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Medicine

Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Aqui apresentamos os protocolos de ecocardiografia para aquisição de imagens bidimensionais e tridimensionais do coração pulsante de salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), uma espécie de modelo na regeneração do coração. Estes métodos permitem a avaliação longitudinal da função cardíaca em uma alta resolução spatiotemporal.

Abstract

Defeito cardíaco como resultado de doença isquêmica do coração é um grande desafio, e terapias regenerativas ao coração estão em alta demanda. Algumas espécies de modelo como zebrafish e salamandras que são capazes de regeneração intrínseca coração segura promessa futura das terapias regenerativas para pacientes humanos. Para avaliar o resultado das experiências de cardioregenerative, é imperativo que a função do coração pode ser monitorizada. A salamandra Ambystoma mexicanum (a. mexicanum) representa uma espécie de modelo bem estabelecida em biologia regenerativa atingir tamanhos que permite a avaliação da função cardíaca. O propósito do presente protocolo é estabelecer métodos para medir a função cardíaca nos axolotes usando ecocardiografia reproducibly. A aplicação de diferentes anestésicos (Benzocaína, MS-222 e propofol) é demonstrada, e a aquisição de dados de ecocardiográficas bidimensionais (2D) em axolotes anestesiados e sem anestesia é descrita. Ecocardiografia 2D do coração tridimensional (3D) pode sofrer de imprecisão e subjetividade das medições e para aliviar esse fenômeno um método sólido, ou seja análise intra/inter-operator/observador, para medir e minimizar esse viés é demonstrado. Finalmente, um método para adquirir dados ecocardiográficos 3D do coração axolote batendo em uma resolução muito alta spatiotemporal e com acentuado contraste de sangue-de-tecido é descrito. Globalmente, este protocolo deverá proporcionar os métodos necessários para avaliar a função cardíaca e anatomia do modelo e dinâmica nos axolotes utilizando imagens de ultra-som com aplicações em biologia regenerativa e experiências fisiológicas gerais de fluxo.

Introduction

Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte em todo o mundo1,2. Embora muitos sobrevivem a um infarto do miocárdio devido à intervenção médica rápida e aperfeiçoá-lo, incidentes isquêmicas em seres humanos, muitas vezes, levar a cicatrizes fibróticas associadas a hipertrofia, mau funcionamento elétrico e uma reduzida capacidade funcional do coração . Esta falta de potencial regenerativo do tecido cardíaco é compartilhada entre os mamíferos e embora controversas declarações de mamíferos regeneração cardíaca têm sido relatadas, estas foram limitadas ao cepas específicas de murino3,4 e ratos de hipóxia tratada5. Assim, o campo da biologia e medicina regenerativa cardíaca é geralmente limitado a modelos animais não-mamíferos para estudar fenômenos regenerativos intrínseca do coração. O peixe-zebra (Danio rerio) na última década foi estabelecido como o modelo mais bem caracterizado para coração intrínseca regeneração6,7,8,9,10 . Devido à manutenção do laboratório fácil, um tempo de geração curto e um vasto leque de ferramentas moleculares disponíveis, o zebrafish está bem adaptado como um modelo para mecanismos genéticos e moleculares subjacentes cardíaco desenvolvimento e regeneração. No entanto, as dimensões minutos do coração zebrafish torná-lo que menos adequado para a avaliação funcional e complicados procedimentos cirúrgicos e a não-tetrápode filogenia do zebrafish limita a extrapolação razoável das conclusões nesta espécie, assim justificando o uso de outros modelos maiores de tetrápodes. Um dos primeiros modelos de regeneração de coração de vertebrados foi um anfíbio caudado, o Tritão Oriental (Notophthalmus viridescens)11, uma espécie que continua a ser um modelo valioso12.

Nos últimos anos outro anfíbio caudado, o axolotl mexicano (a. mexicanum) entrou em cena como uma grande (até 100 g de corpo em massa) e altamente laboratório adaptável modelo animal para uma ampla gama de disciplinas regenerativas, abrangendo a regeneração de membro, lesão da medula espinhal e regeneração cardíaca13,14,15,16,17. O axolotl é altamente passível de medidas funcionais sobre o coração, usando a alta frequência ecocardiografia e ultra-som de imagem com um nível muito inferior de artefatos de imagem (acústicos permite a ausência de estruturas calcificadas no lado ventral do coração sombreamento e reverberação em particular) do que o observado em outros animais modelo com calcificada esterno e costelas.

O protocolo seguinte descreve vários métodos diferentes e preparações (Figura 1, Figura 2) para adquirir reprodutíveis ecocardiográficas medições no coração axolote em ambos anestesiados (aplicar três diferentes anestésicos: benzocaína, MS-222 e propofol) e sem anestesia animais em dois (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Arquivos complementares 1-12) e três (Figura 8, Figura 9, Arquivos complementares 13-14) dimensões espaciais. O coração dos anfíbios é três câmaras (dois átrios e um ventrículo único). Os átrios são fornecidos por um grande seio venoso e o ventrículo deságua o tracto de saída do conus arteriosus (Figura 2). Uma vez que mais ênfase é tradicionalmente colocado na regeneração ventricular e menos sobre a recuperação dos átrios6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, este protocolo centra-se principalmente em medições da função ventricular.

Ecocardiografia de anfíbios não é bem descrita na literatura, e o desenvolvimento dos métodos 2D descritas neste documento foram dirigidos pela necessidade de melhor representam a funcionalidade do coração batendo axolote em um determinado momento e configuração experimental. Assim, os métodos descritos aqui são aplicáveis em experiências regenerativas de coração onde função cardíaca pode ser monitorizada repetidamente ao longo de um processo de regeneração. Além disso, os métodos podem ser aplicados em experimentos de cardiophysiological sobre o axolote em geral ou ligeiramente modificados para abranger outros modelos de anfíbio caudados ou anfíbios anuros (e.g.,Xenopus). O axolote existe em várias cepas diferentes e variações de cor (por exemplo, sua, babão, branco, albino, branco transgénico com expressão de proteínas fluorescência verde), no entanto, estas características não afetar a compatibilidade do Ambystoma mexicanum com o protocolo descrito. O método descrito aqui para adquirir dados ecocardiográficos 3D é uma versão modificada da imagem spatiotemporal correlação (STIC) técnica desenvolvida por ultra-som clínico e a função quadrática média método descrito anteriormente no frango em desenvolvimento para aumentar o sinal de manchas de sangue em tecidos moles em espécies contendo hemácias nucleadas18,19. Este método permite a modelagem avançada de contração cardíaca e computada dinâmica de fluidos no coração axolote.

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Protocol

Os procedimentos realizados neste protocolo estavam em conformidade com a legislação nacional dinamarquesa para o cuidado e uso de animais de laboratório e as experiências foram aprovadas pela inspecção de experimentos de Animal nacional dinamarquês (protocolo # 15-00615-0201-2015).

1. preparações

  1. Preparar o axolote médio.
    1. Aplica água da torneira alta qualidade não-quimicamente tratada como meio de axolote. Se este não estiver disponível, aplica solução de 40% Holtfreter.
    2. Preparar a solução de 40% (wt/vol) Holtfreter dissolvendo 15,84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O e 0,288 g KCl em água filtrada e desionizada até um volume de 1 L.
  2. Fazer anestésicos de imersão.
    1. Prepare solução anestésica a benzocaína (4-aminobenzoato de etilo) dissolver 4-aminobenzoato de etilo 200 mg em 3 mL de acetona e em seguida, dissolvendo-se esta mistura em solução do 1 L água da torneira ou 40% Holtfreter.
    2. Prepare a solução anestésica de MS-222 (etil 3-aminobenzoato ácido metanossulfônico, também conhecido como tricane), dissolvendo o ácido metanossulfônico do 200mg etil 3-aminobenzoato diretamente na solução do 1 L água da torneira ou 40% Holtfreter.
    3. Prepare a solução anestésica do propofol (2,6-diisopropilfenol) dissolvendo mg 3,3 2,6-diisopropilfenol em solução do 1 L água da torneira ou 40% Holtfreter. Alternativamente, diluir a solução comercialmente do premade para 3,3 mg/L.
      Cuidado: Propofol é um potente anestésico humano (administrado por via intravenosa) e deve ser manuseado com cuidado, incluindo na forma diluída.
  3. Prepare a cama e recipiente para ecocardiografia.
    1. Prepare a cama de animais em forma de lábio para ecocardiografia dobrando um pedaço de 70 cm x 55 cm de pano uma vez e então, rolando-o em "forma de burrito" (figura 1A). Em seguida, dobre sobre as extremidades até que encontrar e gravar esses juntos (figura 1B).
    2. Submergi o lábio em forma de estrutura no meio de axolotl para acomodar o axolote anestesiados durante a ultra-sonografia. Proteger o animal para a estrutura e evitar flutuante usando elásticos soltos; Posicione estes meados-mandibular e sobre a região sacral (Figura 1).
      Nota: As bandas de borracha não pode apertar o animal como isso afetará a hemodinâmica.
    3. Para Ecocardiografia 2D em axolotes sem anestesia, prepare um hammock, esculpindo um 16 x 8 cm x furo de 5 cm em um 33 x 27 cm x bloco de 5 cm de espuma de poliestireno (por exemplo, uma tampa de um recipiente de espuma de poliestireno de tamanho médio) (Figura 1).
    4. Empurrar um pedaço de 33 cm x 27 cm de plástico através do furo e prenda as bordas do pano para a superfície superior do bloco de espuma de poliestireno (Figura 1E) para criar uma rede. Adicione meio axolotes a 3cm de profundidade na rede. O axolote sem anestesia vai afundar até o fundo da rede permitindo fácil acesso ventral com o envoltório plástico (Figura 1F).

2. anestesiar axolotes

  1. Mergulhe o axolotl em solução anestésica desejada (MS-222, benzocaína, propofol ou).
  2. Inspecionar para os primeiros sinais de sedação, redução de movimentos e crescente perda do reflexo de braço endireitante, isto aparece dentro de 10 min em animais < 10g (< 10 cm) e dentro de 20 min em animais entre 10 g e 50 g de massa corporal (10-22 cm).
  3. Verifique se há falta total de movimentos do corpo, movimentos de ventilação gill e braço endireitante reflex e certifique-se de que o animal é não-responsivos à estimulação de dor moderada, testada por beliscar as membranas entre dígitos.
    Nota: apesar do fato de que a anestesia geral é realizada dentro de 30 min em axolotes benzocaína anestesiada, função cardíaca não está estabilizada até 1h. Este não é o caso no MS-222 ou propofol anestesiados axolotes (figura 6A-F).
  4. Para manter o axolote sob anestesia geral, manter o animal em solução de anestesia ou embrulhado em papel molhado toalhetes humedecidos em solução de anestesia.
    Nota: Anestesia pode ser mantida por 7 h sem efeitos adversos sobre o bem-estar do animal dado que a pele e especialmente as brânquias são mantidas húmidas.
  5. Para vocês acordem axolote, transferi o animal para meio livre de anestesia.
    Nota: O primeiro sinal do despertar é gill ventilação movimentos. Animal deve ser ereta e responsivo à estimulação dentro de 1h.

3. 2D ecocardiografia na Axolotl anestesiados

  1. Lugar axolotl anestesiados em uma posição supina na cama animal em forma de lábio (passos 1.3.1-1.3.2). Fixá-lo de flutuar usando elásticos soltos (Figura 1). Certifique-se de que a superfície torácica é coberta por 3-5 mm de média.
    Nota: Para uma breve aquisição (< 5min) médio livre de anestésico pode ser aplicado. Para aquisição prolongada, solução anestésica deve ser aplicada como meio de ultra-som para assegurar a função cardíaca estável durante as medições.
  2. Posicione o transdutor sobre a linha mediana do animal na região torácica paralelo ao eixo longitudinal do animal (Figura 2A, 3A figura-B, 2 de arquivo complementar). Use transiluminação com uma fonte de luz fria em axolotes albino e branco para garantir o correto posicionamento do transdutor (Figura 2 e complementar 1 arquivo).
    1. Para axolotes com < 20 g, use um transdutor de 50 MHz; para axolotes > 20 g, use um transdutor de 40 MHz. Certifique-se de posicionamento da direção cranial/anterior à direita para aquisição de imagem padronizada. Se isso não for o caso rode o transdutor 180 ° ou inverter a imagem.
  3. Certifique-se de que a exibição de linha mediana do eixo longo, uma pequena porção do ventrículo (posicionado para a direita na cavidade torácica, Figura 2A) aparece no quadro na diástole ventricular e uma grande parte dos átrios direito e esquerdos (posicionado no centro / ligeiramente para a esquerda na cavidade torácica, Figura 2A) e o seio venoso são visíveis tanto na sístole atrial e diástole (Figura 3A, B).
  4. Traduza o transdutor 1-3 mm em direção direita do animal para obter a visão do eixo longo ventricular (Figura 2A). A posição correcta é atingida quando a área transversal do ventrículo final-sístole está no seu máximo (Figura 3-H).
  5. Em modo-B, adquirir ≥ 3 ciclos cardíacos com > 50 frames/s em qualquer imagem' geral' (alta resolução temporal espacial/baixa) ou no modo 'Cardiologia' (baixa resolução temporal espacial/alto).
    Nota: Este modo de exibição permite a avaliação da função ventricular. Função ventricular pode ser avaliada em duas dimensões usando a mudança de área fracionário ventricular (cara) calculada a partir da final-sistólica e diastólica final área exposta do ventrículo (CSAv) usando a equação:
    Equation 1(1)
    O ventrículo do axolote assume a forma de uma esfera e um volume de curso de geometria com base [SV(geo)] pode ser calculado usando a equação:
    Equation 2(2)
  6. Traduza o transdutor no eixo longo do animal até o centro do ventrículo é no meio da tela. Rode o transdutor 90 ° no sentido horário para obter a visão do eixo curto médio-ventricular (Figura 5A e B, complementar arquivo 10). Avalie a forma circular do ventrículo, traduzindo o transdutor no eixo longo do coração.
  7. Retornar o transdutor para o avião de eixo longo e traduzi-lo em direção à linha média ou ligeiramente à esquerda da linha média para obter a exibição de dois câmara atrial eixo longo (Figura 2A). Certifique-se que a posição correta é alcançada, confirmando que as áreas transversais das aurículas a fim-sístole são na sua maxima e os dois átrios combinados assumem o contorno do número '8' inclinado ~ 45 ° para a esquerda (Figura 4A e B, Arquivo complementar 6).
  8. Em modo-B adquira ≥ 3 ciclos cardíacos com > 50 frames/s em modo 'imagem geral' ou 'Cardiologia'.
    Nota: Átrios dos axolotes são irregulares em forma e função 3D não pode ser diretamente inferidos a partir dados 2D, assim, sua função deve ser avaliada como uma medida de índice como chance atrial área fracionária (FACa) com base na área secional transversal combinada (CSAa) de ambos câmaras atrial na sístole e a diástole:
    Equation 3(3)
  9. Traduzir o transdutor para a direita até que apareça o tracto de saída (conus arteriosus) (próximo a visão do eixo longo ventricular) (Figura 2A).
    Nota: Depois de deixar o ventrículo em uma direção anterior, tracto de saída faz uma curva acentuada e é executado em um pequeno ângulo em direção à superfície ventral antes novamente assumindo uma direção anterior e dividindo em ramos gill e vasos sistêmicos.
    1. Certifique-se de que a vista do trato de saída correta é alcançada, confirmando que o diâmetro da vazão está no seu máximo no final-sístole ventricular e duas das três válvulas semilunar na entrada da vazão são visíveis no meio da ejeção (Figura 4E, Arquivo complementar 8).
      Nota: A direção ventral na direção do transdutor da parte intermediária do tracto de saída permite medições de velocidade e fluxo utilizando imagens de Doppler.
  10. Aplica cor modo Doppler para mapear as velocidades de fluxo de sangue do trato de saída durante a ejeção cardíaca (Figura 4F e complementar arquivo 9). Da mesma forma, aplica cor Doppler e Power Doppler de imagem para visualizar o fluxo de sangue nas exibições de ventricular e atrial (Figura 3E-H, Arquivos complementares 4-5 e Figura 4-De complementar 7 do arquivo).
  11. Aplicar-se o Doppler de onda de pulso (PW)-modo na posição da velocidade máxima do sangue na porção do tracto de saída correndo em direção do transdutor.
    1. Use 'ângulo de feixe' e 'correção angular' até 45 ° para ajustar a vazão não sendo completamente perpendicular à face do transdutor (Figura 4). Certifique-se que a posição de PW Doppler não é sobreposta pela válvula espiral da vazão durante qualquer fase do ciclo cardíaco (Figura 4E).
  12. Em modo Doppler PW adquirir dados de velocidade/tempo sobre ≥ 3 ciclos cardíacos.
  13. Retornar ao modo-B e adquirir ≥ 3 ciclos cardíacos no exato mesmo avião como PWV foi adquirida.
  14. Medida do velocidade tempo integral (VTI) do fluxo de sangue no tracto como a área sob a curva de velocidade/tempo de saída para um cardíaco completo ciclo (Figura 4, g1).
    Nota: O VTI e o diâmetro (d) do tracto de saída no final-sístole obtido a aquisição de modo-B, um Doppler PW volume de curso com base [SV(pw)] pode ser calculada usando a equação:
    Equation 4(4)
    Frequência cardíaca (FC) é medida a partir da curva de velocidade/tempo medindo a duração de um ciclo cardíaco. Débito cardíaco [CO(pw)] é calculado usando a equação:
    Equation 5(5)
  15. Obter a vista paragill oblíquo, uma visão que oferece uma alternativa para a medição da velocidade de fluxo de sangue no tracto de vazão, girando o axolote 90 ° no lábio em forma de cama, de modo que a parte direita do animal está enfrentando para cima (Figura 2B). Ângulo e rodar o transdutor e posicioná-lo paralelo e só posterior até ao queixo protuberante (Figura 2B). Certifique-se que a posição correta é alcançada, confirmando que o trato de saída está funcionando para baixo em ~ 45 ° e que os átrios aparecem sob o trato de saída durante a ejeção (Figura 5 C, complementar arquivo 11).
  16. Aplica o modo Doppler PW na posição de velocidade máxima do sangue na porção do tracto vazão fugindo do transdutor (Figura 5, complementar arquivo 12). Use 'ângulo de feixe' e 'correção angular' até 45 ° para ajustar a vazão não sendo completamente perpendicular à face do transdutor (Figura 5E).
  17. No modo de Doppler PW adquirem velocidade sangue sobre ≥ 3 ciclos cardíacos.
  18. Retornar ao modo-B e adquirir ≥ 3 ciclos cardíacos no exato mesmo avião como PWV foi adquirida.
    Nota: SV(pw) e CO(pw) são calculados para a exibição de paragill oblíquo usando a equação 4 e 5 de equação conforme descrito acima para a exibição de eixo longo.

4. 2D ecocardiografia na Axolotl sem anestesia

  1. Coloque o axolote sem anestesia em posição na rede (passo 1.3.3).
  2. Deixe o animal sem ser perturbado por 30-60 min para se recuperar de lidar com stress.
  3. Posicione o transdutor de ultrassom com a cabeça de transdutor virada para cima para o axolote na rede.
  4. Aplica o ultra-som-gel no transdutor.
  5. Suavemente e sem incomodar o animal, posicione o transdutor sobre a linha mediana do animal na região torácica paralelo ao eixo longitudinal do animal.
    Nota: Esta é a mesma, mas invertida, posição quanto o axolote anestesiados (passo 3.2).
  6. Obter o modo B, modo de cor Doppler, dados de modo PW no eixo longo e visão do eixo curto conforme descrito nas etapas 3.2-3.14.
    Nota: Uma visão paragill oblíquo é inalcançável nos axolotes sem anestesia. Os dados ecocardiográficos em axolotes sem anestesia devem ser adquiridos entre movimentos de ventilação gill (10-20 s período para um descanso animal). Se o axolote move durante a aquisição, medições devem ser repetidas.

5. avaliar dados de Ecocardiografia 2D e minimizar a subjetividade

  1. Evite o viés de operador/observador em ultra-som 2D imagens e 3D avaliação da função cardíaca com base em dados 2D causados pela subjetividade em fase de análise de dados e a aquisição de dados, realizando análise intra/inter-operator/observador20.
    Nota: Na inicialização de estudos e quando o treinamento de pessoal novo esta subjetividade deve ser quantificada e minimizado usando análise intra/inter-operator/observador.
  2. Iniciar a análise intra/inter-operator/observador em uma configuração de duas pessoa com operador/observador 1 (menos experientes) sendo testada contra o trabalho do operador/observador 2 (mais experimentada) através da realização de medições de ≥ 6 consenso juntos, incluindo os dois banco no o sistema de ultra-som (operação) e posterior análise dos parâmetros relevantes (observação).
  3. Chegar a um consenso entre os operadores e os observadores e operar (operador/observador 1) o sistema de ultra-som para adquirir dados relevantes sobre ≥ 6 animais (operação 1.1).
  4. Logo após, opere (operador/observador 2) o sistema de ultra-som para adquirir dados relevantes sobre os mesmos animais (operação 2.1).
  5. Deixe os animais recuperar durante 3 dias. Posteriormente, repeti (operador/observador 1) o procedimento (operação 1.2).
  6. Analisar (operador/observador 1) dados todos medidos (operação 1.1/Observação 1.1; operação 2.1/Observação 1.1; operação 1.2/Observação 1.1) e após 24h repetir a análise dos dados do operador/observador do 2 (operação 2.1/Observação 1.2).
  7. Analise (operador/observador 2) os dados adquiridos por-se (operação 2.1/Observação 2.1). Observe que os valores obtidos por esta análise são considerados os verdadeiros valores mais próximos.
  8. Avaliar a variação, tendências e viés em comparações entre todos os parâmetros adquiridos usando Bland-Atman plotagem, plotagem de QQ, t-teste (média igual) e F-teste (variância igual) (Figura 6).
    1. Observe que a operação 1.1/Observação 1.1 contra comparação de 2.1/Observação 1.1 operação demonstra a variação inter operador.
    2. Observe que a operação 2.1/Observação 1.1 contra comparação de operação 2.1/Observação 2.1 demonstra a variação inter observador.
    3. Observe que a operação 1.1/Observação 1.1 contra comparação de 1.2/Observação 1.1 operação demonstra a variação intraoperador.
    4. Observe que a operação 2.1/Observação 1.1 contra comparação de 2.1/Observação 1.2 operação demonstra a variação intraobservador.
  9. Certifique-se que a média e variação das medições diferentes são não-significativamente diferentes para as quatro comparações; a diferença entre os valores de medição deve situar-se ± 1,96 desvios-padrão, e não deve aparecer nenhum tendências em direção a menor precisão dos valores nem pequenos nem grandes.

6. 3D ecocardiografia na Axolotl anestesiados

  1. Aquisição 3D
    1. Coloque o axolote anestesiados em posição supina na cama animal em forma de lábio (etapa 1.3.1). Fixá-lo de flutuar usando elásticos soltos (Figura 1) e certifique-se que a superfície torácica é coberta por 3-5 mm de média. Aquisição 3D é um processo moroso, portanto aplicar a solução anestésica como meio de ultra-som para assegurar a função cardíaca estável durante as medições.
    2. Posicione o transdutor sobre a linha mediana do animal na região torácica ou paralela ao eixo longitudinal do animal (para uma gravação 3D sagital) ou ortogonal ao eixo longo (gravação 3D transversal).
    3. Traduza o transdutor na dimensão longitudinal (x e y) e a dimensão para fora-de-avião (z ou fatia) para garantir que toda a região cardíaca será coberta na subsequente captura 3D.
    4. Ajustar a taxa de quadros e resolução espacial como desejado, selecionando qualquer imagem' geral' (alta resolução temporal espacial/baixa) ou no modo 'Cardiologia' (baixa resolução temporal espacial/alto). Para 0,33 Hz < HR < 1 Hz usar uma resolução temporal de 50 frames/s obtidos em alta resolução espacial ('imagem geral') que permite o ciclo cardíaco ser reconstruído em fases distintas de 50-150.
    5. Ajuste de 'ganho 2D' para um nível onde as estruturas anatômicas estão quase irreconhecível na imagem raw modo-B (~ 5 dB) para aumentar a-relação sinal ruído em reconstruções da finais.
    6. Para cada fatia (etapa de z), grave 1.000 quadros ≥.
    7. Traduzir um passo de z do transdutor em um momento, por exemplo, 20 µm ou 50 µm e repita a gravação até toda a região cardíaca é coberta.
  2. Reconstrução 3D (complementares arquivos 13 e 14).
    1. Exportação de aquisições em Digital Imaging and Communications em medicina DICOM (little endian).
      Nota: Cada fatia contendo um número definido de frames comporão um único arquivo.
    2. Determine o número de quadros em um ciclo cardíaco completo. Como HR pode variar ao longo do tempo, determine isso para a primeira e a última fatia. Defina o maior número de quadros por ciclo conforme a estimativa inicial superior de resolução de fase que posteriormente pode ser reduzido (etapa 6.2.8).
    3. Determinar os limites das culturas e impostos especiais de consumo irrelevante espaço ao redor da janela de modo-B.
      Nota: Estes limites devem ser constantes em todas as fatias.
    4. Converta a imagem de cor RGB em 32 bits.
    5. Calcule o valor de correlação (C) para cada quadro na pilha e o número de quadros incluídos no primeiro ciclo cardíaco usando a fórmula:
      Equation 6(6)
      Nota: Aqui Equation 7 é a intensidade do sinal do pixel na coordenada (i, j) na primeira imagem Equation 8 e é o mesmo na segunda imagem, Equation 9 , Equation 10 e Equation 11 , Equation 12 são de média intensidade e padrão desvio, respectivamente, da primeira e segunda imagem na comparação e eu e J são os números de colunas e linhas na imagem. A matriz resultante dos valores de correlação terá o tamanho do produto do número de quadros por ciclo cardíaco e o número total de frames por fatia (por exemplo, 75 × 1.000 = 75.000 na Figura 8) (ver exemplar script em complementar Arquivo 16). O valor de correlação não pode ser calculado se uma ou ambas as imagens na comparação tem um desvio-padrão dos valores de pixel de zero, no entanto isto é altamente improvável em imagens ultra-sonográficos.
    6. Detecta o local maxima na matriz de valores de correlação (Figura 8A, consulte script exemplar em complementar arquivo 17 para detectar automaticamente o local maxima).
    7. Calcular a média quadrática Q(AVG) de quadros com valores de correlação de pico (i.e., combinando as fases cardíacas) usando a fórmula:
      Equation 14(7)
      onde N é o número total de quadros de correspondência cardíacas fases, Equation 15 é a intensidade do pixel na coordenada (i, j) da imagem nth e Equation 16 é a temporal média aritmética de Equation 17 da imagem nth (ver roteiro exemplar no 18. arquivo complementar).
    8. Repita o passo 6.2.3-6.2.7 para todas as fatias.
    9. Selecione uma fatia (fatia de referência), com estruturas anatômicas facilmente reconhecíveis (por exemplo, meados-ventricular) e verifique se o conjunto reconstruído em média um ciclo cardíaco corresponde a exatamente um ciclo (ou seja, se houver adicionais fases, resultando em mais de um ciclo cardíaco). Exclua fases adicionais para produzir exatamente um ciclo cardíaco (por exemplo, indo de uma superestimada 75 fases/ciclo (na realidade, ciclo 1.07) na Figura 8 para exatamente um ciclo contendo 70 fases na Figura 8).
    10. Na vizinha fatia (fatia de teste), tipo o ensemble em média um ciclo cardíaco t-pilha em correspondência cardíacas fases com a fatia de referência usando a fórmula de valor de correlação (equação 6) (ver exemplares scripts em complementar arquivo 19 e arquivo complementar 20).
      Nota: Embora duas fatias não idênticos não aparecerá completamente similares a qualquer momento durante o ciclo cardíaco, fatias adjacentes com um tamanho suficientemente pequeno passo (por exemplo, 20 µm ou 50 µm) vão ter pronunciado semelhanças resultando em correlação maxima de valor que pode ser traduzido em fases de correspondência.
    11. Repita o passo 6.2.9-6.2.10 para todas as fatias.
    12. Colapso da reconstrução 3D inteira em um único arquivo de imagem com a tag formato 3D (TIF) contendo fatias de z e t quadros ou em uma pilha de arquivos DICOM.
      Nota: Dados podem ser guardados em cada dimensão para reduzir o tamanho, aumentar a relação sinal-ruído e gerar dados isotrópicos (resolução no plano é geralmente superior a resolução fora-de-avião várias dobras).

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Representative Results

Espaço Intrapericárdica nos axolotes é dependente do tamanho do animal. Animais menores (2-20 g, 7-15 cm) terá um excesso de líquido pericárdico (aparecendo escuro em ecocardiografia) em torno que do cardíaco câmaras Considerando que em animais sexualmente maduros maiores (> 20 g, > 15 cm) as câmaras ocupará a maior parte do intrapericardial espaço. Para fornecer a melhor visão para resultados representativos de pontos de vista ecocardiográfica do coração axolote, um animal menor (10g, 10cm) foi aplicado para a Figura 3, Figura 4, Figura 5e Figura 9.

A visão do eixo longo geralmente fornece uma boa visão da anatomia cardíaca no axolote. Entrando no avião com o seio venoso, átrios e parte do ventrículo na linha média no plano (Figura 3A, B, 2 de arquivo complementar), ou o avião ventricular (Figura 3–H) ou o avião atrial (Figura 4A –D) pode ser alcançado por traduzir o transdutor para a direita ou a esquerda do animal, respectivamente. O ventrículo aparecerá esférica e altamente trabeculada (Figura 3, complementar 3 arquivos–5), Considerando que os átrios tem uma forma mais irregular e quase nenhum trabeculação (Figura 4A, Arquivo complementar 6, arquivo complementar 7). A visão do eixo curto (Figura 5A, B, 10 de arquivo suplementar) fornece uma visão menos facilmente interpretável da anatomia cardíaca do axolote coração, porém contribui para a avaliação da correta contração cardíaca (por exemplo zonas enfartadas ou não contratantes do ventrículo circular são claramente visualizadas neste plano de vista). No plano da vista de eixo longo, o centro do tracto de saída está posicionado perto ao centro do ventrículo (Figura 2Ae comparar Figura 3 com Figura 4E e complementar 3 arquivo com complementar 8 arquivo ). Desde que o tecido mole do tracto de saída será em movimento em cima de ejeção de sangue, o sinal de sangue de alta intensidade durante um ciclo cardíaco, medido pela onda de pulso Doppler no eixo longo e o avião paragill oblíquo irá ser adjacente pelo ruído de baixa intensidade do movimentos do tecido mole circundante (zona cinzenta que cercam a área branca na curva de velocidade/tempo na Figura 4 e Figura 5E). Geralmente, o contraste entre o sinal de sangue e tecidos moles ruído deve ser grande o suficiente para segmento apenas o sinal de sangue quando se mede a integral do tempo de velocidade (Figura 4 (ampliação de g1) e Figura 5E (ampliação de e1)).

Para avaliação qualitativa dos padrões de fluxo de sangue, Doppler colorido e Doppler imagem poder fornecer visualizações de padrões de fluxo em diferentes câmaras cardíacas (ventrículo: Figura 3E–H, complementar arquivo 4, Arquivo complementar 5; átrios: Figura 4 C, D, complementar 7 do arquivo; trato de saída: Figura 4F Figura 5 D, 9 de arquivo suplementar, complementar arquivo 12).

Axolotes utilizados para experimentação de laboratório variam em tamanho de fase larval inicial de post de 2-4 g de plena maturidade em 10-30 g e animais maiores, pesando > 100 g da mesma forma, função cardíaca e alguns valores absolutos dos parâmetros funcionais aqui descritos dependem sobre o tamanho dos animais. Geralmente, mudança de área fracionária é constante em grupos de tamanhos diferentes com valores que variam de 40-50% (desviado em direção a valores mais baixos para os animais maiores). Volume de curso é altamente dependente do tamanho do animal, ou seja, o tamanho do coração, variando por exemplo, 20-30 µ l em axolotes 5 g, 50-70 µ l em axolotes 10g e 250-300 µ l em axolotes 50g. Taxa de coração e para um volume de curso de grau são altamente dependentes do anestésico aplicado e o nível de anestesia (figura 6A–F, Figura 7).

Análise intra/inter-operator/observador tradicional envolve representações gráficas (parcelas parcelas Q-Q e Bland-Altman) e teste de média igual (t-test) e variância (F-teste) para avaliar a distribuição normal dos dados e para comparar exatidão e precisão entre duas pessoas (Figura 6).

Ecocardiografia 3D adiciona uma dimensão adicional (z ou profundidade) para a aquisição de mais tradicional 2D. Isto permite a visualização multi-planar de dados (Figura 9A), reslicing (Figura 9B), reconstruções de superfície e volume (Figura 9, complementar arquivo 13e 14 de arquivo complementar) e segmentação e geração de modelos 3D (Figura 9 C, 15 complementar do arquivo).

Figure 1
Figura 1. Preparação da cama e do recipiente para ecocardiografia de anestesiados e sem anestesia axolote. Pedaço de pano macio (A) A é dobrado uma vez e enrolado em forma de "burrito". (B) as extremidades são dobradas para trás e gravou para formar uma cama de lábio em forma para o axolote durante a exploração subaquática. (C) para Ecocardiografia 2D e 3D de um axolote anestesiado, o animal é delicadamente colocado em posição supina na fissura do lábio em forma de cama e fixado com um elástico sobre a região sacral e meados-mandibular. (D, E) Uma rede é preparada por esculpir um furo quadrado em um pedaço de espuma de poliestireno e gravando o filme plástico de superfície superior. (F) para Ecocardiografia 2D de um axolote sem anestesia, o animal é colocado em posição natural na rede e se aproximou com uma ponta de transdutor coberto de gel de por baixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Posicionamento do transdutor. (, B) Modelo da rede arterial nos axolotes com a posição aproximada do transdutor para o longo eixo e eixo curto (A) e visualização paragill oblíquo (B). (C) transiluminação com uma fonte poderosa luz fria pode ajudar em encontrar a localização exacta das câmaras cardíacas antes de aplicar o transdutor (ver arquivo complementar 1). Anatômicas abreviaturas: A, átrios; OFT, trato de saída; SinV, seio venoso; V, ventrículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Vistas ecocardiográfica de eixo longo representativa do ventrículo. (, B) Eixo longo típico mediana vista em modo-B (linha amarela na Figura 2A) no final-diástole ventricular (A) e final-sistólica (B) fases (ver arquivo complementar 2 para representação de vídeo). (C, D) Vista do eixo longo do ventrículo em modo-B (linha preta na Figura 2A) no final-diástole ventricular (C) e fim-sistólica (D) fases (ver 3 de arquivo complementar para representação de vídeo). (E–H) Plano de vista similar como em (A) e (B) na cor Doppler (CD) e modo de Doppler (PD) de energia demonstrando sangue fluir (consulte complementar arquivo 4 e 5 de arquivo complementar para a representação de CD e PD-modo, respectivamente). Cores vermelhas em imagens de CD-modo indicam sangue fluindo na direção do transdutor e cores azuis indicam o contrário. Câmaras cardíacas e fluxo sanguíneo tem sido destacadas com linhas pontilhadas. Desenhos animados inseridos no (A) e (C) Mostrar posicionamento do transdutor e tradução em relação à linha média do eixo longo de exibição. Anatômicas abreviaturas: A, átrios; DC(L), deixada o duto de Cuvier; OFT, trato de saída; SinV, seio venoso; V, ventrículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Eixo longo representante ecocardiográfica vistas para os átrios e vazão trato. (, B) Vista do eixo longo dos átrios em modo-B (linha verde na Figura 2A) no final-diastólica atrial (A) e final-sistólica (B) fases (ver 6 de arquivo complementar para representação de vídeo). (C, D) Plano de vista similar como em (A) e (B) no modo de cor Doppler (CD) demonstrando sangue fluir (veja 7 de arquivo adicionais para a representação). (E) exibição de eixo longo do tracto de saída em modo-B (linha azul na Figura 2A) na fase de ejeção mid (consulte complementar 8 arquivo para representação de vídeo). F: Plano de vista similar como em (E) no sangue demonstrando CD-modo flow (consulte complementar arquivo 9 para representação de vídeo). Plano de vista semelhante (G) como em (E) e (F) modo pulso onda Doppler (PW) permitindo a calor de deteção e velocidade tempo integral (VTI) medição para cálculo de volumes de acidente vascular cerebral. Cores vermelhas em imagens de CD-modo indicam sangue fluindo na direção do transdutor e cores azuis indicam o contrário. Câmaras cardíacas e fluxo sanguíneo tem sido destacadas com linhas pontilhadas. Cabeças de seta amarela e vermelha indicam válvulas semilunar na raiz do trato de saída e a válvula espiral do trato de saída, respectivamente. Desenhos animados inseridos no (A) e (E) Mostrar posicionamento do transdutor e tradução em relação à linha média do eixo longo de exibição. Abreviaturas anatômicas: A(R), átrio direito; Sensor, deixada o átrio; OFT, trato de saída; SinV, seio venoso; V, ventrículo; VC, veia cava. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Eixo curto representativo e paragill oblíquas vistas ecocardiográfica do tracto ventrículo e efluxo. (, B) Visão do eixo curto do ventrículo em modo-B (linha cinza na Figura 2A) no final-diástole ventricular (A) e final-sistólica (B) fases (ver 10 de arquivo complementar para representação de vídeo). (C) paragill Oblique vista do tracto de saída em modo-B (linha roxa na Figura 2B) na fase de ejeção mid (ver 11 de arquivo complementar para representação de vídeo). (D) semelhante plano de vista como em (C) no sangue demonstrando CD-modo de fluxo (ver 12 de arquivo complementar para representação de vídeo). (E) plano de vista Similar como em (C) e (D) o modo pulso onda Doppler (PW) permitindo a calor de deteção e velocidade tempo integral (VTI) medição para cálculo de volumes de acidente vascular cerebral. Cores vermelhas em imagens de CD-modo indicam sangue fluindo na direção do transdutor e cores azuis indicam o contrário. Câmaras cardíacas e fluxo sanguíneo tem sido destacadas com linhas pontilhadas. Desenhos animados inseridos no (A) e (C) Mostrar posicionamento do transdutor e tradução em relação à linha média do eixo longo de exibição. Anatômicas abreviaturas: A, átrios; OFT, trato de saída; SinV, seio venoso; V, ventrículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Resultados representativos de medições de volume de frequência cardíaca e acidente vascular cerebral, o efeito da anestesia e representante análise intra/inter-operator/observador. (–C) Frequência cardíaca (FC) em relação à linha de base sem anestesia plotados ao longo do tempo (0 h está em anestesia completa) para seis axolotes anestesiados em benzocaína (por), MS-222 (B) e propofol (C). (D–F) Stroke volume (SV) em relação a linha de base sem anestesia plotada ao longo do tempo (0 h está em anestesia completa) para seis axolotes anestesiados em benzocaína (D), MS-222 (E) e propofol (F). (G) análise Intra/inter-operator/observador do volume de curso. Parcelas de Bland-Altman [diferença (Dif) entre operadores (Op) / observadores (Obs) plotagem contra média (Avg)] não deve revelar nenhum viés sistemático nas medições normalmente distribuídas (parcelas de Q-Q) obtidos por diferentes operadores e observadores. Teste para média igual (t-test) e variância igual (F-teste) deve revelar que não há diferenças significativas entre os operadores/observadores (tabela no canto inferior direito). A - F foi modificado do material disponível sob a licença Creative Commons Attribution (Figura 1 de Thygesen et al 21). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Comparação do volume de curso estimado pela média geométrica e a onda de pulso método Doppler. Comparação do volume de curso (SV) estimada pelo pulso onda Doppler medições sobre a velocidade do sangue saindo do trato de saída ou bidimensionais medições geométricas (geo) de modo-B. SV(GEO) e SV(pw) é registrado nos mesmos seis animais com segundos entre os tipos de medição de dois e usando três diferentes anestésicos, benzocaína (quadrados azuis inclinados), MS-222 (quadrados vermelhos) e propofol (triângulos verdes) com uma semana de recuperação entre aplicar os diferentes anestésicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8. Correlação de imagem representativa spatiotemporal para ecocardiografia 3D. (A) curva a representação dos valores de correlação rendidos de uma operação de correlação em um quadro de 1.000 cine dataset com 75 frames por ciclo cardíaco. Dois quadros com pequenas diferenças, indicando a correspondência cardíacas fases, irão produzir um valor de alta correlação. Posteriormente um local maxima busca algoritmo pode ser aplicado sobre os dados para detectar todos os quadros correspondentes. (B) representação gráfica dos mesmos dados como em (A). Quando valores de correlação são obtidos comparando-se o primeiro ciclo cardíaco com a pilha inteira cine, linhas diagonais de correlação máxima indicam correspondência cardíacas fases. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9. Ecocardiografia 3D representativa. (A) vista multi-planares do coração 3D axolote reconstruído. O procedimento de correlação spatiotemporal imagem permite a reconstrução de um ciclo cardíaco completo com várias fases distintas (aqui 70 fases) em três dimensões espaciais que podem então ser cortados como uns para a desejada investigação de fenômenos spatiotemporal em o coração batendo. (B) três fatias transversais de 115 a reconstruída fatias de dados 3D. A função quadrática média procedimento aumenta o contraste de sangue-de-tecido e reduz a relação sinal-ruído, permitindo uma melhor apreciação da natureza trabeculada do ventrículo axolote e uma visualização clara do septo interatrial e o válvulas do trato de saída. (C) superfície e volume representações do coração batendo em três fases, ao longo de um código de cores segmentadas modelo (consulte complementar arquivo 13 e 14 de arquivo complementar para vídeo representações da superfície e volume processado batendo coração e complementar arquivo 15 para um trifásico segmentado modelo 3D interativo). Anatômicas abreviaturas: A, átrios; Cau, caudal; CRA, craniana; Dex, dexter (para o animal certo); Dor, dorsal; OFT, trato de saída; Pecado, sinistro (para os animais à esquerda); SinV, seio venoso; V, ventrículo; Ven, ventral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar arquivo 1. Transiluminação para localizar câmaras cardíacas noaxolote. Ver Figura 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 2. Eixo longo, a linha mediana vista, modo-B. Ver Figura 3A, B. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3. Eixo longo, vista ventricular, modo-B. Ver Figura 3, D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 4. Eixo longo, vista ventricular, modo de cor Doppler. Ver Figura 3E, F. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 5. Eixo longo, vista ventricular, modo Power Doppler. Ver Figura 3, H. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 6. Eixo longo, vista atrial, modo-B. Ver Figura 4A, B. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 7. Eixo longo, vista atrial, modo de cor Doppler. Consulte a Figura 4, D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 8. Eixo longo, vista do trato de saída, modo-B. Ver Figura 4E. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 9. Eixo longo, vista do trato de saída, modo de cor Doppler. Ver Figura 4F. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 10. Eixo curto, vista ventricular, modo-B. Ver Figura 5A, B. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 11. Paragill oblíquo, vista do trato de saída, modo-B. Consulte a Figura 5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 12. Paragill oblíquo, vista do trato de saída, modo de cor Doppler. Consulte a Figura 5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 13. Processamento de superfície tridimensional do coração batendo em 70 fases (19,6 ms resolução temporal). Ver Figura 9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 14. Renderização de volume tridimensional de coração batendo em 70 fases (19,6 ms resolução temporal). Ver Figura 9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 15. Modelo tridimensional interativo, de coração batendo em 3 fases: final-sístole Ventricular, ejeção ventricular de meados e final-sístole ventricular. Consulte a Figura 7. O arquivo PDF interativo deve ser visto em Adobe Acrobat Reader 9 ou superior. Para ativar o recurso 3D, clique o modelo. Usando o cursor, agora é possível girar, zoom, pan o modelo, e na árvore modelo, todos os segmentos do modelo podem ser ligados/desligada ou transparentes. A árvore modelo é uma hierarquia que contém várias camadas de sub que podem ser aberto (+). Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 16. Representante anotado script para calcular o valor de correlação de uma aquisição de 1.000 quadros com uma estimativa superior do ciclo de 75 frames/cardíaco. O script é escrito em linguagem de macro IJ1 e pode ser implementado como uma macro de lote no ImageJ para calcular valores de correlação (75.000 por aquisição) através de um inteiro z-pilha de dados 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 17. Script de representante para detecção de pico automático em uma série de valores de correlação de uma aquisição de 1.000 quadros com uma estimativa superior do ciclo de 75 frames/cardíaco. a série de valores de correlação (coluna B, marcado em amarelo) pode ser substituída e após a ativação da macro (Ctrl + r) a lista de comandos para selecionar fases cardíacas de correspondência e realizar uma média quadrática será exibido (coluna Q, marcado em verde). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 18. Representante anotado script para selecionar fases cardíacas de correspondência e realizar a média quadrática de uma aquisição de 1.000 quadros com uma estimativa superior do ciclo de 75 frames/cardíaco (coluna Q em complementar arquivo 17). o script é escrito em linguagem de macro IJ1 e pode ser implementado como uma macro no ImageJ para criar um ensemble em média uma fatia 2D de ciclo (75 fases). Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar arquivo 19. Representante anotado script para calcular o valor de correlação entre uma fatia de referência de 70 quadros e uma fatia de teste adjacentes 75 frames. O script é escrito em linguagem de macro IJ1 e pode ser implementado como uma macro no ImageJ para calcular valores de correlação (5.250). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 20. Script de representante do Excel para detecção de pico automático em uma série de valores de correlação de uma comparação entre uma fatia de referência de 70 quadros e uma fatia de teste adjacentes 75 frames. A série de valores de correlação (coluna C, marcado em amarelo) pode ser substituída e após a ativação da macro (Ctrl + t), a lista de fatias para ser selecionado como um substack na fatia de teste será exibida (coluna L, linha 2, marcado em verde). O teste substack de fatia terá correspondência espacialmente de quadros para a fatia de referência. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Ecocardiografia no axolote e outras espécies não-mamíferos produz dados fundamentalmente diferentes do que a Ecocardiografia mamíferos devido à natureza nucleada das células vermelhas do sangue em todos os vertebrados exceto mamíferos adultos. Isso resulta em um sinal de sangue pronunciado e menos sangue-de-tecido contraste nas imagens ecocardiográficas axolote, em comparação com , por exemplo, mouse ou ecocardiografia humana. Isso pode dificultar segmentação de imagens em imagens de ultra-som não transformados único frame como pode ser difícil distinguir o sangue do tecido. No entanto, este fenômeno pode ser vantajoso quando usado para criar o sangue sinalizar imagens melhorada aplicando a função quadrática média procedimento descrito anteriormente18 e modificado por ecocardiografia axolote no protocolo seção 6. Desde manchas de sangue são muito mais dinâmicas do que aqueles encontrados nos tecidos moles, com uma média quadrática irá gerar acentuado contraste entre estes dois compartimentos que facilita a segmentação de imagens em duas e três dimensões.

Este protocolo descreve três diferentes anestésicos para o axolote que foram exaustivamente testados anteriormente21. Tanto a benzocaína e a MS-222 estimulam um aumento da frequência cardíaca, que pode ser desejável ao testar a função cardíaca, sob condições de estresse. Propofol induz menos stress para o coração durante a anestesia e pode ser usado como uma substituição para ecocardiografia sem anestesia em situações onde o tempo de aquisição excede os limites de comportamento sedentário em axolotes sem anestesia.

Ecocardiografia 2D descrevendo o coração 3D é afetada pela subjetividade. Consequentemente, é imperativo para conduta e análise intra/inter-operator/observador antes de realizar uma experiência real, conforme descrito na seção de protocolo 5. Da mesma forma, ecocardiográficas medições devem ser vistas mais como valores de índice que podem ser aplicados para investigar possíveis diferenças na função cardíaca, sob circunstâncias diferentes, ao invés de valores absolutos. O volume de curso, determinado pela equação geométrica (equação 2) raramente produz o mesmo valor absoluto como a onda de pulso equação Doppler (equação 4; A Figura 7), e deve ser decidido que medir a aderir ao longo de uma série de experimentos. O SV(geo) pode ser obtido mais rapidamente do que o SV(pw), no entanto, a suposição esférica da forma ventricular só se aplica a saudável uniformemente contratantes corações, e em modelos de doenças e regeneração, SV(pw) devem ser considerados para uma melhor reflexão de o volume de curso verdadeiro.

A correlação e quadrática média procedimento de protocolo seção 6 podem ser implementados em várias imagens diferentes e pacotes de matemáticas. Desde que as habilidades de programação e acesso a pacotes de software variam dentro de pesquisadores de Ciências da vida, nós tenho me esforçado para fornecer scripts de representante para os métodos em pacotes de software que a maioria dos pesquisadores estão familiarizados com (por exemplo, Excel) que são facilmente abordados e livremente disponível (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Arquivos complementares 16 - 20 fornecer anotados exemplares scripts escritos em linguagem de macro IJ1 e. xlsm macros que devem ser compreensíveis mesmo com experiência mínima em codificação.

Regeneração do coração intrínseco é um fenômeno encontrado exclusivamente nos corações das espécies pequenas (em relação ao ser humano), e, portanto, medições e imagem da função cardíaca de base e o progresso funcional durante a regeneração é desafiada pelo tamanho do coração e a resolução espacial da modalidade de imagem aplicada. Imagem de ultra-som de alta frequência proporciona uma compensação desejável entre uma alta resolução espacial no plano (~ 30 x 30 µm2 a 50 MHz) é comparável na vivo µCT de imagem e muito maior do que na vivo µMRI, que tem uma profundidade de penetração (~ 1 cm em 50 MHz) várias vezes maior do que a microscopia confocal e uma muito de alta resolução temporal (50-300 quadros/s a 50 MHz, 1 cm de profundidade). Juntamente com o manual ou automatizada z movimento dimensional do transdutor, ultra-som permite reconstrução incomparável da função cardíaca e modelagem anatômica em quatro dimensões. Além disso, a natureza não-invasiva da técnica permite a experimentação longitudinal. Para nosso conhecimento não são atualmente sem transdutores de matriz matriz para micro de alta frequência ultra-sonografia. O desenvolvimento desta tecnologia iria ajudar muito as aquisições de dados 3D de pequenos corações como o do axolote em um procedimento mais rápido do que mecanicamente movendo o transdutor.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Nós gostaríamos de reconhecer Kasper Hansen, Instituto de Biociências, Universidade de Aarhus para fornecer acesso e assistência com o micromanipulador eletrônico para aquisição de ecocardiográfica 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

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Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
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Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

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