Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

2D и 3D эхокардиография в Аксолотля (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Здесь мы представляем эхокардиография протоколы для двухмерных и трëхмерных изображений приобретение бьющееся сердце Аксолотль саламандра (Ambystoma mexicanum), модель виды в регенерации сердца. Эти методы позволяют продольные оценки функции сердца с высоким разрешением пространственно-временных.

Abstract

Сердца неисправности в результате ишемической болезни сердца является серьезной проблемой, и регенеративной терапии в сердце пользуются высоким спросом. Несколько видов модели как данио рерио и саламандры, которые способны внутренней сердце регенерации перспективны для будущих регенеративной терапии для человека пациентов. Чтобы оценить результаты экспериментов cardioregenerative важно, что функции сердца может контролироваться. Аксолотль саламандра (A. mexicanum) представляет устоявшихся моделей видов в регенеративных биологии, достижения размеров, что позволяет для оценки функции сердца. Целью настоящего Протокола является разработать методы измерения можно воспроизвести сердечной функции в Аксолотль, с помощью эхокардиографии. Применение различных анестетиков (бензокаин, MS-222 и пропофол) продемонстрировал, и приобретение двухмерных (2D) эхокардиографические данных в наркотизированных и наркозу axolotls описан. 2D эхокардиография сердца трехмерной (3D), могут страдать от неточностей и является субъективность измерений и для облегчения это явление сплошной метод, а именно intra/Межамери-операторами/наблюдателя анализа, измерения и свести к минимуму этот уклон продемонстрировал. Наконец описан метод для приобретения 3D эхокардиографические данных Аксолотль сердце с очень высоким разрешением пространственно-временных и с выраженным контраст крови в ткани. В целом этот протокол должен обеспечивать необходимые методы для оценки функции сердца и модель анатомии и потока динамика в Аксолотль, с помощью УЗИ с приложениями в регенеративных биологии и общие физиологических экспериментов.

Introduction

Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Хотя многие выжить инфаркт миокарда за счет быстрого и точного медицинского вмешательства, ишемическая инцидентов в организме человека часто приводят к фиброзных рубцов, связанные с гипертрофией, электрические неисправности и снижение функциональных возможностей сердца . Это отсутствие регенеративного потенциала сердечной ткани распределяется среди млекопитающих и хотя спорные претензии млекопитающих сердечной регенерации сообщалось, они были ограничены конкретным мышиных штаммов3,4 и лечение гипоксии мышей5. Таким образом области сердца регенеративной медицины и биологии обычно ограничивается не млекопитающих животных моделей для изучения внутренней сердце регенеративные явления. Данио рерио (Danio рерио) в последнее десятилетие создана как наиболее хорошо характеризуется модель для внутренней сердце регенерации6,,78,9,10 . Благодаря легко лабораторных обслуживания, время коротких поколения и широкий спектр молекулярных инструментов, доступных, данио рерио хорошо приспособлены как модель генетические и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития сердечной и регенерации. Однако минута размеры сердца данио рерио сделать его менее подходящими для функциональной оценки, и сложных хирургических процедур и не четвероногие филогении данио рерио ограничивает разумным экстраполяцию выводов этого вида, таким образом обоснование использования других крупных тетрапод моделей. Одним из ранних моделей позвоночных сердце регенерации был хвостатого амфибий, Восточной Тритон (полосатый viridescens)11, виды, которые остается ценным модель12.

В последние годы еще хвостатого амфибий, мексиканский Аксолотля (A. mexicanum) вышла сцена как большой (тела до 100 г массы) и высоко Лаборатория адаптации животных модель для широкий спектр восстановительных дисциплин, охватывающих регенерации конечностей, травмы спинного мозга и сердечной регенерации13,14,15,16,17. Аксолотль очень поддаются функциональных измерений на сердце с помощью эхокардиографии высокой частоты и отсутствие Кальцифицированный структур на вентральной стороне сердца позволяет для ультразвуковой визуализации с гораздо более низким уровнем изображения артефактов (акустическая затенение и реверберации в частности), чем в другие модели животных Кальцифицированный грудины и ребрами.

Следующий протокол описывает несколько различных методов и препаратов (рис. 1, рис. 2) получить воспроизводимые эхокардиографические измерений на сердце Аксолотль в обоих под наркозом (применяя три различных анестетики: бензокаин, MS-222 и пропофол) и наркозу животных в двух (рис. 3, рис. 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Дополнительные файлы 1-12) и три (Рисунок 8, Рисунок 9, Дополнительные файлы 13-14) пространственных измерениях. Амфибия сердца 3 камерные (два предсердия и желудочка один). Предсердия поставляются с большой venosus пазухи и желудочка впадает в урочище отток артериальный конус (рис. 2). Поскольку большинство внимание традиционно уделяется желудочков регенерации и меньше на восстановление предсердия6,,78,9,10,11 , 12 , 14 , 17, этот протокол в основном сосредоточена на измерение вентрикулярной функции.

Амфибия эхокардиографии не хорошо описан в литературе, и разработка 2D методов, описанных в этом документе были изгнаны, необходимость лучший представляют функциональность бьющееся сердце Аксолотль на данный момент времени и экспериментальной установки. Таким образом описанные здесь методы применяются в сердце регенеративной экспериментов где неоднократно сердечной функции могут контролироваться, в течение процесса регенерации. Кроме того методы можно в целом применяется в cardiophysiological экспериментах на Аксолотль или слегка изменены, чтобы охватывать другие хвостатого или anuran амфибия модели (e.g.,Xenopus). Аксолотль существует в нескольких различных сортов и оттенков (например, wildtype, melanoid, белый, альбинос, трансгенных белый с зеленым флуоресценции белков), однако эти характеристики не влияют на совместимость Аксолотль с описанной протоколом. Метод, описанный здесь приобрести 3D эхокардиографические данных представляет собой модифицированную версию метода корреляции (ЦУТИ) пространственно-временных изображений, разработанных для клинических УЗИ и квадратичные, метод, описанный ранее в развивающихся курица для усреднения усилить сигнал пятен крови в мягких тканях, содержащих ядерных клеток красной крови18,19видов. Этот метод позволяет для продвинутых моделирование сердечного сокращения и вычисляемые гидродинамики в самом Аксолотль.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры, осуществляется в настоящем Протоколе, были в соответствии с законодательством Дании для ухода и использования лабораторных животных и эксперименты были одобрены датской национальной инспекции экспериментов животных (протокол # 2015-15-0201-00615).

