Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ecocardiografía 2D y 3D en el ajolote (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Aquí presentamos los protocolos de la ecocardiografía para la adquisición de la imagen bidimensional y tridimensional del corazón de la Salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), una especie de modelo en la regeneración del corazón. Estos métodos permiten una evaluación longitudinal de la función cardiaca con una alta resolución espaciotemporal.

Abstract

Mal funcionamiento cardiaco como resultado de enfermedad isquémica del corazón es un gran desafío, y terapias regenerativas del corazón están en alta demanda. Algunas especies de modelo como el pez cebra y salamandras que son capaces de regeneración intrínseca del corazón son prometedoras para futuras terapias regenerativas para pacientes humanos. Para evaluar el resultado de experimentos de cardioregenerative es imprescindible que puede controlarse la función cardíaca. La Salamandra axolotl (a. mexicanum) representa una especie de modelo bien establecido en la biología regenerativa alcanzar tamaños que permite la evaluación de la función cardiaca. El propósito del presente Protocolo es establecer métodos para reproducible medir función cardiaca en el ajolote mediante ecocardiografía. La aplicación de diferentes anestésicos (benzocaína, MS-222 y propofol) está demostrado, y se describe la adquisición de dos dimensiones (2D) datos ecocardiográficos en axolotl anestesiados y sin anestesiar. La ecocardiografía 2D del corazón tridimensional (3D) puede sufrir de imprecisión y subjetividad de las mediciones y para aliviar este fenómeno un método sólido, es decir, intra/inter-operator/observador análisis, para medir y reducir al mínimo este sesgo es demostrado. Por último, se describe un método para adquirir datos ecocardiográficos 3D del corazón de ajolote con una muy alta resolución espaciotemporal y pronunciado contraste de la sangre al tejido. En general, este protocolo debe proporcionar los métodos necesarios para evaluar la función cardiaca y la anatomía de la modelo y dinámica en el ajolote usando proyección de imagen de ultrasonido con aplicaciones en biología regenerativa y experimentos fisiológicos generales del flujo.

Introduction

Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en todo el mundo1,2. Aunque muchos sobreviven un infarto del miocardio debido a la intervención médica rápida y afinado, incidentes isquémicos en los seres humanos se conducen a menudo a cicatrices fibróticas asociadas con hipertrofia, avería eléctrica y una capacidad funcional disminuida del corazón . Esta falta de potencial regenerativo del tejido cardiaco es compartida entre mamíferos y aunque controvertidas afirmaciones de mamífera Regeneración cardiaca se han divulgado, estos se han limitado a cepas murinas específicas3,4 y tratar la hipoxia ratones5. Así, el campo de la biología y la medicina regenerativa cardíaca es generalmente limitado a los modelos animales no mamíferos para estudiar los fenómenos regenerativos intrínsecos del corazón. El pez cebra (Danio rerio) en la última década se estableció como el modelo más bien caracterizado para corazón intrínseca regeneración6,7,8,9,10 . Debido a mantenimiento de laboratorio fácil, un tiempo de generación corto y una amplia gama de herramientas moleculares disponibles, el pez cebra es adaptado como modelo de mecanismos genéticos y moleculares subyacentes el desarrollo cardíaco y regeneración. Sin embargo, las dimensiones minutos del corazón del pez cebra hacen menos adecuado para la evaluación funcional, y procedimientos quirúrgicos complicados y la filogenia no tetrápodo del pez cebra limita la extrapolación razonable de los resultados en esta especie, así justificar el uso de otros modelos más grandes tetrápodos. Uno de los primeros modelos de regeneración del corazón vertebrados fue un anfibio caudado, el newt del este (Notophthalmus viridescens)11, una especie que sigue siendo un modelo valioso de12.

En los últimos años otro anfibio caudado, el ajolote mexicano (a. mexicanum) ha entrado en la escena como un grande (hasta 100 g de cuerpo total) y altamente laboratorio adaptable modelo animal para una amplia gama de disciplinas regenerativas que regeneración de extremidades, lesión de la médula espinal y regeneración cardiaca13,14,15,16,17. El ajolote es altamente susceptible de mediciones funcionales en el corazón utilizando la ecocardiografía de alta frecuencia y la ausencia de estructuras calcificadas en el lado ventral del corazón permite ultrasonido proyección de imagen con un nivel mucho más bajo de los artefactos de la imagen (acústicos sombras y reverberación en particular) que la observada en otros animales modelo calcificado esternón y las costillas.

El siguiente protocolo describe varios diferentes métodos y preparaciones (figura 1, figura 2) para la adquisición de mediciones ecocardiográficas reproducibles en el corazón de ajolote en ambos anestesiados (aplicación de tres diferentes anestésicos: benzocaína, MS-222 y propofol) y sin anestesiar animales en dos (figura 3, figura 4, figura 5, figura 6, figura 7, Archivos complementarios 1-12) y tres (figura 8, figura 9, Archivos complementarios 13-14) dimensiones espaciales. El corazón de los anfibios es tres cámaras (dos aurículas y un ventrículo único). Las aurículas son suministradas por un gran seno venoso y el ventrículo se vacía en el tracto de salida del cono arterioso (figura 2). Puesto que la mayoría es tradicionalmente sobre regeneración ventricular y menos en la recuperación de atria6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, este protocolo se centra principalmente en las mediciones de la función ventricular.

Ecocardiografía de anfibios no está bien descrita en la literatura, y el desarrollo de los métodos 2D se describe en este documento han sido expulsados por la necesidad de representar mejor la funcionalidad del corazón de ajolote en un momento dado y ajuste experimental. Así, los métodos aquí descritos son aplicables en los experimentos de regeneración de corazón donde función cardiaca puede ser supervisada varias veces sobre el curso de un proceso de regeneración. Además, los métodos pueden ser aplicados en experimentos de cardiophysiological con el ajolote en general o modificados levemente para abarcar otros modelos de anfibio caudados o anuros (e.g.,Xenopus). El Axolote existe en diversas variedades y variaciones del color (e.g., tipo salvaje, melanoid, blanco, albino, blanco transgénica con expresión de la proteína de fluorescencia verde), sin embargo estas características no afectan a la compatibilidad de la Axolote con el protocolo descrito. El método aquí descrito para adquirir datos ecocardiográficos 3D es una versión modificada de la técnica de correlación (STIC) imagen espacio-temporal para ultrasonido clínico y la cuadrática promedio método descrito anteriormente en el pollo en desarrollo a mejorar la señal de puntos de sangre en los tejidos blandos en las especies que contienen glóbulos rojos nucleados18,19. Este método permite el modelado avanzado de la contracción cardiaca y computada dinámica de fluidos en el corazón de ajolote.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fueron los procedimientos realizados en el presente Protocolo con arreglo a la legislación danesa para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los experimentos fueron aprobados por la inspección de experimentos nacional danés Animal (protocolo # 2015-15-0201-00615).

1. preparaciones

  1. Preparar axolotl medio.
    1. Aplique agua del grifo de alta calidad tratado químicamente no como medio de ajolote. Si esto no está disponible, aplicar solución de Holtfreter 40%.
    2. Preparar solución de 40% (peso/vol) Holtfreter disolviendo 15,84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O y 0,288 g de KCl en agua filtrada y desionizado hasta un volumen de 1 L.
  2. Hacer anestésicos de inmersión.
    1. Preparar solución anestésica de benzocaína (etilo 4-aminobenzoato) disolviendo 200 mg etilo 4-aminobenzoato en acetona de 3 mL y luego disolver esta mezcla en la solución de 1 L agua del grifo o 40% Holtfreter.
    2. Preparar solución anestésica de MS-222 (etil 3-aminobenzoato metanosulfónico ácido que también se conoce comúnmente como tricane) disolviendo 200 mg etil aminobenzoato 3 metanosulfónico ácido directamente en solución de 1 L agua del grifo o 40% Holtfreter.
    3. Preparar solución anestésico propofol (2,6 diisopropylphenol) disolviendo mg 3,3 2,6 diisopropylphenol en solución de 1 L agua del grifo o 40% Holtfreter. Alternativamente, diluir solución comercialmente premade a 3,3 mg/L.
      PRECAUCIÓN: Propofol es un potente anestésico humano (administrado por vía intravenosa) y debe ser manejado con cuidado, incluso en forma diluida.
  3. Preparar cama y recipiente para la ecocardiografía.
    1. Preparar cama de animal en forma de labio para ecocardiografía doblando una pieza de 70 cm x 55 cm de tela suave una vez y luego enrollándolo en forma de"burrito" (figura 1A). Luego doblar sobre los extremos hasta que se reúnen y cinta estos juntos (figura 1B).
    2. Sumerja el labio en forma de estructura en medio de ajolote para acomodar el ajolote anestesiado durante proyección de imagen de ultrasonido. Sujetar el animal a la estructura y evitar flotante con gomas sueltas; Coloque estos mediados-de la mandíbula y la región sacra (figura 1).
      Nota: Las gomas no deben apretar el animal como esto afecta la hemodinámica.
    3. Para ecocardiografía 2D en axolotl sin anestesiar, preparar una hamaca por esculpiendo una 16 cm x 8 cm x 5 orificios cm en una 33 cm x 27 cm x 5 bloque cm de espuma de poliestireno (por ejemplo, una tapa de un envase de espuma de poliestireno de tamaño medio) (figura 1).
    4. Empujar una pieza de 33 x 27 cm de la envoltura de plástico a través del orificio y fije los bordes de la envoltura de la superficie superior del bloque de espuma de poliestireno (Figura 1E) para crear una hamaca. Añadir medio ajolote a 3 cm de profundidad en la hamaca. El axolotl sin anestesiar se hundirá hasta el fondo de la hamaca que permite fácil acceso ventral a través de la envoltura de plástico (Figura 1F).

2. anestesiar axolotl

  1. Sumerja el ajolote en la deseada solución anestésico (benzocaína, MS-222 o propofol).
  2. Inspeccione para primeros signos de sedación, disminución movimientos y creciente pérdida de righting reflex, esto aparece dentro de 10 min en animales < 10 g (< 10 cm) y dentro de 20 min en animales de entre 10 g y 50 g de masa corporal (10-22 cm).
  3. Inspeccione si hay ausencia total de movimientos del cuerpo, los movimientos de ventilación branquial y righting reflex y asegúrese de que el animal sea no responde al estímulo de dolor moderado prueba pellizcando entre dígitos.
    Nota: a pesar de que la anestesia general se logra dentro de 30 minutos en axolotl benzocaína anestesiada, función cardiaca no se estabiliza hasta 1 h. Este no es el caso de MS-222 o propofol anestesiar axolotl (figura 6A-F).
  4. Para mantener el ajolote bajo anestesia general, mantener el animal en la solución de anestesia o envuelto en trapos de papel mojado, humedecidos en la solución de anestesia.
    Nota: La anestesia se puede mantener durante 7 h sin efectos adversos sobre el bienestar de los animales dado que la piel y especialmente las branquias se mantienen húmedas.
  5. Para reawake axolotl, traslado del animal al medio sin anestesia.
    Nota: El primer signo del despertar es gill movimientos de ventilación. Animal debe ser vertical y sensible a la estimulación dentro de 1 h.

3. 2D ecocardiografía en anestesia Axolotl

  1. Lugar axolotl anestesiado en posición supina en la cama del animal en forma de labio (medidas 1.3.1-1.3.2). Asegure de flotantes con gomas sueltas (figura 1). Asegúrese de que la superficie torácica está cubierta por 3-5 mm de media.
    Nota: Para una adquisición breve (< 5 min) puede aplicarse medio sin anestesia. De adquisición prolongado, la solución anestésica debe aplicarse como medio para asegurar la función cardiaca estable a lo largo de las mediciones de ultrasonido.
  2. Colocar el transductor sobre la línea media del animal en la región torácica paralelas al eje longitudinal del animal (figura 2A, Figura 3A-B, 2 archivo suplementario). Utilizar la transiluminación con una fuente de luz fría en el axolotl blanco y albino para asegurar la colocación correcta del transductor (figura 2 y archivo adicional 1).
    1. Para ajolotes < 20 g de peso, utilizar un transductor de 50 MHz; para ajolotes > 20 g, utilizar un transductor de 40 MHz. Asegurar la colocación de la dirección craneal, anterior a la derecha para la adquisición de imágenes estandarizadas. Si esto no es el caso de rotar el transductor 180 ° o invertir la imagen.
  3. Asegúrese de que en la vista de eje largo de la línea media, una pequeña porción del ventrículo (colocado a la derecha en la cavidad torácica, figura 2A) aparece en el marco de la diástole ventricular y una gran parte de las aurículas izquierdas y derecha (colocado en el centro / levemente hacia la izquierda en la cavidad torácica, figura 2A) y el seno venoso son visibles tanto en la sístole y diástole (Figura 3A, B).
  4. Traducir el transductor 1-3 mm hacia la derecha del animal para obtener la vista de eje largo ventricular (figura 2A). La posición correcta se alcanza cuando el área transversal del ventrículo telesístole es su máximo (figura 3-H).
  5. En modo B, adquirir ≥ 3 ciclos cardiacos con > 50 fotogramas/s en cualquiera de los dos 'general imaging' (alta resolución espacial baja temporal) o en modo 'Cardiología' (baja resolución espacial alta temporal).
    Nota: Este punto de vista permite evaluación de función ventricular. Función ventricular puede ser evaluada en dos dimensiones usando el cambio de área fraccional ventricular (FACv) calculado a partir del telediastólico y telesistólico seccional área transversal del ventrículo (CSAv) utilizando la ecuación:
    Equation 1(1)
    Ventrículo de axolotl asume la forma de una esfera y un volumen de movimiento de la geometría basado en [SV(geo)] puede calcularse mediante la ecuación:
    Equation 2(2)
  6. Traducir el transductor en el eje largo del animal hasta el centro del ventrículo está en el centro de la pantalla. Rotar el transductor 90 ° hacia la derecha para obtener la vista de eje corto mediados de-ventricular (figura 5A y B, 10 archivo suplementario). Evaluar la forma circular del ventrículo traduciendo el transductor en el eje largo del corazón.
  7. Retomar el transductor en el plano eje largo y traducirlo hacia la línea media o levemente a la izquierda de la línea media para obtener la vista de cámara dos auricular eje largo (figura 2A). Asegúrese de que la posición correcta se alcanza al confirmar que las áreas transversales de las aurículas telesístole en su maxima y las dos aurículas combinadas asuman el contorno del número '8' inclinado ~ 45 ° hacia la izquierda (Figura 4A y B, Archivo complementario 6).
  8. En modo B adquirir ≥ 3 ciclos cardiacos con > 50 fotogramas/s en modo 'Cardiología' o 'general imaging'.
    Nota: Atria del axolotl es irregular en forma y la función 3D no directamente deducir de datos 2D, por lo tanto su función deberá ser evaluada como una medida de índice como oportunidad de la área fraccional (FACa) basada en el área seccional transversal combinado (CSAa) de ambos latidos cámaras en sístole y diástole:
    Equation 3(3)
  9. Traducir el transductor hacia la derecha hasta que aparezca el tracto de salida (cono arterioso) (cerca de la vista de eje largo ventricular) (figura 2A).
    Nota: Después de salir del ventrículo en sentido anterior, el tracto de salida hace una curva cerrada y funciona en un ángulo pequeño hacia la superficie ventral antes otra vez asumiendo una dirección anterior y dividirse en ramas branquiales y los vasos sistémicos.
    1. Asegúrese de que se alcanza el punto de vista del tracto de salida correcta confirmando que el diámetro de la salida está en su máximo en telesístole ventricular y dos de las tres válvulas semilunares en la entrada de la salida son accesibles en el medio de eyección (figura 4E, Archivo suplementario 8).
      Nota: La dirección ventral hacia el transductor de la porción intermedia de la zona de salida permite mediciones de velocidad y flujo usando proyección de imagen de Doppler.
  10. Aplique el modo Doppler Color para asignar velocidades de flujo de sangre en el tracto de salida durante la eyección cardiaca (figura 4F y 9 archivos complementarios). Asimismo aplicar Doppler Color y Power Doppler de imagen para visualizar el flujo sanguíneo en las vistas ventriculares y auriculares (figura 3E-H, Archivos complementarios 4-5 y figura 4-Dy 7 de archivo adicional).
  11. Aplique el modo Doppler de la onda de pulso (PW) en la posición de velocidad máxima de la sangre en la parte de la zona de la salida hacia hacia el transductor.
    1. Uso de 'ángulo' y 'corrección angular' hasta 45 ° para ajustar la salida no es totalmente perpendicular a la cara del transductor (figura 4). Asegúrese de que la posición PW Doppler no es sobrepuesta por la válvula espiral de la salida durante cualquier fase del ciclo cardíaco (figura 4E).
  12. En el modo Doppler PW adquirir datos de velocidad/tiempo sobre ≥ 3 ciclos cardiacos.
  13. Volver al modo B y adquirir ≥ 3 ciclos cardiacos en el mismo plano exacto como VOP fue adquirida.
  14. Medida el tiempo de velocidad integral (VTI) del flujo sanguíneo en el tracto de salida como el área bajo la curva de velocidad/tiempo para cardiaco completo un ciclo (figura 4, g1).
    Nota: Desde el VTI y el diámetro (d) de la zona de salida en telesístole obtienen de la adquisición de B-mode, un movimiento basado en volumen [SV(pw)] puede calcularse utilizando la ecuación PW Doppler:
    Equation 4(4)
    Frecuencia cardiaca (FC) se mide desde la curva de velocidad/tiempo midiendo la duración de un ciclo cardiaco completo. Gasto cardíaco [CO(pw)] se calcula con la ecuación:
    Equation 5(5)
  15. Obtener la opinión de paragill oblicua, una vista que ofrece una alternativa para la medición de la velocidad de flujo de sangre en el tracto de salida, girando el ajolote 90 ° en el labio en forma de cama de tal manera que la parte derecha del animal quede hacia arriba (figura 2B). Ángulo y rotar el transductor y colocarlo paralelo y justo posterior a las branquias que sobresalen (figura 2B). Asegúrese de que la posición correcta se alcanza al confirmar que el tracto de salida corre hacia abajo en el ~ 45 ° y que las aurículas en el tracto de salida durante la eyección (figura 5 C, 11 archivos complementarios).
  16. Aplicar PW Doppler modo en la posición de velocidad máxima de la sangre en la parte de la zona de la salida huyendo del transductor (figura 5, 12 archivos complementarios). Uso de 'ángulo' y 'corrección angular' hasta 45 ° para ajustar la salida no es totalmente perpendicular a la cara del transductor (figura 5E).
  17. En el modo Doppler PW adquirir velocidad de sangre sobre ≥ 3 ciclos cardiacos.
  18. Volver al modo B y adquirir ≥ 3 ciclos cardiacos en el mismo plano exacto como VOP fue adquirida.
    Nota: SV(pw) y CO(pw) se calculan para la vista paragill oblicua utilizando la ecuación 4 y la ecuación 5 como se describe anteriormente para la vista de eje largo.

4. 2D ecocardiografía en Axolotl sin anestesiar

  1. Lugar el axolotl sin anestesiar en una posición prona en la hamaca (paso 1.3.3).
  2. Deje reposar durante 30-60 min para recuperarse de manejo de estrés del animal.
  3. Coloque el transductor del ultrasonido con la cabeza del transductor hacia arriba hacia el ajolote en la hamaca.
  4. Aplicar ultrasonido-gel en el transductor.
  5. Suavemente y sin molestar a los animales, colocar el transductor sobre la línea media del animal en la región torácica paralelas al eje largo del animal.
    Nota: Esta es la posición mismo, pero invertida, como el ajolote anestesiado (paso 3.2).
  6. Obtener el modo B, modo Doppler Color, PW modo datos en el eje largo y eje corto vista como se describe en pasos 3.2-3.14.
    Nota: Una vista oblicua paragill es inalcanzable en el axolotl sin anestesiar. Entre los movimientos de ventilación branquial (10-20 s cierto para un descanso animal) se deben adquirir los datos ecocardiográficos en axolotl sin anestesiar. Si el ajolote se mueve durante la adquisición, las mediciones deben repetirse.

5. evaluar los datos de la ecocardiografía 2D y minimizar la subjetividad

  1. Evitar el sesgo del observador/operador en ultrasonido 2D proyección de imagen y 3D la evaluación de la función cardiaca, basada en datos 2D causados por la subjetividad en la adquisición de datos y la fase de análisis de datos mediante la realización de análisis intra/inter-operator/observador20.
    Nota: En la puesta en marcha de estudios y capacitación del personal nuevo esta subjetividad debe cuantificarse y reducido al mínimo usando análisis intra/inter-operator/observador.
  2. Iniciar el análisis intra/inter-operator/observador en una configuración de dos personas con 1 operador/observador (menos experiencia) está probando contra el trabajo de operador/observador 2 (más experimentada) mediante la realización de mediciones de ≥ 6 consenso, incluyendo ambos Banco en el sistema de ultrasonido (operación) y posterior análisis de los parámetros relevantes (observación).
  3. Llegar a un consenso entre los operadores y observadores y operar (operador/observador 1) el sistema de ultrasonido para adquirir datos relevantes en ≥ 6 animales (operación 1.1).
  4. Inmediatamente después, operar (operador/observador 2) el sistema de ultrasonido para adquirir los datos pertinentes sobre los mismos animales (operación 2.1).
  5. Que animales recuperar durante 3 días. Después, repita (operador/observador 1) el procedimiento (operación de 1.2).
  6. Analizar (operador/observador 1) todos medidos (operación 1.1/observación 1.1; 2.1 Operación/observación 1.1; 1.2 Operación/observación 1.1) y después de 24 h, repetir el análisis de datos de operador/observador 2 (operación 2.1/observación 1.2).
  7. Analizar (operador/observador 2) los datos adquiridos por sí mismo (operación 2.1/observación 2.1). Tenga en cuenta que los valores obtenidos mediante este análisis se consideran más cercanos a los verdaderos valores.
  8. Evaluar variaciones, tendencias y sesgos en las comparaciones entre todos los parámetros adquiridos mediante Bland-Atman tramando, tramando QQ, t-test (igual media) y F-test (igual varianza) (figura 6).
    1. Tenga en cuenta que la operación 1.1/observación 1.1 comparación comparación de operación 2.1/observación 1.1 se muestra la variación inter-operador.
    2. Tenga en cuenta que la operación 2.1/observación 1.1 comparación comparación de operación 2.1/observación 2.1 muestra la variación entre observador.
    3. Tenga en cuenta que la operación 1.1/observación 1.1 comparación comparación de operación 1.2/observación 1.1 se muestra la variación intra-operador.
    4. Tenga en cuenta que la operación 2.1/observación 1.1 comparación comparación de operación 2.1/observación 1.2 se muestra la variación intraobservador.
  9. Asegúrese de que media y variación de las diferentes mediciones no significativamente diferentes de las cuatro comparaciones; la diferencia entre los valores medidos debe caer dentro de ± 1.96 desviaciones, y no debe aparecer tendencias hacia menos precisión de valores ni pequeñas ni grandes.

6. 3D ecocardiografía en anestesia Axolotl

  1. Adquisición 3D
    1. Lugar el ajolote anestesiado en posición supina en la cama del animal en forma de labio (paso 1.3.1). Asegure de flotantes con gomas sueltas (figura 1) y asegúrese de que la superficie torácica está cubierta por 3-5 mm de media. Adquisición 3D es un procedimiento muy largo, por lo tanto aplicar solución anestésica como medio para asegurar la función cardiaca estable a lo largo de las mediciones de ultrasonido.
    2. Posición del transductor sobre la línea media del animal en la región torácica ya sea paralela al eje longitudinal del animal (para grabación 3D sagital) u ortogonal al eje longitudinal (grabación 3D transversal).
    3. Traducir el transductor en la dimensión en el plano (x e y) y la dimensión de la hacia fuera-de-plano (z o slice) para garantizar que se cubrirá toda la región cardíaca en la posterior captura 3D.
    4. Ajustar la velocidad de fotogramas y resolución espacial deseada seleccionando cualquiera de los dos 'general imaging' (alta resolución espacial baja temporal) o en modo 'Cardiología' (baja resolución espacial alta temporal). Para 0,33 Hz < HR < 1 Hz usa una resolución temporal de 50 fotogramas/s en alta resolución espacial (general imaging) que permite el ciclo cardiaco ser reconstruido en fases distintas de 50-150.
    5. Ajustar 'ganancia 2D' a un nivel donde las estructuras anatómicas son apenas reconocibles en la cruda imagen de modo B (~ 5 dB) para aumentar la relación señal a ruido en las reconstrucciones finales.
    6. Para cada rodaja (paso de z), grabar 1.000 fotogramas ≥.
    7. Traducir paso z transductor en un tiempo, por ejemplo, 20 μm o 50 μm y repetir la grabación hasta que cubra toda la región cardiaca.
  2. Reconstrucción 3D (complementaria archivos 13 y 14).
    1. Exportación de adquisiciones en imagen Digital y comunicaciones en medicina DICOM (little endian).
      Nota: Cada rebanada contiene un número determinado de fotogramas que componen un solo archivo.
    2. Determinar el número de fotogramas en un ciclo cardiaco completo. Como HR puede variar con el tiempo, determinar esto para el primer y el último segmento. Establecer el mayor número de frames por ciclo como la estimación superior inicial de la resolución de la fase que más adelante puede ser reducida (paso 6.2.8).
    3. Determinar límites de cultivo y suprimir espacio irrelevante que rodea la ventana modo B.
      Nota: Estos límites deben ser constantes a lo largo de rebanadas.
    4. Convertir la imagen en Color RGB de 32 bits.
    5. Calcular el valor de la correlación (C) para cada fotograma de la pila y el número de fotogramas en el primer ciclo cardiaco mediante la fórmula:
      Equation 6(6)
      Nota: Aquí Equation 7 es la intensidad del píxel en las coordenadas (i, j) en la primera imagen Equation 8 y es el mismo en la segunda imagen, Equation 9 , Equation 10 y Equation 11 , Equation 12 son el patrón y la intensidad media desviación, respectivamente, de la primera y la segunda imagen en la comparación y I y J son los números de columnas y filas en la imagen. La matriz resultante de los valores de correlación tendrá el tamaño del producto de la cantidad de frames por ciclo cardíaco y el número total de fotogramas por rebanada (p. ej., 75 × 1.000 = 75.000 en la figura 8) (ver guión ejemplar en complementario Archivo 16). El valor de correlación no se puede calcular si una o ambas de las imágenes en la comparación tienen una desviación estándar de los valores de píxeles de cero, sin embargo esto es muy poco probable en imágenes ultrasonographic.
    6. Detectar máximos locales en la matriz de valores de correlación (figura 8A, véase guión ejemplar en 17 archivos complementarios para detectar automáticamente máximos locales).
    7. Calcular la media cuadrática Q(AVG) de marcos con valores de correlación máximos (es decir, coincidencia de fases cardiacas) mediante la fórmula:
      Equation 14(7)
      donde N es el número total de fotogramas con coincidencia de fases cardiacas, Equation 15 es la intensidad del píxel en las coordenadas (i, j) de la imagen deth ny Equation 16 es la media aritmética temporal de Equation 17 de la imagen deth n(ver guión ejemplar en 18 archivos complementarios).
    8. Repita el paso 6.2.3-6.2.7 para todos los sectores.
    9. Seleccione un slice (rebanada de referencia) con estructuras anatómicas fácilmente reconocibles (por ejemplo, mediados de-ventricular) y comprobar si el conjunto reconstruido promedió un ciclo cardíaco corresponde a exactamente un ciclo (es decir, si hay adicionales fases en más de un ciclo cardiaco). Eliminar fases adicionales para producir exactamente un ciclo cardiaco (p. ej., pasando de un sobrestimado 75 fases/ciclo (en realidad, ciclo 1.07) en la figura 8 a exactamente un ciclo que contiene 70 fases en la figura 8).
    10. En el segmento vecino (prueba rebanada), ordenar el conjunto un promedio de un ciclo cardiaco t-pila en fases cardiacas los coincidentes con el segmento de referencia utilizando la fórmula de valor de correlación (ecuación 6) (ver ejemplares scripts en 19 archivo complementario y archivo suplementario 20).
      Nota: Aunque dos rebanadas no idénticos no aparece totalmente similares en cualquier punto durante el ciclo cardíaco, rebanadas juntos con un tamaño suficientemente pequeño paso (por ejemplo20 μm y 50 μm) habrá pronunciado semejanzas en correlación máxima de valor que puede traducirse en coincidencia de fases.
    11. Repita el paso 6.2.9-6.2.10 para todos los sectores.
    12. Contraer la reconstrucción 3D toda en un formato 3D único de archivo de imagen etiquetado (TIF) que contiene rebanadas de z y t marcos o en una pila de archivos DICOM.
      Nota: Los datos se pueden clasifica en cada dimensión para reducir el tamaño, aumentar la relación señal a ruido y generar datos isotrópicos (resolución en el plano es generalmente superior a la resolución de la hacia fuera-de-plano varios pliegues).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Espacio intrapericárdico en el axolotl es dependiente en el tamaño del animal. Animales más pequeños (2-20 g, 7-15 cm) tendrá un exceso de líquido pericárdico (aparece oscura en ecocardiografía) que rodean que el cardiaco cámaras mientras que en animales sexualmente maduros más grandes (> 20 g, > 15 cm) las cámaras ocupan la mayor parte de la intrapericardial espacio. Para proporcionar la mejor descripción para obtener resultados representativos de vistas ecocardiográficas del corazón ajolote, un animal más pequeño (10 g, 10 cm) se aplicó para la figura 3, figura 4, figura 5y figura 9.

La vista de eje largo generalmente proporciona una buena descripción de la anatomía cardíaca en el axolotl. Entrando en el plano de la línea media con el seno venoso, aurículas y parte del ventrículo en plano (Figura 3A, B, 2 archivo complementario), el plano ventricular (figura 3–H) o el plano auricular (Figura 4A –D) se puede llegar por traducir el transductor hacia la derecha o izquierda del animal, respectivamente. El ventrículo aparece muy trabeculada y esférica (figura 3, 3 archivos complementarios–5), mientras que las aurículas tienen una forma más irregular y casi sin trabeculación (Figura 4A, Archivo complementario 6, archivo suplementario 7). La vista de eje corto (figura 5A, B, 10 archivo suplementario) ofrece una visión menos fácilmente interpretable de la anatomía cardíaca de los axolotl corazón, sin embargo contribuye a la evaluación de la contracción cardiaca correcta (p. ej. aquejada de un infarto o no zonas del ventrículo circular se visualizan claramente en este plano de la vista). En el plano de la vista de eje largo, el centro de la zona de la salida esté cerca al centro del ventrículo (figura 2Ay figura 3 con figura 4E y complementario 3 archivo con 8 archivo suplementario en comparación ). Ya que el tejido blando de la zona de la salida serán movibles sobre la eyección de sangre, la señal de la sangre de alta intensidad durante un ciclo cardíaco medido por Doppler de la onda de pulso en el eje y el plano oblicuo paragill se va unida por el ruido de baja intensidad de la movimientos de los tejidos blandos circundantes (zona gris que rodea el área blanca en la curva de velocidad/tiempo en la figura 4 y figura 5E). Generalmente, el contraste entre la señal de sangre y el tejido blando ruido debe ser lo suficientemente grande para segmento sólo la señal de la sangre al medir integral tiempo velocidad (figura 4 (ampliación de g1) y figura 5E (ampliación e1)).

Para la evaluación cualitativa de los patrones de flujo de sangre, color Doppler y la proyección de imagen Doppler poder proporcionar visualizaciones de los patrones de flujo en diferentes cámaras cardiacas (ventrículo: figura 3E–H, 4 archivo complementario, Archivo suplementario 5; ATRIA: figura 4 C, D, 7 de archivo adicional; tracto de salida: figura 4F figura 5 D, 9 archivo complementario, suplementario archivo 12).

Axolotl utilizados para la experimentación de laboratorio varía en tamaño desde la primera etapa larval post de 2-4 g a la plena madurez en 10-30 g y animales más grandes, de peso > 100 g. Asimismo, dependen de la función cardiaca y algunos valores absolutos de los parámetros funcionales que se describe aquí en el tamaño de los animales. En general, cambio de área fraccional es constante en grupos de diverso tamaño con valores que van en el 40-50% (sesgado hacia valores más bajos para los animales más grandes). Volumen de movimiento es altamente dependiente del tamaño del animal, es decir, el tamaño del corazón, que van desde por ejemplo, 20-30 μL en axolotl 5 g 50-70 μl en axolotl de 10 g y 250-300 μL en axolotl 50 g. Frecuencia cardíaca y a cierto volumen de carrera de grado son altamente dependientes de la anestesia aplicada y el nivel de anestesia (figura 6A–F, figura 7).

Análisis intra/inter-operator/observador tradicional consiste en representaciones gráficas (parcelas parcelas Q-Q y Bland-Altman) y pruebas de igual media (t-test) y varianza (F-prueba) para evaluar la distribución normal de datos y comparar exactitud y precisión entre dos personas (figura 6).

Ecocardiografía 3D añade una dimensión adicional (z o profundidad) para la adquisición 2D tradicional. Esto permite una visualización multi-planar de los datos (Figura 9A), reslicing (figura 9B), reconstrucciones de superficie y volumen (figura 9, complementarios archivo 13y 14 de archivo complementario) y segmentación y generación de modelos 3D (figura 9 C, 15 archivos complementarios).

Figure 1
Figura 1. Preparación de cama y contenedor para ecocardiografía de anestesiados y sin anestesiar axolotl. (A) A suave trozo de tela doblado una vez y enrollado en forma de "burrito". (B) los extremos doblados hacia atrás y con cinta para formar una cama con forma de labio para el ajolote durante la exploración submarina. (C) para la ecocardiografía 2D y 3D de un axolotl anestesiado, el animal se coloca suavemente en una posición supina en la grieta del labio en forma de cama y fija con bandas de goma sobre la región mediados de-de la mandíbula y el sacra. (D, E) Una hamaca es elaborada por tallar hacia fuera un agujero cuadrado en un pedazo de espuma de poliestireno y grabar una película para la superficie superior. (F) para la ecocardiografía 2D de un axolotl sin anestesiar, el animal es colocado en una posición propensa natural en la hamaca y se acercó con una punta de transductor cubierto de gel de debajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Colocación de transductor. (A, B) Modelo de la red arterial en el axolotl con la posición aproximada del transductor de eje largo y eje corto vista (A) y oblicua paragill (B). Transiluminación (C) con una fuente potente de luz fría puede ayudar a encontrar la ubicación exacta de los compartimientos cardiacos antes de aplicar el transductor (véase la archivo adicional 1). Las abreviaturas anatómicas: A, atria; OFT, tracto de salida; SinV, seno venoso; V, ventrículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Vistas ecocardiográficas representante eje largo del ventrículo. (A, B) Típica de eje largo de la línea media vista en modo B (línea amarilla en la figura 2A) en el telediastólico ventricular (A) y telesistólico (B) fases (ver 2 archivos complementarios para representación video). (C, D) Vista de eje largo del ventrículo en modo B (línea negra en la figura 2A) en el telediastólico ventricular (C) y telesistólico (D) las fases (ver 3 archivos complementarios para representación video). (E–H) Plano de visualización similar como en (A) y (B) en color Doppler (CD) y el power Doppler (PD) modo demostrar sangre flujo (ver complementarios archivo 4 y 5 de archivo complementario para representación video de - y PD-modo de CD, ««««respectivamente). Colores rojos en imágenes en modo CD indican sangre que fluye hacia el transductor y azul colores indican lo contrario. Cámaras cardiacas y el flujo de sangre se han destacado con líneas punteadas. Ven dibujos animados insertados en (A) y (C) Mostrar la colocación de transductor y de traducción en relación con la línea media del eje largo. Las abreviaturas anatómicas: A, atria; DC(L), a la izquierda del conducto de Cuvier; OFT, tracto de salida; SinV, seno venoso; V, ventrículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Vistas ecocardiográficas representante eje largo de las aurículas y la salida de la zona. (A, B) Vista de eje largo de las aurículas en modo B (línea verde en la figura 2A) en el auricular telediastólico (A) y telesistólico fases (B) (ver 6 de archivo complementario para representación video). (C, D) Plano de visualización similar como en (A) y (B) en modo Doppler (CD) de color que demuestra sangre flujo (ver 7 de archivo adicional de vídeo representación). Vista de eje largo (E) de la zona de salida en modo B (línea azul en la figura 2A) en la fase de eyección media (ver 8 de archivo complementario para representación video). F: Plano de visualización similar en (E) en sangre que demuestra de modo CD flow (ver 9 de archivo complementario para representación video). Plano de visualización Similar (G) como (E) y (F) de la onda Doppler (picovatio) pulso permitiendo calor tasa detección y velocidad integral (VTI) medida de tiempo para cálculo de volumen de movimiento. Colores rojos en imágenes en modo CD indican sangre que fluye hacia el transductor y azul colores indican lo contrario. Cámaras cardiacas y el flujo de sangre se han destacado con líneas punteadas. Cabezas de la flecha amarilla y roja indican válvulas semilunares en la raíz de la zona de salida y la válvula espiral en el tracto de salida, respectivamente. Ven dibujos animados insertados en (A) y (E) Mostrar colocación de transductor y de traducción en relación con la línea media del eje largo. Las abreviaturas anatómicas: A(R), aurícula derecha; Max-a, izquierda atrio; OFT, tracto de salida; SinV, seno venoso; V, ventrículo; VC, la vena cava. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Representante eje corto y oblicuo paragill vistas ecocardiográficas del tracto del ventrículo y de la salida. (A, B) Vista de eje corto del ventrículo en modo B (línea gris en la figura 2A) en el telediastólico ventricular (A) y telesistólico fases (B) (ver 10 de archivo complementario para representación video). (C) vista de paragill oblicua de la zona de salida en modo B (línea púrpura en la figura 2B) en la fase de eyección media (ver 11 de archivo complementario para representación video). (D) del plano de visualización Similar, como en (C) en la sangre que demuestra de modo CD flow (ver 12 de archivo complementario para representación video). Plano de visualización Similar (E) como en (C) y (D) en la onda Doppler (picovatio) pulso permitiendo calor tasa detección y velocidad integral (VTI) medida de tiempo para cálculo de volumen de movimiento. Colores rojos en imágenes en modo CD indican sangre que fluye hacia el transductor y azul colores indican lo contrario. Cámaras cardiacas y el flujo de sangre se han destacado con líneas punteadas. Ven dibujos animados insertados en (A) y (C) Mostrar la colocación de transductor y de traducción en relación con la línea media del eje largo. Las abreviaturas anatómicas: A, atria; OFT, tracto de salida; SinV, seno venoso; V, ventrículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Resultados representativos de medición de volumen cardíaco y accidente cerebrovascular, el efecto de la anestesia y análisis intra/inter-operator/observador representante. (A–C) Frecuencia cardiaca (FC) en relación con la línea de fondo sin anestesiar trazar en el tiempo (0 h está en anestesia completa) para seis axolotl anestesiados en benzocaína (un), MS-222 (B) y propofol (C). (FdeD–) Volumen (SV) en relación con la línea de fondo sin anestesiar conspiró con el tiempo (0 h está en completa anestesia) para seis axolotl anestesiados en benzocaína (D), MS-222 (E), del movimiento y del propofol (F). (G) análisis Intra/inter-operator/observador de volumen sistólico. Diagramas de Bland-Altman [diferencia (Dif) entre operadores (Op) / observadores (Obs) conspiraron contra promedio (Avg)] no debe revelar ningún sesgo sistemático en las mediciones normalmente distribuidas (parcelas Q-Q) obtenida por distintos operadores y observadores. Prueba de igual media (t-test) y varianza igual (F-prueba) no debe revelar ninguna diferencia significativa entre los operadores/observadores (cuadro en la parte inferior derecha). A - F fue modificado de material disponible bajo la Creative Commons Attribution License (figura 1 de Asturicense et al. 21). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Comparación de volumen de movimiento estimado por la geométrica y la onda de pulso Doppler método. Comparación de volumen sistólico (SV) estimada por mediciones de geométrica (geo) B-modo bidimensionales o pulso onda Doppler las mediciones en la velocidad de la sangre salir de la zona de salida. SV(GEO) y SV(pw) se registran en los mismos seis animales segundos entre los tipos de dos medición y utilizando tres diferentes anestésicos benzocaína (cuadrados azules inclinados), MS-222 (cuadrados rojos) y el propofol (triángulos verdes) con una semana de recuperación entre la aplicación de los diferentes anestésicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8. Correlación de imagen representativa espacio-temporal para la ecocardiografía 3D. (A) curva de representación de los valores de correlación rendido de una operación de correlación en un conjunto de datos de cine de 1.000 marco con 75 frames por ciclo cardiaco. Dos marcos con sólo pequeñas diferencias, que indica coincidencia de fases cardiacas, producirá un valor de correlación alto. Posteriormente un local maxima búsqueda algoritmo puede ser aplicado en los datos para detectar todos los marcos correspondientes. (B) representación gráfica de los mismos como en (A). Cuando se obtienen valores de correlación al comparar el primer ciclo cardiaco con la pila de todo cine, líneas diagonales de máxima correlación indican coincidencia de fases cardiacas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9. Ecocardiografía 3D representante. (A) vista multi-planar de corazón 3D reconstruido axolotl. El procedimiento de correlación espacio-temporal de la imagen permite la reconstrucción de un ciclo cardiaco completo con varias fases distintas (aquí las 70 fases) en tres dimensiones espaciales que luego ser cortadas como para investigación deseada de fenómenos espacio-temporales en el corazón. (B) tres rebanadas transversales del 115 reconstruida rebanadas de datos 3D. La cuadrática promedio procedimiento realza el contraste de la sangre al tejido y disminuye el cociente signal-to-noise que permite una mejor apreciación de la naturaleza trabeculada del ventrículo axolotl y una clara visualización del septo interauricular y la válvulas en el tracto de salida. (C) superficie y volumen de las representaciones del corazón en tres fases a lo largo de un código de color segmentada modelo (ver complementarios archivo 13 y 14 de archivo complementario para videos representaciones de la superficie y el volumen representa a corazón y 15 archivo complementario para un modelo 3D interactivo segmentado de tres fases). Las abreviaturas anatómicas: A, atria; Cau, caudal; CRA, craneal; DEX, dexter (a la derecha animal); Dor, dorsal; OFT, tracto de salida; Pecado, siniestro (a los animales de izquierda); SinV, seno venoso; V, ventrículo; Ven, ventral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1. La transiluminación para localizar cavidades cardiacas en laaxolotl. Ver figura 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo adicional 2. De eje largo, media vista, modo B. Vea la Figura 3A, B. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3. Eje largo, vista ventricular, modo B. Ver figura 3, D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo adicional 4. Eje largo ventricular vista, modo Doppler Color. Ver figura 3E, F. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5. Eje largo ventricular vista, modo Doppler de poder. Ver figura 3, H. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6. Eje largo, la vista, modo B. Ver Figura 4A, B. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 7. Eje largo, la vista, modo Doppler Color. Vea la figura 4, D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 8. Eje largo, vista del tracto de salida, modo B. Ver figura 4E. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo adicional 9. Eje largo, vista del tracto de salida, modo Doppler Color. Ver figura 4F. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 10. Eje corto, vista ventricular, modo B. Ver figura 5A, B. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 11. Paragill oblicuo, vista del tracto de salida, modo B. Ver figura 5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 12. Paragill oblicuo, vista del tracto de salida, modo Doppler Color. Ver figura 5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 13. Representación de superficie tridimensional de vencer a corazón en 70 fases (19,6 ms resolución temporal). Ver figura 9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 14. Representación de volúmenes tridimensionales de vencer a corazón en 70 fases (19,6 ms resolución temporal). Ver figura 9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 15. Modelo interactivo tridimensional de vencer a corazón en 3 fases: final-sístole Ventricular y eyección media del ventrículo ventricular telesístole. Ver figura 7. El archivo PDF interactivo debe verse en Adobe Acrobat Reader 9 o superior. Para activar la función 3D, haga clic en el modelo. Utilizando el cursor, ahora es posible girar, zoom, pan el modelo, y en el árbol modelo todos los segmentos del modelo pueden encenderse/apagarse o transparentes. El árbol del modelo es una jerarquía que contiene varias capas de sub que se pueden abre (+). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 16. Representante anotado script para calcular el valor de la correlación de una adquisición de 1.000 marcos con una valoración superior del ciclo cardíaco Marcos 75. El guión está escrito en lenguaje de macros IJ1 y puede aplicarse como un macro lote de ImageJ para calcular valores de correlación (75.000 por adquisición) un entero z-pila de datos 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 17. Representante de script para detección de pico automático en una serie de valores de la correlación de una adquisición de 1.000 marcos con una estimación superior de 75 ciclo cardíaco Marcos. La serie de los valores de correlación (columna B, marcados en amarillo) puede ser sustituida y después de la activación de la macro (Ctrl + r) la lista de comandos para seleccionar juego cardiacas fases y realizar un promedio cuadrático será mostrado (columna Q, marcado en verde). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 18. Representante anota script seleccionar juego cardiacas fases y realizar promedio cuadrático de una adquisición de 1.000 marcos con una estimación superior de 75 ciclo cardíaco marcos (columna Q en 17 archivos complementarios). El script está escrito en lenguaje de macros IJ1 y puede ser implementado como una macro en ImageJ para crear un conjunto promediado una rebanada 2D de ciclo (75 fases). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 19. Representante anotado script para calcular el valor de la correlación entre un sector de referencia de 70 Marcos y una rebanada de prueba adyacentes 75 frames. El guión está escrito en lenguaje de macros IJ1 y puede aplicarse como una macro en ImageJ para calcular los valores de correlación (5.250). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 20. Comandos Excel representante para la detección de pico automático en una serie de valores de la correlación de una comparación entre un sector de referencia de 70 Marcos y una rebanada de prueba adyacentes 75 frames. La serie de los valores de correlación (columna C, marcados en amarillo) puede ser sustituida y después de la activación de la macro (Ctrl + t) muestra la lista de sectores para ser seleccionado como un substack en la prueba de la rebanada (columna L, fila 2, marcado en verde). El substack de corte de prueba tendrá coincidencia espacial de fotogramas en el segmento de referencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ecocardiografía en el ajolote y otras especies de animales no mamíferos produce fundamentalmente diferentes datos de la ecocardiografía de mamífero debido a la naturaleza nucleada de glóbulos rojos en todos los vertebrados excepto mamíferos adultos. Esto resulta en una señal de sangre pronunciado y menos sangre al tejido contraste en imágenes ecocardiográficas axolotl en comparación con e.g., ratón o humana ecocardiografía. Esto puede hacer segmentación de imágenes de ultrasonido solo más difícil ya que puede ser difícil distinguir la sangre del tejido. Sin embargo, este fenómeno puede ser ventajoso cuando se utiliza para crear sangre señal imágenes mejoradas mediante la aplicación de la cuadrática promedio procedimiento describen previamente18 y modificación para ecocardiografía de ajolote en protocolo sección 6. Manchas de sangre son mucho más dinámicos que los que se encuentran en los tejidos blandos, promedio cuadrático generará pronunciado contraste entre estos dos compartimientos que facilita la segmentación de la imagen en dos y tres dimensiones.

Este protocolo describe tres diferentes anestésicos para el ajolote que ha sido completamente probados previamente21. Benzocaína y MS-222 estimulan un aumento en ritmo cardíaco, que puede ser deseable cuando la función cardiaca bajo condiciones de estrés. Propofol induce menos estrés para el corazón durante la anestesia y puede utilizarse como una sustitución para la ecocardiografía sin anestesiar en situaciones donde el tiempo de la adquisición supere los límites de sedentarismo en axolotl sin anestesiar.

La ecocardiografía 2D que describe el corazón 3D es afectada por la subjetividad. Por lo tanto, es imperativo a la conducta y el análisis intra/inter-operator/observador antes de llevar a cabo un experimento real como se describe en la sección 5 de protocolo. Además, las mediciones ecocardiográficas deberían considerarse más valores de índice que pueden aplicarse para investigar las posibles diferencias en la función cardiaca bajo diferentes circunstancias, en lugar de valores absolutos. El volumen de movimiento determinado por la ecuación geométrica (ecuación 2) rara vez rinde el mismo valor absoluto que la onda de pulso Doppler ecuación (ecuación 4; Figura 7), y debe ser decidido que miden a adherirse a toda una serie de experimentos. El SV(geo) puede obtenerse más rápidamente que la SV(pw), sin embargo la asunción esférica de la forma ventricular sólo se aplica a contratantes uniformemente corazones sanos, y en modelos de enfermedad y de la regeneración, SV(pw) deben ser considerados para un mejor reflejo de el volumen de movimiento verdadero.

La correlación y cuadrática con un promedio de procedimiento de la sección de protocolo 6 pueden implementarse en varios paquetes matemáticos y diferentes imágenes. Puesto que las habilidades de programación y acceso a paquetes de software varían mucho dentro de los investigadores de Ciencias de la vida, nos hemos esforzado para proporcionar guiones representativos para los métodos en paquetes de software que la mayoría de los investigadores esté familiarizada con (e.g., Excel) que son abordados fácilmente y libremente disponible (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Archivos complementarios 16 - 20 proporcionar scripts ejemplares anotados escritos en lenguaje de macros IJ1 y como .xlsm macros que deben ser comprensibles incluso con mínima experiencia en codificación.

Regeneración del corazón intrínseca es un fenómeno exclusivamente encontrado en el corazón de pequeñas especies (en relación con los humanos), y así las mediciones y la proyección de imagen de la función cardiaca de base y el progreso funcional durante la regeneración es desafiado por el tamaño del corazón y la resolución espacial de la proyección de imagen modalidad aplicada. La proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia ofrece un deseable equilibrio entre una alta resolución espacial en el plano (~ 30 x 30 μm2 a 50 MHz) que es comparable al µCT en vivo imagen y mucho más alto que µMRI en vivo , que tiene una profundidad de penetración (~ 1 cm a 50 MHz) varias veces más grande que la microscopia confocal y una resolución temporal muy alta (50-300 fotogramas/s a 50 MHz, 1 cm de profundidad). Junto con el manual o automatizado z movimiento dimensional del transductor, el ultrasonido permite una reconstrucción de la función cardiaca y modelado anatómico en cuatro dimensiones. Además, el carácter no invasivo de la técnica permite experimentación longitudinal. A nuestro conocimiento no existen actualmente transductores de matriz de matriz para la proyección de imagen de ultrasonido micro de alta frecuencia. El desarrollo de esta tecnología ayudaría enormemente la adquisición de datos 3D de pequeños corazones como el del ajolote en un procedimiento más rápido que mover mecánicamente el transductor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer Kasper Hansen, Instituto de biociencias, Universidad de Aarhus para proporcionar acceso y asistencia con el micromanipulador electrónico para adquisición ecocardiográfica 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Medicina número 141 ecocardiografía ecografía corazón ecografía cardíaca regeneración ajolote Ambystoma mexicanum correlación espacio-temporal de la imagen
Ecocardiografía 2D y 3D en el ajolote (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter