Summary
מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.
Abstract
הניתוח של הרכיבים ביואקטיביות נוכח מזונות ומוצרים טבעיים הפך אזור פופולרי של המחקר בתחומים רבים, לרבות מסורתית סינית רפואה ומזון בטיחות/רעלים. רבים של טכניקות ניתוח קלאסי דורשים ציוד יקר ו/או התמחות. ראוי לציין, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הפכו שיטה המתעוררים לניתוח של מזונות ומוצרים טבעיים. שיטה זו מבוססת על זיהוי בתיווך נוגדנים של רכיבי היעד. עם זאת, רבים רכיבים ביו-אקטיביים במוצרים טבעיים הם קטנים (< 1,000 Da), אל תגרום / תגובה חיסונית, יצירת נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) נגדם הוא לעתים קרובות קשה. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים הסבר מפורט של כל השלבים הדרושים להפקת mAbs נגד היעד מולקולות, כמו גם אלה צריך ליצור את המשויך עקיף תחרותי (ic) אליסה לניתוח מהיר של המתחם בדגימות מרובות. ההליך מתאר את סינתזה של אנטיגן מלאכותיים (קרי, המספר המשלים הפטן-המוביל), חיסונים, פיוז'ן תא, ליפידים monoclonal הכנה, אפיון mAb ולאחר יישום מבוסס-אליסה של mAb. המספר המשלים הפטן-המוביל היה מסונתז על ידי הנתרן periodate שיטת ומוערכת על ידי MALDI-תוף-MS. לאחר חיסון, splenocytes הם בודדו אותנו מהמתרחש העכבר immunized עם כייל נוגדנים הגבוהה, התמזגו עם Ag14 (כובע) - העכבר רגיש מיאלומה תא קו Sp2/0 - hypoxanthine-aminopterin-תימידין באמצעות של פוליאתילן גליקול (PEG)-המבוסס על שיטה. Hybridomas הפרשת mAbs תגובתי ל אנטיגן מטרה הוקרנו על-ידי icELISA ירידה לפרטים, אשיג. יתר על כן, שיטת הדילול המגביל הונחה להכין monoclonal hybridomas. MAbs הסופית היו עוד יותר מאופיין icELISA, ואז מנוצל יישום המבוסס על אליסה איתור מהיר ונוח הפטן דוגמה (naringin (NAR)) במוצרים טבעיים.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), הידוע גם בשם נוגדנים ספציפיים מונו, מיוצרים שיבוט B-lymphocyte יחיד, המורכבת של נוגדנים monovalent כל לאגד epitope אותה1. בשנים האחרונות, מרפא הצמחי הטבעי מוצרים רבים שימשו לטיפול במחלות שונות2. ואכן, רבים תרכובות מולקולריות קטנות נגזר במקור מוצרים טבעיים המוחלות כעת כמו תרופות שורה ראשונה, כגון ארטמיסינין עבור מלריה ו- paciltaxel (טקסול) עבור סרטן2,3. המחקר של מוצרים טבעיים עשה התקדמות מהירה, בעיקר בשל פיתוח אדירה, אופטימיזציה של טכניקות ניתוח קונבנציונלי, כולל ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) וספקטרומטר מסה (MS). עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות הקשורות בשיטות אלה, כגון פרוטוקולים pretreatment מורכבים שלהם ואת עלויות לגבי זמן העבודה/מומחיות, כלים נדרשים4.
לאחרונה, מבחני מבוססי mAb מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הוחלו לנתח איכותית, באופן כמותי מזון ומוצרים טבעיים. למעשה, שיטה זו הוחל עבור ניתוח דגימות ביולוגיות והן ניסויים קליניים, הוכח להיות מדויק, רגיש ויעיל מאוד תוך הימנעות גם את השלבים pretreatment מייגע המשויך ניתוחים אחרים5, 6.
בעת שימוש ELISAs מבוססי mAb ללמוד מורכבים מוצרים טבעיים, הכנת נוגדנים חד-שבטיים הוא אחד הצעדים הליבה. למרבה הצער, mAbs מסוימים ברכיבים ביו קטן נוכח סוגים אלה של חומרים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 מוגבלים לעיתים קרובות לעומת חלבון אנטיגנים. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו פרוטוקול ליצירת mAbs נגד תרכובות קטן במיוחד. פרוטוקול המוצג כאן כולל סינתזה מלאכותית אנטיגן, חיסון עכבר, פיוז'ן תא, עקיף ELISA תחרותי ליפידים monoclonal הכנה.
ראוי לציין, קבוצת המחקר שלנו יש כבר לומד היווצרות של mAbs נגד תרכובות ביו קטנה של תרופות סיניות מסורתיות, פיתוח היישומים שלהם במשך שנים. במחקרים שלנו מתמשך, פיתחנו mAbs נגד baicalin16, puerarin17,18, חומצה glycyrrhizic, paeoniflorin19, Re ginsenoside20, ginsenoside Rh121, הרבה מולקולות קטנות אחרות. פרוטוקולים אליסה שלנו המבוססת על mAbs אלה שימשו מספר מחקרים כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של מולקולות קטנות אלה, כמו גם הגומלין שלהם עם אחרים תרכובות ביו. יתר על כן, באמצעות mAbs האלה, גם פותחו שיטות כרומטוגרפיה immunoaffinity ההפרדה של מבנים מקבילים, כולל epimers. לאחרונה, הכנו של ראגנטים לרוחב זרימה באמצעות שלנו mAb anti-puerarin ששימש לאחר מכן לצורך זיהוי מהיר, באתר של מתחם זה. התוצאות שלנו מציינים כי מבחני מבוססי mAb שלנו הם כלי חיוני, נוח ללמוד את הביולוגיה ואיכות טבעי-מוצר-derived תרכובות, במיוחד אלה בשימוש תרופות סיניות מסורתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעה במחקר זה אושרו על ידי ועדת ביקורת אתית באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (אישור מספר 2016BZYYL00109).
הערה: עכברים BALB הנשי/c (בן 8 שבועות) היו חיסון עם מנשא הפטן חלבון conjugates. כאשר נעשה שימוש לבד, מולקולה קטנה (< 1,000 Da) לא יכול להפיק תגובה חיסונית. עם זאת, conjugating של מולקולה קטנה תוצאות מקרומולקולה נושא אנטיגן סינתזה. בהקשר זה, מולקולה קטנה מסומנת בתווית של הפטן. הפטן ההטיה היא אסטרטגיה נחוץ ויעיל לייצור mAb. כדי להימנע תגובתיות קרוס, שתי נושאות חלבונים שונים, כגון אלבומין שור (BSA), אובלבומין (פשוט) או חור המנעול מגנטיים המוציאנין (KLH) BSA, וצריך לשמש immunogens (עבור חיסון בעלי חיים), ציפוי אנטיגנים (כדי להרגיע את הצלחת. בשביל אנטי-סרום הזיהוי). BSA וביצית משמשים כדוגמה של פרוטוקול זה.
1. הכנת Immunogen ואת ציפוי אנטיגן
הערה: סינתזה מלאכותית אנטיגן, לשימוש הקבוצה הפונקציונלית המתאים (למשל, הידרוקסיל, carboxyl sulfhydryl חומצה, או אמינו) כזרוע צד עבור איגוד קוולנטיות עם חלבון נשא. הבניין שיטות כוללות periodate חמצון בשיטת carbodiimide, תגובה anhydrides מעורב, תגובת גלוטראלדהיד, בשיטת succinate. פרוטוקול זה משתמש naringin (NAR), גליקוזיד מוכרות flavanone, תרכובת דוגמה. קריין הוא קטן תרכובת (581 Da) נוכח פירות הדר, כמו גם תרופות סיניות מסורתיות שונות.
- השתמש תהליך חמצון periodate לסנתז conjugates קריין-BSA וביצית נאר.
- להמיס 50 מ"ג של קריין במים-ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל22.
- להוסיף 100 µL של נתרן הטרי periodate פתרון (0.1 M) 5 מ של הפתרון נאר. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר מאובטח.
- להמיס 4 מ ג של BSA וביצית ב mL 2.0 מאגר קרבונט 50 מ מ (pH 9.6). להוסיף חלבון זה פתרון נאר/הנתרן periodate תערובת התגובה.
- התאם את התערובת pH 9 עם 1 מ ' נה2CO3 פתרון ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 6-8 שעות.
- Dialyze את תערובת התגובה בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) באמצעות קרום דיאליזה (MWCO 10 kDa) במשך 3 ימים להחליף הלמ ס.
- לנתח את המספר המשלים הפטן-המוביל באמצעות מטריקס בסיוע לייזר desorption/יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF)-MS.
- לערבב 1-10 pmol של לחשב את המשלים שלו עם 103-מקפלים טוחנת עודף של חומצה sinapinic תמיסה מימית המכילה 0.15% חומצה trifluoroacetic (TFA). יבש את התערובת על מגש מדגם באוויר.
- לבצע את ניתוח באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטר מסה מצויד עם לייזר פעמו חנקן המופעל ב- 337 ננומטר. רוכשים יון חיובי MALDI המוני ספקטרה במצב לינארי בטווח המוני (מ/z) של 15,000-100,000 כפי שתואר22.
2. חיסונים
הערה: סך של BALB/c 5 נקבות עכברים (בן 8 שבועות) שימשו: 4 עבור נאר נזווג התחסנות ו- 1 התחסנות שליטה (PBS).
- החיסון הראשון, מערבבים 50 µg של המספר המשלים (מדולל ב 100 µL ל- PBS) עם אמצעי אחסון שווה של אדג'וונט מלאה של פרוינד (CFA), emulsify לחלוטין. לנהל µL 100 של תערובת זו את כל העכבר באמצעות הגבי בזריקה תת עורית.
- שבועיים לאחר מכן, לספק זריקת חיסון (100 µL) באמצעות הזרקה תת-עוריים עם אותה כמות של המספר המשלים מעורבב עם לא שלם אדג'וונט (IFA).
- לחלץ µL 200 של דם מ וריד הזנב העכבר כל 7 ימים מאוחר יותר כדי לקבל סרום.
- צנטריפוגה הדם ב 3000 g x עבור 10 דקות להעביר את הנסיוב supernatant צינור טריים.
- לנתח בנסיוב באמצעות אליסה כפי שתואר לעיל21. בחר את העכבר עם כייל נוגדנים הגבוהה סרום לשימוש עבור תא פיוז'ן.
- כהכנה תא פיוז'ן, לנהל התחסנות פעמו כדי העכבר שבחרת באמצעות הזרקה בקרום הבטן של 50 µg של לחשב את המשלים שלו ב- 300 µL ל- PBS ללא אדג'וונט 3 ימים לפני פיוז'ן.
הערה: שלב זה יכול להיות מושמט אם כייל זה גבוה מספיק.
3. הכנה תא פיוז'ן
- תא פיוז'ן הכנה בינונית
- עבור המדיום סלקטיבי hypoxanthine-aminopterin-תימידין (כובע): להמיס 50 x הכובע מדיה תוספת של 10 מ"ל של RPMI-1640 ולהוסיף תערובת זו עד 500 מ"ל של RPMI-1640 המכיל 20% FBS.
הערה: כאשר 10 מ ל תרכיז 50 x הם מעורבבת עם 500 מ"ל של תרבות בינוני, הריכוזים הסופי של hypoxanthine, aminopterin ו תימידין הם 100 מיקרומטר, מיקרומטר 0.4 16 מיקרומטר, בהתאמה. - עבור המדיה hypoxanthine-תימידין (HT): להמיס 50 x HT מדיה תוספת של 10 מ"ל של RPMI-1640 ולהוסיף תערובת זו עד 500 מ"ל של RPMI-1640 המכיל 20% FBS. האחרון ריכוזי hypoxanthine תימידין הם 100 מיקרומטר ו 16 מיקרומטר, בהתאמה.