1. Подготовка

  1. Подготовить Аксолотль среднего.
    1. Применяют как Аксолотль среднего высокого качества не химически очищенной водопроводной воды. Если это недоступно, применяют раствор 40% Holtfreter.
    2. Готовят раствор 40% (wt/vol) Holtfreter путем растворения 15.84 г NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O и 0,288 г KCl в отфильтрованных и деионизированной воды до объемом 1 л.
  2. Сделайте погружение анестетиков.
    1. Подготовьте бензокаин (этиловый 4-аминобензоат) анестезирующий раствор путем растворения 200 мг этиловый 4-аминобензоат в 3 мл ацетона и затем роспуска этой смеси в 1 Л воды или 40% Holtfreter раствор.
    2. Подготовьте MS-222 (этиловый 3-аминобензоат methanesulfonic кислоты, также известный как tricane) анестезирующий раствор путем растворения 200 мг 3-аминобензоат этиловый methanesulfonic кислоты непосредственно в 1 Л воды или 40% Holtfreter раствор.
    3. Подготовьте раствор анестетика пропофол (2,6-diisopropylphenol), растворяя 3,3 мг 2,6-diisopropylphenol в в 1 Л воды или 40% Holtfreter раствор. Кроме того разбавьте коммерчески готовые решения до 3,3 мг/л.
      Предупреждение: Пропофол является мощным человека цистит (внутривенно вводить) и должны быть обработаны с осторожностью, в том числе в разбавленном виде.
  3. Подготовка кровати и контейнер для эхокардиографии.
    1. Подготовить губы в форме животных кровати для эхокардиографии складывающиеся 70 см х 55 см кусок мягкой ткани один раз и затем прокатки его в «буррито форму» (рис. 1A). Затем согните над заканчивается до тех пор, пока они удовлетворяют и ленты эти вместе (рис. 1B).
    2. Опускайте губы в форме структуры в среде Аксолотль для размещения наркотизированных Аксолотль во время УЗИ. Защитить животных к структуре и предотвратить плавающей, используя свободные резинки; Расположите эти середины нижней челюсти и над районом сакрального (рис. 1 c).
      Примечание: Резинки не следует сжать животное, как это повлияет на гемодинамику.
    3. Для 2D эхокардиографии на ненаркотизированных axolotls, подготовьте гамак, вырезая 16 см х 8 см х 5 см отверстие в 33 x 27 см х 5 см блока пенополистирола (например, крышки из пенополистирола среднего размера контейнера) (рис. 1 d).
    4. 33 x 27 см кусок полиэтиленовой пленкой вставьте в отверстие и закрепите края wrap на верхней поверхности блока пенополистирола (Рисунок 1E) для создания гамак. Добавьте Аксолотль средний 3 см глубины в гамаке. Наркозу Аксолотль будет опускаться на дно гамак, позволяя легко вентральной доступа через полиэтиленовой пленкой (Рисунок 1F).

2. анестезировать Axolotls

  1. Погружайте Аксолотль в желаемой анестезирующий раствор (бензокаин, MS-222 или пропофола).
  2. Проверьте первые признаки седативный эффект, уменьшение движения и увеличение потери восстанавливающих рефлекс, это появляется в течение 10 мин в животных < 10 g (< 10 см) и в течение 20 мин в животных между 10 g и 50 g массы тела (10-22 см).
  3. Проверьте полное отсутствие движений тела, Гилл вентиляции движений и восстанавливающих рефлекс и убедитесь, что животное не отвечающих стимуляции умеренной боли, проверены щипать лямки между цифрами.
    Примечание: Несмотря на то, что общая анестезия осуществляется в течение 30 мин в axolotls под наркозом бензокаин, сердечной функции не стабилизировалась вплоть до 1 ч. Это не в случае с MS-222 или пропофола под наркозом axolotls (рис. 6A-F).
  4. Чтобы сохранить Аксолотль под общим наркозом, держите животных в растворе анестезии или завернутые в мокрую бумагу салфетки, смоченные в растворе анестезии.
    Примечание: Анестезия может поддерживаться для 7 h без негативного воздействия на самочувствие животного, учитывая, что кожу и особенно жабры находятся влажные.
  5. Reawake Аксолотль, передачи животное анестезии свободный носитель.
    Примечание: Первый признак пробуждения — Джилл вентиляции движений. Животное должно быть вертикально и реагировать стимуляции в течение 1 ч.

3. 2D эхокардиографии на наркотизированных Аксолотль

  1. Место под наркозом Аксолотль в лежачем положении в губы в форме животных кровати (1.3.1-1.3.2 меры). Закрепите его с плавающей, используя свободные резинки (рис. 1 c). Убедитесь, что поверхности грудной покрыто 3-5 мм среды.
    Примечание: Для приобретения нового краткого (< 5 мин) может применяться цистит свободной среде. Для длительной приобретения анестезирующий раствор должны применяться как средство УЗИ для обеспечения стабильного сердечной функции проведения измерений.
  2. Поместите датчик midline животного в регионе грудной параллельно длинной оси животного (рис. 2A, Рисунок 3A-B, дополнительный файл 2). Используйте просвечивания с источником холодного света на белом и Альбино axolotls для обеспечения правильного размещения датчика (рис. 2 c и дополнительный файл 1).
    1. Для axolotls весом < 20 g Используйте преобразователь 50 МГц; для axolotls > 20 г, использовать преобразователь 40 МГц. Обеспечить позиционирование черепа/передней направления с правом на приобретение стандартных изображений. Если это не так поворот преобразователя 180 ° или инвертировать изображение.
  3. Убедитесь, что в представлении срединной линии длинной оси, небольшая часть желудочка (располагаться справа в грудной полости, рисунок 2A) появляется в кадре на большую часть левого и правого предсердия и желудочка диастола (расположены в центре / слегка к левой в грудной полости, рисунок 2A) и venosus пазухи являются видимыми в предсердной систолой и диастола (рис. 3а, B).
  4. Перевести датчика 1-3 мм к животного права на получение представления желудочков длинной оси (рис. 2A). Правильное положение достигается, когда площадь поперечного сечения конце систолы желудочков в максимума (рис. 3 c-H).
  5. В B-режиме, приобрести ≥ 3 сердечных циклов с > 50 кадров/с в любом «общие изображений» (высокой пространственной Лоу временное разрешение) или в режиме «кардиология» (низкой пространственной/высокая временное разрешение).
    Примечание: Эта точка зрения позволяет для оценки функции желудочка. Желудочков функция может оцениваться в двух измерениях, используя изменение желудочков дробных площади (FACv), рассчитывается от конечного диастолического и конец систолическое площадь поперечного сечения желудочка (CSAv) с помощью уравнения:
    Equation 1(1)
    Аксолотль желудочка принимает форму шара и геометрии на основе ударный объем [SV(geo)] может рассчитываться с использованием уравнения:
    Equation 2(2)
  6. Перевести датчика вдоль длинной оси животного до тех пор, пока центр желудочке находится в середине экрана. Поворота 90 ° по часовой стрелке, чтобы получить вид середине Вентрикулярная короткой оси (Рисунок 5A и B, дополнительный файл 10) датчика. Оцените круглую форму желудочка, переведя датчика вдоль длинной оси сердца.
  7. Возврат преобразователя к длинной оси плоскости и перевести его обратно к средней линии или слегка влево срединной получить представление две палаты предсердий длинной оси (рис. 2A). Убедитесь, что правильное положение достигается, подтвердив, что поперечного сечения в конце систолы предсердий находятся в их Максима и два предсердия комбинированные себя наброски числа '8' наклонена ~ 45 ° влево (рис. 4A и B, Дополнительный файл 6).
  8. В B-режиме приобрести ≥ 3 сердечных циклов с > 50 кадров в секунду в режиме «кардиология» или «общие изображения».
    Примечание: Аксолотль предсердия неправильную форму и 3D функции могут быть определены непосредственно из 2D данных, таким образом их функции должны оцениваться как мера индекс например предсердий дробных области шанс (ЦАВС) как на основе комбинированных площади поперечного сечения (CSAa) предсердий камер в систолы и диастола:
    Equation 3(3)
  9. Перевести датчика к право до тех пор, пока отток тракта (артериальный конус) появляется (недалеко от желудочков длинной оси зрения) (рис. 2A).
    Примечание: После ухода из желудочка в направлении передней, урочище отток делает резкий изгиб и работает под небольшим углом к вентральной поверхности перед снова предполагая передней направление и разбиваем Гилл филиалов и системных судов.
    1. Убедитесь, что правильный отток тракта вид достигается, подтвердив, что диаметр отток в его максимум при желудочковой конце систолы и два из трех Полулунные клапаны на входе отток являются видимыми в середине отстрела (Рисунок 4E, Дополнительный файл 8).
      Примечание: Брюшной направленность сторону датчика промежуточной части тракта отток позволяет для измерения скорости и потока с использованием доплеровских визуализации.
  10. Примените Цветной Допплер режим сопоставления скорости потока крови в урочище отток во время сердечного выброса (Рисунок 4F и дополнительный файл 9). Аналогичным образом применяются цветные Doppler и сила Doppler imaging для визуализации кровотока в представлениях предсердий и желудочков (Рисунок 3E-H, Дополнительные файлы 4-5 и рис. 4 c-Dи дополнительный файл 7).
  11. Примените импульса волны (PW) Допплер режим с позиции крови максимальной скорости в части тракта отток, побежал к преобразователя.
    1. Используйте «угол луча» и «угловая коррекция» до 45 ° для регулировки для оттока, не будучи полностью перпендикулярном лицевой преобразователя (рис. 4 g). Убедитесь, что PW Doppler позиция не перекрываются, спиральный клапан оттока во время любой фазы сердечного цикла (Рисунок 4E).
  12. В PW режиме Доплера приобрести время скорость данных над ≥ 3 сердечных циклов.
  13. Возвращение в B-режиме и приобретать ≥ 3 сердечных циклов на точное же плоскости, как была приобретена ПВВ.
  14. Мера скорости время неотъемлемой (VTI) потока крови в урочище отток как площадь под кривой скорости и времени для одного полного сердечных цикла (рис. 4 g, g1).
    Примечание: От VTI и диаметр (d) отток тракта в конце систолы полученные от B-режим приобретения, PW Доплера на основе ударный объем [SV(pw)] может рассчитываться с использованием уравнения:
    Equation 4(4)
    Сердечного ритма (HR) измеряется от кривой скорости и времени измерения длительности всего сердечного цикла. Сердечный выброс [CO(pw)] рассчитывается с помощью уравнения:
    Equation 5(5)
  15. Получите наклонный paragill вид, что предлагает альтернативу для измерения скорости потока крови в урочище отток, вращая Аксолотль 90 ° в губы в форме кровати таким образом, что в правой части животного сталкивается вверх (рис. 2B). Угол и поворот преобразователя и расположите его параллельных и просто кзади выступающих жабры (рис. 2B). Убедитесь, что правильное положение достигается путем подтверждения, что отток тракта работает вниз на ~ 45 ° и что предсердия появляются под отток тракта во время выброса (Рисунок 5 C, дополнительный файл 11).
  16. Примените PW Допплер режим с позиции крови максимальной скорости в части тракта отток, убегая от датчика (рис. 5 d, дополнительный файл 12). Используйте «угол луча» и «угловая коррекция» до 45 ° для регулировки для оттока, не будучи полностью перпендикулярном лицевой преобразователя (рис. 5E).
  17. В PW режиме Доплера приобрести скорость кровотока через ≥ 3 сердечных циклов.
  18. Возвращение в B-режиме и приобретать ≥ 3 сердечных циклов на точное же плоскости, как была приобретена ПВВ.
    Примечание: SV(pw) и CO(pw) рассчитываются для представления косой paragill, используя уравнение 4 и 5 уравнение , как описано выше, для представления длинной оси.

4. 2D эхокардиографии на ненаркотизированных Аксолотль

  1. Место наркозу Аксолотль в положении лежа в гамаке (шаг 1.3.3).
  2. Оставьте животное спокойно за 30-60 минут, чтобы оправиться от обработки стресса.
  3. Расположите ультразвукового датчика с главой датчика, обращенной вверх к Аксолотль в гамаке.
  4. Применение ультразвука гель на преобразователя.
  5. Осторожно и не нарушая животного поместите преобразователя midline животного в регионе грудной параллельно длинной оси животного.
    Примечание: Это же, но перевернутый, позиция как наркотизированных Аксолотля (шаг 3.2).
  6. Получите B-режим, Цветной Допплер режим, PW режиме данные в длинной оси и короткой оси зрения, как описано в шагах 3.2-3.14.
    Примечание: Представление косой paragill является недоступным в наркозу Аксолотль. Эхокардиографические данные наркозу axolotls должны быть приобретены между жаберными вентиляции движений (10-20 s период для отдыха животных). Если Аксолотль движется во время приобретения, необходимо повторить измерения.

5. Оценка данных 2D эхокардиографии и свести к минимуму субъективность

  1. Избегайте оператора/наблюдателя предвзятости в 2D ультразвуковых изображений и 3D оценки сердечной функции, основанные на данных 2D, вызванные субъективности как сбора данных, так и на этапе анализа данных, выполняя анализ intra/Межамери-операторами/наблюдателя20.
    Примечание: В запуске исследований и при обучении новых сотрудников этой субъективности должны быть количественно и свести к минимуму с помощью анализа intra/Межамери-операторами/наблюдателя.
  2. Инициировать анализ intra/Межамери-операторами/наблюдателя в двух человек установки с оператора/наблюдатель 1 (менее опытных) проходит тестирование работы оператора/наблюдателя 2 (более опытных), выполняя ≥ 6 консенсуса измерений вместе, включая оба скамейке на ультразвуковая система (операции) и последующего анализа соответствующих параметров (наблюдение).
  3. Достичь консенсуса между операторами и наблюдателей и действуют (оператор/наблюдатель 1) ультразвуковая система для получения соответствующих данных на ≥ 6 животных (операция 1.1).
  4. Непосредственно после этого действуют (оператор/наблюдателя 2) ультразвуковая система для получения соответствующих данных на том же животных (операция 2.1).
  5. Пусть животных восстановить на 3 дня. После этого повторите (оператор/наблюдатель 1) (операция 1.2).
  6. Анализировать (оператор/наблюдатель 1) все измеренные данные (операции 1.1/наблюдения 1.1; операции 2.1/наблюдения 1.1 операции 1.2/наблюдения 1.1) и после 24 ч повторить анализ данных оператора/наблюдателя 2 (операция 2.1/наблюдения 1.2).
  7. Анализ (оператор/наблюдателя 2) данные, полученные при себе (операция 2.1/наблюдения 2.1). Обратите внимание, что значения, полученные этим анализом считаются ближе к подлинным ценностям.
  8. Оценить изменения, тенденции и предвзятости в сравнение всех приобретенных параметров, с помощью построения Bland-Атман, QQ заговоре, т-тест (равно среднее) и F-тест (равные дисперсии) (рис. 6 g).
    1. Обратите внимание, что операция 1.1/наблюдения 1.1 против операции сравнения 2.1/наблюдения 1.1 демонстрирует различия между оператором.
    2. Обратите внимание, что операция 2.1/наблюдения 1.1 против операции сравнения 2.1/наблюдения 2.1 демонстрирует различия между наблюдателя.
    3. Обратите внимание, что операции 1.1/наблюдения 1.1 против операции 1.2/наблюдения 1.1 Сравнение демонстрирует различия внутри оператор.
    4. Обратите внимание, что операция 2.1/наблюдения 1.1 против операции сравнения 2.1/наблюдения 1.2 демонстрирует различия внутри наблюдателя.
  9. Убедитесь, что среднее и вариации различных измерений-значительно различаются для четырех сравнений; разница между измеренные значения должны подпадать ± 1,96 стандартных отклонений, и должен появиться без тенденции к меньшей точностью ни малого, ни больших значений.

6. 3D эхокардиографии на наркотизированных Аксолотль

  1. Приобретение 3D
    1. Место наркотизированных Аксолотль в лежачем положении в губы в форме животных кровати (шаг 1.3.1). Закрепите его с плавающей, используя свободные резинки (рис. 1 c) и убедитесь, что грудной поверхность покрыта 3-5 мм среды. 3D приобретение является длительной процедурой, поэтому применять анестезирующий раствор как УЗИ среды для обеспечения стабильного сердечной функции проведения измерений.
    2. Положение датчика по срединной животного в регионе грудной ортогонально к длинной оси (поперечные 3D записи) или параллельно с длинной оси животного (для сагиттальной 3D записи).
    3. Перевести преобразователя в в плоскости (x и y) и вне плоскости измерений (z или ломтик) для обеспечения охвата всего региона сердца в последующих захвата 3D.
    4. Отрегулируйте частоту кадров и пространственного разрешения по желанию, выбрав либо «общие изображения» (высокой пространственной Лоу временное разрешение) или в режиме «кардиология» (низкой пространственной/высокая временное разрешение). Для 0,33 Гц < HR < 1 Гц использовать временное разрешение 50 кадров/сек, полученные высоким пространственным разрешением («Общие изображения»), который позволяет для сердечного цикла будет реконструирован в 50-150 отдельных этапов.
    5. Отрегулируйте «2D получить» на уровень, где анатомические структуры едва узнаваемый в raw изображений B-режим (~ 5 дБ) для увеличения сигнала к--шум в окончательном реконструкций.
    6. Для каждого фрагмента (шаг z) запись ≥ 1000 кадров.
    7. Перевести z шаг датчика одновременно, например, 20 мкм или 50 мкм и повторите запись до тех пор, пока весь регион сердечных покрыты.
  2. 3D реконструкция (Дополнительные файлы 13 и 14).
    1. Экспорт приобретений в Digital Imaging и коммуникации в медицине DICOM (обратным порядком байтов).
      Примечание: Каждый фрагмент, содержащий определенное количество кадров будет составлять один файл.
    2. Определите количество кадров в полном объеме сердечного цикла. Как HR могут меняться с течением времени, определите это для первого и заключительного фрагмента. Задайте наибольшее количество кадров в цикл, как первоначальный верхней оценки этапа резолюции, который впоследствии может быть уменьшена (шаг 6.2.8).
    3. Определить границы сельскохозяйственных культур и акцизных не значения пространство, окружающее в B-режиме окно.
      Примечание: Эти границы должны быть постоянной на протяжении всех фрагментов.
    4. Преобразуйте изображение цвета RGB в 32-разрядных.
    5. Вычислите значение корреляции (C) для каждого кадра в стеке и количество кадров включали в первых сердечного цикла, используя формулу:
      Equation 6(6)
      Примечание: Здесь Equation 7 является интенсивность сигнала пикселя в координаты (i, j) в первом изображении Equation 8 и это то же самое на втором изображении, Equation 9 , Equation 10 и Equation 11 , Equation 12 средняя интенсивность и стандарт отклонение, соответственно, первого и второго изображения в сравнение и I и J являются количество столбцов и строк в изображении. Результирующий массив значений корреляции будет иметь размер продукта количество кадров в сердечного цикла и общее количество кадров в ломтик (например, 75 × 1000 = 75000 на рис. 8) (см. образцовое скрипта в Дополнительные Файл 16). Значение корреляции рассчитать невозможно если оба или одно из изображений в сравнении есть стандартное отклонение значений пикселов нуля, однако это маловероятно в ультразвукового изображения.
    6. Обнаружить локальные максимумы в массив значений корреляции (Рисунок 8А, образцовое сценарий см в дополнительный файл 17 автоматически обнаружить локальные максимумы).
    7. Вычислить среднее квадратичное в Q(AVG) кадров с пиковых значений корреляции (т.е., соответствия сердца фазы) по формуле:
      Equation 14(7)
      где N — общее количество кадров с совпадающими сердца фаз, Equation 15 является интенсивность пикселя в координаты (i, j) nй изображения и Equation 16 является временной арифметическое Equation 17 nй изображения (см. образцовое сценарий в дополнительный файл 18).
    8. Повторите шаг 6.2.3-6.2.7 для всех фрагментов.
    9. Выберите ломтик (ссылка ломтик) с легко узнаваемые анатомических структур (например, середина желудочковая) и проверить, если реконструированный ансамбля в среднем одного сердечного цикла соответствует ровно одного цикла (т.е., если есть дополнительные фазы, что приводит к более чем одного сердечного цикла). Удаление дополнительных этапах поддаваться ровно одного сердечного цикла (например, собирается ровно один цикл, содержащий 70 этапов в рисунке 8от завышенной 75 фазы/цикл (в действительности, 1.07 цикла) на рис. 8 ).
    10. На соседней ломтик (тест ломтик), сортировка ансамбля в среднем одного сердечного цикла t-стека в соответствие сердца фазы с фрагментом ссылку, с помощью формулы значение корреляции (уравнение 6) (см. образцовое скрипты в дополнительного файла 19 и дополнительный файл 20).
      Примечание: Хотя два ломтика неидентичные не появится полностью аналогичные в любой точке во время сердечного цикла, прилегающих фрагментов с размером достаточно маленький шаг (например, 20 мкм или 50 мкм) будет произносится сходство, что приводит к корреляции значение максимумы, которые могут быть переведены на соответствующих этапах.
    11. Повторите шаг 6.2.9-6.2.10 для всех фрагментов.
    12. Сверните все 3D-реконструкции в единый 3D меткой формат файла изображения (TIF) содержащие z ломтиками и t рамы или в стопку файлов DICOM.
      Примечание: Данные могут сегментирования в каждом измерении для уменьшения размера, повышение соотношения сигнал шум и генерировать изотропной данных (in плоскости резолюция является обычно несколько выше, чем вне плоскости резолюции складки).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intrapericardial пространство в Аксолотль зависит от размера животного. Мелкие животные (2-20 г, 7-15 см) будет иметь избыток перикарда жидкости (появляются темные в эхокардиографии), окружающих сердечных камерах в то время как в более крупных половозрелых животных (> 20 g, > 15 см) камеры будет занимать большую часть intrapericardial пространство. Чтобы обеспечить лучший обзор для представителя результаты эхокардиографические просмотров Аксолотль сердца, меньше животных (10 g, 10 см) был применен на рис. 3, рис 4, Рисунок 5и Рисунок 9.

Длинная ось зрения обычно обеспечивает хороший обзор анатомии сердца в Аксолотль. Ввод в срединной плоскости с venosus пазухи, предсердиями и части желудочка в плоскости (рис. 3а, B, дополнительный файл 2), желудочковая плоскости (рис. 3 c–H) или плоскости предсердий (Рисунок 4A –D) можно добраться на перевод преобразователь справа или слева от животного, соответственно. Желудочка появится сферических и высоко trabeculated (рис. 3 c,5 дополнительных файлов 3–), тогда как предсердия более неправильной формы и почти не trabeculation (рис. 4а, Дополнительный файл 6, дополнительный файл 7). Просмотр короткой оси (Рисунок 5A, B, дополнительный файл 10) обеспечивает менее легко интерпретируемых обзор анатомии сердца Аксолотль сердца, однако он способствует оценке правильное сокращение сердца (например infarcted или неучаствующих зон круговой желудочка четко визуализируется в этой плоскости обзора). В длинной оси плоскости обзора центр отток тракта располагается тесно в центр желудочка (рисунок 2Aи сравните Рисунок отождествлены с Рисунок 4E и дополнительный файл 3 с дополнительного файла 8 ). Так как мягкие ткани отток тракта будет двигаться после выброса крови, высокой интенсивности сигнала крови во время сердечного цикла, измеряется импульсная волна Doppler в длинной оси и косой paragill самолет будет примыкают низкой интенсивности шума от движения окружающих мягких тканей (серый окрестностях белые области в кривой скорости/времени в 4 g рисунок и Рисунок 5E). Вообще контраст между крови сигнала и шума в мягких тканей должна быть достаточно большой, чтобы сегмент только сигнал крови при измерении скорости время интеграл (Рисунок 4 g (g1 увеличение) и рисунке 5E (e1 увеличение)).

Для качественной оценки моделей потока крови, цветным дипплером и сила Doppler изображений обеспечивают визуализацию шаблонов потока в разных камерах сердца (желудочек: Рисунок 3E–H, дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5; предсердий: Рисунок 4 C, D, дополнительный файл 7; отток тракта: 4F рисунок, Рисунок 5 D, 9 дополнительных файлов, дополнительный файл 12).

Axolotls, используемых для лабораторных экспериментов варьируются в размерах от ранних пост личиночной стадии 2-4 g до полной зрелости на 10-30 г и более крупных животных весом > 100 г. Аналогичным образом, функции сердца и некоторые абсолютные значения функциональных параметров, описанные здесь зависят от на размер животных. Как правило изменение фракционного площади постоянна в группах разных размеров в диапазоне 40-50% (перекос в сторону более низких значений для более больших животных). Ударный объем сильно зависит от размера животного, т.е., размер сердца, начиная от например, 20-30 мкл в 5 g axolotls, 50-70 мкл в 10 g axolotls и 250-300 мкл в 50 г axolotls. Сердце скорость и объем инсульта некоторые степени зависят прикладной анестетика и уровень анестезии (рис. 6A–F, рис. 7).

Традиционные intra/Межамери-операторами/наблюдателя анализ включает графическое представление (Bland-Альтман и Q-Q участков участков) и тестирование на равных среднее (t-тест) и дисперсией (F-тест) для оценки нормального распределения данных и сравнения точность и повторяемость между двумя лицами (рис. 6 g).

Эхокардиография 3D добавляет дополнительное измерение (z или глубина) более традиционные 2D приобретения. Это позволяет для нескольких плоских визуализации данных (рис. 9а), reslicing (рис. 9B), поверхность и объем реконструкций (Рисунок 9C, дополнительный файл 13и 14 дополнительных файлов) и сегментации и поколение 3D модели (Рисунок 9 C, дополнительный файл 15).

Figure 1
Рисунок 1. Подготовка постели и контейнера для эхокардиографии из под наркозом и наркозу Аксолотль. (A) A мягкий кусок ткани сложить один раз и проката в форму «буррито». (B) концы назад загибаются и выявляется сформировать губы в форме кровати для Аксолотля во время подводной сканирования. (C) для 2D и 3D эхокардиография наркотизированных Аксолотль, животное аккуратно помещается в лежачем положении в расщелине губы в форме кровати и фиксированной с резинками в середине нижней челюсти и сакрального регионе. (D, E) Гамак готовится вырезая квадратное отверстие в кусок из пенополистирола и лентой полиэтиленовой пленкой на верхней поверхности. (F) для 2D эхокардиография наркозу Аксолотль, животное помещают в естественной положении лежа в гамаке и подошел с наконечником покрыты датчика гель из под. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Размещение датчика. (A, B) Модель в артериальной сети в Аксолотль с приблизительное положение датчика для длинной оси и короткой оси зрения (A) и косая paragill (B). (C) просвечивания с источником мощного холодного света может помочь найти точное расположение камер сердца перед наложением датчика (см. дополнительный файл 1). Анатомические аббревиатуры: A, предсердиями; УДК, отток тракта; SinV, venosus пазухи; V, желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Представитель длинной оси эхокардиографические просмотров желудочка. (A, B) Типичный длинной оси срединной вид в B-режиме (желтая линия на рисунке 2A) желудочка конечного диастолического (A) и конец систолической фазы (B) (см. дополнительный файл 2 видео представления). (C, D) Длинная ось зрения желудочка в B-режиме (черная линия на рисунке 2A) желудочка конечного диастолического (C) и конец систолическое (D) фаз (см. дополнительные 3 файла для видео представительстве). (HE–) Подобный вид плоскости как (A) и (B) в цветной допплер (CD) и режим питания Doppler (PD), демонстрируя крови поток (см. дополнительный файл 4 и 5 дополнительных файлов видео представление из CD-PD-режиме и, ««««соответственно). Красного цвета в режиме CD образы показывают кровь течет в сторону датчика и синий цвета указывают на обратное. Сердца камер и поток крови были выделены с пунктирными линиями. Вставленные мультфильмы в (A) и (C) шоу размещение датчика и перевод по отношению к средней длинной оси просмотра. Анатомические аббревиатуры: A, предсердиями; DC(L), оставил протока Кювье; УДК, отток тракта; SinV, venosus пазухи; V, желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Представитель длинной оси эхокардиографические просмотров предсердия и отток тракта. (A, B) Длинная ось вид предсердий в B-режиме (зеленая линия на рисунке 2A) предсердий конечного диастолического (A) и конец систолическое (B) фаз (см. дополнительный файл 6 для видео представительстве). (C, D) Подобный вид плоскости как (A) и (B) в режиме Доплера (CD) цвета, демонстрируя крови поток (см. дополнительный файл 7 для видео представительстве). (E) длинной оси зрения отток тракта в B-режиме (синяя линия на рисунке 2A) на этапе среднего выброса (см. дополнительный файл 8 для видео представительстве). F: Аналогичных плоскости обзора как и (E) в режим CD демонстрируя крови поток (см. дополнительный файл 9 для видео представительстве). Аналогичных плоскости обзора (G) и (E) и (F) в режиме Доплера (PW) волна импульса, позволяя для тепла скорость обнаружения и скорости составной (VTI) измерение времени для расчета объема инсульта. Красного цвета в режиме CD образы показывают кровь течет в сторону датчика и синий цвета указывают на обратное. Сердца камер и поток крови были выделены с пунктирными линиями. Желтый и красный стрел указывают Полулунные клапаны в корне отток тракта и спиральный клапан в урочище отток, соответственно. Вставленные мультфильмы в (A) и (E) шоу размещение датчика и перевод по отношению к средней длинной оси просмотра. Анатомические аббревиатуры: A(R), правое предсердие; A(L), оставил Атриум; УДК, отток тракта; SinV, venosus пазухи; V, желудочка; VC, верхней полой вены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Представитель короткой оси и эхокардиографических видом косой paragill желудочка и отток тракта. (A, B) Короткой оси зрения желудочка в B-режиме (серая линия на рисунке 2A) желудочка конечного диастолического (A) и конец систолическое (B) фаз (см. дополнительный файл 10 для видео представительстве). (C) косой paragill вид отток тракта в B-режиме (фиолетовая линия на рис. 2B) на этапе среднего выброса (см. дополнительный файл 11 для видео представительстве). Аналогичные Показать плоскости (D) и (C) в режим CD демонстрируя крови поток (см. дополнительный файл 12 видео представления). Аналогичных плоскости обзора (E) и (C) и (D) в режиме Доплера (PW) волна импульса, позволяя для тепла скорость обнаружения и скорости составной (VTI) измерение времени для расчета объема инсульта. Красного цвета в режиме CD образы показывают кровь течет в сторону датчика и синий цвета указывают на обратное. Сердца камер и поток крови были выделены с пунктирными линиями. Вставленные мультфильмы в (A) и (C) шоу размещение датчика и перевод по отношению к средней длинной оси просмотра. Анатомические аббревиатуры: A, предсердиями; УДК, отток тракта; SinV, venosus пазухи; V, желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Представитель результаты измерения объема сердечного ритма и инсульта, эффект анестезии и представитель intra/Межамери-операторами/наблюдателя анализа. (CA–) Сердечного ритма (HR) по отношению к наркозу базовой диаграмме со временем (0 h находится в полной анестезии) для шести axolotls под наркозом в бензокаин (A) и MS-222 (B), пропофол (C). (FD–) Инсульта тома (SV) по отношению к наркозу базовой диаграмме со временем (0 h находится в полной анестезии) для шести axolotls под наркозом в бензокаин (D), MS-222 (E) и пропофол (F). (G) внутри/Межамери-операторами/наблюдателя анализ ударного объема. Bland-Альтман участков [разница (Dif) между операторами (Op) / наблюдателей (Obs) заговор против в среднем (Avg)] следует выявить без систематической предвзятости в нормально распределенных измерений (Q-Q участков), полученные различными операторами и наблюдателями. Тестирование на равных среднее (t-тест) и с равными дисперсиями (F-тест) следует выявить статистически значимых различий между операторами/наблюдателей (таблица в нижнем правом углу). A - F была изменена из материала под Creative Commons License Attribution (рис. 1 Тигисен et al. 21). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7. Сравнение объема инсульта оценкам геометрических и пульсовой волны Метод Doppler. Сравнение ударный объем (SV) оценены двумерных B-режим измерения геометрических (geo) или пульс волна Doppler измерений на скорость выхода из путей оттока крови. SV(GEO) и SV(pw) записывается в же шести животных с секунд между типы двух измерений и с помощью трех разных анестетиков, бензокаин (синий наклонена квадраты), MS-222 (красный квадрат) и пропофол (треугольников зеленого цвета) с одной недели восстановления между применение различных обезболивающих средств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8. Представитель пространственно-временных изображений корреляции для 3D эхокардиография. (A) кривой представление дали корреляции значений корреляции операции в наборе cine 1000 кадров с 75 кадров в сердечного цикла. Две рамы с лишь небольшие различия, указывающее соответствие сердца фаз, принесут высокие корреляции значение. Впоследствии местные Максима поиска алгоритм может быть применен на данных для выявления всех соответствующих кадров. (B) графическое представление тех же данных как (A). При корреляции значения получаются путем сравнения первого сердечного цикла с стек весь фильм, диагональные линии максимального корреляции указывают сопоставления сердца фазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9. Представитель 3D эхокардиография. (A) мульти планарные вид 3D реконструированный Аксолотль сердца. Процедура корреляция пространственно-временных изображений позволяет для восстановления полной сердечного цикла с несколько отдельных этапов (здесь 70 фазы) в трех пространственных измерениях, которые затем могут быть нарезанный как для желаемого исследование пространственно-временных явлений в бьющееся сердце. (B) три поперечных срезов реконструированный 115 ломтики 3D данных. Квадратичные, в среднем процедура улучшает контраст крови в ткани и снижает соотношение сигнал шум, позволяющие лучше понять trabeculated характер Аксолотль желудочка и четкой визуализации межпредсердной перегородки и Клапаны в урочище отток. (C) поверхности и объема представлений биение сердца в три этапа по цвету сегментированные модель (см. дополнительный файл 13 и 14 дополнительных файлов видео представления поверхности и объема оказываемых избиение сердце и дополнительный файл 15 для трехфазных сегментирована интерактивной 3D-модели). Анатомические аббревиатуры: A, предсердиями; Cau, хвостовой; CRA, черепа; DEX, Декстер (для животного права); Дор, спинной; УДК, отток тракта; Грех, зловещий (для животных слева); SinV, venosus пазухи; V, желудочка; Вен, брюшному. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1. Просвечивания найти сердца камер вАксолотль. Смотрите Рисунок 2 c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2. Длинной оси, срединная точка зрения, B-режим. Смотрите Рисунок 3А, B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3. Длинная ось, желудочковая вид, B-режим. Смотрите Рисунок 3 c, D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4. Длинная ось, желудочковая вид, Цветной Допплер режим. См Рисунок 3E, F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5. Длинная ось, желудочковая вид, сила Doppler режим. См Рисунок 3 g, H. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6. Длинная ось, предсердная вид, B-режим. Смотрите рис. 4A, B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 7. Длинная ось, предсердная вид, Цветной Допплер режим. Смотрите Рисунок 4 c, D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 8. Длинная ось, отток тракта взгляд, B-режим. См Рисунок 4E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 9. Длинная ось, отток тракта вид, Цветной Допплер режим. Смотрите Рисунок 4F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 10. Короткой оси, желудочковая взгляд, B-режим. См Рисунок 5A, B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 11. Косой paragill, отток тракта вид, B-режим. Смотрите Рисунок 5 c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 12. Косой paragill, отток тракта вид, Цветной Допплер режим. Смотрите Рисунок 5 d. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 13. Трехмерной поверхности отрисовки бьющееся сердце в 70 этапов (19.6 ms временное разрешение). См 9C рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 14. Трехмерный объемный рендеринг избиение сердце в 70 этапов (19.6 ms временное разрешение). См 9C рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 15. Интерактивная трехмерная модель бьющееся сердце в 3 этапа: желудочковая конце систолы, желудочковая среднего выброса и желудочковой конце систолы. Смотрите Рисунок 7 c. Интерактивные PDF-файл следует рассматривать в Adobe Acrobat Reader 9 или выше. Чтобы активировать функцию 3D, выберите модель. С помощью курсора, это теперь возможно для поворота, масштабирования, панорамирования модель, и в дереве Модель все сегменты модели может быть выключен / или прозрачными. Дерево модели является иерархии, содержащей несколько суб слоев, которые могут быть открыты (+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 16. Представитель Аннотированная сценарий для вычисления значения корреляции приобретения 1000 кадров с верхней оценкой 75 кадров/сердечного цикла. Сценарий написан на языке макрос IJ1 и могут быть реализованы как макрос пакетной ImageJ для вычисления значения корреляции (75000 за приобретение) через весь z-стека 3D данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 17. Представитель сценарий для автоматического пик обнаружения в серии значений корреляции из 1000 кадров приобретения с верхней оценкой 75 кадров/сердечного цикла. Серии значений корреляции (столбец B, отмечены желтым цветом) может быть заменен и после активации макроса (Ctrl + r) в списке команд выберите соответствие сердца фазы и выполнять квадратичной усреднения будет отображаться (столбец Q, отмеченные зеленым). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 18. Представитель Аннотированная сценарий выберите соответствие сердца фазы и выполнять квадратичной в среднем 1000 кадров приобретения с верхней оценкой 75 кадров/сердечного цикла (столбец Q в дополнительный файл 17). Сценарий написан на языке макрос IJ1 и может быть реализован как макрос в ImageJ создать ансамбль в среднем один цикл (75 фазы) 2D срез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 19. Представитель Аннотированная сценарий для вычисления значения корреляции между ломтиком ссылка 70 кадров и кусочек теста 75 кадры, расположенные рядом. Сценарий написан на языке макрос IJ1 и могут быть реализованы как макрос в ImageJ для вычисления значения корреляции (5250). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 20. Представитель Excel сценарий для автоматического пик обнаружения в серии значений корреляции из сравнения между ломтиком ссылка 70 кадров и кусочек теста 75 кадры, расположенные рядом. Могут быть заменены серии значений корреляции (столбец C, отмечены желтым цветом) и после активации макроса (Ctrl + t) список фрагментов должен выбираться как substack в кусочек теста будет отображаться (колонка L, 2 строки, отмеченные зеленым). Substack кусочек теста будет иметь пространственно соответствующие кадры на ссылку фрагмент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эхокардиография в Аксолотль и других не млекопитающих видов дает принципиально различных данных, чем у млекопитающих эхокардиография из-за ядерных характер красных кровяных клеток в всех позвоночных за исключением взрослых млекопитающих. Это приводит к выраженным крови сигнал и меньше крови в ткани контраст в Аксолотль Эхокардиографические изображений по сравнению с например, мыши или человека эхокардиографии. Это может сделать сегментации изображений на необработанные однорамные УЗИ изображения более сложным, как это может быть трудно отличить от ткани крови. Однако, это явление может быть выгодным при использовании для создания крови сигнал расширенной изображений, применяя квадратичных усреднения процедуры описано ранее18 и модифицированы для Аксолотля эхокардиография в разделе 6 протокола. Поскольку кровь крапинками намного более динамичным, чем те, которые нашли в мягких тканях, квадратичных усреднения будет генерировать выраженный контраст между этими двумя отделениями, что облегчает сегментации изображений в двух и трех измерениях.

Этот протокол описывает три различных анестетиков для Аксолотля, которые были тщательно протестированы ранее21. Бензокаин и MS-222 стимулировать увеличение сердечного ритма, который может быть желательным, при тестировании сердечной функции в условиях стресса. Пропофол вызывает меньше стресса в сердце во время анестезии и может использоваться как замена для наркозу эхокардиография в ситуациях, когда приобретение время превышает пределы сидячий образ поведения в наркозу axolotls.

2D эхокардиографии, описывая 3D сердце зависит от субъективности. Таким образом крайне важно для поведения и анализа intra/Межамери-операторами/наблюдателя до проведения фактической эксперимента, как описано в разделе 5 протокола. Аналогичным образом эхокардиографические измерения следует считать более значения индекса, которые могут быть применены для изучения потенциальных различий в функции сердца при различных обстоятельствах, а не абсолютные значения. Ударный объем, определяется геометрическая уравнение (уравнение 2) редко дает то же абсолютное значение импульсная волна Doppler уравнение (уравнение 4; Рисунок 7), и оно должно быть решено, который мера придерживаться на протяжении серии экспериментов. SV(geo) можно получить быстрее, чем SV(pw), однако сферических Успения желудочковой формы применяется только к здоровой, равномерно Договаривающихся сердца, и в моделях болезни и регенерации SV(pw) должны рассматриваться для лучшего отражения истинный ударный объем.

Корреляция и квадратичные усреднения процедуры раздела 6 протокола может осуществляться в нескольких различных изображений и математических пакетов. Поскольку в рамках наук о жизни исследователи различаются программирования навыки и доступ к пакетам программного обеспечения, мы стремились на обеспечение представительной скрипты для методов в пакеты программного обеспечения, что большинство исследователей знакомы с (например, Excel) что легко подошел и свободно доступны (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Дополнительные файлы 16 - 20 обеспечивают аннотированный образцовое скриптов, написанных IJ1 макро языке и как .xlsm макросы, которые должны быть понятным даже с минимальным опытом работы в кодирования.

Регенерации внутренней сердце представляет собой явление, исключительно нашли в сердцах мелких видов (по сравнению с человека), и таким образом измерения и визуализации базовые функции сердца и функциональная прогресса во время регенерации оспаривается Размер сердца и пространственное разрешение изображений модальности применяется. Высокая частота ультразвуковых изображений обеспечивает желательно компромисс между высоким пространственным разрешением в плоскости (~ 30 х 30 мкм2 50 МГц), сопоставимы в vivo µCT изображений и намного выше, чем в естественных условиях µMRI, которая имеет глубину проникновение (~ 1 см на 50 МГц) несколько раз больше, чем confocal микроскопии и очень высоким временным разрешением (50-300 кадров/с при 50 МГц, 1 см Глубина). В сочетании с ручной или автоматической z размеров движения датчика, УЗИ позволяет непревзойденной восстановления функции сердца и анатомические моделирования в четырех измерениях. Кроме того неинвазивный характер техника позволяет для продольной экспериментов. Наши знания имеются в настоящее время не матрицы массива преобразователей для высокой частоты микро УЗИ. Развитие этой технологии значительно поможет приобретения 3D данных небольших сердец как Аксолотль в процедуре быстрее чем механически перемещения преобразователя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы признать Kasper Хансен, Институт бионауки, Орхусе университет для обеспечения доступа и помощи с электронной микроманипулятор для 3D эхокардиографические приобретения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Медицина выпуск 141 эхокардиография УЗИ сердца УЗИ сердца регенерации Аксолотль Ambystoma mexicanum корреляция пространственно-временных изображений
2D и 3D эхокардиография в Аксолотля (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter