Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Amfibi (Ambystoma Mexicanum) 2D ve 3D ekokardiyografinin yeri

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/57089
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University

Summary

Burada ekokardiyografi protokolleri kalbi amfibi semender (Ambystoma mexicanum), kalp yeniden oluşturma işlemi bir modeli türler, iki boyutlu ve üç boyutlu görüntü edinimi için mevcut. Bu yöntemler ile kardiyak fonksiyonların yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlükte boyuna değerlendirilmesi için olanak sağlar.

Abstract

İskemik kalp hastalığı sonucunda kalp arıza büyük bir sorun olduğunu ve yüksek talep kalbine rejeneratif tedaviler vardır. Zebra balığı ve içsel kalp yenilenme yeteneğine semenderler gibi bir kaç modeli tür insan hastalar için gelecekteki rejeneratif tedaviler için sözü tutun. Cardioregenerative deneyler sonucu değerlendirmek için kalp fonksiyonunu takip edilebilir zorunludur. Amfibi semender (A. mexicanum) Biyolojide kardiyak fonksiyon değerlendirme için izin veren boyutları ulaşmak rejeneratif köklü modeli tür temsil eder. Bu iletişim kuralının amacını tekrarlanarak kardiyak patolojilerin ekokardiyografi ile değerlendirilmesi amfibi işlevinde ölçmek için yöntemleri oluşturmaktır. Farklı anestezi (benzokain, MS-222 ve propofol) uygulanması gösterdi ve imzalat ve unanesthetized axolotls iki boyutlu (2D) ekokardiyografik verilerinde edinimi açıklanmıştır. Üç boyutlu (3D) kalbin 2D ekokardiyografi-ebilmek ıstırap çekmek--dan tutarsızlık ve öznellik ölçümler ve bu fenomen sağlam bir yöntem, yani içi/arası-operator/gözlemci analiz ölçmek ve bu önyargı en aza indirmek için hafifletmek için olduğunu gösterdi. Son olarak, amfibi kalbi çok yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlükte ve belirgin kan doku kontrast ile 3D ekokardiyografik verileri elde etmek için bir yöntem açıklanır. Genel olarak, bu iletişim kuralı, kardiyak fonksiyon ve modeli anatomi değerlendirmek için gerekli yöntemleri sağlamak ve genel fizyolojik deneyler ve rejeneratif biyoloji uygulamaları ile ultrason Imaging'i kullanma amfibi dinamiklerini akış.

Introduction

İskemik kalp hastalığı, ölüm dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Her ne kadar çok hızlı ve ince ayar tıbbi müdahale nedeniyle akut miyokard infarktüsü hayatta, insanlarda iskemik olaylar genellikle fibrotik hipertrofisi, elektrik arıza ve kalp azalmış bir fonksiyonel kapasite ile ilişkili yara izi için yol . Bu eksikliği kalp doku rejeneratif potansiyel memeliler arasında paylaşılır ve her ne kadar tartışmalı talepleri memeli kardiyak rejenerasyon bildirilmiştir, bunlar belirli fare suşları3,4 ' e sınırlı olmuştur ve hipoksi fareler5tedavi. Böylece, kardiyak rejeneratif tıp ve biyoloji alanında sigara memeli hayvan modelleri iç kalp rejeneratif olayları incelemek için genellikle sınırlıdır. Zebra balığı (Danio rerio) son on yılda iç kalp rejenerasyon6,7,8,9,10 için en iyi karakterize model olarak kurulmuştur . Kolay laboratuvar bakım, kısa oluşturma süresi ve moleküler araçları geniş bir dizi nedeniyle zebra balığı de kalp geliştirme ve yenileme altta yatan genetik ve moleküler mekanizmaları için bir model olarak adapte olduğunu. Ancak, zebra balığı kalp dakika boyutları yapmak o daha az işlevsel değerlendirme için uygun ve karmaşık cerrahi prosedürler ve zebra balığı olmayan sevgilin phylogeny böylece bu tür bulgular mantıklı ekstrapolasyon sınırlar diğer büyük tetrapod modelleri kullanımını haklı. Omurgalı kalp rejenerasyon ilk modellerinden birini kaudat amfibi, Doğu newt (Notophthalmus viridescens)11, değerli model12kalır bir tür oldu.

Sahne başka bir kaudat amfibi, Meksika amfibi (A. mexicanum) son yıllarda büyük bir girmiştir (ilâ 100 g vücut kitle) ve laboratuvar uyarlanabilir hayvan modeli rejeneratif disiplinleri uzuv rejenerasyon, kapsayan geniş bir dizi için son derece Medulla Spinalis Yaralanmalarında ve kardiyak rejenerasyon13,14,15,16,17. Amfibi yüksek frekans ekokardiyografi kullanarak kalp üzerinde fonksiyonel ölçümler için son derece uysal ve kalp ventral tarafta kalsifiye yapıları yokluğu ultrason çok daha düşük seviyede resim eserler (Akustik ile görüntüleme sağlar gölgeleme ve yankı özellikle) daha kalsifiye göğüs kemiğinde ve kaburga ile diğer modeli hayvanlarda gözlenen.

Birkaç farklı yöntem ve amfibi kalp anestezi hem de tekrarlanabilir ekokardiyografik ölçümler elde etmek için hazırlıklar (Şekil 1, resim 2) aşağıdaki protokolünü açıklar (üç farklı anestezi uygulanıyor: benzokain, MS-222 ve propofol) ve anestezisiz iki hayvanlarda (3 rakam, 4 rakam, 5 rakam, 6 rakam, 7 rakam, Ek dosyaları 1-12) ve üç (Şekil 8, 9 rakam, Ek dosyaları 13-14) mekansal boyutları. Üç Odalı amfibi kalbidir (iki kulakçık ve bir tek ventrikül). Kulakçık büyük bir Sinüs Venozus tarafından sağlanır ve ventrikül konus arteriosus çıkım yolu (Şekil 2) boşaltır. Çoğu vurgu geleneksel olarak ventriküler rejenerasyon yerleştirilir ve kulakçık6,7,8,9,10,11 kurtarma daha az olduğu , 12 , 14 , 17, bu protokolü esas ölçümler ventrikül fonksiyonunun odaklanır.

Amfibi ekokardiyografi iyi literatürde tarif değil ve bu yazıda açıklanan 2B Yöntem geliştirme tahrik tarafından en iyi temsil gerek amfibi kalbi işlevselliğini verilen deneysel ayarı ve saatte. Böylece, yöntem tanımlamak burada nerede kardiyak fonksiyon sürekli bir yenilenme süreci boyunca izlenebilir kalp rejeneratif deneylerde tabidir. Ayrıca, yöntemleri genel olarak cardiophysiological deneylerde amfibi üzerinde uygulanan veya diğer kaudat veya anuran amfibi modelleri (e.g.,Xenopus) yayılmasını biraz değiştirilmiş. Amfibi birkaç farklı suşları ve renk çeşitleri (Örneğin, wildtype, melanoid, beyaz, albino, transgenik beyaz yeşil floresans protein ifadesi ile), ancak bu özellikleri uyumluluğunu etkiler mi var amfibi açıklanan protokol ile. 3D ekokardiyografik verisini almak için burada açıklanan yöntemi için geliştirilen klinik ultrason ve gelişmekte olan tavuk için daha önce açıklanan yöntemi ortalama ikinci dereceden kronolojik zamanmekansal görüntü korelasyon (STIC) tekniği, değiştirilmiş bir sürümüdür çekirdekli kırmızı kan hücreleri18,19içeren türler içinde yumuşak dokularda kan speckles sinyal geliştirmek. Bu yöntem, kardiyak kasılma ve hesaplanan akışkanlar dinamiği amfibi kalbinde gelişmiş modellenmesi için sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı için ulusal Danimarka mevzuatı uyarınca bu protokol için yürütülen yordamlar vardı ve deneyler Danimarka ulusal hayvan deneyleri müfettişliği tarafından (iletişim kuralı # 2015-15-0201-00615) kabul edildi.

1. hazırlıkları

  1. Amfibi hazırlamak orta.
    1. Yüksek kaliteli olmayan kimyasal tedavi musluk suyu amfibi araç olarak uygulanır. Bu kullanılamıyorsa, % 40'Holtfreter ' nın çözümü uygulayın.
    2. 15.84 g NaCl, 0,54 g CaCl2·2H2O, 1,11 g MgSO4·7H2O ve 0,288 g 1 L. hacmi kadar filtre uygulanmış ve deiyonize su KCl çözülerek % 40 (wt/vol) Holtfreter'ın çözüm hazırlamak
  2. Daldırma anestezi yapmak.
    1. Benzokain (etil 4-aminobenzoate) anestezik çözüm 200 mg etil 4-aminobenzoate 3 mL aseton içinde eriterek ve sonra bu karışımı 1 L musluk suyu veya % 40 Holtfreter'ın çözüm içinde eriterek hazırlayın.
    2. MS-222 (etil 3-aminobenzoate methanesulfonic asit, tricane da bilinen) anestezik çözüm 200 mg etil 3-aminobenzoate methanesulfonic asit 1 L musluk suyu veya % 40 Holtfreter'ın çözümünde doğrudan çözülerek hazırlayın.
    3. Anestezik propofol (2,6-diisopropylphenol) çözüm 3.3 mg 2,6-diisopropylphenol içinde 1 L musluk suyu veya % 40 Holtfreter'ın çözümünde çözülerek hazırlayın. Alternatif olarak, 3.3 mg/l ticari olarak hazır çözüm sulandırmak
      Dikkat: Propofol güçlü bir insan anestezi (intravenöz yönetilen) ve seyreltilmiş formunda da dahil olmak üzere dikkatle ele alınmalıdır.
  3. Yatak ve konteyner ekokardiyografi için hazır olun.
    1. Bir kez yumuşak bez 70 cm x 55 cm parçası katlama ve sonra "burrito şekle" haddeleme tarafından ekokardiyografi için hayvan yatak dudak şeklindeki hazırlayın (Şekil 1A). Kadar onlar karşılamak ve bu birlikte (Şekil 1B) bant üzerinde biter viraj.
    2. Amfibi orta imzalat amfibi ultrason görüntüleme sırasında karşılamak için yapısında şeklinde dudak daldırın. Hayvan yapısına güvenli ve gevşek kauçuk şeritler kullanarak yüzen önlemek; Bu orta-çene kemiğinde ve sakral bölge (Şekil 1 c) üzerinde konumlandırın.
      Not: Bu hemodinami etkileyecek gibi lastik bantlar hayvan sıkmak değil.
    3. Unanesthetized axolotls üzerinde 2D ekokardiyografi için bir hamak bir 16 cm x 8 cm x 5 cm delik bir 33 cm x 27 cm x 5 cm blok polistren köpük (Örneğin, bir orta boy polistren köpük kap dan bir kapak) dışarı oyularak hazırlamak (Şekil 1 d).
    4. 33 cm x 27 cm biteviye-in plastik wrap delikten itmek ve kenarlarına Wrap bir hamak oluşturmak için polistren köpük blok (Şekil 1E) üst yüzeyine güvenli. Amfibi orta 3 cm derinlik hamakta ekleyin. Unanesthetized amfibi plastik wrap (Şekil 1F) üzerinden kolay ventral erişim için izin hamak dibine batacak.

2. Axolotls anestezi

  1. Amfibi istenen anestezik solüsyona (benzokain, MS-222 veya propofol) bırakın.
  2. Bu hayvanlarda 10 dk içinde görünür sedasyon, indirimli hareketleri ve artan iyileştiren refleks kaybı ilk belirtileri için incelemek < 10 g (< 10 cm) ve 10 g ve vücut kitle (10-22 cm) 50 gr arasında hayvanlarda 20 dk içinde.
  3. Vücut hareketleri, gill havalandırma hareketleri ve iyileştiren refleks tam eksikliği için inceleyin ve hayvan non-yanıt veren orta ağrısı stimülasyon rakamlar arasındaki dokuma pinching tarafından test için olduğundan emin olun.
    Not: Aslında rağmen bu genel anestezi anestezi benzokain axolotls 30 dk içinde gerçekleştirilir, kardiyak fonksiyon değil kadar 1 h stabilize. Bu MS-222 veya propofol içinde durum böyle değil anestezi axolotls (Şekil 6A-F).
  4. Amfibi genel anestezi altında korumak için hayvan anestezi çözümde veya anestezi çözümde ıslak ıslak kağıt mendil sarılmış tutun.
    Not: verilen bu deri ve özellikle solungaçları nemli tutulur anestezi hayvanın sağlığı üzerinde olumsuz etkileri olmadan 7 h için muhafaza edilebilir.
  5. Amfibi reawake orta ve anestezi ücretsiz hayvan aktarın.
    Not: Solungaç havalandırma hareketleri uyanış ilk işaretidir. Hayvan dik ve stimülasyon 1s içinde duyarlı olmalıdır.

3. 2D ekokardiyografi imzalat amfibi üzerinde

  1. Yer amfibi sırtüstü pozisyonda dudak şeklindeki hayvan yatak (adımları 1.3.1-1.3.2) anestezi. Gevşek kauçuk şeritler (Şekil 1 c) kullanarak yüzen üzerinden güvenli. Göğüs yüzeyi tarafından 3-5 mm orta kaplı emin olun.
    Not: kısa bir kazanım (< 5 dk) anestezi-Alerjik orta uygulanabilir. Uzun süreli alımı için anestezik çözüm ölçümleri boyunca istikrarlı kalp fonksiyonu sağlamak için ultrason orta olarak kullanılmalıdır.
  2. Dönüştürücü (Şekil 2A, Şekil 3A-B, ek dosya 2) hayvan uzun eksenine paralel göğüs bölgesinde hayvan orta hat üzerine getirin. Transillumination üzerinde beyaz ve albino axolotls soğuk ışık kaynağı ile dönüştürücü (Şekil 2C ve ek dosya 1) doğru yerleşimini emin olmak için kullanın.
    1. < 20 g ağırlığında axolotls için 50 MHz dönüştürücü kullanın; axolotls için > 20 g, 40 MHz dönüştürücü kullanın. Standart resim alma için sağa kafatası/ön yön konumlandırma emin olun. Bu durumda değilse dönüştürücü döndürmek 180 ° veya ters çevir'i görüntü.
  3. Uzun eksen orta hat görünümünde ventriküler diastole ve sol ve sağ kulakçık büyük bir bölümünü çerçevede (sağdaki Şekil 2Agöğüs boşluğunda konumlandırılan) ventrikül küçük bir bölümünü göründüğünden emin olun (merkezde konumlandırılmış / biraz doğru sol göğüs boşluğuna, Şekil 2A) ve Sinüs Venozus atriyal Sistol ve diastole (Şekil 3A, B) hem de görünür.
  4. Dönüştürücüler 1-3 mm hayvanın sağ ventrikül uzun eksen görünümü (Şekil 2A) elde etmek için doğru çevirmek. Son-sistol ventrikül kesiti, en yüksek seviyede (Şekil 3 c-H) olduğunda doğru pozisyon elde etti.
  5. B-modunda ≥ 3 kalp kür > 50 kare/s ya da 'genel görüntülemede' ile elde (yüksek kayma/düşük zamansal çözünürlük) veya 'Kardiyoloji' (düşük kayma/yüksek zamansal çözünürlük) modu.
    Not: Bu görünüm ventrikül fonksiyonunun değerlendirilmesi için izin verir. Ventrikül fonksiyon denklemi kullanarak end-diastolik ve son sistolik çapraz kesit bölmesinden ventrikül (CSAv) hesaplanan ventrikül kesirli alan değişikliği (FACv) kullanarak iki boyutlu olarak değerlendirilebilir:
    Equation 1(1)
    Amfibi'nın ventrikül bir küre şeklinde varsayar ve bir temel geometri kontur birim [SV(geo)] denklemi kullanılarak hesaplanabilir:
    Equation 2(2)
  6. Ventrikül ekranın ortasında ortasıdır kadar hayvan uzun ekseni boyunca dönüştürücü çevirmek. Dönüştürücü (Şekil 5A ve B, ek dosya 10) orta-ventriküler kısa eksen görünümü elde etmek için saat yönünde 90 ° döndürün. Ventrikül dairesel şekil dönüştürücü kalp uzun ekseni boyunca çevirerek değerlendirin.
  7. Dönüştürücü uzun eksen uçağa dönmek ve geri doğru orta hat veya atriyal uzun eksenin iki odası görünümü (Şekil 2A) elde etmek için orta hat biraz solundaki çevirmek. Doğru pozisyonda onların maxima son-sistol atria, kesitsel alanlardır ve kombine iki kulakçık anahat numarası 'eğik 8' varsayalım teyit ederek elde emin olun ~ 45 ° (Şekil 4A ve B, sola doğru Ek dosya 6).
  8. B-modunda ≥ 3 kalp kür > 50 kare/s 'genel görüntüleme' ya da 'Kardiyoloji' modu ile elde etmek.
    Not: Axolotl'ın kulakçık forma düzensizdir ve 3D işlevi cant doğrudan değişkenden 2D verileri, böylece kombine çapraz kesit alanı (CSAa) üzerinde her ikisi de dayalı bir dizin gibi ölçü birimi atriyal kesirli alan şans (FACa) işlevlerine değerlendirilmelidir atriyal chambers Sistol ve diastole:
    Equation 3(3)
  9. Çıkış yolu (konus arteriosus) (ventrikül uzun eksen görünümü yakın) görünene kadar sağa doğru dönüştürücü çevirmek (Şekil 2A).
    Not: Ventrikül anterior doğrultusunda ayrıldıktan sonra çıkış yolu keskin viraj yapar ve yine bir anterior yönde varsayarak ve gill şube ve sistemik damarlarının ayrılmanın önce menfez yüzey doğru küçük bir açıyla çalışır.
    1. Doğru çıkış yolu görünümü ise en ventrikül sonu-sistol, çıkış çapı olduğunu ve iki üç Semilunar kapaklar çıkış giriş Orta fırlatma (Şekil 4E, görülebilir teyit ederek elde emin olun Ek dosya 8).
      Not: Doppler görüntüleme kullanarak hız ve akış ölçüleri için dönüştürücü çıkım yolu orta bölümünün doğru ventral yön verir.
  10. Renkli Doppler-modu kan akım hızları ve çıkış yolu olarak kardiyak ejeksiyon (Şekil 4F ve ek dosya 9) sırasında eşlemek için geçerlidir. Aynı şekilde renkli Doppler ve güç kan akımı (Şekil 3E-H, Ek dosya 4-5 ve Şekil 4 c-Dve ek dosya 7) ventrikül ve atriyal görünümlerinde görselleştirmek için Imaging Doppler geçerlidir.
  11. Nabız dalga (PW) Doppler-mod dönüştürücü doğru çalışan çıkış yolu bölümünde en fazla kan hız konumundaki geçerli.
    1. Kullanın 'kiriş açı' ve 'açısal düzeltme' tamamen dönüştürücü (Şekil 4 g) yüze dik değil varlık çıkış için ayarlamak için 45 °. PW Doppler pozisyon çıkış sarmal vana tarafından kalp döngüsü (4E rakam) herhangi bir aşamasında örtüşüyor değil ki emin olun.
  12. PW Doppler-modunda hız/saat veri üzerinde ≥ 3 kalp kür elde etmek.
  13. B-moduna dönmek ve PWV alınan ≥ 3 kalp döngüsü sırasında tam aynı uçak elde etmek.
  14. Ölçü birimi hız zaman ayrılmaz (VTI) bir tam kalp hızı/saat eğri altındaki alan olarak çıkış yolu kan akışında döngüsü (Şekil 4 g, g1).
    Not: VTI ve çıkış yolu bitiş-sistol, çapı (d) B-mod satın PW tabanlı kontur birim [SV(pw)] denklemi kullanılarak hesaplanabilir Doppler aldı:
    Equation 4(4)
    Kalp hızı (HR) tüm kalp döngüsü süresi ölçülerek hız/saat eğrisi ölçülür. Kardiyak çıkış [CO(pw)] denklem kullanılarak hesaplanır:
    Equation 5(5)
  15. Eğik paragill görünümü, amfibi hayvan sağ bölümünü yukarı doğru (Şekil 2B) karşı karşıya olduğu şekilde yatakta şeklinde dudak 90 ° döndürerek çıkım yolu kan akım hızı ölçümü için bir seçenek sunar bir görünümü elde etmek. Açı ve dönüştürücü döndürmek ve paralel ve çıkıntılı solungaçları (Şekil 2B) için sadece arka konumlandırın. Doğru pozisyonda çıkış yolu, aşağıya doğru çalıştığından emin teyit ederek elde emin olun ~ 45 ° ve kulakçık (5 C rakam, ek dosya 11) fırlatma sırasında çıkış yolu altında görünür.
  16. PW Doppler-mod dönüştürücü (Şekil 5 d, ek dosya 12) uzak çalışan çıkış yolu bölümünde en fazla kan hız konumundaki geçerli. Kullanın 'kiriş açı' ve 'açısal düzeltme' tamamen dönüştürücü (Şekil 5E) yüze dik değil varlık çıkış için ayarlamak için 45 °.
  17. PW Doppler modunda kan hız ≥ 3 kalp kür elde etmek.
  18. B-moduna dönmek ve PWV alınan ≥ 3 kalp döngüsü sırasında tam aynı uçak elde etmek.
    Not: SV(pw) ve CO(pw) denklem 4 ve denklem 5 uzun eksen görünümü için yukarıda açıklandığı gibi kullanarak eğik paragill görünüm için hesaplanır.

4. Unanesthetized amfibi üzerinde 2D ekokardiyografi

  1. Unanesthetized amfibi yüzükoyun hamak (adım 1.3.3) yerleştirin.
  2. Hayvan rahatsız stres işleme kurtarmak 30-60 dk bekletin.
  3. Amfibi hamakta doğru yukarı bakacak şekilde dönüştürücü kafa ile ultrason dönüştürücü getirin.
  4. Ultrason jeli dönüştürücü üzerinde uygulayın.
  5. Yavaşça ve hayvan, rahatsız edici olmadan göğüs bölgesinde hayvan orta hat üzerine dönüştürücü, hayvan uzun eksenine paralel getirin.
    Not: Bu aynı ama ters, pozisyonuna gelince imzalat amfibi (adım 3.2) olduğunu.
  6. B-mod, renkli Doppler modu, PW modu veri uzun eksen ve 3.2-3.14 adımlarda açıklandığı gibi kısa eksen görünümü elde.
    Not: Bir eğik paragill görünümü unanesthetized amfibi sağlanamaz. Unanesthetized axolotls ekokardiyografik verilerinde gill havalandırma hareketleri (10-20 s süreyle dinlenme bir hayvan) arasında elde edilebilir. Alım sırasında axolotl hareket ederse, ölçümler tekrarlanmalıdır.

5. 2D ekokardiyografi verileri değerlendirmek ve öznellik en aza indirmek

  1. Operatör/gözlemci önyargı 2D ultrason görüntüleme ve 3D prognoz belirlemede kardiyak fonksiyon içi/arası-operator/gözlemci analiz20gerçekleştirerek öznellik veri toplama ve veri analizi aşaması neden 2D verileri esas kaçının.
    Not: Başlangıç çalışmaları ve yeni personel eğitim bu öznellik sayısal gerekir ve içi/arası-operator/gözlemci analizi kullanılarak en aza indirilmiştir.
  2. Operatör / (daha deneyimli) birlikte, ≥ 6 fikir birliği ölçmeler yaparak her iki banka da dahil olmak üzere gözlemci 2 iş yerinde karşı test edilen bir iki kişi kurulum operatör/gözlemci 1 (daha az deneyimli) ile içi/arası-operator/gözlemci analizde başlatmak ultrason sistemi (çalışma) ve ilgili parametreleri (gözlem) sonraki analizi.
  3. İşleçler ve gözlemciler arasında fikir birliği ulaşmak ve (operatör/gözlemci 1) ≥ 6 üzerinde ilgili verileri elde etmek için ultrason sisteminin çalışması hayvanlar (çalışma 1.1).
  4. Hemen sonra aynı hayvanlar (çalışma 2.1) üzerinde ilgili verileri elde etmek için ultrason sistemi (operatör/gözlemci 2) çalışır.
  5. 3 gün boyunca kurtarmak hayvanlar izin. Bundan sonra (operatör/gözlemci 1) (çalışma 1.2) yordamı yineleyin.
  6. (Operatör/gözlemci 1) (işlem 1.1/Gözlem 1.1; işlemi 2.1/Gözlem 1.1; işlemi 1.2/gözlem 1.1) tüm ölçülen verileri çözümlemek ve sonra 24 h operatör/gözlemci 2 kullanıcısının veri (işlem 2.1/Gözlem 1.2) analizi tekrarlayın.
  7. (Operatör/gözlemci 2) her/başına (işlem 2.1/gözlem 2.1) elde veri analiz. Not Bu analizi ile elde edilen değerler gerçek değerleri için en yakın kabul edilir.
  8. Varyasyon, eğilimler ve tüm alınan parametreleri kullanma Bland-Atman komplo, QQ komplo, tarasındaki karşılaştırmaları içinde önyargı değerlendirmek-test (eşit Ortalama) ve F-test (eşit varyans) (Şekil 6G).
    1. Not işlemi 1.1/Gözlem 1.1 işlemi 2.1/Gözlem 1.1 karşılaştırma karşı arası operatör değişimi gösterir.
    2. Not işlemi 2.1/Gözlem 1.1 işlemi 2.1/gözlem 2.1 karşılaştırma karşı arası gözlemci değişim gösterir.
    3. Not işlemi 1.1/Gözlem 1.1 karşı operasyon 1.2/gözlem 1.1 karşılaştırma Intra-operatör değişimi gösterir.
    4. Not işlemi 2.1/Gözlem 1.1 karşı operasyon 2.1/Gözlem 1.2 karşılaştırma Intra-gözlemci değişim gösterir.
  9. Ortalama ve değişim farklı ölçümlerin dört karşılaştırmalar için önemli ölçüde olmayan farklı olduğundan emin olun; ölçüm değerleri arasındaki farkı ± 1,96 standart sapmalar içinde düşmek gerekir ve hiçbir eğilimler daha az duyarlık ne küçük, ne de büyük değerler doğru görünmelidir.

6. 3D ekokardiyografi imzalat amfibi üzerinde

  1. 3D edinme
    1. İmzalat amfibi dudak şeklindeki hayvan yatak (adım 1.3.1) sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Gevşek kauçuk şeritler (Şekil 1 c) kullanarak yüzen üzerinden güvenli ve göğüs yüzeyi tarafından 3-5 mm orta kaplı olduğundan emin olun. 3D satın alma uzun bir işlemdir, bu nedenle ultrason ölçümleri boyunca istikrarlı kalp fonksiyonu sağlamak için ortam olarak anestezik çözüm geçerlidir.
    2. Dönüştürücü (sagittal 3D kayıt için) hayvan uzun eksenine paralel veya uzun eksen (enine 3D kayıt) dik göğüs bölgesinde hayvan orta hat üzerine getirin.
    3. Uçak-boyut (x ve y) ve tüm kalp bölgenin sonraki 3D yakalama içinde ele alınacaktır emin olmak için uçak boyut (z veya dilim) dönüştürücü çevirmek.
    4. Kare hızı ve istediğiniz gibi uzamsal çözünürlük ya 'genel görüntüleme' seçerek ayarlayın (yüksek kayma/düşük zamansal çözünürlük) veya 'Kardiyoloji' (düşük kayma/yüksek zamansal çözünürlük) modu. 0,33 Hz için < İK < 1 Hz 50 kare/s 50-150 farklı aşamalar halinde yeniden olabilir kalp döngüsü için sağlar yüksek uzaysal çözünürlük ('genel görüntüleme'), elde edilen zamansal çözünürlük kullanın.
    5. '2D kazanç' anatomik yapıları nerede ham B-mod görüntünün içinde zar zor tanınabilir bir düzeye ayarlayın (~ 5 dB) sinyal-için-gürültü-oranı son rekonstrüksiyonlar artırmak için.
    6. Her dilim için (z adım), ≥ 1000 kare kaydetmek.
    7. Bir gün, Örneğin, 20 µm veya 50 µm dönüştürücü bir z adım çevirmek ve tüm kalp bölgenin kaplı kadar kayıt tekrarlayın.
  2. 3D imar (ek dosyaları 13 ve 14).
    1. Digital Imaging and Communications in Medicine DICOM (küçük endian) içine satın almalar verin.
      Not: her dilim bir set kare sayısı içeren tek bir dosya oluşturmak.
    2. Kare sayısı tam kalp döngüsünde belirlemek. İK zamanla değişebilir gibi bu ilk ve son dilim için belirler. Daha sonra olabilir faz çözünürlük ilk üst Tahmini (adım 6.2.8) azaltılmış olarak kare döngüsü / en yüksek sayısını ayarlayın.
    3. Kırpma sınırlarını belirlemek ve B-mod penceresini çevreleyen alakasız boşluk tüketim.
      Not: Bu sınırlar dilimleri sabit olmalıdır.
    4. RGB renk resmi 32-gem dönüştürün.
    5. Her karede yığın ve formülü kullanarak ilk kalp döngüsünde dahil çerçeve sayısı (C) correlation değeri hesaplamak:
      Equation 6(6)
      Not: Burada Equation 7 koordinat (ı, j) piksel sinyal yoğunluğu içinde ilk görüntüdür Equation 8 ve ikinci resimdeki aynı Equation 9 , Equation 10 ve Equation 11 , Equation 12 ortalama yoğunluğu ve standart sapma, sırasıyla birinci ve ikinci görüntünün karşılaştırma ve ben ve J çoğu görüntü satır ve sütun numaraları. Sonuçta elde edilen dizinin korelasyon değerleri kalp döngüsü başına kare sayısı ve kare dilim (Örneğin, 75 × 1000 = 75.000 Şekil8) / toplam sayısı ürünün olacaktır ( ek olarak örnek komut dosyasına bakın Dosya 16). Bir veya iki karşılaştırma görüntülerin piksel değerlerini sıfır, standart sapması varsa bu ultrasonografik Albümdeki pek mümkün değil ancak correlation değeri hesaplanamaz.
    6. Yerel maxima korelasyon değerler (8A rakam, bkz: örnek komut dosyasında otomatik olarak yerel maxima algılamak için ek dosya 17 ) tespit edebilir.
    7. İkinci dereceden ortalama Q(AVG) kare ile en yüksek korelasyon değerleri hesaplamak (yani, kardiyak aşamaları eşleştirme) formülü kullanarak:
      Equation 14(7)
      N çerçeve kardiyak aşamaları, eşleşen toplam sayısı olduğu yerde Equation 15 koordinat (ı, j) nth görüntünün piksel yoğunluğu ve Equation 16 Equation 17in zamansal aritmetik ortalaması nth görüntünün ( ek dosya18 örnek komut dosyasına bakın).
    8. Adım 6.2.3-6.2.7 tüm dilimler için yineleyin.
    9. Bir dilim (başvuru dilim) ile kolayca tanınabilir anatomik yapıları (Örneğin, orta-ventrikül) seçin ve yeniden oluşturulan topluluk ortalama bir kalp döngüsü (ek varsayani, tam olarak bir döngüsü için karşılık gelir Aşama) birden fazla kalp döngüsünde kaynaklanan. Tam olarak bir kalp döngüsü (üzerinden bir fazla hesaplamış 75 aşamaları/döngüsündeki (gerçekte, 1.07 döngüsü) Şekil 8 tam olarak bir döngüsü 70 Şekil 8aşamalarında içeren olacakÖrneğin,) vermeye ek aşamaları silin.
    10. Komşu dilim (test dilim), sıralama ensemble ortalama olarak bir kalp döngüsü t-kardiyak aşamaları korelasyon değeri formülü (denklem 6) kullanarak başvuru dilim ile eşleşen içine yığın (bkz: ek dosya 19 örnek komut dosyaları ve ek dosya 20).
      Not: her ne kadar iki özdeş olmayan dilim kalp döngüsü sırasında herhangi bir noktada tamamen benzer görünmez, bitişik dilimleri bir yeterince küçük bir adım (Örneğin, 20 µm veya boyutu 50 µm) ile ilişki sonucunda benzerlikler telaffuz aşama eşleşen içine çevrilebilir değeri maxima.
    11. Adım 6.2.9-6.2.10 tüm dilimler için yineleyin.
    12. Tüm 3D imar z dilimleri ve t çerçeveler içeren bir tek 3D etiketli görüntü dosyası biçimi (TIF) ya da bir yığın DICOM dosyalarını daraltma.
      Not: Veri boyutunu küçültmek, sinyal-gürültü oranı artırmak ve izotropik verileri oluşturmak için her boyuttaki binned (uçak-çözünürlük ise genellikle birkaç kıvrımlar uçak çözünürlük yüksek).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intrapericardial uzayda amfibi hayvan boyutuna bağlıdır. Daha küçük hayvanlar (2-20 g, 7-15 cm) daha büyük cinsel olgun hayvanlar (> 20 g, > 15 cm) intrapericardial çoğunu odaları yer alacak, ancak kalp odaları perikardiyal sıvı (ekokardiyografinin yeri karanlık görünür) çevresindeki aşırı olacak alanı. Amfibi kalp ekokardiyografik sayısı temsilcisi sonuçlar için en iyi genel bakış sağlamak için daha küçük bir hayvan (10 g, 10 cm) Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5ve Şekil 9için uygulandı.

Uzun eksen görünümü genellikle amfibi kardiyak anatomi iyi bir genel bakış sağlar. Sinüs Venozus, kulakçık ve ventrikül parçası ile orta hat uçak, uçak (Şekil 3A, B, ek dosya 2), ventrikül uçak (Şekil 3 c-H) veya atriyal uçak (Şekil 4A girme -D) için sağa veya sola hayvanın dönüştürücü sırasıyla çevirerek ulaşılabilir. Ventrikül küresel ve son derece trabeculated görüntülenir (ekil 3 c, ek dosyaları 3-5), kulakçık daha düzensiz bir şekil ve neredeyse hiçbir trabeculation (Şekil 4A, var ise Ek dosya 6, ek dosya 7). Doğru kardiyak kasılma (Örneğin değerlendirilmesi için katkıda bulunur ancak kısa eksen görünümü (Şekil 5A, B, ek dosya 10) kalp, amfibi kardiyak anatomi daha az kolay yorumlanabilir bir genel bakış sağlar hazır veya sigara müteahhitlik bölgeye dairesel ventrikül açıkça bu görünümü düzlemde görüntülenir). Uzun eksen görünümü düzlemde çıkım yolu ortasına yakından ventrikül (2Ave sonra karşılaştırın Şekil 3 c ile Şekil 4E ve ek dosya 3 ek dosya 8 ile ortasına yerleştirilir ). Çıkış yolu yumuşak doku kan fırlatma hareket edilecektir beri yüksek yoğunluklu kan sinyal nabız dalga Doppler uzun eksen ve eğik paragill uçak tarafından ölçülen kardiyak döngüsü sırasında düşük yoğunluklu gürültü tarafından keşfedemiyoruz hareketleri çevreleyen yumuşak doku (hız/saat eğrisi Şekil 4 g ve Şekil 5Eiçinde beyaz alanı gri çevresi). Genellikle, kan sinyal ve yumuşak doku gürültü arasındaki kontrast hız zaman ayrılmaz (Şekil 4 g (g1 büyütme) ve Şekil 5E (e1 büyütme)) ölçerken segment dışarı sadece kan sinyal almaya yetecek kadar olması gerekir.

Kan akışı desenleri nitel değerlendirilmesi için renkli Doppler ve güç Doppler görüntüleme sağlar görsel akış desenlerinin farklı kalp odalarında (ventrikül: Şekil 3E-H, ek dosya 4, Ek dosya 5; Kulakçık: rakam 4 C, D, ek dosya 7; çıkış yolu: Şekil 4F, 5 D rakam, ek dosya 9, ek dosya 12).

Laboratuvar deney için kullanılan axolotls 10-30 g de tam olgunluk için erken sonrası larva sahne alanı'ndan 2-4 g boyutu değişir ve daha büyük hayvanlar > 100 g. Likewise ağırlığında, kardiyak fonksiyon ve fonksiyonel parametreler burada açıklanan bazı mutlak değerleri hayvanlar boyutuna. Genel olarak, kesirli alan 40-%50 (daha büyük hayvanlar için daha düşük değerler doğru eğilmiş) arasında değişen değerlere sahip farklı boyut gruplarında sürekli değişimdir. Kontur birim hayvan, yani, Örneğin, 5 g axolotls 20-30 µL, 10 g axolotls 50-70 µL ve 250-300 µL 50 gr axolotls içinde değişen kalp boyutunu boyutunu son derece bağlıdır. Kalp hızı ve bazı derecesi kontur birime son derece uygulanan anestezik ve anestezi (Şekil 6A-F, Şekil 7) düzeyine bağlıdır.

Geleneksel içi/arası-operator/gözlemci çözümleme içerir grafiksel gösterimleri (Bland Altman Q-Q arsalar ve araziler) ve eşit ortalaması için test (t-test) ve varyans (F-test) normal dağılım verileri değerlendirmek ve karşılaştırmak için doğruluk ve kesinlik arasında iki kişi (Şekil 6G).

3D ekokardiyografi (z veya derinlik) ek bir boyut daha geleneksel 2D edinme için ekler. Bu veri (Þekil 9A), reslicing (Şekil 9B), yüzey ve hacim rekonstrüksiyonu (Şekil 9C, ek dosya 13ve ek dosya 14) ve segmentasyon çok düzlemsel görselleştirme için sağlar ve 3D modeller (9 C rakam, ek dosya 15) nesil.

Figure 1
Şekil 1. Yatak ve konteyner hazırlanması için ekokardiyografi anestezi ve anestezisiz amfibi. (A) A yumuşak bez parçası bir kez katlanmış ve "burrito" şekil yuvarlandı. (B) biter geri eğildi ve sualtı tarama sırasında amfibi dudak şeklinde yatma kurmaya bantlanmış. (C) bir imzalat amfibi 2D ve 3D ekokardiyografi için hayvan yavaşça yarık dudak şeklinde yatak ve lastik bantlar ile orta-çene kemiğinde ve sakral bölge üzerinde sabit bir sırtüstü pozisyonda yerleştirilir. (D, E) Bir hamak polistren köpük bir parça kare delik dışarı oyma ve üst yüzey için plastik wrap taping tarafından hazırlanmıştır. (F) için 2D ekokardiyografi, unanesthetized bir amfibi hayvan doğal yüzükoyun hamakta yerleştirilir ve bir jel kaplı dönüştürücü uç--dan altında ile yaklaştı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Dönüştürücü yerleştirme. (A, B) Amfibi arteryel ağ modeli ile dönüştürücü uzun eksen ve kısa eksen görünümü(a)ve eğik paragill görünümü (B) için yaklaşık konumunu. (C) Transillumination bir güçlü soğuk ışık kaynağı ile yardım dönüştürücü uygulamadan önce kalp odaları tam konumunu bulma (bkz. ek dosya 1). Anatomik kısaltmalar: A, kulakçık; Gerçekten, çıkış yolu; SinV, Sinüs Venozus; V, ventrikül. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Ventrikül temsilcisi uzun eksen ekokardiyografik sayısı. (A, B) (Bkz: ek dosya 2 video gösterimi için) tipik uzun eksen orta hat modunda görüntüle B-( Şekil 2Aiçinde sarı hat) ventrikül end-diastolik (A) ve son Sistolik (B) aşamaları. (C, D) Uzun eksen görünümü karıncığın içinde B-tarz ( Şekil 2Aiçinde siyah çizgi) ventrikül end-diastolik (C) ve (bkz ek dosya 3 . video gösterimi için) son Sistolik (D) aşama içinde. (E-H) Benzer görünüm uçak olduğu gibi(a)ve (B) renkli Doppler (CD) ve güç Doppler (PD) modu kan gösteren akış (bkz ek dosya 4 ve ek dosya 5 video gösterimi, CD ve PD-mod, sırasıyla). Dönüştürücü doğru akan kan kırmızı renklerde CD-modundaki görüntüler gösterir ve tam tersi mavi rengi belirtir. Kalp odaları ve kan akımı noktalı çizgiler ile vurgulu olarak gösterilmiştir. Eklenen çizgi film(a)ve (C) gösteri yerleşimini dönüştürücü ve çeviri uzun eksen orta hat göre görüntüleyin. Anatomik kısaltmalar: A, kulakçık; DC(L), Cuvier kanal yaptı; Gerçekten, çıkış yolu; SinV, Sinüs Venozus; V, ventrikül. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Temsilcisi uzun eksen ekokardiyografik görüş kulakçık ve çıkış yolu. (A, B) B-modunda ( Şekil 2Aiçinde yeşil hat) atriyal end-diastolik (A) ve (bkz. ek dosya 6 video gösterimi için) son Sistolik (B) aşamaları kulakçık uzun eksen görünümü. (C, D) Benzer görünüm uçak olduğu gibi(a)ve (B) (bkz. ek dosya 7 için video gösterimi) kan gösteren renkli Doppler (CD) modunda akışı. (E) uzun eksen görünümü orta fırlatma aşamasında çıkış sistemi içinde B-tarz ( Şekil 2Aiçinde mavi çizgi) ( ek dosya 8 video gösterimi için bakınız). F: Benzer görünüm düzlemde (E) olduğu gibi CD-modu gösteren kan akışı (bkz ek dosya 9 video gösterimi için). (G) benzer görünüm uçak olduğu gibi (E) ve (F) ısı oranı algılama ve hız zaman ayrılmaz (VTI) ölçüm için kontur hacim hesaplama için izin nabız dalga Doppler (PW) modunda. Dönüştürücü doğru akan kan kırmızı renklerde CD-modundaki görüntüler gösterir ve tam tersi mavi rengi belirtir. Kalp odaları ve kan akımı noktalı çizgiler ile vurgulu olarak gösterilmiştir. Sarı ve kırmızı ok uçları Semilunar kapaklar çıkış yolu ve çıkış yolu spiral kapak kökündeki sırasıyla gösterir. Eklenen çizgi film(a)ve (E) gösteri yerleşimini dönüştürücü ve çeviri uzun eksen orta hat göre görüntüleyin. Anatomik kısaltmalar: A(R), sağ atrium; A(L), Atrium yaptı; Gerçekten, çıkış yolu; SinV, Sinüs Venozus; V, ventrikül; VC, vena cava. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Temsilcisi kısa eksen eğik paragill ekokardiyografik olarak ve ventrikül ve çıkış yolları. (A, B) Kısa eksen görünümü karıncığın içinde B-tarz (gri satırında Şekil 2A) ventrikül end-diastolik (A) ve (bkz ek dosya 10 . video gösterimi için) son Sistolik (B) aşama içinde. (C) eğik paragill görünümü içinde B-tarz ( Şekil2B mor çizgi) çıkış sistemi orta fırlatma aşamasında (bkz. ek dosya 11 video gösterimi için). (D) benzer görünüm düzlemde (C) olduğu gibi CD-modu gösteren kan akışı (bkz ek dosya 12 video gösterimi için). (E) benzer görünüm uçak olduğu gibi (C) ve (D) nabız dalga Doppler (PW) modunda ısı oranı algılama ve hız zaman ayrılmaz (VTI) ölçüm için kontur hacim hesaplama için izin. Dönüştürücü doğru akan kan kırmızı renklerde CD-modundaki görüntüler gösterir ve tam tersi mavi rengi belirtir. Kalp odaları ve kan akımı noktalı çizgiler ile vurgulu olarak gösterilmiştir. Eklenen çizgi film(a)ve (C) gösteri yerleşimini dönüştürücü ve çeviri uzun eksen orta hat göre görüntüleyin. Anatomik kısaltmalar: A, kulakçık; Gerçekten, çıkış yolu; SinV, Sinüs Venozus; V, ventrikül. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Kalp hızı ve kontur Hacim ölçüleri, anestezi ve temsilcisi içi/arası-operator/gözlemci analiz temsilcisi sonuçlarını. (A-C) Benzokain (A), MS-222 (B) ve (C) propofol anestezi altı axolotls için (0 h tam anestezi ise) zaman içinde kalp hızı (HR) unanesthetized temel göre çizilen. (D-F) İnme birim (SV) göre unanesthetized temel altı axolotls benzokain (D), MS-222 (E), anestezi için (0 h ise tam anestezi) zamanla çizilen ve propofol (F). (G) kontur birim içi/arası-operator/gözlemci analizi. Bland Altman çizer [operatörleri (Op) arasındaki fark (DIF) / gözlemci (Obs) ortalama (ort) karşı çizilen] farklı operatör ve gözlemciler tarafından elde edilen normal dağılım ölçüleri (Q-Q araziler) sistematik hiçbir önyargı ortaya çıkarmak. Eşit ortalaması için test (t-test) ve eşit varyans (F-test) operatörleri/gözlemci (sağ alt tabloda) arasında önemli bir fark yoktur ortaya çıkarmak. A - F malzeme temin edilir (Şekil 1 Thygesen vd / Creative Commons Attribution License altında güncellenmiştir 21). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. Karşılaştırma kontur birimin tahmini geometrik ve nabız dalga Doppler yöntemi ile. Kontur birim (SV) iki boyutlu B-mod geometrik (geo) ölçümleri ya da nabız dalga Doppler ölçümleri hızı üzerinde çıkış yolu çıkmadan kan tahmini karşılaştırılması. SV(Geo) ve SV(pw) saniye arasında iki ölçüm türleri ve üç farklı anestezikler, benzokain (mavi eğik kareler), MS-222 (kırmızı kare), kullanarak aynı altı hayvanlarda kaydedilir ve propofol (yeşil üçgenler) ile bir hafta arasında kurtarma farklı anestezi uygulanıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Temsilcisi kronolojik zamanmekansal görüntü korelasyon için 3D ekokardiyografi. (A)eğri vermiştir korelasyon değerleri bir veri kümesindeki 1000 kare cine 75 kare / kalp döngüsü ile korelasyon işleminin gösterimi. Kardiyak aşamaları, eşleşen gösteren sadece küçük farklılıklar ile iki çerçeve yüksek korelasyon değeri verecektir. Daha sonra yerel bir maxima algoritması arama tüm eşleşen çerçeveleri algılamak için veriler üzerinde uygulanır. (B)(a)olduğu gibi aynı verilerin grafik gösterimi. Korelasyon değerleri ilk kalp döngüsü tüm cine deste ile karşılaştırarak elde edilir, en yüksek korelasyon çapraz çizgiler kalp aşamaları eşleşen belirtiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9. Temsilcisi 3D ekokardiyografi. (A) 3D yeniden oluşturulan amfibi kalp çok düzlemsel görünümünü. Birkaç farklı aşamaları ile tam kalp döngüsü yeniden inşası için kronolojik zamanmekansal görüntü korelasyon yordam verir (burada 70 aşama) sonra olanlar içinde kronolojik zamanmekansal olayların istenen soruşturma için olarak dilimlenmiş üç mekansal boyutlar kalbi. (B) üç yeniden oluşturulan 115 enine dilim dilim 3D verileri. Yordam ortalama ikinci dereceden kan doku zıtlığını arttırır ve amfibi ventrikül trabeculated doğası ve pek septum açık bir görselleştirme için bir daha iyi takdir sağlayan sinyal gürültü oranı düşürür ve vanalar dışa akış sistem. (C) yüzey ve hacim temsilleri kalbi, bir renk kodlu boyunca üç aşamada parçalara modeli (bkz ek dosya 13 ve ek dosya 14 yüzey ve dayak işlenen cilt video gösterimleri için kalp ve ek dosya 15 üç fazlı kesimli etkileşimli 3D model için). Anatomik kısaltmalar: A, kulakçık; CAU kaudal; MKK, kafatası; Dex, dexter (hayvan için değil); Dor, dorsal; Gerçekten, çıkış yolu; Günah, uğursuz (hayvanlar için sol); SinV, Sinüs Venozus; V, ventrikül; Ven, ventral. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1. Kardiyak odasında bulmak için transilluminationamfibi. Şekil 2Cbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 2. Uzun eksen, orta hat görünümü, B-mode. Şekil 3A, Bbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 3. Uzun eksen, ventrikül görünümü, B-mode. Şekil 3 c, Dbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 4. Uzun eksen, ventrikül görünümü, renkli Doppler modu. Bkz: Şekil 3E, F. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 5. Uzun eksen, ventrikül görünümü, Power Doppler modu. Bkz: Şekil 3 g, H. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 6. Uzun eksen, atriyal görünümü, B-mode. Şekil 4A, Bbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 7. Uzun eksen, atriyal görünümü, renkli Doppler modu. Şekil 4 c, Dbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 8. Uzun eksen, çıkış yolu görünümü, B-mod. Bkz: Şekil 4E. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 9. Uzun eksen, çıkış yolu görünümü, renkli Doppler modu. Şekil 4Fbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 10. Kısa eksen, ventrikül görünümü, B-mod. Bkz: Şekil 5A, B. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 11. Eğik paragill, çıkış yolu görünüm, B-mode. Şekil 5Cbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 12. Eğik paragill, çıkış yolu görünümü, renkli Doppler modu. Şekil 5 dbakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 13. 70 aşamalarında (19,6 ms zamansal çözünürlük) kalp atışları, üç boyutlu yüzey işleme. Bkz: Şekil 9C. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 14. 70 aşamalarında (19,6 ms zamansal çözünürlük) kalp atışları, üç boyutlu toplu oluşturma. Bkz: Şekil 9C. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 15. 3 aşamada kalp atışları, üç boyutlu İnteraktif model: ventriküler sonu-sistol, ventrikül orta fırlatma ve ventrikül sonu-sistol. Şekil 7Cbakın. Etkileşimli PDF dosyası Adobe Acrobat Reader 9 veya daha yüksek bakılmalıdır. 3D özelliği etkinleştirmek için model tıklayın. İmleci kullanarak, döndürme, zoom, model kaydırmak şimdi mümkündür ve model ağacı'nda modelinin tüm kesimlerini edilebilir açma/kapama açık veya şeffaf yapılmış. Model ağacı-ebilmek var olmak birkaç alt katmanlar içeren bir hiyerarşi açıldı (+) olduğunu. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 16. Temsilcisi açıklamalı bir 1000 çerçeve kazanım korelasyon değeri 75 kare/kalp döngüsünün üst bir tahmin ile hesaplamak için komut dosyası. Komut dosyası IJ1 makro dilinde yazılmış ve ImageJ tüm birkorelasyon değerleri (edinme başı 75.000) hesaplamak için bir toplu iş makro olarak uygulanan-3D veri yığını. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 17. Otomatik peak algılama bir 1000 çerçeve kazanım korelasyon değerleri bir dizi ile bir üst tahmini 75 kare/kalp döngüsünün temsilcisi komut dosyası. Korelasyon değerleri (sütun B, sarı renk ile işaretlenmiş) dizi değiştirilebilir ve makro (Ctrl + r) aktivasyon sonra kalp aşamaları eşleşen seçin ve ikinci dereceden ortalama gerçekleştirmek için komut listesi olacak (sütun Q, yeşil renkle işaretlenmiş) görüntülenir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 18. Temsilcisi kardiyak aşamaları eşleşen seçin ve ikinci dereceden bir 1000 kare edinimi ortalama 75 kare/kalp döngüsünün (sütun Q ek dosya 17) üst bir tahmin ile gerçekleştirmek için komut dosyası açıklamalı. Komut dosyası IJ1 makro dilinde yazılmış ve ImageJ bir topluluk oluşturmak için bir makroda bir döngüsü (75 aşama) 2D dilim ortalama olarak uygulanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 19. Temsilcisi açıklamalı bir 70 kare başvuru dilim ve bitişik 75 kare testi dilimlerden arasında korelasyon değeri hesaplamak için komut dosyası. Komut dosyası IJ1 makro dilinde yazılmış ve ImageJ korelasyon değerleri (5.250) hesaplamak için bir makroda olarak uygulanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 20. Temsilcisi Excel komut otomatik peak algılama 70 kare başvuru dilim ve bitişik 75 kare testi dilimlerden arasında bir karşılaştırma korelasyon değerleri bir dizi için. Korelasyon değerleri (sütun C, sarı renk ile işaretlenmiş) dizi değiştirilebilir ve makro (Ctrl + t) aktivasyon sonra test dilim içinde bir substack olarak seçilmesi için dilimler listesi (sütun L, satır 2, yeşil renkle işaretlenmiş) görüntülenir. Test dilim substack dağınık şekilde eşleşen çerçeveleri için başvuru dilim olacaktır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amfibi ve diğer memeli olmayan türler ekokardiyografinin yeri kırmızı kan hücreleri yetişkin memeliler dışında tüm omurgalılarda çekirdekli doğası nedeniyle memeli ekokardiyografi daha temelde farklı veri verir. Bu belirgin kan sinyal ve kan doku kontrast amfibi ekokardiyografik görüntüleri Örneğin, fare veya insan ekokardiyografi ile karşılaştırıldığında daha az olur. Bu görüntü segmentasyonu işlenmemiş tek kare ultrason görüntüleri üzerinde kan dokusundan ayırt etmek zor olabilir gibi güçleştirebilir. Ancak, bu fenomen kan oluşturmak için kullanıldığında yararlı olabilir, yordam ortalama ikinci dereceden uygulayarak gelişmiş görüntü daha önce açıklanan18 ve amfibi Ekokardiyografinin Yeri Protokolü Bölüm 6 için modifiye sinyal. Kan speckles çok daha yumuşak dokuda bulunanlardan daha dinamik olduğundan, ikinci dereceden ortalama iki ve üç boyutlu görüntü segmentasyonu kolaylaştıran iki bu bölmeleri arasında belirgin kontrast oluşturur.

Bu iletişim kuralı için iyice olmuştur amfibi daha önce21test üç farklı anestezi açıklar. Benzokain ve MS-222 kalp hızı, bir artış stres koşullarında kardiyak fonksiyon test ederken arzu edilebilir teşvik. Propofol anestezi sırasında daha az stres kalbe indükler ve olarak ikame unanesthetized ekokardiyografi nerede satın alma zaman unanesthetized axolotls yerleşik davranış sınırları aşıyor durumlarda kullanılabilir.

2D ekokardiyografi 3D kalp açıklayan öznellik tarafından etkilenir. Bu nedenle, bu bir gerçek iletişim kuralı Bölüm 5'te açıklandığı gibi deney önce kuralları ve içi/arası-operator/gözlemci analiz için zorunludur. Aynı şekilde, ekokardiyografi ölçümleri daha potansiyel mutlak değerler yerine farklı koşullar altında kardiyak fonksiyon farklılıkları araştırmak için uygulanan Dizin değerleri olarak görülmelidir. Nadiren geometrik denklemi (denklem 2) tarafından belirlenen inme birim nabız dalga Doppler Denklem (denklem 4; aynı mutlak değeri verir Şekil 7), ve olması gereken bir dizi deney uymaları ölçmek karar verdi. SV(geo) SV(pw), daha hızlı ancak ventrikül şekli küresel varsayımı sağlıklı için düzgün kalpler sözleşme geçerlidir ve hastalık ve rejenerasyon modellerinde SV(pw) için daha iyi bir yansıması olarak gereken elde edilebilir gerçek zamanlı ses.

Korelasyon ve ikinci dereceden yordamı Protokolü Bölüm 6 ortalama birkaç farklı görüntüleme ve matematiksel paketleri uygulanabilir. Programlama becerileri ve yazılım paketleri erişim büyük ölçüde hayat bilgisi araştırmacılar içinde değişken olduğundan, biz çoğu araştırmacı (Örneğin, ile Excel) aşina olduğu için yazılım paketleri yöntemlerde temsilcisi komut dosyaları sağlayarak doğru gayret Bu serbestçe kullanılabilir ve kolayca yaklaştı (ImageJ: https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Ek dosyaları 16 - 20 IJ1 makro dil ve kodlama bile en az deneyime sahip anlaşılır olmalıdır .xlsm makrolar olarak yazılmış açıklamalı örnek komut dosyalarını sağlar.

İçsel kalp yenilenme sadece (insan) görece küçük türler kalplerinde bulunan bir olgu olduğunu ve böylece ölçümleri ve yeniden oluşturma işlemi sırasında temel kardiyak fonksiyon ve fonksiyonel ilerleme görüntüleme, meydan gönül boyutuyla ve uygulanan görüntüleme modalite Uzaysal Çözünürlük. Yüksek frekans ultrason görüntüleme sağlar arzu edilen bir trade-off arasında yüksek bir uçak-Uzaysal Çözünürlük (~ 30 x 30 µm2 50 MHz) vivo µCT görüntüleme ve çok vivo içinde µMRI, daha yüksek karşılaştırılabilir derinliğe sahip olduğu penetrasyon (~ 1 cm 50 MHz) birkaç confocal mikroskobu ve çok yüksek zamansal çözünürlük (50-300 50 MHz, 1 cm derinlik kare/s) daha büyük katlayın. El ile veya otomatik z boyutlu hareketi dönüştürücü ile birleştiğinde, ultrason eşsiz inşası kardiyak fonksiyon ve dört boyutlu olarak anatomik modelleme etkinleştirir. Ayrıca, teknik non-invaziv doğası için boyuna deneme sağlar. Bilgimizi vardır şu anda hiçbir matris dizi güç çeviriciler yüksek frekans mikro ultrason görüntüleme için kullanılabilir. Bu teknolojinin gelişimi büyük ölçüde bu amfibi gibi küçük kalplerin 3D verileri satın almalar mekanik olarak dönüştürücü hareket daha hızlı bir prosedür yardım.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Kasper Hansen, Bioscience Enstitüsü, Aarhus Üniversitesi 3D ekokardiyografik alımı için erişim ve elektronik micromanipulator ile ilgili yardım sağlamak için kabul etmek istiyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator Zeiss NA
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
MS-222 Sigma-Aldrich 886-86-2 ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol B. Braun Medical A/S NA 2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride Sigma-Aldrich  7647-14-5  NaCl
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 10035-04-8 CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich  10034-99-8  MgSO4·7H2O
Potassium chloride Sigma-Aldrich  7447-40-7 KCl
Acetone Sigma-Aldrich  67-64-1  Propanone
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block N/A N/A Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap N/A N/A Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape BSN Medical 72359-02 Leukoplast sleek
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956  Kimwipes, disposable wipers 
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
  3. Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
  4. Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
  5. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
  6. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  7. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
  8. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  10. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
  11. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
  12. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
  13. Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
  14. Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
  15. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  16. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
  17. Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
  18. Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
  19. Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , Epub ahead of print (2017).
  20. Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
  21. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).

Tags

Tıp sayı: 141 ekokardiyografi ultrason kalp kalp ultrasonografi rejenerasyon amfibi Ambystoma mexicanum kronolojik zamanmekansal görüntü korelasyon
Amfibi (<em>Ambystoma Mexicanum</em>) 2D ve 3D ekokardiyografinin yeri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittrich, A., Thygesen, M. M.,… More

Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). J. Vis. Exp. (141), e57089, doi:10.3791/57089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter