Summary
準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA 解析を使用して抗体の特性の仕様もあります。
Abstract
食品や天然物の生理活性成分の分析は、伝統的な中国医学や食品安全/毒物学を含む多くの分野で研究の人気のエリアになっています。古典的な分析の技術の多くは高価な機器や専門知識を必要とします。特に、酵素抗体法 (Elisa) 食品や天然物の分析のための新たな方法となっています。このメソッドは、ターゲット コンポーネントの抗体検出に基づいています。しかし、天然の生理活性成分の多くが小さい (< 1,000 Da) と免疫反応を誘発しない、それらに対するモノクローナル抗体 (Mab) を作成するは困難です。このプロトコルでは、複数のサンプルの化合物の迅速分析に関連する間接競争 (ic) ELISA を作成に必要なものだけでなく、標的分子に対する抗体を生成するために必要な手順の詳細な説明を提供します。手順では、(すなわち、ハプテン キャリア共役) 人工抗原の合成、免疫、細胞融合、モノクローナルハイブリドーマ準備、モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションと mAb の elisa 法を用いたアプリケーションについて説明します。ハプテン キャリア共役はナトリウムによって合成されたメソッドを過ヨウ素酸し、MALDI TOF MS によって評価されます。予防接種後脾細胞が最も高い抗体価と免疫マウスから分離したし、ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) - 敏感なマウス骨髄腫細胞ライン Sp2/0 - Ag14 と融合、ポリエチレング リコール (PEG) を使用しての手法します。ターゲット抗原に対する反応性抗体産生ハイブリドーマの特異性と交差反応性の icELISA で上映されました。さらに、限界希釈法は、モノクローナル ハイブリドーマの準備に適用されました。最終的な Mab icELISA によってさらに特徴づけられる、天然の例ハプテン (ナリンギン (NAR)) の迅速で簡便な検出のための elisa 法を用いたアプリケーションのために用いられる。
Introduction
モノクローナル抗体 (Mab)、として知られているモノラル特異的抗体、単一 b リンパ球クローンから生成され、すべてが同じエピトープ1にバインドすると 1 価の抗体で構成されています。近年、多く薬用植物由来の天然物は、様々 な病気の2の治療に使用されています。確かに、もともと天然物から派生した多くの小さな分子の化合物が癌2,3paciltaxel (タキソール) ・ マラリアのアルテミシニンなどの最初の行薬として適用されます。天然物の研究は主に途方もない開発と高速液体クロマトグラフィー (HPLC) や質量分析法 (MS) など、従来の解析手法の最適化のための急速な進歩をしました。ただし、まだ複雑な前処理プロトコルや時間、労働/専門知識、および必要な楽器4に関して関連するコストなど、これらの方法に関連付けられているいくつかの制限があります。
最近では、モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法 (Elisa) は、定性的・定量的分析食品や天然物に適用されています。実際には、このメソッドの生体試料分析と臨床検査の両方に適用されているし、も関連付けられているその他の解析5、面倒な前処理手順を回避しながら、正確、敏感、かつ高効率に示されています。 6。
モノクローナル抗体を用いた Elisa を使用して、複雑な天然物を研究する、モノクローナル抗体の調製は、主な手順の 1 つです。残念ながら、Mab は小さな生物活性成分物質6,7,8,9,10、11,12 のこれらのタイプの存在に固有 ,13,14,15蛋白質の抗原と比較して限られています。この問題を回避するためには、具体的には小さな化合物に対して抗体を生成するプロトコルを開発しました。ここで提示されたプロトコルには、人工抗原の合成には、マウス免疫には、細胞融合には、間接競合 ELISA にはモノクローナルハイブリドーマ準備が含まれます。
特に、我々 の研究グループは中国の伝統薬から小さな生理活性物質に対するモノクローナル抗体の形成を勉強と長年彼らのアプリケーションを開発されています。当社の継続的研究では、baicalin16、puerarin17グリチルリチン酸18、ペオニフロリン19、ジンセノ サイド Re20、ジンセノ サイド Rh121、および他の多くの小さい分子に対して抗体を開発しました。これらの Mab に基づいて私達の ELISA のプロトコルは、その他の生理活性物質との相互作用と同様に、これらの小さな分子の薬物動態を評価する多くの研究で使用されています。さらに、これらのモノクローナル抗体を使用して、構築した immunoaffinity クロマトグラフィー法黒淵を含む構造の類似物の分離。最近では、この化合物、敷地内に急速な検出のために使用されました私たちの抗 puerarin モノクローナル抗体を用いた側方流動免疫測定法をご用意しました。モノクローナル抗体アッセイが生物学と伝統的な中国薬で使用される特にそれら天然由来製品化合物の質を研究するための不可欠なツールであることが示唆されました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究で動物の手続きのすべては、中国医学 (承認番号 2016BZYYL00109) の北京大学の倫理審査委員会によって承認されています。
注: 女性 BALB/c マウス (8 週齢) はハプテン キャリア蛋白抱合体で免疫しました。単独で、使用する小分子 (< 1,000 Da) 免疫反応を引き出すことはできません。しかし、抗原の合成高分子キャリアに小さな分子を活用します。この文脈では、小さな分子は、ハプテンにラベルを付けます。ハプテン共役は、モノクローナル抗体の生産のために必要かつ効果的な戦略です。ウシ血清アルブミン (BSA) や卵白アルブミン (OVA) 鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) など、2 つの異なる蛋白質キャリア交差反応を避けるために、(コート用プレートに (動物の予防接種) の混合とコーティング抗原として使用する BSA、抗血清の検出)。BSA と卵子は、このプロトコルの例として使用されます。
1. 免疫およびコーティングの抗原の準備
注: 人工抗原の合成の適切な機能グループ (例えば、ヒドロキシル基、スルフヒ カルボキシル基酸、またはアミノ酸) のとして使用側の腕にキャリア蛋白と共有結合。活用方法には、過ヨウ素酸酸化、カルボジイミド法、混合酸無水物の反応、グルタルアルデヒド反応コハク酸法。このプロトコルは、例の化合物としてナリンギン (NAR)、有名のフラバノン配糖体を使用します。NAR は小さなコンパウンド (581 Da) 様々 な漢方薬と同様に、柑橘系の果物に存在です。
- 過ヨウ素酸酸化プロシージャを使用して、NAR BSA と NAR-卵子複合体を合成します。
- 最終濃度 1 mg/mL22で水に NAR の 50 mg を溶解します。
- 作りたてのナトリウムの 100 μ L は、NAR 溶液 5 mL にソリューション (0.1 M) を過ヨウ素酸を追加します。混合物を 1 時間室温で攪拌します。
- 2.0 mL の 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) BSA の OVA 4 mg を溶解します。このタンパク質を加える NAR/ナトリウムの解決策は、反応混合物を過ヨウ素酸。
- 1 M Na2CO3溶液を pH 9 混合比を調整し、6-8 時間室温で攪拌します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 3 日間透析膜 (MWCO 10 kDa) を使用して、CBS を交換するで反応混合物を dialyze します。
- マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI tof) 時を使用してハプテン キャリア共役を分析-MS。
- 共役の 10 の 1-10 pmol のミックス3-0.15% トリフルオロ酢酸 (TFA) を含む水溶液中の sinapinic 酸のモル超過分を折る。空気中サンプル皿に混合物を乾燥させます。
- パルス窒素レーザー装備質量運営 337 MALDI TOF を使用して分析を行う nm。15,000 100,000 として前述の22の質量範囲 (m/z) 内で線形モードで正イオン MALDI マススペクトルを取得します。
2. 予防接種
注: 5 BALB/c マウス (8 週齢) の合計が使用されて: nar 4 共役予防接種とコントロール (PBS) 予防接種のための 1。
- 最初の予防接種の Freund 完全アジュバント (CFA) の等量を (100 μ L の PBS で希釈) 共役の 50 μ g を混合し、完全に乳化します。この混合物を 100 μ L を各マウス経由で背側皮下注射に管理します。
- 2 週間後は、同じ不完全なアジェバント (IFA) と混合共役量とブースターの皮下注射によるワクチン接種 (100 μ L) を提供します。
- 200 μ L の血液のすべてのマウスの尾静脈から 7 日後に抽出血清を入手します。
- 10 分間遠心分離機 3,000 x g で血は新鮮なチューブに上清の血清を転送します。
- 前述の21として ELISA を用いた血清を分析します。細胞融合に使用する最高の血清抗体価とマウスを選択します。
- 細胞融合の準備で、融合前に 3 日間 300 μ L の PBS 補助なしで共役の 50 μ g の腹腔内注入を介して選択したマウスにパルス予防接種を管理します。
注: 力価は十分に高い場合は、この手順を省略できます。
3. 細胞融合のための準備
- セル融合中準備
- ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) の選択的な媒体のため: RPMI 1640 の 10 mL の帽子メディア サプリメント x 50 を溶かし RPMI 1640 の 500 mL にこの混合物を追加して 20% を含む政府短期証券。
注: 50 倍濃縮の 10 mL は、500 mL の培地で希釈されて、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンの最終濃度が 0.4 μ M、100 μ M、16 μ M それぞれ。 - ヒポキサンチン チミジン (HT) メディア: RPMI 1640 の 10 mL で HT メディア サプリメント x 50 を溶かし RPMI 1640 の 500 mL にこの混合物を追加して 20% を含む政府短期証券。ヒポキサンチンとチミジンの最終濃度は、それぞれ 100 μ M と 16 μ M です。
- ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) の選択的な媒体のため: RPMI 1640 の 10 mL の帽子メディア サプリメント x 50 を溶かし RPMI 1640 の 500 mL にこの混合物を追加して 20% を含む政府短期証券。
- Sp2/0-Ag14 細胞を培養します。
- 融合、前に少なくとも 7 日間は急速に液体窒素凍結 SP2/0-Ag14 骨髄腫細胞に暖かい水の入った瓶を解凍します。
- 新鮮な培地 (RPMI 1640 年) 5 mL、1000 × g で 10 分間遠心する携帯ソリューションに転送します。
- 遠心分離の後培養培地を削除し、新鮮な RPMI 1640 年 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した細胞を再懸濁します。
- 25 cm2フラスコに細胞と培地を転送し、37 ° c 5% CO2の大気中で孵化させなさい。
- 3 または 4 75 cm2フラスコ融合前にセルを展開します。
- 腹部フィーダー層細胞の調製
- 頚部転位前日細胞融合によってアルビノ 12 週齢 ICR マウスを犠牲に、75% エタノールで水没します。
- 止血鉗子で腹部から毛を除去した後、エタノール 75% と領域を消毒します。腹腔内を公開する外側の皮膚をカットします。腹部に RPMI 1640 生殖不能媒体の 3 mL を注入し、ソリューションに追加のセルをデタッチするのには腹部をマッサージします。15 mL 遠心管にフィーダー細胞懸濁液を吸い出しなさい。
- 1000 × g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心分離後上澄みを廃棄し、帽子選択培地 20 mL にフィーダー細胞を再懸濁します。
- 96 ウェルの細胞培養皿 (100 μ L/ウェル) にセルを転送します。一晩で 37 ° C、5% CO2版を孵化させなさい。
4. 細胞融合
- マウスがセル融合のため準備されている選択された接種後 (ステップ 2.4 を参照)、10% 抱水クロラール (麻酔薬) の腹腔内注射し、頚部転位を介して免疫マウスを犠牲に。
- (1 mL)、心の底から追加の血液を収集し、手順 2.3.1 ハイブリドーマ選択中に肯定的な制御として使用する血清を準備します。
- 脾臓を公開するはさみを使用して皮膚や筋肉組織を削除します。
- 慎重にピンセットで脾臓を分離し、RPMI 1640 と脾臓を洗ってください。脾臓を切るし、ゆっくりカップ刻んだ脾臓をポンドします。50 mL の遠心管にセルにある、800 メッシュのストレーナを脾臓組織を押すことによって脾臓細胞懸濁液を準備します。
- RPMI 1640 媒体と脾臓細胞懸濁液を洗います。遠心 (1000 × g、10 分、4 ° C) で脾臓細胞を収穫し、その後、上澄みを廃棄します。この洗浄工程を 3 回繰り返します。
- インキュベーターから栽培し、増幅された骨髄腫細胞を除去し、軽くタップ/シェイク フラスコ細胞懸濁液を取得します。この懸濁液、FBS を削除する 2 回 RPMI 1640 中を洗ってください。
注: これは、不可欠なステップ FBS 細胞融合に影響を与える可能性があります。 - セルをカウントし、脾臓細胞と混合する前に濃度を調整します。骨髄腫細胞に対する脾臓細胞の最終的な比率は、1:5、1:10 の間でなければなりません。
- 脾臓細胞懸濁液および骨髄腫細胞をミックスします。セルの混合物 (1000 × g、10 分、4 ° C) を遠心し、上清を除去します。
- セルに 50% ポリエチレング リコール (PEG) 溶液の 1 mL を追加し、優しく 1 分の 37 ° C で攪拌します。放置 30 秒。
注: この手順で使用される止め釘の解決が 50% (w/v) ポリエチレング リコール 1500 を含める必要があります、10% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO) PBS のカルシウム (Ca2 +) なし。 - おかなければ、反応を終了する 2 分の 2 mL を追加します。別の 1 分に RPMI 1640 媒体の追加 2 mL を追加し、RPMI 1640 媒体の追加 10 mL を追加します。
- 10 分間 800 x g で細胞を遠心します。上清を廃棄後帽子ソリューションを追加し、セルを育成し続けます。フィーダー層プレートの各ウェルに細胞懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2で 7 日間の版を孵化させなさい。
注: これらの条件下で縮合骨髄腫細胞は死亡し、ハイブリドーマ細胞が HAT 培地で成長を続けるでしょう。7 日後モノクローナルハイブリドーマはポリクローナル ハイブリドーマを含む井戸がセルの複数のクラスターを持っているだけでなく、細胞の 1 つのクラスターとして形成します。 - 分析の上清を吸引し、HT 媒体に媒体を置き換えます。
注: する帽子の中に置き換えてください HT 培培地に直接切り替え中最初はハイブリドーマ培養に有害であります。
5. 間接競合 elisa 法 (icELISA)
- NAR OVA (1 μ g/mL、100 μ L/ウェル) と 96 ウェル プレートをコートし、37 ° c または一晩 4 ° C で 1 時間インキュベート
- 非特異吸着を防ぐために 37 ° C で 1 時間 GPBS (1 %m/v ゼラチンを含む PBS) の 300 μ L でプレートをブロックします。
- TPBS (0.05 %v/v トゥイーン 20 を含む PBS) を 3 回洗浄します。
- 10% メタノール濃度のシリーズに非 NAR を希釈します。井戸を分離するこれらの希釈の 50 μ L を追加します。他の井戸の抗血清またはハイブリドーマ培養上清 (Mab を含む) の 50 μ L を追加します。37 ° C で 1 時間の版を孵化させなさい
- ペルオキシダーゼ標識抗マウス igg 抗体を各ウェルに 100 μ L を追加し、さらに 1 時間インキュベートします。
- TPBS に板を 3 回洗浄した後追加基板の解決の 100 μ L (0.1 M クエン酸バッファー (pH 4) 含む 0.015 %v/v H2O2と 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-テトラメチル ベンジジン (TMB)) それぞれにも、15 分間インキュベートします。
- だから 1 M H2の 50 μ L の追加によって反作用を停止を各ウェル4 。
- 測定吸光度をマイクロ プレート リーダーを使用して 450 nm。さらに準備のため、清にナール抗体の濃度が高い分泌ハイブリドーマを選択します。
6. モノクローナル ハイブリドーマの作製
- 限界希釈法を使用してモノクローナル ハイブリドーマを準備します。
- 選択したハイブリドーマから HT 培地を除去した後 (すなわち、それらはナール抗体の分泌の肯定的な) RPMI 1640 年に細胞を再懸濁します、それらを数えます。
- 1 つのセル、2 セル、および 100 μ L RPMI 1640 の 96 ウェル プレートでの井戸あたり 4 細胞の濃度に細胞を希釈します。37 ° c、5% CO2プレートを孵化させなさい。
- 7 ~ 10 日後に、icELISA プロトコル (手順 5) を使用して上清の文化で NAR 抗体を検出します。24 ウェル プレート、25 cm2フラスコおよび耕作のための 75 cm2フラスコにナール抗体陽性ハイブリドーマからセルを転送します。
- モノクローナル抗体のハイブリドーマを凍結します。
- セルを収穫し、チューブを遠心分離機にそれらを転送します。
- (800 × g, 10 分) 細胞を遠心分離後上澄みを除去し、凍結中 (RPMI 1640、20% 牛胎児血清 (FCS)、および 10 %dmso) で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を cryotubes に転送します。
- -80 ° c 24 時間勾配冷却ボックスに、cryotubes を格納します。長期保存用液体窒素、cryotubes を転送します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
モノクローナル ハイブリドーマの生成
Hapten-キャリアの複合体分子の重量は、MALDI TOF 質量分析によって確認されました。BSA と NAR の分子量は知られている、BSA を用いた共役分子の数を計算する可能性があります。図 1には、代表的なスペクトル NAR BSA22 m/z 77,058 ブロードなピークが表示されます結果が表示されます。BSA の平均分子量は 66,430、それは少なくとも 18 の NAR 分子 (MW 581) された BSA の共役を表示されます (モル比 (NAR:BSA) = 18:1)。
icELISAs は、次のマウス免疫22抗血清の抗体価を決定するため行われました。それは NAR BSA 共役免疫 4 マウスの血清抗体価の有意高かったコントロール マウス (図 2) の観察よりも表示されます。最高価とマウス (以上 1 ユニット: 5, 000) 細胞融合に使用されました。
このマウス由来脾細胞は腹部フィーダー層細胞に融合した後、ハイブリドーマが 7 日 inselection 媒体用に栽培されます。IcELISAs を使用して、細胞培養上清中にテストされた、NAR Mab の肯定的な andthehybridomas されたアルギニンし拡大します。図 3の画像は、安定したモノクローナル抗体とポリクローナル ハイブリドーマ細胞株の従来の結果を示しています。
アンチ NAR mAb の探索と応用
この実験の重要なポイントは、モノクローナル抗体の特異性のスクリーニングです。表 1に結果を示す NAR がないブロック バッファーまたはキャリア蛋白質22この実験ではモノクローナル抗体が反応しました。さらに、mAb の特異性は、構造的に関連化合物との交差反応性をテストすることによってさらに行った。表 2は、計算された交差反応率を示しています。その他のフラボノイドの交差反応率のテストとして 2% 以内であった、この mAb は NAR22のために特定であることは明らかです。
IcELISA アンチ NAR モノクローナル抗体を使用して開発された、この方法論の適用を強調します。NAR の既知の濃度の溶液を使用すると、標準曲線カラムベッドこれらのソリューションを使用してプロットした、S モデルの曲線の線形の範囲だった (右図左下のように) 計算されます。直線回帰式 (y = 0.176 ln(x) + 1.1243、R2 = 0.9978) に対して、この曲線は、未知試料の定量分析に適用できる計算されました。
グリチルリチン酸に対するモノクローナル抗体の作製と解析
この生/骨髄腫細胞融合プロトコルを使用して、名前付き DF5 アンチ グリチルリチン酸モノクローナル抗体を分泌モノクローナルハイブリドーマだったも確立された18です。この DF5 mAb のサブタイプは、kappa の軽鎖 (表 3) に特異的な IgG1 として同定されました。上記の分析と同様に、mAb に使用された追加のスクリーニングのアプリケーションでは、抗原特異的モノクローナル抗体ハイブリドーマは、長期保存用液体窒素の拡張 andcryopreserved。
| コーティング物質 | 450の値 | 交差反応性 (%) |
| Nar OVA | 0.97 | 100 |
| OVA | 0.056 | < 0.01 |
| BSA | 0.068 | < 0.01 |
| ゼラチン | :0.053 | < 0.01 |
| スキムミルク | 0.05 | < 0.01 |
表 1。NAR OVA とキャリア アンチ NAR モノクローナル抗体の反応性タンパク質。
| 分類 | 化合物 | 交差反応性 (%) |
| フラボノイド | ナリンギン | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| 不許可合成甘味料 | 1,880万 % | |
| ルチン | 1.95% | |
| Baicalein | < 0.09% | |
| Hyperoside | < 0.09% | |
| テルペン類 | ジンセノ サイド Rg2 | < 0.09% |
| ジンセノ サイド Rb1 | < 0.09% | |
| ジンセノ サイド Re | < 0.09% | |
| Notoginsenoside | < 0.09% | |
| グリチルリチン酸 | < 0.09% | |
| グリチルレチン酸 | < 0.09% | |
| サイコサポニン | < 0.09% | |
| ペオニフロリン | < 0.09% | |
| Gentiopicrin | < 0.09% | |
| Sterides | コール酸 | < 0.09% |
| デオキシ コール酸 | < 0.09% | |
| アントラキノン | Rheumemodin | < 0.09% |
| Rheinic 酸 | < 0.09% | |
| その他 | Salvianolic 酸 | < 0.09% |
| クルクミン | < 0.09% | |
| Gastrodin | < 0.09% | |
| アミグダリン | < 0.09% |
表 2。交差反応性 (%)NAR およびその関連化合物に対してアンチ NAR mab。
| 重鎖のアイソタイプ | 軽鎖のアイソタイプ | ||||||||
| IgG1 | Igg2a 産 | IgG2b | IgG3 | 伊賀 | IgM | カッパ | ラムダ | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
表 3。MAb DF5 のアイソタイプ分析。
図 1: NAR BSA 共役の MALDI TOF MS 分析します。[M + H]+ [M + 2 H]2 + 、NAR BSA の単一および二重プロトン化分子をそれぞれ示します。この図は、クら、2016年22から変更されています。
図 2:抗血清抗体価の icELISA の解析。1-4 に NAR BSA と接種した共役、制御車 (PBS) で予防接種を受けている間。データは、平均 ± 標準偏差 (SD) を表す (n = 3)。この図は、クら、2016年22から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:代表的な画像(A) とポリクローナル抗体 (B) ハイブリドーマを安定した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 、IcELISA でアンチ NAR mAb のアプリケーション。NAR OVA (1 mg/mL) でプレコート井戸におけるモノクローナル抗体を添加して NAR の濃度。A は NAR の存在下で吸光度0は NAR の不在で吸光度。データは、平均 ± 標準偏差 (SD) を表す (n = 3)。この図は、クら、2016年22から変更されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、自然製品由来の低分子抗体の巧妙な生産のためのプロトコルを提案する.重要な手順が記載されているし、我々 は例小分子として NAR を使用してこのプロトコルの有用性を示しています。例スペクトル、反応性の解析と icELISA の結果は、代表実験と、このプロトコルを使用して取得コントロール データを表示します。ハイブリドーマの例の画像は、どのような研究者を探していなければならないポリクロ ・ モノクロ ハイブリドーマを区別するときの視覚的表現を提供します。一緒に取られて、我々 は、mAb 生産、キャラクタリゼーション、およびアプリケーション戦略結果で次に示します ELISA テストするために使用することができます特定のモノクローナル抗体に基づく小説だけでなく、小分子に対する効果的なモノクローナル抗体の作成を示しています。他の天然物のターゲット分子の式です。
抗体の任意の種類を使用して、この手順の間に生じる可能性のある最も一般的な問題は、mAb の感度に関連付けられます。確かに、mAb は低感度、高い交差性またはその他の要因により正常に動作しないリスクが高いがあります。全体の手順は、完全に実行する、少なくとも 4 ヶ月かかります、ハイブリドーマから分泌される抗体の最初のスクリーニングに世話をすることが重要です。効果がモノクローナル抗体の作成を避けるために 1 つの重要な側面は、細胞融合、ハプテンがなく、キャリアと反応を確認する前に icELISA で抗血清を画面することです。これはそれぞれ免疫やコーティング抗原キャリアとして (この場合 BSA と OVA) で 2 つの異なる蛋白質キャリアを使用して実行されます。ハプテン BSA 共役、予防接種中に動物 (例えばNAR)、両方のハプテン抗体が生成されますと BSA。したがって、スクリーニング中に抗 BSA 抗体の誤検出を避けるために、ハプテン-卵子を具体的に抗ハプテン抗体を検出する使用してください。プロトコルで明示的にそれらを使用するを強調するときと同様、これら二つのタンパク質のキャリアの作成。
また、モノクローナル抗体のハイブリドーマの準備中、限界希釈法が、モノクローナル細胞を含む井戸のすべてが正になるまで数回繰り返すしばしば必要に注意することが重要です。確認することができますこの繰り返しすべて秘密に特異抗体クローン安定。
このメソッドの制限事項には、ハイブリドーマ世代の複雑なプロセスや目的抗体産生ハイブリドーマの選択のために必要な時間が含まれます。ただし、mAb を取得すると、icELISA の開発、迅速かつ効率的に、天然物のターゲット化合物の検出を実行できます。特に、このプロトコルはいくつかの他の分析手法に関連付けられているコストを回避は、高価な楽器の使用繰り返しのすべての自然な製品のテストします。
一度制作・上映、ハプテン mAb はさまざまな解析に広く使用できます。このプロトコルでは、20,22の薬物動態学的相互作用と同様、小さい分子の生物を勉強する ELISA 法は、モノクローナル抗体の使用に着目。このプロトコルで作成された他の Mab は、構造類似物18、黒淵21、23側方流動免疫測定法などの分離のためのモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティーカラム クロマトグラフィー法を確立に使用されています。標的分子の検出を迅速かつ敷地内。これらの研究は、ここで概説されたプロトコルを使用して生成された Mab の広範なアプリケーションを強調表示します。したがって、この手順と、抗体作成、行為の様々 な開発のための基礎評価と自然製品の品質管理のための解析ツールとして効果的に利用できるモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイを対象として。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81573573、81473338、および 81503344) および古典的な処方基本的な研究チームが北京大学で中国医学のサポートだった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
