Summary
Эта статья содержит подробный протокол для подготовки и оценки моноклональных антител против натуральных продуктов для использования в различных иммуноанализа. Эта процедура включает в себя иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA для положительных клон скрининг и моноклональных гибридомной подготовки. Спецификации для характеризации антитела используя MALDI-TOF-MS и анализа ELISA также предоставляются.
Abstract
Анализ биологически активных компонентов, присутствующих в продукты и натуральные продукты стал популярным области исследования во многих областях, включая традиционной китайской медицины и пищевой безопасности/токсикология. Многие из методов классического анализа требуют дорогостоящего оборудования или опыта. В частности энзим соединенный иммуноферментного анализа (ELISAs) стали возникающих метод для анализа продуктов и натуральных продуктов. Этот метод основан на обнаружении антител опосредованной целевых компонентов. Однако, как многие из биологически активных компонентов в природных продуктах малы (< 1000 да) и не вызывают иммунный ответ, создание моноклональных антител (mAbs) против них часто бывает трудно. В этом протоколе мы предоставляем подробное описание шагов, необходимых для создания mAbs против молекулы-мишени, а также те, которые необходимы для создания связанного косвенные конкурентные (ic) ELISA для быстрого анализа соединения в нескольких образцах. Процедура описывает синтез искусственных антигена (т.е., сопряженное Гаптены перевозчик), иммунизации, слияние клеток, моноклональных гибридомной подготовки, квалификация МАБ и на базе ИФА применение МАБ. Сопряженное Гаптены перевозчик был синтезирован натрия Периодат метод и оценены MALDI-TOF-МС. После иммунизации, splenocytes были изолированы от иммунизированная мышь с высокий титр антител и сливается с гипоксантин аминоптерин тимидина (HAT) - линия клетки миеломы чувствительных мыши Sp2/0 - Ag14 с помощью полиэтиленгликоля (PEG)-на основе метода. Hybridomas секреции mAbs реактивной целевой антигена были экранированы, icELISA специфику и перекрестной реактивности. Кроме того ограничение разведения был применен подготовить моноклональных hybridomas. Окончательный mAbs были также характеризуется icELISA и затем использовать в приложении на основе ELISA для быстрого и удобного обнаружения пример Гаптены (нарингин (нар)) в натуральных продуктов.
Introduction
Моноклональные антитела (mAbs), также известный как моно специфические антитела, производятся из одного клонов лимфоцитов и состоят из моновалентной антител, что все привязки к же эпитоп1. В последние годы множество лекарственных растений, полученных натуральные продукты используются в лечении различных заболеваний2. Действительно многие малые высокомолекулярных соединений, первоначально полученных от натуральных продуктов теперь применяются в качестве первой линии препаратов, таких как артемизинина для малярии и paciltaxel (Таксол) для рака2,3. Изучение природных продуктов достигнут быстрый прогресс, во многом благодаря огромным развития и оптимизации обычных анализа методов, включая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия (МС). Однако есть еще некоторые ограничения, связанные с этими методами, например их сложные протоколы предварительной и связанные с этим расходы в отношении времени, труда/опыт и необходимые инструменты4.
Недавно МАБ основе иммуноферментного анализа (ELISAs) были применены и количественно и качественно проанализировать питание и натуральные продукты. В самом деле этот метод был применен для анализа биологических образцов и клинических испытаний и было показано, чтобы быть точным, чувствительной и высокоэффективных также избегая утомительной предварительной шаги, связанные с другими анализы5, 6.
При использовании на основе МАБ ELISAs изучить комплекс натуральных продуктов, подготовка моноклональных антител является одним из основных шагов. К сожалению mAbs, характерных для малых биологически активных компонентов, присутствующих в этих видов веществ6,,78,9,10,11,12 ,13,,1415 часто ограничены по сравнению с белков антигенов. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали протокол к специально генерировать mAbs против малых соединений. Протокол, представленные здесь включает в себя синтез искусственных антигена, мыши иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA и моноклональных гибридомной подготовки.
В частности Наша исследовательская группа изучения формирования mAbs против мелких биоактивных соединений из традиционных китайских лекарственных средств и лет разработкой их приложений. В наших исследованиях продолжается мы разработали mAbs против baicalin16, puerarin17, глицирризиновой кислоты18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121и многих других малых молекул. Наши ELISA протоколы, основанные на этих mAbs были использованы в ряде исследований для оценки фармакокинетики этих маленьких молекул, а также их взаимодействия с другими биологически активных соединений. Кроме того использование этих mAbs, мы также разработали иммуноаффинной хроматографии методов для разделения структурных аналогов, в том числе спектральными. Недавно мы подготовили иммуноанализа бокового потока, используя наши МАБ анти puerarin, который впоследствии используется для быстрого, на месте обнаружения этого соединения. Наши результаты показывают, что наш МАБ основе анализов являются незаменимым и удобные инструменты для изучения биологии и качества природных продуктов, полученных соединений, особенно те, которые используются в традиционной китайской медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполняется в этом исследовании были одобрены этическим Комитетом по рассмотрению на Пекинский университет китайской медицины (утверждение номер 2016BZYYL00109).
Примечание: Женский BALB/c мышей (8 недель) были иммунизированы с конъюгатов белков Гаптены перевозчик. При использовании отдельно, малые молекулы (< 1000 Da) не вызывают иммунный ответ. Однако спряжение малые молекулы на перевозчика макромолекулы приводит синтеза антигена. В этом контексте малые молекулы помечается Гаптены. Спряжение Гаптены является необходимой и эффективной стратегии для производства МАБ. Чтобы избежать перекрестной реактивности, два различных белков перевозчиков, таких как бычьим сывороточным альбумином (БСА) и овальбумина (OVA) или магнитные Гемоцианин замочной скважины (KLH) и BSA, должен использоваться как иммуногенов (для иммунизации животных) и покрытие антигены (для покрытия пластина для обнаружения сыворотки). В качестве примера в настоящем протоколе используются BSA и OVA.
1. Подготовка Immunogen и покрытие антигена
Примечание: Для синтеза искусственных антигена, используйте соответствующую функциональную группу (например, гидроксил, сульфгидрильных карбоксильной кислоты, или аминокислот) в сторону руку для ковалентной связывания с белками перевозчика. Сопряжения, которые включают методы Периодат окисления, метод Карбодиимиды, реакция смешанными ангидридами, глютаральдегид реакции и сукцината метод. Этот протокол использует нарингин (NAR), хорошо известный флаванонов гликозид, как пример соединения. NAR — небольшой соединение (581 Da) присутствует в цитрусовых, а также различных традиционных китайских лекарственных средств.
- Используйте процедуру окисления periodate для синтеза конъюгатов нар-BSA и нар-OVA.
- Растворяют 50 мг нар в воде в конечной концентрации 1 мг/мл22.
- Добавьте 100 мкл свежеприготовленные натрия Периодат решение (0,1 М) до 5 мл раствора нар. Перемешайте смесь при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Растворите 4 мг в 2.0 мл 50 мм карбонат буфера (рН 9,6) BSA и OVA. Добавьте этот белок решение NAR/натрия Периодат реакционной смеси.
- Отрегулировать смесь до pH 9 с3 решения 1 М Na2CO и перемешать при комнатной температуре для 6-8 ч.
- Dialyze реакционной смеси в фосфат амортизированное saline (PBS), с помощью диализа мембраны (MWCO 10 кДа) для 3 дней для обмена CBS.
- Анализировать Гаптены перевозчик сопряженное с помощью матрицы помогает лазерная десорбция/ионизации время полета (MALDI-TOF)-МС.
- Смешать 1-10 пмоль сопряженное с 103-сложите Молярная избыток Синапиновая кислоты в водный раствор, содержащий 0,15% trifluoroacetic кислоты (ТФК). Сухая смесь на тарелку образца в воздухе.
- Выполнить анализ с помощью MALDI-TOF масс-спектрометр с лазерной импульсной азота действовали в 337 нм. Приобрести положительных ионов MALDI массового спектры в линейный режим в область диапазона массы (m/z) 15 000-100 000 как описано22.
2. Иммунизация
Примечание: В общей сложности 5 самок мышей BALB/c (8 недель) были использованы: 4 для нар конъюгат иммунизации и 1 для управления (телефонной книги PBS) иммунизации.
- Для первой вакцинации Смешайте 50 мкг конъюгата (разводят в 100 мкл PBS) с равным объемом Фройнд в полной адъювантной (CFA) и полностью эмульсию. Управлять 100 мкл этой смеси для каждой мыши через спинной подкожной инъекции.
- Две недели спустя, доставить руля вакцинации (100 мкл) через подкожно с тем же количеством конъюгата, смешанного с неполной адъювантной (IFA).
- Экстракт 200 мкл крови из Вены хвост каждой мыши 7 дней позже для получения сыворотки.
- Центрифугирования крови на 3000 x g 10 мин передачи сыворотки супернатанта свежие трубки.
- Анализ сыворотки, используя ELISA как описано выше21. Выберите мышь с высокий титр сыворотки для синтеза клеток.
- В рамках подготовки клетки фьюжн администрировать импульсного иммунизации для выбранной мыши через внутрибрюшинной инъекции 50 мкг конъюгата в 300 мкл PBS без адъювантов за 3 дня до фьюжн.
Примечание: Этот шаг может быть опущен, если титр достаточно высока.
3. Подготовка к ячейке Fusion
- Подготовка среднего фьюжн клетки
- Для селективной среде гипоксантин аминоптерин тимидина (HAT): 50 x HAT СМИ дополнение в 10 мл RPMI 1640 растворить и добавить эту смесь в 500 мл RPMI 1640 содержащий 20% FBS.
Примечание: Когда 10 мл 50 x концентрат разводят в 500 мл питательной среды, окончательный концентрации гипоксантина, аминоптерин и тимидина, 100 мкм, 0,4 мкм и 16 мкм, соответственно. - Для СМИ гипоксантин тимидина (HT): 50 x HT СМИ дополнение в 10 мл RPMI 1640 растворить и добавить эту смесь в 500 мл RPMI 1640 содержащий 20% FBS. Окончательный концентрации гипоксантина и тимидина, 100 мкм и 16 мкм, соответственно.
- Для селективной среде гипоксантин аминоптерин тимидина (HAT): 50 x HAT СМИ дополнение в 10 мл RPMI 1640 растворить и добавить эту смесь в 500 мл RPMI 1640 содержащий 20% FBS.
- Культура клетки Sp2/0-Ag14.
- По крайней мере за 7 дней до фьюжн, быстро разморозить флаконе жидкого азота замороженные SP2/0-Ag14 клеток миеломы в теплой воде.
- Передача решения клеток в 5 мл свежей питательной среды (RPMI 1640) и центрифуги для 10 мин на 1000 x g.
- После центрифугирования удалите питательной среды и Ресуспензируйте клетки в свежих RPMI 1640, дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
- Преобразует в колбу 25 см2 клетки и среднего и инкубировать при 37 ° C в атмосферу 5% CO2.
- Разверните клетки для 3 или 4 75 см2 фляги до фьюжн.
- Подготовка брюшной фидер слой клеток
- Пожертвовать ICR мышь альбинос 12-недельных шейки матки дислокации за 1 день до слияния клеток и погрузите его в 75% этанола.
- После удаления мех из живота с гемостатический пинцет, дезинфицировать области с 75% этанола. Вырежьте наружная кожа подвергать брюшной полости. Придать 3 мл стерильной среды RPMI 1640 в брюшную полость и массаж живота для отсоединения дополнительные ячейки в раствор. Аспирационная подачи суспензии клеток в пластиковых пробирок 15мл.
- После центрифугирования суспензию клеток для 10 мин на 1000 x g, удалить супернатант и Ресуспензируйте ячейки едока в 20 мл HAT селективной среде.
- Перенесите клетки в 96-луночных клетки культуры пластин (100 мкл/хорошо). Инкубируйте пластины на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
4. клетки Fusion
- После того, как выбрали прививки мыши был подготовлен для синтеза клеток (см. шаг 2.4), администрировать внутрибрюшинного введения 10% хлораль гидрат (цистит) и пожертвовать иммунизированная мышь через шейки матки дислокации.
- Собирать дополнительные кровь от сердца (1 мл) и подготовить сыворотки, как описано в шаге 2.3.1 для использования в качестве позитивного элемента управления во время гибридомной выбора.
- Удаление кожи и мышечной ткани, с помощью ножниц выставить селезенки.
- Тщательно изолировать селезенки с помощью пинцета и мыть селезенки с RPMI 1640. Нарезать селезенки и медленно фунта нарезанных селезенки. Готовят суспензию клеток селезенки, нажав в ткани селезенки через 800 сетчатый клеток в 50 мл пластиковых пробирок.
- Вымойте суспензию клеток селезенки с RPMI 1640 среднего. Урожай селезенки клетки центрифугированием (1000 x g, 10 мин и 4 ° C), а затем удалить супернатант. Повторите этот шаг Стиральная три раза.
- Снимите культивируемых и усиленные миеломой клетки из инкубатора и осторожно нажмите/shake колбы для получения суспензии клеток. Вымойте это подвеска с RPMI 1640 среднего дважды, чтобы удалить FBS.
Примечание: Это важный шаг как FBS могут влиять слияние клеток. - Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации до смешивания с клетками хандры. Окончательный соотношение клеток селезенки клетки миеломы должно быть между 1:5 и 1:10.
- Смесь клеток селезенки подвеска и миеломой клетки. Центрифуга ячейку смесь (1000 x g, 10 мин и 4 ° C) и удалить супернатант.
- Добавить 1 мл 50% полиэтиленгликоля (PEG) раствора в клетки и осторожно перемешать при 37 ° C за 1 мин. Пусть стоять 30 s.
Примечание: PEG решение, используемое в этот шаг должен содержать 50% (w/v) полиэтиленгликоль 1500 и 10% (v/v) диметилсульфоксида (ДМСО) в PBS без кальция (Ca2 +). - Добавьте 2 мл RPMI 1640 среды для 2 минут для завершения реакции. Добавьте еще 2 мл RPMI 1640 среды для еще 1 мин, а затем добавьте еще 10 мл RPMI 1640 среды.
- Центрифуга клетки на 800 x g за 10 мин. После отмены супернатанта, добавляют раствор ШЛЯПУ и продолжают культивировать клетки. Затем добавить 100 мкл суспензии клеток в каждой скважине слой пластины питателя и инкубировать и пластины для 7 дней при 37 ° C, 5% CO2.
Примечание: В этих условиях клетки миеломы неконденсированное умрет пока hybridoma клетки будут продолжать расти в среде ШЛЯПУ. После 7 дней моноклональных гибридомной форме как единый кластер клеток в колодец, в то время как скважин, содержащая Поликлональные гибридомной будет иметь несколько кластеров клеток. - Аспирационная супернатант для анализа и замените HT среднего носителя.
Примечание: Не забудьте заменить среднего ШЛЯПУ с HT средних первым как переход непосредственно к unsupplemented среднего наносит ущерб гибридомной.
5. косвенные конкурентные ELISA (icELISA)
- Слой 96-луночных плита с нар-OVA (1 мкг/мл, 100 мкл/а) и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C или на ночь при 4 ° C.
- Блокировать пластину с 300 мкл GPBS (PBS, содержащей 1% m/v желатина) за 1 ч при 37 ° C для предотвращения неспецифической адсорбционной.
- Вымойте тарелку три раза с TPBS (PBS, содержащие 0,05% v/v Tween-20).
- Разбавьте неконъюгированной нар в серии концентраций с 10% метанола. Добавьте 50 мкл этих растворов для отдельных скважин. В скважинах 50 мкл сыворотки или гибридомной супернатанта (содержащие mAbs). Инкубировать пластину за 1 ч при 37 ° C.
- Добавьте 100 мкл пероксидаза помечены анти мыши IgG в каждой скважине и проинкубируйте дополнительного 1 ч.
- После мытья пластины три раза с TPBS, добавить 100 мкл раствора субстрата (0,1 М цитрат буфере (рН 4) содержащий 0,015% v/v H2O2 и 2 мг/мл 3, 3', 5, 5'-тетраметилсвинца бензидина (ТМБ)) Ну и Инкубируйте 15 мин.
- Остановить реакции, добавляя 50 мкл 1 М H2так4 для каждой скважины.
- Измерение оптической плотности, используя Считыватель микропланшетов на 450 Нм. Выберите hybridomas которые выделяется самая высокая концентрация антител нар в их супернатант для дальнейшей подготовки.
6. Подготовка моноклональных Hybridomas
- Используйте метод ограничения разрежения подготовить моноклональных hybridomas.
- После удаления HT среднего из выбранного hybridomas (то есть, те позитивные для нар антитела секреции), Ресуспензируйте клетки в RPMI 1640 и подсчитать их.
- Разбавьте клетки к концентрации 1, 2 ячейки, а 4 клетки на колодец в 100 мкл RPMI 1640 в 96-луночных пластине. Инкубируйте пластины при 37 ° C, 5% CO2.
- После 7-10 дней выявления антител нар в культуре супернатанта по протоколу icELISA (шаг 5). Клетки перехода от hybridomas, которые являются позитивными на антитела нар 24-ну пластины, 25 см2 фляги и 75 см2 фляги для выращивания.
- Криоконсервировать моноклональных hybridomas.
- Урожай клетки и передача их центрифуга трубы.
- После центрифугирования клетки (800 x g, 10 мин), удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в замораживания среднего (RPMI 1640, 20% плода телячьей сыворотки (FCS) и 10% ДМСО). Передавать cryotubes клеточных суспензий.
- Магазин cryotubes в поле градиента охлаждения в-80 ° C в течение 24 ч. Затем перенесите cryotubes жидкого азота для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколение hybridomas моноклональных
Молекулярная масса конъюгата Гаптены перевозчик был подтвержден MALDI-TOF-MS анализа. Как молекулярный вес BSA и нар, как известно, может быть рассчитано количество маленьких молекул, конъюгированных с BSA. Рисунок 1 показывает представитель спектральных результаты для нар-BSA22, который отображает широкий пик на m/z 77,058. Как средняя молекулярная масса BSA 66,430, похоже, что по крайней мере 18 нар молекул (МВт 581) были проспряганное с BSA (коэффициент молярной сцепления (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs были проведены для определения сыворотки титры, после иммунизации мыши22. Похоже, что титры антител сыворотки четырех мышей иммунизированных с нар-BSA конъюгата были значительно выше, чем для управления мышью (рис. 2). Мышь с высоком титре (более 1:5, 000) было использовано для синтеза клеток.
После клеток селезенки с этой мыши были слиты брюшной фидер слой клеток, hybridomas выращивались для средних inselection 7 дней. С помощью icELISAs, супернатанта клеточной культуры был испытан, andthehybridomas положительный для нар mAbs были recloned и расширены. Изображения на рисунке 3 иллюстрируют обычных результатов для стабильной моноклональных и поликлональных гибридомной клеточных линий.
Скрининг и применение анти нар МАБ
Критическая точка этого эксперимента является скрининг МАБ специфичности. Результаты в таблице 1 , показывают, что МАБ в этом эксперименте прореагировало с нар, но не блокирующий буфер или перевозчик белки22. Кроме того специфичность МАБ далее оценивалась путем тестирования своей перекрестной реактивности с структурно родственные соединения. Таблица 2 показывает рассчитанные перекрестной реактивности ставки. Как перекрестной реактивности курс для других флавоноидов испытания были менее чем 2%, становится ясно, что этот МАБ для нар22.
IcELISA был разработан с использованием анти нар МАБ и освещает применение этой методологии. Используя решения, содержащие известные концентрации нар, калибровочной кривой создавалась с использованием absorbances эти решения и диапазона линейной кривой модель S была рассчитана (показано в верхнем правом рисунке врезные). Уравнение линейной регрессии (y = 0,176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978) рассчитаны на этой кривой может быть применен к количественного анализа неизвестных образцов.
Производство и характеристика МАБ против глицирризиновой кислоты
Используя этот протокол синтеза клеток splenocyte/миеломы, моноклональных гибридомной секреции анти глицирризиновой кислоты МАБ, названный DF5, также был установленным18. Подтип этой DF5 МАБ была определена как IgG1 с легкой цепи Каппа (таблица 3). Подобно сделанного выше анализа, МАБ была использована для дополнительной проверки и приложений, в то время как антиген специфические моноклональные hybridomas были расширенный andcryopreserved в жидком азоте для длительного хранения.
| Покрытие вещество | Значение450 | Перекрестной реактивности (%) |
| Нар OVA | 0,97 | 100 |
| OVA | 0,056 | < 0.01 |
| BSA | 0.068 | < 0.01 |
| Желатина | 0,053 | < 0.01 |
| Сухое обезжиренное молоко | 0.05 | < 0.01 |
Таблица 1. Реактивность МАБ анти нар с нар-OVA и перевозчик белков.
| Классификация | Соединение | Перекрестной реактивности (%) |
| Флавоноиды | Нарингин | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| Neohesperidin | 18.80% | |
| Рутин | 1.95% | |
| Baicalein | < 0,09% | |
| Гиперозид | < 0,09% | |
| Терпены | Ginsenoside Rg2 | < 0,09% |
| Ginsenoside Rb1 | < 0,09% | |
| Ginsenoside Re | < 0,09% | |
| Notoginsenoside | < 0,09% | |
| Глицирризиновой кислоты | < 0,09% | |
| Glycyrrhetic кислота | < 0,09% | |
| Saikosaponin | < 0,09% | |
| Paeoniflorin | < 0,09% | |
| Gentiopicrin | < 0,09% | |
| Sterides | Холевая кислота | < 0,09% |
| Деоксихолевая кислота | < 0,09% | |
| Антрахиноны | Rheumemodin | < 0,09% |
| Rheinic кислота | < 0,09% | |
| Другие | Salvianolic кислота | < 0,09% |
| Куркумин | < 0,09% | |
| Gastrodin | < 0,09% | |
| Амигдалин | < 0,09% |
Таблица 2. Перекрестной реактивности (%) о анти нар МАБ против нар и его родственных соединений.
| Isotype тяжёлые цепи | Isotype лёгкие цепи | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | Каппа | лямбда | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Таблица 3. Isotype анализ МАБ DF5.
Рисунок 1: анализ MALDI-TOF-MS нар-BSA конъюгата. [M + H] + и [M + 2H]2 + указать одно - и двойной протонированный молекулы нар-BSA, соответственно. Эта цифра была изменена от Цюй et al., 201622
Рисунок 2 : Анализ титр сыворотки, icELISA. Мышей 1 - 4 были иммунизированы с нар-BSA конъюгат, в то время как элемент управления был иммунизацию с транспортного средства (PBS). Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 3). Эта цифра была изменена от Цюй et al., 201622. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель изображения стабильный моноклональных (A) и поликлональными (B) hybridomas. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Применение анти нар МАБ в icELISA. Различные концентрации нар инкубировали с МАБ в лунках предварительно с нар-OVA (1 мг/мл). A является поглощения присутствии нар, в то время как0 является поглощение в отсутствие нар. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 3). Эта цифра была изменена от Цюй et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем собой протокол для успешного производства mAbs против натуральных продуктов, полученных малых молекул. Основные шаги в процедуре были изложены, и мы продемонстрировали полезность этого протокола, с помощью NAR как пример маленькой молекулы. Пример спектры, реактивность анализы и icELISA результаты показывают представитель экспериментальной и управления данные, полученные с помощью этого протокола. Пример изображения hybridomas обеспечивают визуальное представление того, что исследователь следует искать при дифференциации между моноклональных и поликлональных hybridomas. Взятые вместе, мы продемонстрировали, что МАБ производства, характеристика и применение стратегии представил результаты здесь в создании эффективной МАБ против малых молекул, а также Роман, ИФА на основе конкретного МАБ, который может использоваться для тестирования выражение целевой молекулы в других натуральных продуктов.
Работает с любым типом антител, наиболее распространенные проблемы, которые могут возникнуть во время этой процедуры связан с чувствительностью МАБ. Действительно существует высокий риск, что МАБ не будет работать, как ожидалось, из-за низкой чувствительностью, высокой перекрестной реактивности или другие факторы. Как вся процедура занимает по меньшей мере 4 месяца для выполнения в полном объеме, важно, чтобы заботиться в ходе первоначальной проверки mAbs выделяется из hybridomas. Одним важным аспектом во избежание создания неэффективными МАБ заключается в экран сыворотки, icELISA до клеток фьюжн подтверждены реактивной с Гаптены но не перевозчиком. Это выполняется с помощью двух различных белков перевозчиков (в данном случае BSA и OVA) как immunogen и покрытие антигена перевозчиков, соответственно. В ходе иммунизации с Гаптены BSA конъюгата, животных будет производить антитела против обоих Гаптены (например, нар) и BSA. Таким образом чтобы избежать ложного обнаружения антител anti-BSA во время отбора, Гаптены OVA следует использовать для выявления антител анти Гаптены специально. Создание этих двух белковых перевозчиков, а также тогда, когда их использовать явно выделяется в протоколе.
Важно также отметить, что во время подготовки моноклональных hybridomas, ограничивающих метод разбавления часто необходимо повторить несколько раз до тех пор, пока все скважин, содержащих моноклональные клетки являются положительными. Это повторение помогает подтвердить, что каждый клон стабильно секреты специфическое антитело.
Ограниченность этого метода включают сложный процесс гибридомной поколения и время, необходимое для выбора желаемого hybridoma производит антитела. Однако после того, как получены МАБ и разработана icELISA, обнаружения целевого соединения в натуральных продуктов могут выполняться быстро и эффективно. В частности этот протокол избежать некоторых издержек, связанных с другими методами анализа и не требуют использования дорогостоящих инструментов неоднократно для каждого натуральный продукт испытания.
После того, как производятся и скрининг, Гаптены МАБ может широко используется в различных анализов. В этом протоколе мы сосредоточены на использовании МАБ в методе ИФА основе, который был использован для изучения биологии малые молекулы, а также его фармакокинетического взаимодействия20,22. Другие mAbs, созданные с этот протокол также были использованы для создания на основе МАБ иммуноаффинной хроматографии метод для разделения структурных аналогов18, включая спектральными21, а также боковое поток иммуноанализа23 для быстрого и на месте обнаружения целевого молекулы. Эти исследования выделить широкое применение mAbs производится с помощью протокола изложенных здесь. Таким образом, эта процедура и mAbs созданы, акты как фундамента для развития различных целевых иммуноанализа МАБ основе, которые могут эффективно использоваться в качестве аналитических инструментов для оценки и контроля качества продуктов природы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант номера 81573573, 81473338 и 81503344) и классического рецепта основной исследовательской группы в Пекинском университете китайской медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