- עבור המדיום סלקטיבי hypoxanthine-aminopterin-תימידין (כובע): להמיס 50 x הכובע מדיה תוספת של 10 מ"ל של RPMI-1640 ולהוסיף תערובת זו עד 500 מ"ל של RPMI-1640 המכיל 20% FBS.
- התרבות התאים Sp2/0-Ag14.
- לפחות 7 ימים לפני היתוך, להפשיר במהירות בקבוקון של נוזלי מוקפאים חנקן SP2/0-Ag14 תאים מיאלומה במים חמים.
- להעביר את הפתרון תא 5 מ של תרבות טריים בינונית (RPMI-1640), צנטריפוגה 10 דקות ב- 1000 g x.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את המדיום תרבות, resuspend התאים טרי RPMI-1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS).
- להעביר את התאים ואת בינוני לתוך בקבוקון2 25 ס מ, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2.
- להרחיב את התאים 3 או 4 75 ס מ2 מבחנות לפני פיוז'ן.
- הכנה של תאים בשכבה מזין בטן
- להקריב עכבר ICR לבקן בן שבוע 12 מאת נקע בצוואר הרחם עד יום אחד לפני תא פיוז'ן ויציפו אותה ב- 75% אתנול.
- לאחר הסרת הפרווה מהבטן עם מלקחיים hemostatic, לחטא את האזור עם 75% אתנול. לחתוך את העור החיצוני כדי לחשוף את חלל הבטן. להזריק 3 מ"ל של אמצעי RPMI-1640 סטרילי לתוך הבטן, עיסוי הבטן כדי לנתק תאים נוספים לתוך הפתרון. האחות התליה תא מזין לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.
- לאחר צריך שתוציאו התליה תא 10 דקות ב- 1000 g x, למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מזין בתאים 20 מ של הכובע בינוני סלקטיבי.
- העבר את התאים 96-ובכן תא תרבות לוחות (100 µL טוב). דגירה הלוחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
4. תא פיוז'ן
- לאחר חיסון הנבחרים העכבר הוכן עבור תא פיוז'ן (ראה שלב 2.4), לניהול זריקה בקרום הבטן של 10% כלורין (הרדמה) ולהקריב העכבר לחסן באמצעות נקע בצוואר הרחם.
- לאסוף דם נוסף מהלב (1 מ"ל), ולהכין סרום כפי שמתואר בשלב 2.3.1 להשתמש כפקד חיובית במהלך הבחירה ליפידים.
- להסיר את רקמת העור והשריר באמצעות מספריים כדי לחשוף את הטחול.
- לבודד את הטחול עם פינצטה בקפידה ולשטוף את הטחול עם RPMI-1640. לחתוך את הטחול לחתיכות ולדפוק לאט את הטחול כדי triturate. הכן השעיה תא הטחול על ידי הקשה על רקמת טחול דרך מסננת תא רשת 800 לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
- רחץ התליה תא טחול RPMI-1640 בינונית. לקצור תאי הטחול על ידי צנטריפוגה (1000 x g, 10 דקות ו- 4 ° C), ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה כביסה שלוש פעמים.
- להסיר תאים מיאלומה מעובדים, מוגבר החממה, המבחנות לקבל השעיה תא בעדינות של ברז/שייק. לשטוף את הבולם עם RPMI-1640 בינוני פעמיים כדי להסיר את FBS.
הערה: זהו צעד חיוני כפי FBS עשויים להשפיע תא פיוז'ן. - לספור את התאים ולהתאים את הריכוז לפני ערבוב עם תאי הטחול. היחס הסופי של הטחול תאים תאים מיאלומה צריך להיות בין 1:5 ו- 1:10.
- מערבבים התא הטחול ההשעיה ותאי מיאלומה. Centrifuge את התערובת תא (1000 x g, 10 דקות ו- 4 ° C), ולהסיר את תגובת שיקוע.
- להוסיף 1 מ"ל של 50% פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון לתאים ומערבבים בעדינות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה. משהים 30 s.
הערה: הפתרון פג בשימוש בשלב זה אמור להכיל 50% (w/v) פוליאתילן גליקול 1500 ו- 10% (v/v) דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ב- PBS ללא סידן (Ca2 +). - להוסיף 2 מ של RPMI-1640 בינונית למשך 2 דקות לסיים את התגובה. להוסיף 2 אוטם שריר נוספים של RPMI-1640 בינונית עבור עוד 1 דקות, ולאחר מכן להוסיף של 10 מ"ל נוספים של RPMI-1640 בינוני.
- Centrifuge התאים ב g 800 x 10 דקות. לאחר השמטת את תגובת שיקוע, להוסיף את הכובע פתרון ולהמשיך לטפח את התאים. לאחר מכן להוסיף 100 µL של התליה תא כל טוב של הלוחות בשכבה מזין, תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 7 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
הערה: בתנאים אלה תאי מיאלומה unfused ימותו בזמן התאים ליפידים ימשיך לגדול בטווח הבינוני כובע. לאחר 7 ימים, ליפידים monoclonal יהוו כמו מקבץ יחיד של תאים בתוך הבאר, בעוד בארות המכיל ליפידים polyclonal יהיו אשכולות מרובים של תאים. - וארוקן את תגובת שיקוע לניתוח המדיום והחלף HT בינוני.
הערה: הקפד להחליף את המדיום כובע עם HT הראשון בינוני כמו מיתוג ישירות אל unsupplemented בינוני הוא מזיק ליפידים.
5. עקיף ELISA תחרותי (icELISA)
- מעיל צלחת 96-ובכן עם קריין-ביצית (µg 1/mL, µL 100/טוב), תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C או ללון ב 4 º C.
- חוסמים את הצלחת עם 300 µL של GPBS (PBS המכיל 1% m/v ג'לטין) h 1 ב 37 ° C כדי למנוע ספיחה שאינם ספציפיים.
- לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם TPBS (PBS המכילה 0.05% v/v Tween-20).
- לדלל נאר unconjugated לתוך סדרה של ריכוזי עם 10% מתנול. להוסיף 50 µL של אלה דילולים להפרדת בארות. הבארות אחרים, הוסף µL 50 של סרום אנטי או ליפידים supernatant (מכיל mAbs). דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 100 μL שאותה ניתן להתאים peroxidase אנטי עכבר IgG לבאר כל, תקופת דגירה של h 1 נוספים.
- אחרי כביסה לצלחת שלוש פעמים עם TPBS, להוסיף 100 µL של פתרון המצע (0.1 M ציטראט מאגר (pH 4) המכיל 0.015% v/v H2O2 ו- 2 מ"ג/מ"ל של 3, 3', 5, 5-tetramethyl benzidine (שוייץ)) לכל אחד טוב ואני תקופת דגירה של 15 דקות.
- לעצור את התגובה על-ידי הוספת µL 50 של 1 מ' H2אז4 כדי מכל קידוח.
- למדוד את ספיגת שימוש בקורא microplate-450 ננומטר. לבחור את hybridomas זה מופרש הריכוזים הגבוהים ביותר של נוגדנים נאר לתוך שלהם תגובת שיקוע הכנה נוספת.
6. הכנת Monoclonal Hybridomas
- השתמש בשיטת דילול המגביל להכין את hybridomas monoclonal.
- לאחר הסרת המדיום HT hybridomas שנבחר (קרי, אלו חיוביים על הפרשת נוגדנים נאר), resuspend תאי RPMI-1640, לספור אותם.
- לדלל את התאים כדי ריכוז 1 תאים, 2 תאים ותאים 4 לכל באר µL 100 של RPMI-1640 בצלחת 96-ובכן. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- לאחר 7-10 ימים, לזהות את הנוגדנים נאר בתרבות supernatant באמצעות פרוטוקול icELISA (שלב 5). להעביר תאים מ hybridomas הם חיוביים עבור נאר נוגדנים. ובכן 24 צלחות, 25 ס מ2 בקבוקונים של 75 ס מ2 מבחנות לטיפוח.
- Cryopreserve את hybridomas monoclonal.
- לקצור את התאים ולהעביר אותם צנטריפוגה צינורות.
- לאחר צריך שתוציאו את התאים (800 x g, 10 דקות), הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי הקפאה בינוני (RPMI-1640, סרום עגל עוברית 20% (FCS) ו- 10% דימתיל סולפוקסיד). להעביר את המתלים תא cryotubes.
- אחסן את cryotubes בתוך קופסת קירור הדרגתי ב-80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. ואז להעביר את cryotubes חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דור של monoclonal hybridomas
המשקל המולקולרי של המספר המשלים הפטן-המוביל אושר ע י ניתוח MALDI-תוף-MS. כמו המשקל המולקולרי של BSA והן את קריין ידועים, יכול לחשב את מספר מולקולות קטנות מצומדת עם BSA. איור 1 מציג תוצאות ספקטרלי נציג NAR-BSA22, אשר מציג לשיא רחב מ/z 77,058. כמו המשקל המולקולרי הממוצע של BSA 66,430, נראה כי לפחות 18 נאר מולקולות (MW 581) היו מצומדת עם BSA (יחס צימוד טוחנת (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs בוצעו כדי לקבוע את סרום אנטי titers בעקבות חיסון עכבר22. נראה כי titers נוגדנים בסרום של העכברים ארבע חיסון עם המספר המשלים קריין-BSA היו גבוהות משמעותית מזה שנצפה עבור שליטה בעכבר (איור 2). העכבר עם כייל הגבוה ביותר (מעל 1:5, 000) שימש תא פיוז'ן.
לאחר תאי הטחול של העכבר הזה היו התמזגו התאים בשכבה מזין בטן, hybridomas היו בוגר בינוני 7 ימים בתוך הקטע הנבחר. באמצעות icELISAs, נבדקה התרבות תא supernatant, andthehybridomas חיובי עבור נאר mAbs היו recloned, מורחב. הדימויים באיור 3 להמחיש את התוצאות קונבנציונליים עבור שורות תאים ליפידים monoclonal, polyclonal יציב.
ההקרנה ויישום של mAb אנטי-נאר
הנקודה הקריטית של הניסוי הזה היא הקרנת הסרט mAb ירידה לפרטים. התוצאות בטבלה 1 להפגין mAb בניסוי זה הגיבה עם קריין אבל לא חסימה מאגר או מנשא חלבונים22. יתר על כן, יחודיות של mAb הוערך עוד יותר על-ידי בדיקת אשיג שלה עם תרכובות קשורות מבחינה מבנית. בטבלה 2 מציג את תעריפי אשיג מחושב. קצב אשיג פלבנואידים אחרים שנבדקו היו כל פחות מ- 2%, ברור כי זו mAb הוא ספציפי נאר22.
IcELISA פותחה באמצעות mAb אנטי-נאר וסימונים היישום של מתודולוגיה זו. באמצעות פתרונות המכילים ריכוזים ידועים של קריין, עיקול רגיל סומן באמצעות absorbances את הפתרונות הללו, הטווח ליניארי של העקומה דגם S מחושב (ראה שיבוץ איור הימנית העליונה). משוואת הרגרסיה הליניארית (כאשר y =-0.176 + 1.1243, R2 = 0.9978) מחושב עבור עקום זה ניתן להחיל על ניתוח כמותי של דגימות לא ידוע.
ייצור ואפיון של mAb נגד חומצה glycyrrhizic
באמצעות פרוטוקול פיוז'ן זה תא splenocyte/מיאלומה, ליפידים monoclonal מפריש mAb חומצה anti-glycyrrhizic, בשם DF5, היה גם הוקמה18. סוג המשנה של mAb DF5 הזה זוהה IgG1 עם שרשרת בהיר kappa (טבלה 3). בדומה הניתוח לעיל, mAb שימש הקרנה נוספים ויישומים, בעוד hybridomas monoclonal אנטיגן ספציפי היו andcryopreserved המורחב של חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
| חומר ציפוי | ערך450 | אשיג (%) |
| קריין-ביצית | 0.97 | 100 |
| ביצית | 0.056 | < 0.01 |
| BSA | 0.068 | < 0.01 |
| ג'לטין | 0.053 | < 0.01 |
| חלב רזה | 0.05 | < 0.01 |
טבלה 1. תגובתיות של אנטי-נאר mAb עם קריין-ביצית, מנשא חלבונים.
| סיווג | תרכובת | אשיג (%) |
| פלבנואידים | Naringin | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| Neohesperidin | 18.80% | |
| רוטין | 1.95% | |
| Baicalein | < 0.09% | |
| Hyperoside | < 0.09% | |
| טרפנים | Ginsenoside Rg2 | < 0.09% |
| Ginsenoside Rb1 | < 0.09% | |
| Ginsenoside Re | < 0.09% | |
| Notoginsenoside | < 0.09% | |
| חומצה Glycyrrhizic | < 0.09% | |
| חומצה Glycyrrhetic | < 0.09% | |
| Saikosaponin | < 0.09% | |
| Paeoniflorin | < 0.09% | |
| Gentiopicrin | < 0.09% | |
| Sterides | חומצה כולית | < 0.09% |
| חומצה Deoxycholic | < 0.09% | |
| Anthraquinones | Rheumemodin | < 0.09% |
| חומצה rheinic | < 0.09% | |
| אחרים | חומצה Salvianolic | < 0.09% |
| כורכומין | < 0.09% | |
| Gastrodin | < 0.09% | |
| אמיגדלין | < 0.09% |
בטבלה 2. אשיג (%) של אנטי-נאר mAb נגד נאר ותרכובות הקשורות שלה.
| isotype של שרשרת כבדה | isotype של שרשרת אור | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | איגה | IgM | קאפה | למדא | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
בטבלה 3. ניתוח Isotype של mAb DF5.
איור 1: MALDI-תוף-MS ניתוח של המספר המשלים קריין-BSA. [מ' + H] + , [M + 2H]2 + לציין מולקולות protonated יחיד, כפול של קריין-BSA, בהתאמה. איור זה שונה מ- Qu. et al., 201622
איור 2 : ניתוח של כייל נוגדנים אנטי סרום מאת icELISA. עכברים 1 - 4 היו חיסון עם קריין-BSA נזווג, בעוד הפקד היה חיסון עם רכב (PBS). הנתונים מייצגים הממוצע ± סטיית התקן (SD) (n = 3). איור זה השתנה מ- Qu. et al., 201622. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : להחליפן בתמונות של יציבה monoclonal (א) ו- polyclonal (ב) hybridomas. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : יישום של mAb אנטי-נאר ב icELISA. ריכוזים שונים של קריין היו מודגרות עם mAb בבארות מצופה מראש עם קריין-ביצית (1 mg/mL). A הוא ספיגת בנוכחות לקריין, בעוד0 הוא ספיגת בהיעדר נאר. הנתונים מייצגים הממוצע ± סטיית התקן (SD) (n = 3). איור זה השתנה מ- Qu. et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מוצלחת של mAbs נגד מולקולות קטנות נגזר מוצר טבעי. השלבים החיוניים במסגרת ההליך יש כבר המתוארים, הראו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות נאר כמו מולקולה קטנה דוגמה. דוגמה ספקטרה, תגובתיות ניתוחים ותוצאות icELISA שלהציג את כל נציג ניסיוני ונתונים שליטה שהושגו באמצעות פרוטוקול זה. דוגמה תמונות של hybridomas מספקים ייצוג חזותי של מה החוקר צריך לחפש כאשר המבדילים בין hybridomas monoclonal, polyclonal. יחדיו, הראו כי mAb הייצור, אפיון ולאחר יישום אסטרטגיה המובאים כאן תוצאות ביצירת mAb יעיל נגד מולקולה קטנה, כמו גם רומן שאליסה המבוסס על mAb מסוים יכול לשמש כדי לבדוק הביטוי של מולקולת המטרה במוצרים טבעיים אחרים.
עובד עם כל סוג של נוגדנים, הבעיה הנפוצה ביותר שעלולים להתעורר במהלך הליך זה מזוהה עם הרגישות של mAb. אכן, יש סיכון גבוה mAb שלא יעבוד כמצופה לאור רגישות נמוכה, אשיג גבוהה או גורמים אחרים. כל התהליך לוקח לפחות 4 חודשים כדי לבצע באופן מלא, חשוב לטפל במהלך ההקרנה הראשונית של mAbs המופרשים את hybridomas. היבט חיוני אחד כדי להימנע מיצירת mAb לא יעיל הוא מסך אנטי-סרום על ידי icELISA לפני תא פיוז'ן מאושרות תגובתי עם הפטן אבל לא המוביל. זה מתבצע באמצעות שני חלבונים שונים נשאים (זה במקרה BSA וביצית) immunogen וציפוי אנטיגן נושאות, בהתאמה. במהלך חיסון המספר המשלים הפטן-BSA, החיות יהיה לייצר נוגדנים נגד שני הפטן (למשל, נאר), BSA. לכן, כדי למנוע זיהוי חיובי-false נוגדנים anti-BSA במהלך ההקרנה, הפטן-ביצית אמור לשמש כדי לזהות את הנוגדנים האנטי-הפטן במיוחד. היצירה של נשאים שני חלבונים אלה, כמו גם בעת השימוש בהן מודגשת במפורש בפרוטוקול.
חשוב גם לציין כי במהלך הכנת hybridomas monoclonal, שיטת הדילול מגבילים לעתים קרובות צריך לחזור מספר פעמים עד כל הבארות המכילות את התאים monoclonal הם חיוביים. החזרה הזו מסייעת כדי לוודא כי כל לשבט stably סודות נוגדן ספציפי.
המגבלות של שיטה זו כוללים את תהליך מסובך של ליפידים הדור והספיגה מבחר ליפידים המייצרים נוגדנים הרצוי. עם זאת, ברגע mAb מתקבל ופיתח icELISA, הגילוי של המתחם היעד במוצרים טבעיים ניתן לבצע במהירות וביעילות. ראוי לציין, פרוטוקול זה למנוע חלק ההוצאות הקשורות טכניקות ניתוח אחרות, אינו דורש שימוש בכלים יקרים שוב ושוב עבור כל מוצר טבעי נבדק.
ברגע הופק והוקרן, mAb הפטן יכול להיות בשימוש נרחב במגוון ניתוחים. ב פרוטוקול זה, התמקדנו על השימוש mAb בשיטה המבוססת על אליסה ששימש כדי ללמוד את הביולוגיה של המולקולה קטנה, כמו גם אינטראקציות פרמוקוקינטיים20,22. MAbs אחרים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה גם שימשו כדי ליצור שיטת כרומטוגרפיה immunoaffinity מבוססי mAb דוגל בהפרדה בין מקבילים מבני18, כולל epimers21, כמו גם חומרים זרימה לרוחב23 גילוי מהיר ולא באתר של מולקולת המטרה. מחקרים אלה לסמן יישום נרחב של mAbs המיוצר באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן. כך, הליך זה, mAbs את יצר, מעשים כמו בסיס לפיתוח של שונים למטרה immunoassays מבוססי mAb זה יכול להיות מנוצל בצורה יעילה כמו כלי אנליטי עבור הערכה ובקרת איכות של מוצרי טבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן סין (גרנט מספרים 81573573, 81473338 ו- 81503344), קלאסית מרשם בסיסי צוות המחקר באוניברסיטת בייג'ינג ברפואה הסינית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
