Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

2D och 3D ekokardiografi i Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Här presenterar vi ekokardiografi protokoll för tvådimensionell och tredimensionell bild förvärv av det pulserande hjärtat av axolotl salamandern (Ambystoma mexicanum), en modell art i hjärtat regenerering. Dessa metoder möjliggöra längsgående utvärdering av hjärtfunktion vid en spatiotemporal högupplöst.

Abstract

Hjärt fel till följd av ischemisk hjärtsjukdom är en stor utmaning och regenerativa behandlingar till hjärtat är i hög efterfrågan. Några modell arter såsom zebrafisk och salamandrar som klarar inneboende hjärtat regenerering håll löftet för framtida regenerativ terapier för mänskliga patienter. Att utvärdera resultatet av cardioregenerative experiment är det absolut nödvändigt att hjärtats funktion kan övervakas. Axolotl salamandern (A. mexicanum) representerar en väletablerad modell art i regenerativ biologi att uppnå storlekar som möjliggör utvärdering av hjärtfunktionen. Syftet med detta protokoll är att fastställa metoder för att mäta reproducibly hjärtfunktion hos den axolotl med ekokardiografi. Tillämpningen av olika bedövningsmedel (bensokain, MS-222 och propofol) demonstreras och förvärvet av tvådimensionella (2D) ekokardiografiska data i både sövda och unanesthetized axolotls beskrivs. 2D ekokardiografi av tredimensionella (3D) hjärtat kan drabbas av vaghet och subjektivitet mätningar, och för att lindra detta fenomen en fast metod, nämligen intra/inter-operator/observatör analys, att mäta och minimera denna bias är visat. Slutligen beskrivs en metod för att förvärva 3D ekokardiografiska data av det pulserande axolotl hjärtat på en mycket hög spatiotemporal upplösning och med uttalad blod-till-vävnad kontrast. Detta protokoll bör sammantaget ger de nödvändiga metoderna för att bedöma hjärtfunktionen och modell anatomi och flow dynamics i den axolotl med ultraljudsundersökningar med program både regenerativ biologi och allmänna fysiologiska experiment.

Introduction

Ischemisk hjärtsjukdom är en ledande orsak till döden i världen1,2. Även om många överlever en hjärtinfarkt på grund av snabb och finjusteras medicinsk intervention, leda ischemiska incidenter i människor ofta till fibrotiska ärrbildning förknippas med hypertrofi, elektriska fel och en minskad funktionell kapacitet av hjärtat . Denna brist på regenerativ potential av hjärtvävnad delas bland däggdjur och även om kontroversiella påståenden om däggdjur hjärtats förnyelse har rapporterats, har varit begränsad till specifika murina stammar3,4 och hypoxi behandlas möss5. Således är fältet hjärt regenerativ medicin och biologi i allmänhet begränsad till icke däggdjur djurmodeller att studera inneboende hjärtat regenerativ fenomen. Zebrafiskar (Danio rerio) har under det senaste decenniet etablerat sig som den mest väl karakteriserade modellen för inneboende hjärtat regenerering6,7,8,9,10 . På grund av lätt laboratorium underhåll, en kort generationstid och ett brett utbud av molekylära verktyg tillgängliga, är zebrafiskar väl anpassad som modell för genetiska och molekylära mekanismer bakom hjärt utveckling och förnyelse. Men minuten måtten på zebrafiskar hjärtat gör den mindre lämpad för funktionell utvärdering och komplicerade kirurgiska ingrepp och icke-idag fylogenin av zebrafiskar begränsar förnuftiga extrapolering av resultaten i denna art, således motiverar användningen av andra större idag modeller. En av de tidigaste modellerna av vertebrate hjärtat förnyelse var ett caudatus amfibie, östra newt (Notophthalmus viridescens)11, en art som förblir en värdefull modell12.

Under senare år en annan caudatus amfibie, den mexikanska axolotl (A. mexicanum) har kommit in på scenen som en stor (upp till 100 g av kroppen massa) och mycket laboratorium anpassningsbar djurmodell för ett brett spektrum av regenerativ discipliner spanning lem förnyelse, ryggmärgsskada och hjärtats förnyelse13,14,15,16,17. Axolotl är mycket mottagliga för funktionella mått på hjärtat med hög frekvens ekokardiografi och avsaknad av förkalkade strukturer på ventrala sida av hjärtat möjliggör ultraljud avbildning med en mycket lägre nivå av bildartefakter (akustisk skuggning och efterklang i synnerhet) än i andra modell djur med förkalkade bröstbenet och revbenen.

Följande protokoll beskriver flera olika metoder och preparat (figur 1, figur 2) att förvärva reproducerbara ekokardiografiska mätningar på axolotl hjärtat både bedövas (tillämpa tre olika bedövningsmedel: bensokain, MS-222 och propofol) och unanesthetized djur i två (bild 3, bild 4, figur 5, figur 6, figur 7, Kompletterande filer 1-12) och tre (figur 8, bild 9, Kompletterande filer 13-14) rumsliga dimensioner. Det amfibiska hjärtat är trekamrat (två atria och en enda ventrikeln). Förmaken levereras av en stor sinus venosus och ventrikeln tömmer in i conus arteriosus utflöde tarmkanalen (figur 2). Eftersom de flesta betoning är traditionellt placerade den ventrikulära förnyelse och mindre på återvinning av atria6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, detta protokoll fokuserar främst på mätningar av vänsterkammarfunktion.

Amfibie ekokardiografi är inte väl beskrivna i litteraturen, och utvecklingen av 2D metoderna som beskrivs i denna uppsats har drivits av att behöva bästa representerar funktionaliteten i det axolotl hjärtat vid en given tidpunkt och experimentell miljö. Metoderna som beskrivs här är således tillämpliga i hjärtat regenerativ experiment där hjärtfunktion kan kontrolleras upprepade gånger under loppet av en återhämtningsprocess. Dessutom kan metoderna som tillämpas i cardiophysiological experiment på axolotl i allmänhet eller modifierats något för att sträcka sig över andra caudatus eller talamancae amfibie modeller (e.g.,Xenopus). Axolotl finns i flera olika stammar och färgvariationer (t.ex., vildtyp, melanoid, vit, albino, transgena vit med grön fluorescens proteinuttryck), men dessa egenskaper påverkar inte huruvida den axolotl med protokollet beskrivs. Den metod som beskrivs här för att förvärva 3D ekokardiografiska data är en modifierad version av spatiotemporal bild korrelation (STIC) tekniken utvecklats för kliniska ultraljud och den kvadratiska genomsnitt metoden som beskrevs tidigare i utvecklingsländer kyckling att förbättra signalen av blod fläckar i mjukdelar i arter som innehåller kärnförsedda röda blodkroppar18,19. Denna metod möjliggör avancerad modellering av hjärtats kontraktion och beräknade fluiddynamik i axolotl hjärtat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De förfaranden som genomförs i detta protokoll var i enlighet med den danska lagstiftningen för skötsel och användning av laboratoriedjur och experimenten godkändes av den danska nationella djur experiment kontrollavdelningen (protokoll nr 2015-15-0201-00615).

1. förberedelser

  1. Förbereda axolotl medium.
    1. Tillämpa hög kvalitet icke-kemiskt behandlat kranvatten som axolotl medium. Om detta inte är tillgänglig, tillämpa 40% Holtfreters lösning.
    2. Förbereda 40% (wt/vol) Holtfreters lösning genom att lösa 15.84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O och 0,288 g KCl i filtrerad och avjoniserat vatten upp till en volym av 1 L.
  2. Gör nedsänkning anestetika.
    1. Förbereda bensokain (etyl-4-aminobensoat) bedövningsmedel lösning genom upplösning 200 mg etanol 4-aminobensoat i 3 mL aceton och sedan upplösa denna blandning i 1 L vatten eller 40% Holtfreter lösning.
    2. Bered MS-222 (etyl 3-aminobensoat methanesulfonic syra, även känd som tricane) narkos genom upplösning 200 mg etyl 3-aminobensoat methanesulfonic syra direkt i 1 L vatten eller 40% Holtfreter lösning.
    3. Förbereda propofol (2,6-diisopropylphenol) bedövningsmedel lösning genom att lösa upp 3,3 mg 2,6-diisopropylphenol i i 1 L vatten eller 40% Holtfreter lösning. Alternativt, späd kommersiellt premade lösningen till 3,3 mg/L.
      FÖRSIKTIGHET: Propofol är en kraftfull mänsklig bedövningsmedel (intravenöst administrerat) och skall hanteras med omsorg, även i utspädd form.
  3. Förbereda säng och behållare för ekokardiografi.
    1. Förbereda lip-formade djur säng för ekokardiografi genom att vika en 70 x 55 cm bit mjuk trasa en gång och sedan rulla in ”burrito form” (figur 1A). Sedan böja över ändarna tills de möts och tejpa dessa grupp (figur 1B).
    2. Dränka läppen formad struktur i axolotl medium att rymma den sövda axolotl under ultraljudsundersökningar. Säkra djur till strukturen och förhindra flytande med löst gummiband; placera dessa mitten-mandibular och över den sakrala regionen (figur 1 c).
      Obs: Gummiband bör inte krama djuret eftersom detta påverkar hemodynamiken.
    3. För 2D ekokardiografi på unanesthetized axolotls, förbereda en hängmatta av carving en 16 x 8 cm x 5 cm hål i en 33 x 27 cm x 5 cm block av styrencellplast (t.ex., ett lock från en medelstor polystyrenskum behållare) (figur 1 d).
    4. Skjut en 33 x 27 cm bit plastfolie genom hålet och fäst kanterna på Radbryt till ovansidan av polystyren cellplast blocket (figur 1E) för att skapa en hängmatta. Lägga till axolotl medium 3 cm djup i hängmattan. Den unanesthetized axolotl kommer att sjunka till botten av hängmattan ger enkel ventrala åtkomst genom plast wrap (figur 1F).

2. söva Axolotls

  1. Fördjupa axolotl i önskad smärtlindring lösning (bensokain, MS-222 eller propofol).
  2. Inspektera för första tecken på sedering, minskad rörelser och ökande förlust av rätande reflex, detta verkar inom 10 min i djur < 10 g (< 10 cm) och inom 20 min i djur mellan 10 g och 50 g av kroppsmassa (10-22 cm).
  3. Undersök för total avsaknad av kroppsrörelser, gill ventilation rörelser och rätande reflex, och kontrollera att djuret är icke-lyhörd för måttlig smärta stimulering testas genom att nypa väven mellan siffror.
    Obs: trots att narkos åstadkoms inom 30 min i bensokain sövda axolotls, hjärtfunktion inte stabiliseras fram till 1 tim. Detta är inte fallet i MS-222 eller propofol sövda axolotls (figur 6A-F).
  4. För att bibehålla axolotl under narkos, förvara djur i anestesi lösning eller insvept i vått papper våtservetter fuktad i anestesi lösning.
    Obs: Anestesi kan bibehållas för 7 h utan negativa effekter på djurens välbefinnande med tanke på att huden och särskilt gälarna hålls fuktig.
  5. För att reawake axolotl, överföra djuret till anestesi-fri medium.
    Obs: Det första tecknen på uppvaknande är gill ventilation rörelser. Djur bör vara upprätt och lyhörd till stimulering inom 1 h.

3. 2D ekokardiografi på sövda Axolotl

  1. Plats sövda axolotl i ryggläge i lip-formade djur sängen (steg 1.3.1-1.3.2). Säkra den från flytande med löst gummiband (figur 1 c). Säkerställa att bröstkorg ytan är täckt av 3-5 mm av medium.
    Obs: För en kort förvärv (< 5 min) bedövningsmedel-fri medium kan tillämpas. För långvarig förvärv, bör bedövningsmedel lösning tillämpas som ultraljud medium att säkerställa stabila hjärtfunktionen under mätningarna.
  2. Placera givaren över mittlinjen av djuret i bröstkorg regionen parallellt med den långa axeln av djuret (figur 2A, figur 3A-B, kompletterande fil 2). Använda genomlysning med en kall ljuskälla på vitt och albino axolotls för att säkerställa korrekt placering av givaren (figur 2 c och kompletterande fil 1).
    1. För axolotls väger < 20 g, Använd en givare med 50 MHz; för axolotls > 20 g, använda en 40 MHz-givare. Säkerställa positionering av kraniala/främre riktning till höger för standardiserade bild förvärv. Om detta inte är fallet rotera givaren 180 ° eller invertera bilden.
  3. Kontrollera att en liten del av ventrikeln (placerad till höger i brösthålan, figur 2A) i den långa axel mittlinjen Visa, visas i ramen vid ventrikulära diastole och en stor del av vänster och höger förmaken (placerad på center / något åt vänster i brösthålan, figur 2A) och den sinus venosus syns både i förmaksflimmer systole och diastole (figur 3A, B).
  4. Översätt givaren 1-3 mm mot djurets rätt att erhålla vyn ventrikulära långa axeln (figur 2A). Rätt position uppnås när tvärsnittsarean på slutet-systole ventrikeln är vid högsta (figur 3 c-H).
  5. I B-läge, förvärva ≥ 3 hjärt cykler med > 50 bildrutor/s i antingen 'general imaging' (hög spatial/låg temporal upplösning) eller 'kardiologi' (låg spatial/hög temporal upplösning) läge.
    Obs: Den här vyn kan för bedömning av vänsterkammarfunktion. Kammarfunktion kan utvärderas i två dimensioner med ventrikulära fraktionerad området ändringen (FACv) beräknas från slutet-diastoliskt och slutet-systoliskt cross sectional området av ventrikeln (CSAv) med hjälp av ekvation:
    Equation 1(1)
    Den axolotl ventrikeln antar formen av en sfär och en geometri baserat slagvolym [SV(geo)] kan beräknas med hjälp av ekvation:
    Equation 2(2)
  6. Översätt givaren längs den långa axeln av djuret tills mitten av ventrikeln är i mitten av skärmen. Rotera givaren 90 ° medurs för att erhålla vyn mid-ventrikulära korta axeln (figur 5A och B, kompletterande fil 10). Utvärdera den cirkulära formen av ventrikeln genom att översätta givaren längs den långa axeln av hjärtat.
  7. Tillbaka givaren till långa axeln planet och översätta det tillbaka mot mittlinjen eller något till vänster om mittlinjen att erhålla vyn förmaksflimmer långa axeln två kammare (figur 2A). Kontrollera att rätt position uppnås genom att bekräfta att tvärsnittsarea för slutet-systole förmaken är på deras maxima och två atria kombinerat antar konturerna av numret '8' lutas ~ 45 ° åt vänster (figur 4A och B, Kompletterande fil 6).
  8. I B-läge förvärva ≥ 3 hjärt cykler med > 50 bildrutor/s i antingen 'general imaging' eller 'kardiologi' läge.
    Obs: Den axolotl atria är oregelbundna i formen och 3D-funktionen inte kan direkt härledas från 2D data, således deras funktion måste utvärderas som index åtgärd såsom förmaksflimmer fraktionerad området chans (Fors) baserat på kombinerade cross sectional området (CSAa) av båda förmaksflimmer kammare i systole och diastole:
    Equation 3(3)
  9. Översätt givaren åt höger tills den utflöde tarmkanalen (conus arteriosus) visas (nära vyn ventrikulära långa axeln) (figur 2A).
    Obs: Efter att ha lämnat ventrikeln i anterior riktning, den utflöde tarmkanalen gör en skarp böj och körs i en liten vinkel mot den ventrala ytan före igen förutsatt att en främre riktning och dela i gill grenar och systemisk fartyg.
    1. Kontrollera att vyn rätt utflöde tarmkanalen uppnås genom att bekräfta att diametern på utflödet är vid högsta vid ventrikulära slutet-systole och två av de tre semilunar ventilerna vid infarten till utflödet är synliga på mitten av utmatning (figur 4E, Kompletterande fil 8).
      Obs: Den ventrala riktningen mot givaren för den mellanliggande delen av utflöde tarmkanalen tillåter för hastighet och flöde mätningar med hjälp av Doppler imaging.
  10. Applicera färg Doppler-läget för att mappa blod flödeshastigheter i utflödet tarmkanalen under hjärt utmatning (figur 4F och kompletterande fil 9). Jämväl gälla färg Doppler och Power Doppler imaging för att visualisera blodflödet i vyerna ventrikulära och förmaksflimmer (figur 3E-H, Kompletterande filer 4-5 och figur 4 c-Doch kompletterande fil 7).
  11. Tillämpa Pulse Wave (PW) Doppler-läge på positionen för maximal blod hastighet i del av utflöde tarmkanalen kör mot givaren.
    1. Använd 'spridningsvinkel' och 'vinkelkorrigering' upp till 45 ° att justera för utflödet inte är helt vinkelrät mot ansiktet av givaren (figur 4 g). Kontrollera att PW Doppler position inte överlappas av spiral ventilen av utflödet under någon fas av hjärt cykeln (figur 4E).
  12. I PW Doppler-läge uppkopplingstyp hastighet och tid över ≥ 3 hjärt cykler.
  13. Tillbaka till B-läge och förvärva ≥ 3 hjärt cykler vid exakt samma plan som PWV förvärvades.
  14. Mäta hastighet tiden integrerad (VTI) av blodflödet i utflödet tarmkanalen som arean under kurvan för hastighet och tid för en full hjärt cykel (figur 4 g, g1).
    Obs: Från VTI och diameter (d) av utflöde tarmkanalen på slutet-systole erhålls från förvärvet av B-läge, en PW Doppler baserat slagvolym [SV(pw)] kan beräknas med hjälp av ekvation:
    Equation 4(4)
    Pulsen (HR) mäts från velocity/tidskurvan genom mätning av varaktigheten av en hela hjärt cykeln. Hjärtminutvolym [CO(pw)] beräknas med hjälp av ekvation:
    Equation 5(5)
  15. Få den sneda paragill Visa, en vy som erbjuder ett alternativ för mätning av blod flödeshastigheten i utflödet tarmkanalen, genom att vrida axolotl 90 ° i läppen formade säng på ett sådant sätt att den högra delen av djuret är vänd uppåt (figur 2B). Vinkla och vrida givaren placera den parallella och bara posteriort utstående gälarna (figur 2B). Kontrollera att rätt position uppnås genom att bekräfta att den utflöde tarmkanalen körs nedåt på ~ 45 ° och att förmaken visas under den utflöde tarmkanalen under utmatning (figur 5 C, kompletterande fil 11).
  16. Tillämpa PW Doppler-läge på positionen för maximal blod hastighet i del av utflöde tarmkanalen körs bort från givaren (figur 5 d, kompletterande fil 12). Använd 'spridningsvinkel' och 'vinkelkorrigering' upp till 45 ° att justera för utflödet inte är helt vinkelrät mot ansiktet av givaren (figur 5E).
  17. I PW Doppler-läget förvärva blod hastighet över ≥ 3 hjärt cykler.
  18. Tillbaka till B-läge och förvärva ≥ 3 hjärt cykler vid exakt samma plan som PWV förvärvades.
    Obs: SV(pw) och CO(pw) beräknas för den sneda paragill vyn med hjälp av ekvation 4 och ekvation 5 som beskrivs ovan för vyn långa axeln.

4. 2D ekokardiografi på Unanesthetized Axolotl

  1. Placera den unanesthetized axolotl i en liggande ställning i hängmattan (steg 1.3.3).
  2. Lämna djuret ostört för 30-60 min att återhämta sig från att hantera stress.
  3. Placera ultraljudstransducern med givaren huvudet uppåt mot axolotl i hängmattan.
  4. Tillämpa ultraljud-gel på givaren.
  5. Försiktigt och utan att störa djuren, placera givaren över mittlinjen av djuret i bröstkorg regionen parallellt med den långa axeln av djuret.
    Obs: Detta är den samma, men inverterad, ståndpunkten när det gäller den sövda axolotl (steg 3,2).
  6. Få B-läge, färg Doppler-läge, PW läge data i den långa axeln och kort axel enligt beskrivningen i steg 3,2-3,14.
    Obs: En sned paragill vy är ouppnåelig i den unanesthetized axolotl. Ekokardiografiska data i unanesthetized axolotls bör förvärvas mellan gill ventilation rörelser (en 10-20 s period för en vila djur). Om en axolotl flyttar under förvärv, skall mätningarna upprepas.

5. utvärdera 2D ekokardiografi Data och minimera subjektivitet

  1. Undvika operatör/observatör bias i 2D ultraljud avbildning och 3D utvärdering av hjärtfunktionen baserat på 2D data som orsakas av subjektivitet i både dataförvärvet och analysfasen data genom att utföra intra/inter-operator/observatör analys20.
    Obs: Start av studier och när utbildning av ny personal detta subjektivitet måste kvantifieras och minimerat med intra/inter-operator/observatör analys.
  2. Initiera intra/inter-operator/observatör analysen i en två person setup med operatören/observatören 1 (mindre erfarna) testas mot operatören/observatör 2 (mer erfarna) genom att utföra ≥ 6 samförstånd mätningar tillsammans, inklusive både bänk arbete på av ultraljud system (drift) och efterföljande analys av relevanta parametrar (observation).
  3. Nå konsensus mellan aktörer och observatörer och driva (operatör/observatör 1) ultraljud systemet att förvärva relevanta data om ≥ 6 djur (verksamhet 1.1).
  4. Direkt efter, driva (operatör/observatör 2) ultraljud systemet att förvärva relevanta data om samma djur (operation 2.1).
  5. Låt djuren återhämta sig i 3 dagar. Därefter upprepa (operatör/observatör 1) proceduren (verksamhet 1.2).
  6. Analysera (operatör/observatör 1) alla uppmätta data (verksamhet 1.1/observation 1.1; drift 2.1/observation 1.1; åtgärd 1.2/observation 1.1) och efter 24 h Upprepa analysen av operatören/observatör 2 data (åtgärd 2.1/observation 1.2).
  7. Analysera (operatör/observatör 2) de uppgifter som erhållits av henne själv (åtgärd 2.1/Anmärkning 2.1). Observera att de värden som erhålls av denna analys anses närmast sanna värden.
  8. Utvärdera variation, tendenser och partiskhet i jämförelser mellan alla förvärvade parametrar med hjälp av intetsägande-Atman plottning, QQ plottning, t-test (lika medelvärde) och F-test (med lika varians) (figur 6 g).
    1. Observera att åtgärd 1.1/observationen 1.1 kontra drift 2.1/observation 1.1 jämförelse visar Inter operator variationen.
    2. Observera att åtgärd 2.1/observationen 1.1 kontra drift 2.1/observation 2.1 jämförelse visar variationen mellan observatör.
    3. Observera att åtgärd 1.1/observationen 1.1 kontra åtgärd 1.2/observation 1.1 jämförelse visar intra-operatör variationen.
    4. Observera att åtgärd 2.1/observationen 1.1 kontra drift 2.1/observation 1.2 jämförelse visar intra-observer variationen.
  9. Kontrollera att medelvärde och variation av de olika mått är icke-signifikant olika för fyra jämförelser; skillnaden mellan uppmätta värden bör falla inom ± 1,96 standardavvikelser, och det bör visas inga tendenser till mindre precision av varken små eller stora värden.

6. 3D ekokardiografi på sövda Axolotl

  1. 3D förvärv
    1. Placera den sövda axolotl i ryggläge i lip-formade djur sängen (steg 1.3.1). Säkra den från flytande med löst gummiband (figur 1 c) och kontrollera att bröstkorg ytan täcks av 3-5 mm av medium. 3D förvärv är en långdragen procedur, därför gäller bedövningsmedel lösning som ultraljud medium att säkerställa stabila hjärtfunktionen under mätningarna.
    2. Placera givaren över mittlinjen av djuret i bröstkorg regionen antingen parallellt med den långa axeln av djuret (för en sagittal 3D inspelning) eller ortogonal mot den långa axeln (övergripande 3D inspelning).
    3. Översätt givaren i dimensionen i-plane (x och y) och out-av-plane dimensionen (z eller slice) att säkerställa att hela hjärt regionen kommer att täckas i det efterföljande 3D-fångst.
    4. Justera bildhastighet och rumslig upplösning som önskas genom att välja antingen 'general imaging' (hög spatial/låg temporal upplösning) eller 'kardiologi' (låg spatial/hög temporal upplösning) läge. För 0.33 Hz < HR < 1 Hz använda en temporal upplösning av 50 bildrutor/s erhålls vid hög rumslig upplösning ('allmän imaging') som möjliggör hjärt cykeln ska rekonstrueras i 50-150 skilda faser.
    5. Justera '2D förstärkning' till en nivå där anatomiska strukturer är knappt igenkännlig i raw B-läge-bilden (~ 5 dB) att öka signal-till-brus-förhållande i de slutliga rekonstruktionerna.
    6. För varje skiva (z steg), registreras ≥ 1000 ramar.
    7. Översätt givaren ett z steg i taget, t.ex., 20 µm eller 50 µm och upprepa inspelningen tills hela hjärt regionen är täckt.
  2. 3D rekonstruktion (kompletterande filer 13 och 14).
    1. Exportera förvärv in i Digital Imaging and Communications i medicin DICOM (little endian).
      Obs: Varje skiva som innehåller ett visst antal ramar kommer att komponera en enda fil.
    2. Bestämma antalet bildrutor i en full hjärt cykel. Som HR kan variera över tid, Bestäm detta för både först och sista skiva. Ange det högsta antalet bildrutor per cykel som den ursprungliga övre uppskattningen av fas upplösning som senare kan minskas (steg 6.2.8).
    3. Bestämma gröda gränser och punktskatt irrelevant utrymmet kring fönstret B-läge.
      Obs: Dessa gränser bör vara konstant under hela skivor.
    4. Omvandla RGB-färg bilden till 32-bitars.
    5. Beräkna värdet korrelation (C) för varje bildruta i stacken och antalet ramar som ingår i den första hjärta cykeln med hjälp av formeln:
      Equation 6(6)
      Obs: Här Equation 7 är signal intensiteten i pixeln på koordinaten (i, j) i den första bilden Equation 8 och är samma i den andra bilden, Equation 9 , Equation 10 och Equation 11 , Equation 12 är den genomsnittliga intensitet och standard avvikelse, respektive av första och andra bilden i jämförelse, och jag och J är antalet kolumner och rader i bilden. Matrisen av korrelation värden måste storleken på produkten av antalet bildrutor per hjärt cykel och det totala antalet bildrutor per skiva (t.ex., 75 × 1000 = 75.000 i figur 8) (se exemplariskt skriptet i tilläggs Fil 16). Det correlation-värdet kan inte beräknas om en eller båda av bilderna i jämförelsen har en standardavvikelse på pixelvärden noll, men detta är högst osannolikt i ultraljud bilder.
    6. Upptäcka lokala maxima i matrisen med korrelation värden (figur 8A, se exemplariskt skript i kompletterande fil 17 att automatiskt upptäcka lokala maxima).
    7. Beräkna kvadratisk genomsnittliga Q(AVG) av ramar med toppvärden korrelation (dvs, matchande hjärt faser) med hjälp av formeln:
      Equation 14(7)
      där N är det totala antalet ramar med matchande hjärt faser, Equation 15 är intensiteten i pixeln på koordinaten (i, j) nth bilden och Equation 16 är det temporal aritmetiska medelvärdet av Equation 17 av Nilssonth bilden (se exemplariskt skript i kompletterande fil 18).
    8. Upprepa steg 6.2.3-6.2.7 för alla segment.
    9. Markera ett segment (referens skiva) med lätt igenkännliga anatomiska strukturer (t.ex., mitten-ventrikulär) och kontrollera om den rekonstruerade ensemblen i genomsnitt en hjärt cykel motsvarar exakt en cykel (dvsom det finns ytterligare faser resulterar i fler än en hjärt cykel). Ta bort ytterligare faser för att ge exakt en hjärt cykel (t.ex., kommer från en överskattade 75 faser/cykel (i verkligheten, 1,07 cykel) i figur 8 att exakt en cykel som innehåller 70 faser i figur 8).
    10. På närliggande skiva (test skiva), sortera ensemblen i genomsnitt en hjärt cykel t-stack i matchande hjärt faser med referens segmentet med hjälp av korrelation värde formeln (ekvation 6) (se exemplariskt scripts i kompletterande fil 19 och kompletterande fil 20).
      Obs: Även om två icke identiska skivor inte visas helt liknande när som helst under hjärt cykeln, angränsande skivor med en tillräckligt små stegstorlek(t ex20 µm eller 50 µm) kommer har uttalat likheter vilket resulterar i samband värdet maxima som kan översättas i matchande faser.
    11. Upprepa steg 6.2.9-6.2.10 för alla segment.
    12. Kollaps av hela 3D rekonstruktion i ett enda 3D Tagged Image File format (TIF) innehållande z skivor och t ramar eller i en bunt med DICOM-filer.
      Obs: Data kan kastas i varje dimension att minska storlek, öka signal-brus-förhållande och generera isotropiskt data (i-plane upplösning är oftast flera veck högre än ute-av-plane upplösning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intraperikardiell utrymme i axolotl är beroende av storleken på djuret. Mindre djur (2-20 g, 7-15 cm) kommer att ha ett överskott av perikardiell vätska (förekommer mörka i ekokardiografi) kring hjärtat kammare medan i större könsmogna djur (> 20 g, > 15 cm) avdelningar kommer att uppta de flesta av de intrapericardial utrymme. För att ge bästa överblick för representativa resultat av ekokardiografiska vyer av axolotl hjärtat, tillämpades en mindre djur (10 g, 10 cm) för bild 3, bild 4, bild 5och figur 9.

Den långa axel vyn ger i allmänhet en god överblick över hjärtats anatomi i axolotl. In på mittlinjen planet med sinus venosus, förmak, och en del av ventrikeln i plan (figur 3A, B, kompletterande fil 2), antingen ventrikulära planet (figur 3 c–H) eller förmaksflimmer planet (figur 4A –D) kan nås genom att översätta givaren till höger eller vänster om djuret, respektive. Ventrikeln visas sfäriska och högt trabeculated (figur 3 c, kompletterande filer 3–5), medan förmaken har en mer oregelbunden form och nästan ingen trabeculation (figur 4A, Kompletterande fil 6, kompletterande fil 7). Vyn kort axel (figur 5A, B, kompletterande fil 10) ger en mindre lätt tolkningsbara översikt av axolotl hjärtats anatomi hjärta, men det bidrar till utvärderingen av rätt hjärtats sammandragning (t.ex. infarcted eller icke avtalsslutande zoner av cirkulär ventrikeln är tydligt visualiserat i detta Visa plan). I den långa axel Visa planet, är centrera av utflöde tarmkanalen placerad nära till centrum av ventrikeln (figur 2Aoch jämför figur 3 c med figur 4E och kompletterande fil 3 med kompletterande fil 8 ). Eftersom den mjuka vävnaden i utflödet tarmkanalen kommer att flytta på blod utmatning, hög intensitet blod signalen under en hjärt cykel mätt puls våg Doppler i både den långa axeln och sneda paragill planet kommer att vara gränsar av lågintensivt buller från den rörelser i omgivande mjukvävnad (grå området kring vita området i hastighet och tid kurvan i figur 4 g och figur 5E). Allmänhet, kontrasten mellan blod signal och mjukvävnad buller bör vara tillräckligt stor för segment ut bara blod signalen när man mäter hastighet tidsintegralen (figur 4 g (g1 förstoring) och figur 5E (e1 förstoring)).

För kvalitativ bedömning av blod flödesmönster, färg Doppler och power Doppler imaging tillhandahålla visualiseringar av flödesmönster i olika hjärtats kammare (ventrikeln: figur 3E–H, kompletterande fil 4, Kompletterande fil 5; Atria: figur 4 C, D, kompletterande fil 7; utflöde tarmkanalen: figur 4F, figur 5 D, kompletterande fil 9, kompletterande fil 12).

Axolotls används för laboratoriet experimenterande varierar i storlek från den tidiga post-larvstadium 2-4 g till full mognad vid 10-30 g och större djur som väger > 100 g. likaså, hjärtfunktion och några absoluta värden av funktionella parametrar beskrivs här beror på storleken på djuren. Allmänhet, fraktionerad området förändring är konstant i olika storlek grupper med värden i intervallet 40-50% (skev mot lägre värden för större djur). Slagvolym är starkt beroende av storleken på djuret, dvs, storleken på hjärtat, allt från t.ex. 20-30 µL i 5 g axolotls, 50-70 µL i 10 g axolotls och 250-300 µL i 50 g axolotls. Puls och till viss grad stroke volym är starkt beroende av det tillämpa bedövningsmedlet och nivån på anestesi (figur 6A–F, figur 7).

Traditionella intra/inter-operator/observatör analys innebär grafiska representationer (Q-Q tomter och Bland-Altman tomter) och testning för lika medelvärde (t-test) och varians (F-testa) att utvärdera normalfördelning av data och jämföra noggrannhet och precision mellan två personer (figur 6 g).

3D ekokardiografi lägger ytterligare en dimension (z eller djup) till mer traditionella 2D förvärvet. Detta möjliggör för flera planar visualisering av data (figur 9A), reslicing (figur 9B), yta och volym rekonstruktioner (figur 9 c, kompletterande fil 13och kompletterande fil 14) och segmentering och generering av 3D-modeller (figur 9 C, kompletterande fil 15).

Figure 1
Figur 1. Beredning av säng och behållare för ekokardiografi av sövda och unanesthetized axolotl. (A) A mjukt tygstycke viks en gång och rullade in ”burrito” form. (B) ändarna är bockade tillbaka och tejpade för att bilda en läpp formade säng för axolotl under undervattens avsökningen. (C) för 2D och 3D ekokardiografi av en sövda axolotl, djuret placeras försiktigt i ryggläge i skreva av läpp formade säng och fast med gummiband över mid-mandibular och sakrala regionen. (D, E) En hängmatta är beredd av carving ut ett fyrkantigt hål i en bit av styrencellplast och tejpning plastfolie på övre ytan. (F) för 2D ekokardiografi av en unanesthetized axolotl, djuret är placerat i en naturlig liggande position i hängmattan och närmade sig med ett gel täckt givaren tips från undersidan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Givarens placering. (A, B) Modell av det arteriella nätverket i axolotl med den ungefärliga platsen för givaren för långa axeln och kort axel (A) och sneda paragill vy (B). (C) genomlysning med en kraftfull kall ljuskälla kan stöd i att hitta den exakta placeringen av hjärtats kammare innan du applicerar givaren (se kompletterande fil 1). Anatomiska förkortningar: A, atria; OFT, utflöde tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Representativa långa axeln ekokardiografiska visningar av ventrikeln. (A, B) Typiska långa axeln mittlinjen vy i B-läge (gula linjen i figur 2A) i ventrikulära slutet-diastoliskt (A) och slutet-systoliskt (B) faser (se kompletterande fil 2 för video representation). (C, D) Långa axeln vy av ventrikeln i B-läge (svart linje i figur 2A) i ventrikulära slutet-diastoliskt (C) och slutet-systoliskt (D) faser (se kompletterande fil 3 för video representation). (E–H) Liknande visningsplanet som i (A) och (B) i färg Doppler (CD) och Doppler (PD) strömläge visar blod flöde (se kompletterande fil 4 och kompletterande fil 5 för video representation av CD - och PD-mode, respektive). Röda färger i CD-läge bilder anger blodet flyter mot givaren och blå färger anger motsatsen. Hjärtats kammare och blodflödet har belysts med streckade linjer. Infogade cartoons i (A) och (C) Visa placeringen av givaren och översättning i förhållande till den långa axeln mittlinjen Visa. Anatomiska förkortningar: A, atria; DC(L), lämnade kanalen av Cuvier; OFT, utflöde tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Representativa långa axeln ekokardiografiska utsikt över atria och utflöde tarmkanalen. (A, B) Långa axeln vy över förmaken i B-läge (gröna linjen i figur 2A) i förmaksflimmer slutet-diastoliskt (A) och slutet-systoliskt (B) faser (se kompletterande fil 6 för video representation). (C, D) Liknande visningsplanet som i (A) och (B) i färg Doppler (CD) läge visar blod flöde (se kompletterande fil 7 för video representation). (E) långa axeln vy av utflöde tarmkanalen i B-läge (blå linje i figur 2A) i mitten av utskjutningen fas (se kompletterande fil 8 för video representation). F: Liknande visningsplanet som i (E) i CD-läge visar blod flöde (se kompletterande fil 9 för video representation). (G) liknande visningsplanet som i (E) och (F) i våg Doppler (PW) pulsläge möjliggör värme hastighet upptäckt och velocity integrerad (VTI) tidmätningen för stroke volymberäkning. Röda färger i CD-läge bilder anger blodet flyter mot givaren och blå färger anger motsatsen. Hjärtats kammare och blodflödet har belysts med streckade linjer. Gula och röda pilen huvuden anger semilunar ventiler vid roten i utflödet tarmkanalen och spiral ventilen i utflödet tarmkanalen, respektive. Infogade cartoons i (A) och (E) Visa placeringen av givaren och översättning i förhållande till den långa axeln mittlinjen Visa. Anatomiska förkortningar: A(R), höger förmak; A(L), vänster atrium; OFT, utflöde tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikeln; VC, vena cava. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Representativa kort axel och sneda paragill ekokardiografiska visningar av ventrikeln och utflöde tarmkanalen. (A, B) Kort axel vy av ventrikeln i B-läge (grå linje i figur 2A) i ventrikulära slutet-diastoliskt (A) och slutet-systoliskt (B) faser (se kompletterande fil 10 för video representation). (C) sned paragill vy av utflöde tarmkanalen i B-läge (lila linjen i figur 2B) i mitten av utskjutningen fas (se kompletterande fil 11 för video representation). (D) liknande visningsplanet som i (C) i CD-läge visar blod flöde (se kompletterande fil 12 för video representation). (E) liknande visningsplanet som i (C) och (D) i våg Doppler (PW) pulsläge möjliggör värme hastighet upptäckt och velocity integrerad (VTI) tidmätningen för stroke volymberäkning. Röda färger i CD-läge bilder anger blodet flyter mot givaren och blå färger anger motsatsen. Hjärtats kammare och blodflödet har belysts med streckade linjer. Infogade cartoons i (A) och (C) Visa placeringen av givaren och översättning i förhållande till den långa axeln mittlinjen Visa. Anatomiska förkortningar: A, atria; OFT, utflöde tarmkanalen; SinV, sinus venosus; V, ventrikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Representativa resultat av mätningar av hjärtfrekvens och stroke volym, effekten av anestesi och representativa intra/inter-operator/observatör analys. (A–C) Pulsen (HR) i förhållande till unanesthetized baslinjen plottas över tid (0 h är på narkos) för sex axolotls sövda i bensokain (A), MS-222 (B) och propofol (C). (D–F) Stroke volume (SV) i förhållande till unanesthetized baslinjen plottas över tiden (0 h är på narkos) för sex axolotls sövda i bensokain (D), MS-222 (E), och propofol (F). (G) Intra/inter-operator/observatör analys av slagvolym. Bland-Altman tomter [skillnaden (Dif) mellan operatörer (Op) / observatörer (Obs) plottas mot genomsnittet (Avg)] bör avslöja inga systematiska bias i normalfördelade mätningar (Q-Q tomter) erhålls genom olika aktörer och observatörer. Testning för lika medelvärde (t-test) och med lika varians (F-testa) bör avslöja inga signifikanta skillnader mellan operatörer/observatörer (tabell i nedre högra hörnet). A - F ändrades från material som är tillgängligt under Creative Commons Attribution License (figur 1 i Thygesen et al. 21). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Jämförelse av slagvolym uppskattas av den geometriska och puls vågen Doppler metod. Jämförelse av Slagvolym (SV) beräknad genom tvådimensionell B-läge geometriska (geo) mätningar eller pulse wave Doppler mätningar på hastigheten av blod spännande utflöde tarmkanalen. SV(geo) och SV(pw) registreras i samma sex djur med sekunder mellan de två mätning-typerna och använder tre olika bedövningsmedel, bensokain (blå lutande torg), MS-222 (röda fyrkanter), och propofol (gröna trianglar) med en vecka av återhämtning mellan tillämpa de olika bedövningsmedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Representativ spatiotemporal bild korrelation för 3D ekokardiografi. (A) kurva återgivning av gav korrelation värden av en korrelation operation i en 1 000 ram cine datamängd med 75 ramar per hjärt cykel. Två ramar med små skillnader, som indikerar matchande hjärt faser, kommer att ge en hög correlation-värdet. Därefter kan en lokala maxima söka algoritmen tillämpas på data att upptäcka alla matchande ramar. (B) grafisk representation av samma data som i (A). När korrelation värden erhålls genom att jämföra den första hjärta cykeln med hela cine stacken, ange diagonala linjer av maximal korrelation matchande hjärt faser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9. Representativa 3D ekokardiografi. (A) flera planar Visa 3D rekonstruerade axolotl hjärta. Spatiotemporal bild korrelation förfarandet gör det möjligt för återuppbyggnaden av en full hjärt cykel med flera distinkta faser (här 70 faser) i tre dimensioner som kan sedan vara skivad som sådana för önskad undersökning av spatiotemporal fenomen i med bultande hjärta. (B) tre tvärgående skivor av de rekonstruerade 115 skivor 3D-data. Den kvadratiska genomsnitt förfarande förbättrar blod-till-vävnad kontrast och sänker den signal-brus-förhållande som möjliggör en bättre uppskattning av den trabeculated naturen av axolotl ventrikeln och en tydlig visualisering av interatrial septum och ventiler i utflödet tarmkanalen. (C) yta och volym representationer av pulserande hjärta på tre faser längs en färgkodade segmenterad modell (se kompletterande fil 13 och kompletterande fil 14 för video representationer av ytan och volymen återges slog hjärta, och kompletterande fil 15 för en tre-fas segmenterade interaktiva 3D-modell). Anatomiska förkortningar: A, atria; CAU, caudal; CRA, kraniala; Dex, dexter (att djuret rätt). Dor, dorsala; OFT, utflöde tarmkanalen; Synd, olycksbådande (till djur kvar). SinV, sinus venosus; V, ventrikeln; Ven, ventrala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Genomlysning att lokalisera hjärtats kammare i denaxolotl. Se figur 2 c. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2. Långa axeln, mittlinjen utsikt, B-läge. Se figur 3A, B. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 3. Längdriktning, ventrikulär utsikt, B-läge. Se figur 3 c, D. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 4. Längdriktning, ventrikulär Visa, färg Doppler-läge. Se figur 3E, F. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 5. Längdriktning, ventrikulär Visa, Power Doppler-läge. Se figur 3 g, H. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 6. Längdriktning, förmaksflimmer utsikt, B-läge. Se figur 4A, B. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 7. Längdriktning, förmaksflimmer Visa, färg Doppler läge. Se figur 4 c, D. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 8. Längdriktning, utflöde tarmkanalen Visa, B-läge. Se figur 4E. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 9. Längdriktning, utflöde tarmkanalen Visa, färg Doppler läge. Se figur 4F. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 10. Kort axel, ventrikulär Visa, B-läge. Se figur 5A, B. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 11. Sneda paragill, utflöde tarmkanalen utsikt, B-läge. Se figur 5 c. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 12. Sneda paragill, utflöde tarmkanalen Visa, färg Doppler läge. Se figur 5 d. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 13. Tredimensionella surface rendering av slog hjärtat i 70 faser (19,6 ms temporal upplösning). Se figur 9 c. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 14. Tredimensionell volym rendering av slog hjärtat i 70 faser (19,6 ms temporal upplösning). Se figur 9 c. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 15. Tredimensionell interaktiv modell av slog hjärtat i 3 faser: ventrikulära slutet-systole, ventrikulär mitten av utmatning och ventrikulära slutet-systole. Se figur 7 c. Interaktiva PDF-filen bör ses i Adobe Acrobat Reader 9 eller högre. Klicka på modellen för att aktivera funktionen 3D. Använda markören, det är nu möjligt att rotera, zooma, panorera modellen och i modellträdet alla segment av modellen kan vara avstängd / eller insyn. Modellträdet är en hierarki som innehåller flera sub-lager som kan öppnas (+). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 16. Representant annotated script för att beräkna korrelation värdet av anskaffning av en 1000 ramar med en övre uppskattning av 75 ramar/hjärt cykel. Skriptet är skrivet i IJ1 makrospråk och kan genomföras som en batch makro i ImageJ att beräkna korrelation värden (75 000 per förvärv) över en hela z-stack av 3D-data. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 17. Representativa skript för automatisk peak detection i en serie av korrelation värden från en 1000 ramar förvärv med en övre uppskattning av 75 ramar/hjärt cykel. Serien av korrelation värden (kolumn B, markerat med gult) kan ersättas och efter aktivering av makrot (Ctrl + r) listan över kommandon för att välja matchande hjärt faser och utföra kvadratisk i genomsnitt kommer att visas (kolumn Q, markerade i grönt). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 18. Representant kommenterad skript för att välja matchande hjärt faser och utföra kvadratisk genomsnitt av ett 1000 ramar förvärv med en övre uppskattning av 75 ramar/hjärt cykel (kolumn Q i kompletterande fil 17). Skriptet är skrivet i IJ1 makrospråk och kan genomföras som ett makro i ImageJ till skapa en ensemble i genomsnitt en cykel (75 faser) 2D slice. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 19. Representant annotated skript för att beräkna korrelation mellan en 70 ramar referens skiva och en intilliggande 75 ramar test skiva. Skriptet är skrivet i IJ1 makrospråk och kan genomföras som ett makro i ImageJ att beräkna korrelation värden (5.250). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 20. Representant Excel skript för automatisk peak detection i en serie av korrelation värden från en jämförelse mellan ett 70 ramar referens segment och en intilliggande 75 ramar test skiva. Serien av korrelation värden (kolumn C, markerat med gult) kan ersättas och efter aktivering av makrot (Ctrl + t) i listan över skivor att väljas som en substack i test skiva kommer att visas (kolumn L, rad 2, markerade i grönt). Den test skiva substack kommer har rumsligt matchande ramar till referens skiva. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ekokardiografi i axolotl och andra icke däggdjur arter ger väsensskilda data än däggdjur ekokardiografi på grund av röda blodkroppar i alla ryggradsdjur utom vuxna däggdjur kärnförsedda. Detta resulterar i en uttalad blod signal och mindre blod-till-vävnad kontrast i axolotl ekokardiografiska bilder jämfört med exempelvis mus eller mänskliga ekokardiografi. Detta kan försvåra bild segmentering på obearbetade bildruta ultraljudsbilder som det kan vara svårt att skilja blod från vävnad. Detta fenomen kan dock vara fördelaktigt när används för att skapa blod signal förbättrade bilder genom att tillämpa den kvadratiska genomsnitt förfarandet beskrivs tidigare18 och modifierad för axolotl ekokardiografi i protokollet avsnitt 6. Eftersom blod fläckar är mycket mer dynamiska än i mjukvävnad, genererar kvadratisk genomsnitt uttalad kontrasten mellan dessa två avdelningar vilket underlättar bild segmentering i två och tre dimensioner.

Det här protokollet beskriver tre olika bedövningsmedel för den axolotl som har noggrant testats tidigare21. Både bensokain och MS-222 stimulera en ökning av puls, vilket kan vara önskvärt när du testar hjärtfunktion stress villkor. Propofol inducerar mindre stress till hjärtat under anestesi och kan användas som en ersättning för unanesthetized ekokardiografi i situationer där förvärvet tid överskrider gränserna för stillasittande beteende i unanesthetized axolotls.

2D ekokardiografi som beskriver 3D hjärtat påverkas av subjektivitet. Därför är det absolut nödvändigt att beteende och intra/inter-operator/observatör analys innan du genomför en verkliga experiment som beskrivs i protokollet avsnitt 5. Jämväl, ekokardiografiska mätningar bör ses mer som indexvärden som kan användas för att undersöka potentiella skillnader i hjärtfunktionen under olika omständigheter i stället för absoluta värden. Stroke volymen bestäms av den geometriska ekvationen (ekvation 2) sällan ger samma absoluta värde som puls våg Doppler ekvation (ekvation 4. (Se figur 7), och det bör vara beslutat som mäter för att följa hela en serie experiment. SV(geo) kan erhållas snabbare än SV(pw), however sfäriska antagandet av ventrikulära formen endast gäller friska enhetligt avtalsslutande hjärtan, och i sjukdom och förnyelse modeller, SV(pw) bör övervägas för bättre speglar den sanna slagvolymen.

Korrelation och kvadratisk genomsnitt tillvägagångssättet av protokollet avsnitt 6 kan implementeras i flera olika imaging och matematiska paket. Eftersom programmering kunskaper och tillgång till programvarupaket varierar kraftigt inom life science forskare, strävat vi mot att ge representativa skript för metoderna i programpaket som de flesta forskare är bekanta med (exempelvis Excel) som är enkelt närma sig och fritt tillgängliga (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Kompletterande filer 16 - 20 ge kommenterad exemplariskt skript som skrivits i makrospråket för IJ1 och som .xlsm makron som ska vara begriplig även med minsta erfarenhet av kodning.

Inneboende hjärtat regenerering är ett fenomen som uteslutande hittade i små arter (i förhållande till mänskliga) hjärtan, och således mätningar och avbildning av baslinjen hjärtfunktion och funktionella framsteg under regenerering utmanas av storleken på hjärtat och den rumsliga upplösningen i bildframställning modalitet tillämpas. Hög frekvens ultraljudsundersökningar ger en önskvärd avvägning mellan hög i-plane spatial upplösning (~ 30 x 30 µm2 på 50 MHz) som är jämförbar med i vivo µCT bildhantering och mycket högre än i vivo µMRI, som har ett djup av Penetration (~ 1 cm på 50 MHz) flera gånger större än konfokalmikroskopi, och en mycket hög temporal upplösning (50-300 bildrutor/s på 50 MHz, 1 cm djup). Tillsammans med manuella eller automatiserade z dimensionell rörlighet för givaren, möjliggör ultraljud oöverträffade återuppbyggnad av hjärtfunktionen och anatomiska modellering i fyra dimensioner. Dessutom, tillåter icke-invasiva arten av tekniken för längsgående experiment. Vår kunskap finns för närvarande ingen matris matris givare för hög frekvens micro ultraljudsundersökningar. Utvecklingen av denna teknik skulle kraftigt stöd förvärven av 3D-data av små hjärtan som axolotl i ett snabbare förfarande än mekaniskt flyttar givaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi skulle vilja erkänna Kasper Hansen, Institutet för Bioscience, Århus universitet för att ge tillgång till och hjälp med den elektroniska micromanipulator för 3D ekokardiografiska förvärv.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Medicin fråga 141 ekokardiografi ultraljud hjärtat hjärt ultraljud regenerering axolotl Ambystoma mexicanum spatiotemporal bild korrelation
2D och 3D ekokardiografi i Axolotl (<em>Ambystoma Mexicanum</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter