyrer og ikke-landlevende virveldyr phylogeny av sebrafisk begrenser den fornuftige ekstrapolering av funnene i denne arten, dermed rettferdiggjøre bruk av andre større tetrapod modeller. En av de tidligste modellene av virveldyr hjertet gjenfødelse var en caudate amfibier, den østlige newt (Notophthalmus viridescens)11, en art som forblir en verdifull model12.

De siste årene har en annen caudate amfibier, den meksikanske axolotl (A. mexicanum) entret scenen som en stor (opp til 100 g kroppen masse) og svært laboratorium tilpasningsdyktig dyr modell for en rekke regenerativ fagområder som spenner over lem gjenfødelse, ryggmargsskade og kardiale gjenfødelse13,14,15,16,17. Axolotl er svært mottakelig for funksjonell målene på hjertet bruker høyfrekvente echocardiography og fravær av calcified strukturer på ventral side av hjertet gir mulighet for ultralyd imaging med et mye lavere bilderester (akustisk skygge og gjenklang spesielt) enn observert i andre modellen dyr med calcified sternum og hinner.

Følgende protokollen beskriver flere ulike metoder og forberedelsene (figur 1, figur 2) å erverve reproduserbar echocardiographic mål på axolotl hjertet i både anesthetized (bruke tre forskjellige bedøvelse: benzocaine, MS-222 og propofol) og unanesthetized dyr i to (Figur 3 4 figur figur 5, figur 6, figur 7, Utfyllende filer 1-12) og tre (Figur 8, finne 9, Supplerende filer 13-14) romlige dimensjoner. Amfibier hjertet er tre-chambered (to atria og en enkelt ventrikkel). Atria leveres av en stor sinus venosus og ventrikkel munner ut i den conus arteriosus utløp skrift (figur 2). Siden Hovedvekten er tradisjonelt monterte på ventrikkel regenerasjon og mindre på utvinning atria6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, denne protokollen hovedsakelig fokuserer på målinger av ventrikkel funksjon.

Amfibier echocardiography er ikke godt beskrevet i litteraturen, og utviklingen av 2D metodene som er beskrevet i denne artikkelen har vært drevet av behovet for å best representerer funksjonaliteten til slo axolotl hjertet på et gitt tidspunkt og eksperimentelle innstillingen. Dermed er metodene som er beskrevet her gjeldende i hjertet regenerativ eksperimenter der hjertefunksjon kan overvåkes gjentatte ganger i løpet av en gjenoppbyggingsprosessen. Metodene kan i tillegg brukes cardiophysiological eksperimenter på axolotl generelt eller endret litt slik at den dekker andre caudate eller springpadder amfibier modeller (e.g.,Xenopus). Axolotl finnes i flere forskjellige stammer og fargevariasjoner (f.ekswildtype melanoid, hvit, albino, transgene hvit med grønne fluorescens protein uttrykk), men disse egenskaper påvirker ikke kompatibiliteten til den Axolotl med beskrevet protokollen. Metoden beskrevet her for å erverve 3D echocardiographic-data er en modifisert versjon av den spatiotemporal sammenheng (STIC) teknikken utviklet for klinisk ultralyd og kvadratiske gjennomsnitt metoden beskrevet tidligere i utviklingsland kylling til forbedre signalet fra blod flekker i bløtvev i arter som inneholder kjerne røde blodlegemer18,19. Denne metoden gir avansert modellering av cardiac sammentrekning og beregnede fluid dynamikk i axolotl hjertet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fremgangsmåtene i denne protokollen var i samsvar med den danske nasjonal for omsorg og bruk av forsøksdyr og eksperimentene ble godkjent av danske nasjonale dyr eksperimenter Inspectorate (protokollen # 2015-15-0201-00615).

1. forberedelser

  1. Forberede axolotl medium.
    1. Bruk høy kvalitet ikke kjemisk behandlet vann fra springen som axolotl medium. Hvis dette er tilgjengelig, bruker du 40% Holtfreter løsning.
    2. Forberede 40% (wt/vol) Holtfreter løsning ved å løse opp 15.84 g NaCl, 0.54 g CaCl2·2H2O, 1.11 g MgSO4·7H2O og 0.288 g KCl i filtrert og deionisert vann til et volum på 1 L.
  2. Gjøre nedsenking bedøvelse.
    1. Klargjør benzocaine (ethyl 4-aminobenzoate) bedøvende løsning ved å oppløse 200 mg ethyl 4-aminobenzoate i 3 mL aceton og deretter løse opp denne blandingen i 1 L vann eller 40% Holtfreters løsning.
    2. Klargjør MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid, også kjent som tricane) bedøvende løsning ved oppløsning 200 mg ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic syre direkte i 1 L vann eller 40% Holtfreters løsning.
    3. Klargjør propofol (2,6-diisopropylphenol) bedøvende løsning ved oppløsning 3.3 mg 2,6-diisopropylphenol i i 1 L vann eller 40% Holtfreters løsning. Alternativt fortynne kommersielt forhåndslagde løsning på 3,3 mg/L.
      FORSIKTIG: Propofol er en kraftig menneskelig bedøvelse (administrert intravenøst) og bør håndteres med forsiktighet, inkludert i skjemaet utvannet.
  3. Forberede seng og beholder echocardiography.
    1. Forberede leppe-formet dyr seng echocardiography ved å sammenleggbar en 70 cm x 55 cm stykke myk klut én gang og deretter rulle den i "burrito form" (figur 1A). Deretter bøye seg endene til de møte og tape disse sammen (figur 1B).
    2. Senk leppe formet struktur i axolotl medium å imøtekomme de bedøvet axolotl under ultralyd imaging. Sikre dyr struktur og hindre flytende bruker løs gummistrikk; Plasser disse midt-mandibular og over sakrale regionen (figur 1 c).
      Merk: Gummistrikk bør ikke klem dyret som vil påvirke hemodynamics.
    3. For 2D echocardiography på unanesthetized axolotls, forberede en hengekøye ved skar ut en 16 cm x 8 cm x 5 cm hull i en 33 cm x 27 cm x 5 cm blokk av polystyrenskum (f.eks, lokk fra en mellomstore polystyrenskum beholder) (figur 1 d).
    4. Presse en 33 cm x 27 cm stykke plastfolie gjennom hullet og sikre kantene av brytes til toppen overflaten av polystyren skum blokken (figur 1E) opprette en hengekøye. Legg axolotl medium til 3 cm dybde i hengekøya. Den unanesthetized axolotl vil synke til bunns i hengekøya muliggjør enkel ventrale tilgang gjennom plastfolie (figur 1F).

2. bedøve Axolotls

  1. Fordype axolotl i ønsket bedøvende løsning (benzocaine, MS-222 eller propofol).
  2. Inspisere for første tegn til sedasjon, redusert bevegelser og økende tap av rettende refleks, dette vises i 10 minutter i dyr < 10 g (< 10 cm) og innen 20 minutter i dyr mellom 10 g og 50 g av kroppsmasseindeks (10-22 cm).
  3. Inspisere for fullstendig mangel på bevegelser, gill ventilasjon bevegelser og rettende refleks, og kontroller at dyret er ikke-responsiv til moderate smerter stimulering testet ved pinching bånd mellom sifrene.
    Merk: til tross for faktum at narkose oppnås innen 30 min i benzocaine anesthetized axolotls, hjertefunksjon er ikke stabilisert til 1t. Dette er ikke tilfelle i MS-222 eller propofol anesthetized axolotls (figur 6A-F).
  4. For å opprettholde axolotl under narkose, holde dyr i anestesi løsning eller innpakket i våt paper kluter wetted i anestesi løsning.
    Merk: Anestesi kan vedlikeholdes 7 h uten bivirkninger fra dyrets velvære, gitt at huden og spesielt gjellene holdes fuktig.
  5. For å reawake axolotl, overføre dyret til anestesi-fri medium.
    Merk: De første tegn på oppvåkning er gill ventilasjon bevegelser. Dyr bør være oppreist og responsive til stimulering i 1 time.

3. 2D Echocardiography på bedøvet Axolotl

  1. Sted anesthetized axolotl i supine posisjon i leppe-formet dyr seng (trinn 1.3.1-1.3.2). Sikre den fra flytende bruker løs gummi band (figur 1 c). Sikre at thorax overflaten er dekket med 3-5 mm av medium.
    Merk: For en kort oppkjøp (< 5 min) bedøvelse-fri medium kan brukes. For langvarig oppkjøp, bør bedøvende løsningen brukes som ultralyd medium for å sikre stabil hjertefunksjon gjennom målinger.
  2. Plasser svingeren over midtlinjen av dyr i regionen thorax parallelt med den lange aksen av dyret (figur 2A, figur 3A-B, utfyllende fil 2). Bruk transillumination med kaldt lyskilde på hvit og albino axolotls for å sikre den riktige plasseringen av svingeren (figur 2C og supplerende fil 1).
    1. Axolotls veiing < 20 g, bruke en 50 MHz svinger; for axolotls > 20 g, bruke en 40 MHz svinger. Kontroller plasseringen av skallen/fremre retning til høyre for standardisert bildeopptak. Hvis dette ikke er tilfelle rotere svingeren 180 ° eller Inverter bildet.
  3. Kontroller at i visningen lange aksen midtlinjen en liten del av ventrikkel (plassert til høyre i bryst hulrom, figur 2A) vises i rammen på ventrikkel diastolen og en stor del av de venstre og høyre atria (oppstilt for senteret / litt mot venstre i bryst hulrom, figur 2A) og sinus venosus vises både i atrial systolen og diastolen (figur 3A, B).
  4. Oversette svingeren 1-3 mm mot dyr rett til å få visningen ventrikkel lange aksen (figur 2A). Riktig posisjon er oppnådd når tverrsnitt av ventrikkel ende-Systolen er på maksimumsnivå (Figur 3 c-H).
  5. I B-modus, erverve ≥ 3 cardiac sykluser med > 50 rammer/s i enten generelle bildebehandling (temporal romlig/lav oppløsning) eller 'kardiologi' (lav timelige romlig/høy oppløsning).
    Merk: Denne visningen lar for evaluering av ventrikkel funksjon. Ventrikkel funksjonen kan evalueres i to dimensjoner med ventrikkel brøk området endringen (FACv) beregnet fra ende-diastolisk og systolisk slutten kryss seksjon området ventrikkel (CSAv) ved hjelp av formelen:
    Equation 1(1)
    Den axolotl ventrikkel tar form av en kule og en geometri basert Slagvolum [SV(geo)] kan beregnes ved hjelp av formelen:
    Equation 2(2)
  6. Oversette svingeren langs den lange aksen av dyret til midten av ventrikkel er i midten av skjermen. Rotere svingeren 90 ° med klokken for å få visningen midt-ventrikkel kort akse (figur 5A og B supplerende fil 10). Evaluere sirkulær form av ventrikkel ved å oversette svingeren langs den lange aksen av hjertet.
  7. Hjem svingeren til lange aksen flyet oversette tilbake mot midtlinjen eller litt til venstre for midtlinjen hente visningen atrial lange aksen to kammer (figur 2A). Kontroller at riktig posisjon er oppnådd ved å bekrefte at de cross-sectional slutten-Systolen atria er på deres maxima og de to atria kombinert anta omrisset av hvor "8" vippet ~ 45 grader mot venstre (figur 4A og B, Supplerende filen 6).
  8. I B-modus erverve ≥ 3 cardiac sykluser med > 50 rammer/s 'generelle imaging' eller 'kardiologi'-modus.
    NOTE Det axolotl atria er uregelmessig i formen og 3D funksjon kan ikke være direkte avledet fra 2D-data, dermed deres funksjon må vurderes som en indeks mål som atrial brøk området sjanse (FACa) basert på kombinert kryss seksjon området (CSAa) av begge atrial kamre i systolen og diastolen:
    Equation 3(3)
  9. Oversette svingeren mot høyre til den utløp skrift (conus arteriosus) vises (nær visningen ventrikkel lange aksen) (figur 2A).
    Merk: Etter at ventrikkel i fremre retning, strøm-skrift gjør en skarp sving og kjøres i en liten vinkel mot ventrale overflaten før igjen antar en fremre retning og splitte i gill grener og systemisk fartøy.
    1. Kontroller at riktig strøm tarmkanalen visningen er oppnådd ved å bekrefte at diameteren på strøm er på sitt maksimum på ventrikkel ende-systolen og to av de tre semilunar ventilene ved inngangen til utstrømming vises på midten av utstøting (figur 4E, Supplerende filen 8).
      Merk: Ventrale retningen mot svingeren til mellomliggende delen av utløp skrift tillater hastighet og flyt mål med Doppler bildebehandling.
  10. Bruke Doppler-fargemodus for å tilordne blod strømning hastigheter i utløp skrift under cardiac utstøting (figur 4F og supplerende filen 9). Likeledes bruke farge Doppler og makt Doppler for å visualisere blodstrøm i ventrikkel og atrial (figur 3E-H, Utfyllende filer 4-5 og figur 4C-Dog supplerende filen 7).
  11. Bruke pulsen bølge (PW) Doppler-modus ved maksimal blod hastighet i delen av utløp skrift kjører mot svingeren.
    1. Bruk "strålevinkel" og "kantete korreksjon" opptil 45 ° å justere for strøm ikke er helt vinkelrett til ansikt svingeren (figur 4G). Kontroller at PW Doppler posisjonen ikke overlappes av spiral ventilen for utstrømningen under enhver fase av cardiac syklusen (figur 4E).
  12. I PW Doppler-modus erverve hastighet klokkeslettdata over ≥ 3 cardiac sykluser.
  13. Tilbake til B-modus og få ≥ 3 cardiac sykluser på nøyaktig samme plan som PMW – ble kjøpt.
  14. Måle hastighet tiden integrert (VTI) av blodstrøm i utløp skrift som området under kurven hastighet/tid for en full cardiac syklus (figur 4G, g1).
    Merk: Fra VTI og diameter (d) av utløp skrift på slutten-Systolen innhentet fra B-modus oppkjøpet, en PW Doppler basert Slagvolum [SV(pw)] kan beregnes ved hjelp av formelen:
    Equation 4(4)
    Hjertefrekvens (HR) måles fra hastighet/tid kurven ved å måle varigheten av en hele hjerte syklus. Minuttvolum [CO(pw)] beregnes ved hjelp av formelen:
    Equation 5(5)
  15. Få visningen skrå paragill, en visning som tilbyr et alternativ for måling av blod flyte hastigheten i utløp skrift, ved å rotere axolotl 90 ° i leppe formet sengen slik at høyre del av dyret vender oppover (figur 2B). Vinkel og rotere svingeren og plasser den parallelle og bare bakenfor utstående gjellene (figur 2B). Kontroller at riktig posisjon er oppnådd ved å bekrefte at den utløp tarmkanalen kjører nedover på ~ 45 °, og at atria vises under det ut spor under utstøting (figur 5 C, utfyllende fil-11).
  16. Bruke PW Doppler-modus ved maksimal blod hastighet i delen av utløp skrift kjører fra svingeren (figur 5 d, utfyllende fil-12). Bruk "strålevinkel" og "kantete korreksjon" opptil 45 ° å justere for strøm ikke er helt vinkelrett til ansikt svingeren (figur 5E).
  17. I PW Doppler-modus erverve blod hastighet over ≥ 3 cardiac sykluser.
  18. Tilbake til B-modus og få ≥ 3 cardiac sykluser på nøyaktig samme plan som PMW – ble kjøpt.
    Merk: SV(pw) og CO(pw) er beregnet for skrå paragill visningen ved hjelp av ligningen 4 og ligningen 5 som beskrevet ovenfor i visningen lange aksen.

4. 2D Echocardiography på Unanesthetized Axolotl

  1. Plassere den unanesthetized axolotl i en utsatt posisjon i hengekøya (trinn 1.3.3).
  2. La dyret uforstyrret i 30-60 minutter å komme seg fra håndtere stress.
  3. Plasser ultralyd svingeren med svinger hodet vendt oppover mot axolotl i hengekøya.
  4. Bruk ultralyd-gel svingeren.
  5. Forsiktig og uten å forstyrre dyret, plasser svingeren over midtlinjen av dyr i regionen thorax parallelt med den lange aksen av dyret.
    Merk: Dette er den samme, men omvendt, stillingen som de bedøvet axolotl (trinn 3.2).
  6. Få B-modus, farge Doppler modus, PW modus data i lange aksen og kort aksen visningen som beskrevet i trinnene 3.2-3.14.
    Merk: En skrå paragill visning er uovertrufne i den unanesthetized axolotl. Echocardiographic dataene i unanesthetized axolotls skal anskaffes mellom gill ventilasjon bevegelser (en 10-20 s periode for en hvile dyr). Hvis axolotl flyttes under oppkjøpet, må mål gjentas.

5. evaluere 2D Echocardiography Data og minimere subjektivitet

  1. Unngå operatør/observatør skjevhet i 2D ultralyd imaging og 3D evaluering av hjertefunksjon basert på 2D-data forårsaket av subjektivitet i både datainnsamling og analysefasen data ved å utføre intra/inter-operator/observatør analyse20.
    Merk: I oppstart av studier og når trening nytt personell denne subjektivitet må kvantifiseres og minimert intra/inter-operator/observatør analyse.
  2. Starte intra/inter-operator/observatør analysen i en to personer oppsett med operatør/observatør 1 (mindre erfarne) testet mot operatør/observatør 2 (mer erfarne) ved å utføre ≥ 6 konsensus mål sammen, inkludert både benk arbeid den ultralyd systemet (operasjon) og påfølgende analyse av relevante parametere (observasjon).
  3. Nå konsensus mellom operatører og observatører og drive (operatør/observatør 1) den ultralyd systemet å erverve relevante data på ≥ 6 dyr (operasjon 1.1).
  4. Direkte etter, Operer (operatør/observatør 2) den ultralyd systemet å erverve relevante data på de samme dyrene (operasjon 2.1).
  5. La dyr gjenopprette for 3 dager. Deretter gjenta (operatør/observatør 1) (operasjon 1.2).
  6. Analysere (operatør/observatør 1) alle målt data (operasjon 1.1/observasjon 1.1, operasjon 2.1/observasjon 1.1, operasjon 1.2/observasjon 1.1) etter 24 h gjenta analyse av operatør/observatør 2 data (operasjon 2.1/observasjon 1.2).
  7. Analysere (operatør/observatør 2) dataene hadde hennes / (operasjon 2.1/observasjon 2.1). Legg merke til at verdiene ved analyseresultatene betraktes nærmest den sanne verdiene.
  8. Evaluere variasjon, tendenser og skjevhet i sammenligninger mellom alle ervervet parametere med Bland-Atman plotting, QQ plotting, t-test (tilsvarende middelverdien), og F-test (lik varians) (figur 6G).
    1. Merk at operasjonen 1.1/observasjon 1.1 versus operasjonen 2.1/observasjon 1.1 sammenligning viser variasjonen mellom operatører.
    2. Merk at operasjonen 2.1/observasjon 1.1 versus operasjonen 2.1/observasjon 2.1 sammenligning viser mellom observatør variasjonen.
    3. Merk at operasjonen 1.1/observasjon 1.1 versus operasjonen 1.2/observasjon 1.1 sammenligning viser intra-Community operatører variasjonen.
    4. Merk at operasjonen 2.1/observasjon 1.1 versus operasjonen 2.1/observasjon 1.2 sammenligning viser intra-observatør variasjonen.
  9. Kontroller at gjennomsnitt og variasjoner i forskjellige målingene er ikke signifikant forskjellig for fire sammenligninger; forskjellen mellom måleverdiene faller innenfor ± 1.96 standard avvik, og det vises ingen tendenser til mindre presisjon hverken liten eller stor verdier.

6. 3D Echocardiography på bedøvet Axolotl

  1. 3D oppkjøp
    1. Plass de bedøvet axolotl i supine posisjon i leppe-formet dyr seng (trinn 1.3.1). Sikre det fra flytende bruker løs gummi band (figur 1 c) og kontroller at thorax overflaten er dekket med 3-5 mm av medium. 3D er utskriftsformatalternativene, derfor gjelder bedøvende løsning som ultralyd medium for å sikre stabil hjertefunksjon gjennom målinger.
    2. Plasser svingeren over midtlinjen av dyr i thorax regionen parallelt med den lange aksen av dyr (for en sagittal 3D opptak) eller ortogonale til den lange aksen (tverrgående 3D opptak).
    3. Oversette svingeren i i-flyet dimensjon (x og y) og den ut-av-plane dimensjonen (z eller sektor) slik at hele hjerte regionen dekkes i det påfølgende 3D-opptaket.
    4. Justere bildefrekvens og romlig oppløsning etter ønske ved å velge enten generelle imaging (temporal romlig/lav oppløsning) eller 'kardiologi' (lav timelige romlig/høy oppløsning). For 0,33 Hz < HR < 1 Hz bruke timelige oppløsning på 50 rammer per sekund på høy romlig oppløsning ('generelle imaging") som tillater cardiac syklusen kan rekonstrueres i 50-150 forskjellige faser.
    5. Juster "2D gevinst" til et nivå hvor anatomiske strukturer er knapt gjenkjennelig i rå B-modus bildet (~ 5 dB) øke signal-til-støy-forhold i de siste rekonstruksjoner.
    6. For hver skive (z trinn), kan du registrere ≥ 1,000 Rammens.
    7. Oversette svinger ett z skritt om gangen, f.eks, 20 µm eller 50 µm og gjentar opptak til hele hjerte regionen er dekket.
  2. 3D rekonstruksjon (supplerende filer 13 og 14).
    1. Eksportere oppkjøp i Digital Imaging og kommunikasjon i medisin DICOM (liten endian-modus).
      Merk: Hver skive som inneholder et angitt antall rammer vil komponere en enkelt fil.
    2. Bestemme antall rammer i en full cardiac syklus. HR kan variere over tid, avgjør dette for både først og siste stykket. Angi det høyeste antallet bilder per syklus som den opprinnelige øvre estimeringen av fase oppløsning som kan senere redusert (trinn 6.2.8).
    3. Bestemme beskjære grenser og avgiftsdirektoratet irrelevante plass rundt vinduet B-modus.
      Merk: Disse grensene bør være konstante gjennom hele skiver.
    4. Konvertere RGB-farge bildet i 32-biters.
    5. Beregne correlation-verdi (C) for hver ramme på stakken og antall rammer som er inkludert i den første hjerte syklusen bruker formelen:
      Equation 6(6)
      Merk: Her Equation 7 er signalet intensiteten i bildepunktet på koordinaten (jeg, j) i det første bildet Equation 8 og det samme i det andre bildet, Equation 9 , Equation 10 og Equation 11 , Equation 12 betyr intensitet og standard avvik, henholdsvis for første og andre bildet i sammenligning, og I og J er antall kolonner og rader i bildet. Den resulterende rekke korrelasjon verdier har størrelsen på produktet av antall bilder per cardiac syklus og antall bilder per sektor (f.eks75 × 1000 = 75.000 i Figur 8) (se eksemplarisk skript i utfyllende Filen 16). Correlation-verdi kan ikke beregnes hvis ett eller begge av bildene i sammenligningen har standardavvik bildepunktverdiene null, men dette er svært lite sannsynlig i ultrasonographic bilder.
    6. Oppdage lokale maxima i matrisen av korrelasjon verdier (figur 8A, se eksemplarisk skript i supplerende filen 17 å automatisk oppdage lokale maxima).
    7. Beregne kvadratisk gjennomsnittlig Q(AVG) rammer med topp korrelasjon verdier (dvs., matchende cardiac faser) ved hjelp av formelen:
      Equation 14(7)
      der N er antall rammer med matchende cardiac faser, Equation 15 er intensiteten i bildepunktet på koordinaten (jeg, j) nth bildet og Equation 16 timelige aritmetisk middelverdi Equation 17 av nth bildet (se eksemplarisk skript i supplerende filen 18).
    8. Gjenta trinn 6.2.3-6.2.7 for alle sektorer.
    9. Merk et stykke (referanse slice) med lett gjenkjennelig anatomiske strukturer (f.eksmidt-ventrikkel) og sjekk hvis rekonstruert ensemblet gjennomsnitt en cardiac syklus tilsvarer nøyaktig én syklus (dvs.hvis det er flere faser som resulterer i mer enn ett hjerte syklus). Slett andre faser for å gi nøyaktig ett hjerte syklus (f.eksgår fra en overvurdert 75 faser/syklus (i virkeligheten, 1,07 syklus) i Figur 8 til nøyaktig en syklus som inneholder 70 faser i Figur 8).
    10. På den nærliggende SKIVE (test slice), Sorter ensemblet gjennomsnitt ett hjerte syklus t-stakken i matchende cardiac faser med referanse stykket ved hjelp av korrelasjon verdien formelen (formelen 6) (se eksemplarisk skript i supplerende filen 19 og supplerende fil 20).
      Merk: Selv om to ikke-identiske skiver ikke vises helt lignende når som helst under cardiac syklus, tilstøtende stykker med tilstrekkelig lite skritt størrelse (f.eks, 20 µm eller 50 µm) vil har uttalt likheter resulterer i sammenheng verdien maxima som kan oversettes til matchende faser.
    11. Gjenta trinn 6.2.9-6.2.10 for alle sektorer.
    12. Skjule hele 3D rekonstruksjon i ett 3D Tagged Image File format (TIF) som inneholder z skiver og t rammer eller i en stabel med DICOM-filer.
      Merk: Data kan være binned i hver dimensjon for å redusere størrelsen, øke signal-til-støy-forhold og generere isotropic data (i-flyet oppløsning er vanligvis flere kaster høyere enn ut-av-plane oppløsning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intrapericardial plass i axolotl er avhengig av størrelsen på dyret. Mindre dyr (2-20 g, 7-15 cm) vil ha et overskudd av perikard væske (vises mørk i echocardiography) rundt cardiac chambers mens i større seksuell modne dyr (> 20 g, > 15 cm) chambers vil oppta de fleste av de intrapericardial plass. For å gi den beste oversikten for representant resultatene av echocardiographic utsikt over axolotl hjertet, ble en mindre dyr (10 g, 10 cm) brukt for Figur 3, Figur 4, figur 5og figur 9.

Visningen lange aksen vanligvis gir en god oversikt over cardiac anatomi i axolotl. Inn på midtlinjen flyet med sinus venosus, atria og del av ventrikkel i flyet (figur 3A, B, utfyllende fil 2) ventrikkel flyet (Figur 3 c--H) eller atrial flyet (figur 4A -D) kan nås ved å oversette svingeren til høyre eller venstre for dyret, henholdsvis. Ventrikkel vises sfærisk og svært trabeculated (Figur 3 c, utfyllende filer 3-5), mens atria har en mer uregelmessig form og nesten ingen trabeculation (figur 4A, Supplerende filen 6, utfyllende filen 7). Visningen kort akse (figur 5A, B, utfyllende fil 10) gir en mindre lett interpretable oversikt over cardiac anatomien i axolotl hjerte, men bidrar til evalueringen av riktig cardiac sammentrekning (f.eks infarcted eller ikke-contracting soner av sirkulære ventrikkel er tydelig visualisert i denne visningen fly). I lange aksen Vis flyet plassert midt i utløp tarmkanalen nært til midten av ventrikkel (figur 2Aog sammenligne Figur 3 c med figur 4E og supplerende filen 3 med supplerende filen 8 ). Siden bløtvev i ut-område skal flytte på blod utstøting, høy intensitet blod signalet i en cardiac syklus målt ved pulsen bølge Doppler i den lange aksen og skrå paragill flyet vil bli Hakuba av lav intensitet støy fra den bevegelser av omkringliggende bløtvev (grå området rundt hvite området i hastighet/tid kurven i figur 4G og figur 5E). Vanligvis bør kontrasten mellom blod signal og bløtvev støy være store nok til å segmentere ut bare blod signalet når du måler hastighet tiden integrert (figur 4G (g1 forstørrelse) og figur 5E (e1 forstørrelse)).

For kvalitativ vurdering av blodet flyt mønstre, farger Doppler og makt Doppler imaging gi visualiseringer av flyt mønstre i forskjellige cardiac kamre (ventrikkel: figur 3E-H, utfyllende filen 4, Supplerende fil 5; Atria: Figur 4 C, D, utfyllende filen 7; utløp skrift: figur 4F, figur 5 D, utfyllende filen 9, utfyllende fil-12).

Axolotls brukes for laboratoriet eksperimentering varierer i størrelse fra tidlig post larvestadiet 2-4 g til full modenhet på 10-30 g og større dyr veier > 100 g. likeledes, hjertefunksjon og noen absolutte verdier av funksjonelle parameterne som beskrives her avhenger på størrelsen på dyrene. Vanligvis er brøk området endring konstant i forskjellig størrelse grupper med verdier spenner på 40-50% (forskjøvet mot lavere verdier for større dyr). Slagvolum er svært avhengig av størrelsen på dyret, dvs, størrelsen på hjertet, alt fra f.eks 20-30 µL i 5 g axolotls, 50-70 µL i 10 g axolotls og 250-300 µL i 50 g axolotls. Pulsen til noen grad Slagvolum er svært avhengig av det anvendt anesthetic og nivået på anestesi (figur 6A-F, figur 7).

Tradisjonelle intra/inter-operator/observatør analyse omfatter grafiske fremstillinger (Q-Q tomter og Bland-Altman tomter) og testing for lik mening (t-test) og varians (F-test) å evaluere normalfordeling data og sammenligne nøyaktighet og presisjon mellom to personer (figur 6G).

3D echocardiography legger en ekstra dimensjon (z eller dybde) til mer tradisjonelle 2D oppkjøpet. Dette gir flere plan visualisering av data (figur 9A), reslicing (figur 9B), overflate og rekonstruksjoner (figur 9C, utfyllende filen 13og supplerende fil 14) og segmentering og generering av 3D-modeller (figur 9 C, utfyllende fil 15).

Figure 1
Figur 1. Forberedelse av sengen og container echocardiography av anesthetized og unanesthetized axolotl. (A) A myk stykke tøy brettes én gang og rullet inn i «burrito» figur. (B) ender er bøyd tilbake og tapet for å danne en leppe formet seng for axolotl under undervanns skanning. (C) For 2D- og 3D echocardiography av en bedøvet axolotl, dyr er forsiktig plassert i supine posisjon i kløft av leppen formet seng og fast med gummistrikk over midt-mandibular og sakrale regionen. (D, E) En hengekøye er utarbeidet av skar ut en firkantet hull i et stykke polystyren skum og taping plast brytes den øvre overflate. (F) For 2D echocardiography av en unanesthetized axolotl, dyr er plassert i en naturlig utsatt posisjon i hengekøya og nærmet seg med en gel dekket svinger tips fra under. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Svinger plassering. (A, B) Modell av arteriell nettverket i axolotl med omtrentlig posisjon svingeren for lange aksen og kort akse (A) og skrå paragill visning (B). (C) Transillumination med en kraftig Kaldtlyskilden kan hjelpe med å finne den nøyaktige plasseringen av cardiac kamre før svingeren (se utfyllende fil 1). Anatomisk forkortelser: A, atria; OFTE, utstrømming skrift; SinV, sinus venosus; V, ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Representant lange aksen echocardiographic visninger av ventrikkel. (A, B) Typisk lange aksen midtlinjen visning i B-modus (gul linje i figur 2A) i ventrikkel ende-diastolisk (A) og slutten-systolisk (B) faser (se utfyllende fil 2 video representasjon). (C, D) Lange aksen visning av ventrikkel i B-modus (svart linje i figur 2A) i ventrikkel ende-diastolisk (C) og slutten-systolisk (D) faser (se utfyllende filen 3 video representasjon). (E-H) Lignende Vis flyet som (A) og (B) i farge Doppler (CD) og strømmodus Doppler (PD) demonstrere blod flyte (se utfyllende filen 4 og supplerende fil 5 video representasjon av CD - og PD-modus, henholdsvis). Røde farger i CD-bilder angir blodet flyter mot svingeren og blå farger angir motsatt. CARDIAC kamre og blodstrøm er markert med prikkede linjer. Innsatte tegneserier i (A) og (C) viser plasseringen av svinger og oversettelsen i forhold til lange aksen midtlinjen Vis. Anatomisk forkortelser: A, atria; DC(L), forlot duct av Cuvier; OFTE, utstrømming skrift; SinV, sinus venosus; V, ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Representant lange aksen echocardiographic utsikt over atria og utløp tarmkanalen. (A, B) Lange aksen visning av atria i B-modus (grønn linje i figur 2A) i atrial ende-diastolisk (A) og slutten-systolisk (B) faser (se utfyllende filen 6 for video representasjon). (C, D) Lignende Vis flyet som (A) og (B) i fargemodus Doppler (CD) demonstrere blod flyte (se utfyllende filen 7 video representasjon). (E) lange aksen visning av utløp skrift i B-modus (blå linje i figur 2A) i midten av utstøting fase (se utfyllende filen 8 video representasjon). F: Lignende Vis flyet som (E) i CD-modus demonstrere blod flyte (se utfyllende filen 9 video representasjon). (G) lignende Vis flyet som (E) og (F) i pulsen bølge Doppler (PW) modus gir varme gjenkjenning og hastighet tid integrert (VTI) måling for hjerneslag volum beregning. Røde farger i CD-bilder angir blodet flyter mot svingeren og blå farger angir motsatt. CARDIAC kamre og blodstrøm er markert med prikkede linjer. Gule og røde pilespisser indikerer semilunar ventiler på roten av utløp luftveiene og spiral ventilen i utløp skrift, henholdsvis. Innsatte tegneserier i (A) og (E) Vis plassering av svinger og oversettelse i forhold til lange aksen midtlinjen Vis. Anatomisk forkortelser: A(R), høyre atrium. A(L), venstre atrium. OFTE, utstrømming skrift; SinV, sinus venosus; V, ventrikkel; VC, vena cava. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Representant kort aksen og skrå paragill echocardiographic visninger i ventrikkel og utløp tarmkanalen. (A, B) Kort aksen visning av ventrikkel i B-modus (grå linje i figur 2A) i ventrikkel ende-diastolisk (A) og slutten-systolisk (B) faser (se utfyllende fil 10 video representasjon). (C) skrå paragill visning av utløp skrift i B-modus (lilla linje i figur 2B) i midten av utstøting fase (se utfyllende filen 11 for video representasjon). (D) lignende Vis flyet som (C) i CD-modus demonstrere blod flyte (se utfyllende filen 12 video representasjon). (E) lignende Vis flyet som (C) og (D) i pulsen bølge Doppler (PW) modus gir varme gjenkjenning og hastighet tid integrert (VTI) måling for hjerneslag volum beregning. Røde farger i CD-bilder angir blodet flyter mot svingeren og blå farger angir motsatt. CARDIAC kamre og blodstrøm er markert med prikkede linjer. Innsatte tegneserier i (A) og (C) viser plasseringen av svinger og oversettelsen i forhold til lange aksen midtlinjen Vis. Anatomisk forkortelser: A, atria; OFTE, utstrømming skrift; SinV, sinus venosus; V, ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Representant resultatene av hjertefrekvens og hjerneslag volum målinger, effekten av anestesi og representant intra/inter-operator/observatør analyse. (En-C) Hjertefrekvens (HR) i forhold til unanesthetized planlagte plottet over tid (0 h er på full anestesi) for seks axolotls anesthetized benzocaine (en), MS-222 (B) og propofol (C). (D-F) Hjerneslag volum (SV) i forhold til unanesthetized planlagte tegnes over tid (0 h er på full anestesi) for seks axolotls anesthetized i benzocaine (D), MS-222 (E), og propofol (F). (G) Intra/inter-operator/observatør analyse av Slagvolum. Bland-Altman tomter [forskjellen (Dif) mellom operatører (Op) / observatører (Obs) plottet mot gjennomsnittet (Avg)] skal avsløre ingen systematiske skjevhet i normalfordelt målinger (Q-Q tomter) ved forskjellige operatører og observatører. Testing for lik mening (t-test) og lik varians (F-test) skal avsløre noen betydelige forskjeller mellom operatører observatører (tabell i nederst til høyre). A - F ble endret fra materiale tilgjengelig under Creative Commons Attribution License (figur 1 av Thygesen et al. 21). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Sammenligning av Slagvolum anslått av den geometriske og pulsen bølge Doppler metoden. Sammenligning av Slagvolum (SV) anslått av todimensjonal B-modus geometriske (geo) mål eller pulsen bølge Doppler målene på hastigheten blod avslutter den utløp tarmkanalen. Sv(Geo) og SV(pw) er registrert i samme seks dyr med sekunder mellom hvilke måling og bruker tre ulike bedøvelse, benzocaine (blå skrå ruter), MS-222 (røde firkanter), og propofol (grønne trekanter) med en uke av utvinning mellom Bruk de forskjellige bedøvelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Representativt spatiotemporal bilde korrelasjon for 3D echocardiography. (A) kurven representasjon gitt sammenheng verdier av en korrelasjon operasjon i 1000 ramme cine dataset med 75 rammer per cardiac syklus. To rammer med bare små forskjeller, som angir matchende cardiac faser, vil gi en høy Korrelasjonsverdi. Senere kan en lokale maxima søke algoritmen brukes på data for å oppdage alle samsvarende rammer. (B) grafisk fremstilling av de samme dataene som (A). Når korrelasjon verdiene hentes ved å sammenligne den første hjerte syklusen med hele cine stack, angi diagonale linjer maksimal korrelasjon matchende cardiac faser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9. Representant 3D echocardiography. (A) multi-Planar Vis 3D rekonstruert axolotl hjerte. Spatiotemporal bilde korrelasjon prosedyren lar for gjenoppbyggingen av en full cardiac syklus med flere forskjellige faser (her 70 faser) i tre romlige dimensjoner som kan deretter bli skiver som de ønsket gransking av spatiotemporal fenomener i det bankende hjertet. (B) tre tverrgående skiver rekonstruert 115 skiver 3D-data. Kvadratisk snitt prosedyren forbedrer blod til vev kontrasten og reduserer signal-til-støy forholdet gir en bedre forståelse av trabeculated natur axolotl ventrikkel og en tydelig visualisering av den interatrial septum og ventiler i utløp skrift. (C) overflate og representasjoner av det bankende hjertet i tre faser langs en fargekodet segmentert modell (se utfyllende filen 13 og supplerende fil 14 for video representasjoner av overflate og volum gjengivelse slo hjerte og supplerende fil 15 for en tre-fase segmentert interaktiv 3D modell). Anatomisk forkortelser: A, atria; Cau, caudal; CRA, skallen; Dex, dexter (til dyret høyre); Dor, dorsal; OFTE, utstrømming skrift; Synd, skumle (til dyrene venstre); SinV, sinus venosus; V, ventrikkel; Ven, ventral. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende fil 1. Transillumination å finne cardiac kamre i denaxolotl. Se figur 2C. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 2. Lange aksen, midtlinjen utsikt, B-modus. Se figur 3A, B. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 3. Lange aksen, ventrikkel utsikt, B-modus. Se Figur 3 c, D. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 4. Lange aksen, ventrikkel visning, farge Doppler modus. Se figur 3E, F. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 5. Lange aksen, ventrikkel visning, makt Doppler modus. Se Figur 3 g, H. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 6. Lange aksen, atrial utsikt, B-modus. Se figur 4A, B. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 7. Lange aksen, atrial visning, farge Doppler modus. Se figur 4C, D. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 8. Lange aksen, utstrømming tarmkanalen visning, B-modus. Se figur 4E. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 9. Lange aksen, utstrømming tarmkanalen visning, farge Doppler modus. Se figur 4F. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 10. Kort akse, ventrikkel visning, B-modus. Se figur 5A, B. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 11. Skrå paragill, strøm tarmkanalen utsikt, B-modus. Se figur 5C. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 12. Skrå paragill, strøm tarmkanalen visning, farge Doppler modus. Se figur 5 d. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 13. Tredimensjonal overflate gjengivelse av vibrerende sentrum i 70 faser (19,6 ms midlertidig løsning). Se figur 9C. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 14. Tredimensjonale volumgjengivelse av vibrerende sentrum i 70 faser (19,6 ms midlertidig løsning). Se figur 9C. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 15. Tredimensjonal interaktiv modell av vibrerende sentrum i 3 faser: ventrikkel ende-Systolen ventrikkel midt utstøting og ventrikkel ende-Systolen. Se figur 7C. Interaktive PDF-filen skal vises i Adobe Acrobat Reader 9 eller høyere. For å aktivere 3D-funksjonen, klikker du modellen. Bruke markøren, er det nå mulig å rotere, zoome, panorere modellen, og i modelltreet alle segmenter av modellen kan være slått av/på eller gjort gjennomsiktig. Modelltreet er et hierarki som inneholder flere sub-lag som kan være åpnet (+). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 16. Representant kommenterte skript for beregning av korrelasjon-verdien til et 1,000 Rammens oppkjøp med en øvre vurdering av 75 rammer/hjerte syklus. Skriptet er skrevet i makrospråket til IJ1 og kan implementeres som en satsvis makro i ImageJ å beregne korrelasjon verdier (75.000 per kjøp) over en hel z-stabel av 3D-data. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 17. Representant skriptet for automatisk peak gjenkjenning i en rekke korrelasjon verdier fra et 1,000 Rammens oppkjøp med en øvre vurdering av 75 rammer/hjerte syklus. Sammenheng verdiserien (kolonne B, merket med gult) kan erstattes og etter aktivering av makroen (Ctrl + r) blir listen over kommandoer å velge matchende cardiac faser og utføre kvadratisk snitt vises (kolonne Q, merket i grønt). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 18. Representant kommentert å velge matchende cardiac faser og utføre kvadratisk snitt av en 1,000 Rammens oppkjøp med en øvre vurdering av 75 rammer/hjerte syklus (kolonne Q i supplerende fil-17). Skriptet er skrevet i makrospråket til IJ1 og kan implementeres som en makro i ImageJ opprette en gjennomsnitt én syklus (75 faser) 2D sektor. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 19. Representant kommenterte skript for å beregne correlation-verdi mellom en 70 rammer referanse skive og en tilstøtende 75 rammer test skive. Skriptet er skrevet i makrospråket til IJ1 og kan implementeres som en makro i ImageJ å beregne korrelasjon verdier (5,250). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 20. Representant Excel skriptet for automatisk peak gjenkjenning i en rekke korrelasjon verdier fra en sammenligning mellom en 70 rammer referanse skive og en tilstøtende 75 rammer test skive. Korrelasjon verdiserien (kolonne C, merket med gult) kan erstattes og etter aktivering av makroen (Ctrl + t) skiver velges en substack i testen sektoren blir vises (kolonne L, rad 2, merket i grønt). Test slice substack vil ha romlig matchende rammer referanse sektoren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Echocardiography i axolotl og andre ikke-pattedyr arter gir annen data enn pattedyr echocardiography hen kjerne av røde blodlegemer i Alle virveldyr unntatt voksen pattedyr. Dette resulterer i et uttalt blod signal og mindre blod til vev kontrast i axolotl echocardiographic bilder sammenlignet eksempelvis musen eller menneskelig echocardiography. Dette kan gjøre bildesegmentering på ubehandlet enkeltbilde ultralyd bildene mer vanskelig som det kan være vanskelig å skille blod fra vev. Dette fenomenet kan imidlertid være en fordel når brukes til å lage blod signal forbedrede bilder ved å bruke den kvadratiske snitt prosedyren beskrevet tidligere18 og endret for axolotl echocardiography protokollen Seksjon 6. Siden blod flekker er mye mer dynamisk enn bløtvev, genererer kvadratisk snitt uttales kontrasten mellom disse to avdelinger som forenkler bildesegmentering i to og tre dimensjoner.

Denne protokollen beskriver tre forskjellige anestesi for axolotl som har blitt grundig testet tidligere21. Både benzocaine og MS-222 stimulere en økning i hjertefrekvens, som kan være ønskelig når testing hjertefunksjon under stress forhold. Propofol forårsaker mindre stress til hjertet under anestesi og kan brukes som en erstatning for unanesthetized echocardiography i situasjoner der anskaffet overstiger grensene for stillesittende atferd i unanesthetized axolotls.

2D echocardiography beskriver 3D hjertet påvirkes av subjektivitet. Derfor er det viktig å oppførsel og intra/inter-operator/observatør analyse før gjennomfører en aktuelle eksperimentet som beskrevet i protokollen seksjon 5. Likeledes bør echocardiographic mål sees mer som som kan brukes for å undersøke mulige forskjeller i hjertefunksjon under ulike omstendigheter i stedet for absolutte verdier. Slagvolum bestemmes av geometriske formelen (formelen 2) sjelden gir samme absoluttverdien som pulsen bølge Doppler formelen (formelen 4; Figur 7), og det bør være besluttet som mål for å følge gjennom en serie eksperimenter. SV(geo) kan fås raskere enn SV(pw), men sfærisk forutsetning av ventrikkel figuren gjelder bare for sunn jevnt kontraktørselskaper hjerter, og i sykdom og regeneration modeller, SV(pw) bør vurderes for en bedre refleksjon av den sanne Slagvolum.

Korrelasjon og kvadratiske snitt prosedyren av protokollen § 6 kan gjennomføres i flere forskjellige bildebehandling og matematiske pakker. Siden programmering og tilgang til programvarepakker variere innen life science forskere, forsiktig vi mot gir representant skript for metodene i programvarepakker som de fleste forskere er kjent med (f.eks Excel) som er lett nærmet og fritt tilgjengelig (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Supplerende filer 16 - 20 gir kommenterte eksemplarisk skript som er skrevet i makrospråket til IJ1 og som XLSM makroer som skal være forståelig selv med minimal erfaring i koding.

Indre hjertet gjenfødelse er et fenomen utelukkende funnet i hjertene til liten arter (i forhold til menneske), og dermed målinger og bildebehandling planlagte hjertefunksjon og funksjonelle fremgang under regenerasjon er utfordret av størrelsen på hjertet og den romlig oppløsningen på tenkelig modalitet brukes. Høy frekvens ultralyd imaging gir en ønskelig avveining mellom en høy i flyet romlig oppløsning (~ 30 x 30 µm2 på 50 MHz) som sammenlignes i vivo µCT imaging og mye høyere enn i vivo µMRI, som har en dyp gjennomtrengning (~ 1 cm på 50 MHz) flere kaste større enn AC confocal mikroskopi og en svært høy timelige oppløsning (50-300 bilder/s 50 MHz, 1 cm dybde). Sammen med manuell eller automatisert z dimensjonale bevegelse svingeren, gir ultralyd uovertruffen rekonstruksjon av hjertefunksjon og anatomisk modellering i fire dimensjoner. I tillegg gir ikke-invasiv art på teknikken langsgående eksperimentering. Vi vet er det ingen matrise matrise transdusere tilgjengelig for høyfrekvent mikro ultralyd imaging. Utviklingen av denne teknologien vil sterkt hjelpe oppkjøp av 3D-data i små hjerter som axolotl i en raskere prosedyre enn mekanisk bevegelse svingeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å erkjenne Kasper Hansen, Institutt for Bioscience, Aarhus universitet for å gi tilgang til og hjelp med den elektroniske micromanipulator for 3D echocardiographic oppkjøpet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Medisin problemet 141 Echocardiography ultralyd hjerte hjerte ultrasonography gjenfødelse axolotl Ambystoma mexicanum spatiotemporal bilde korrelasjon
2D- og 3D-Echocardiography i Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter