Summary
توفر هذه المقالة بروتوكول مفصلة لإعداد وتقييم للأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية لاستخدامها في مختلف تحديدكم. ويشمل هذا الإجراء التحصين، خلية الانصهار، أليسا المنافسة غير المباشرة لاستنساخ إيجابية الفحص، وإعداد هيبريدوما [مونوكلونل]. كما يتم توفير مواصفات جسم توصيف استخدام استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل إليزا.
Abstract
تحليل المكونات النشطة بيولوجيا في الأطعمة والمنتجات الطبيعية أصبحت منطقة شعبية للدراسة في العديد من المجالات، بما في ذلك التقليدية الصينية الدواء والغذاء السلامة/علم السموم. تتطلب العديد من تقنيات التحليل الكلاسيكي معدات غالية الثمن و/أو الخبرة. جدير بالذكر أن فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) أصبحت أسلوب ناشئة لتحليل الأطعمة والمنتجات الطبيعية. يستند هذا الأسلوب إلى الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة من مكونات الهدف. ومع ذلك، كالعديد من المكونات النشطة بيولوجيا في المنتجات الطبيعية هي صغيرة (< دا 1,000) والحث على عدم استجابة مناعية، وغالباً ما يصعب إيجاد الأجسام المضادة (مابس) ضدهم. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم شرحاً مفصلاً للخطوات المطلوبة لإنشاء مابس ضد الجزيئات المستهدفة، فضلا عن تلك المطلوبة لإنشاء المرتبطة بها غير المباشرة التنافسية (ic) أليسا للتحليل السريع للمجمع في عينات متعددة. يصف الإجراء توليف مستضد اصطناعية (أي، المتقارن هابتين الناقل)، التحصين، خلية الانصهار، إعداد هيبريدوما [مونوكلونل]، وصف الإنسان والمحيط الحيوي، وتطبيق المستندة إلى أليسا الإنسان والمحيط الحيوي. المتقارن هابتين الناقل تم تصنيعه بالصوديوم فوق يودات الأسلوب وتقييمه بواسطة استخدام TOF-مللي ثانية. بعد التحصين، بمعزل عن الماوس المحصنين مع عيار الأجسام المضادة أعلى سبلينوسيتيس وتنصهر مع Ag14 (القبعة)--ماوس حساسة الورم النخاعي الخلية خط Sp2/0-هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-التريتيوم استخدام البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-على أساس الأسلوب. تم فحص هيبريدوماس إفراز مابس رد الفعل على مستضد الهدف من إيسيليسا لخصوصية وه. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق الأسلوب إضعاف الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]. كذلك اتسمت إيسيليسا مابس النهائي وثم استخدامها في أحد تطبيقات المستندة إلى إليزا للكشف السريع ومريحة هابتين مثال (نارينجين (NAR)) في المنتجات الطبيعية.
Introduction
مونوكلونل (مابس)، يعرف أيضا باسم الأجسام المضادة أحادية محددة، يتم إنتاجها من استنساخ بليمفوسيتي واحدة وتتألف من الأجسام المضادة الفموي الأحادي التكافؤ أن كل ربط حانمه نفس1. في السنوات الأخيرة، استخدمت العديد من المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات الطبية في علاج الأمراض المختلفة2. وفي الواقع، تطبق الآن العديد من المركبات الجزيئية الصغيرة مستمد أصلاً من المنتجات الطبيعية كأدوية الخط الأول، مثل مادة الأرتيميسينين لعلاج الملاريا وباسيلتاكسيل (تاكسول) للسرطان2،3. دراسة المنتجات الطبيعية حققت تقدما سريعاً، إلى حد كبير بسبب تنمية هائلة والاستغلال الأمثل لتقنيات التحليل التقليدي، بما في ذلك كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) والطيف الكتلي (مللي ثانية). ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود المرتبطة بهذه الأساليب، مثل بروتوكولات المعالجة المعقدة والتكاليف المرتبطة بها فيما يتعلق بالوقت والعمل/الخبرة والأدوات المطلوبة4.
في الآونة الأخيرة، طبقت الاختبارات المستندة إلى ماب الممتز المرتبط بالانزيم (الساس) على كمياً ونوعيا في تحليل المواد الغذائية والمنتجات الطبيعية. في الواقع، هذا الأسلوب قد طبقت لتحليل العينات البيولوجية والتجارب السريرية وقد تبين أن تكون دقيقة وحساسة وذات كفاءة عالية في حين أيضا تجنب الخطوات مملة المعالجة المسبقة المرتبطة ب التحاليل الأخرى5، 6.
عند استخدام الساس ماب المستندة إلى دراسة المنتجات الطبيعية المعقدة، إعداد الأجسام المضادة واحدة من الخطوات الأساسية. ولسوء الحظ، مابس الخاصة بالمكونات النشطة بيولوجيا الصغيرة الموجودة في هذه الأنواع من المواد6،،من78،،من910،11،12 13، ،،من1415 غالباً ما تكون محدودة مقارنة بمولدات المضادات البروتين. للالتفاف حول هذه المسألة، وقد وضعنا بروتوكولا لإنشاء مابس ضد المركبات الصغيرة على وجه التحديد. يشمل البروتوكول المعروضة هنا التوليف مستضد اصطناعية الماوس، خلية الانصهار، ELISA التنافسية غير المباشرة والتحصين والإعداد هيبريدوما [مونوكلونل].
جدير بالذكر أن دراسة تشكيل مابس ضد المركبات النشطة بيولوجيا الصغيرة من الأدوية الصينية التقليدية لدينا مجموعة بحوث وتطوير التطبيقات الخاصة بهم لسنوات. وقد وضعنا في دراساتنا الجارية، مابس ضد بايكالين16، بويرارين17، وحامض glycyrrhizic18، بايونيفلورين19، جنسنوسد Re20، جنسنوسد Rh121والعديد من الجزيئات الصغيرة الأخرى. لدينا بروتوكولات أليسا استناداً إلى هذه مابس قد استخدمت في عدد من الدراسات لتقييم الدوائية هذه الجزيئات الصغيرة، فضلا عن تفاعلها مع غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذه مابس، قد وضعنا أيضا أساليب اللوني إيمونوافينيتي لفصل نظائر الهيكلية، بما في ذلك ابيميرس. في الآونة الأخيرة، أعددنا المناعة تدفق أفقي استخدام لدينا ماب بويرارين المضادة التي استخدمت فيما بعد للكشف السريع، في الموقع لهذا المركب. نتائجنا تشير إلى أن لدينا فحوصات المستندة إلى ماب أدوات لا غنى عنها ومريحة لدراسة علم الأحياء ونوعية المركبات المشتقة من المنتجات الطبيعية، وخاصة تلك المستخدمة في الأدوية الصينية التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات الحيوان القيام في هذه الدراسة بموافقة "لجنة استعراض الأخلاقية" بجامعة بكين "الطب الصيني" (الموافقة على رقم 2016BZYYL00109).
ملاحظة: تم تحصين الفئران الإناث بالب/c (8 أسابيع) مع يصرف البروتين الناقل هابتين. عندما تستخدم وحدها، جزيء صغير (< دا 1,000) لا يمكن الحصول على استجابة مناعية. ومع ذلك، التصريف صغيرة جزيء إلى جزيء ضخم ينتج مستضد توليف الناقل. وفي هذا السياق، يسمى جزيء صغير من هابتين. تصريف هابتين استراتيجية ضرورية وفعالة لإنتاج الإنسان والمحيط الحيوي. لتجنب عبر مفاعليه، حاملتي البروتين المختلفة، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) وأوفالبومين (OVA) أو ثقب المفتاح مفج هيموسيانين (كله) وجيش صرب البوسنة، ينبغي أن تستخدم إيمونوجينس (للتحصين الحيواني) وطلاء المستضدات (للوحة لمعطف اكتشاف المصل المضاد). جيش صرب البوسنة والبويضات تستخدم كمثال في هذا البروتوكول.
1. إعداد إيمونوجين وطلاء مستضد
ملاحظة: لتوليف مستضد مصطنعة، استخدم مجموعة وظيفية مناسبة (مثلاً، الهيدروكسيل، سلفهيدريل الكربوكسيل الحمضية، أو الأمينية) كذراع الجانب للربط التساهمي مع البروتين الناقل. تتضمن أساليب التصريف فوق يودات الأكسدة والأسلوب كاربودييميدي ورد فعل مختلطة أو أملاحه، رد فعل glutaraldehyde والأسلوب سوكسيناتي. هذا البروتوكول يستخدم نارينجين (نار)، غليكوزيد فلافانوني معروفة، كمجمع لمثال. نار مركب صغير (دا 581) موجودة في الحمضيات، فضلا عن مختلف الأدوية الصينية التقليدية.
- استخدام إجراء أكسدة بيريوداتي لتوليف يصرف نار-جيش صرب البوسنة، ونار-البويضات.
- حل 50 مغ نار في الماء بتركيز 1 ملغ/مل22نهائي.
- إضافة 100 ميليلتر من الصوديوم المحضرة فوق يودات الحل (0.1 M) إلى 5 مل الحل نار. يقلب الخليط في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- حل 4 ملغ من جيش صرب البوسنة والبويضات في مل 2.0 من المخزن المؤقت لكربونات 50 مم (pH 9.6). إضافة البروتين هذا الحل على النار/الصوديوم فوق يودات خليط رد فعل.
- ضبط المخلوط للأس الهيدروجيني 9 مع 1 م Na2CO3 الحل وآثاره في درجة حرارة الغرفة ح 6-8.
- دياليزي الخليط رد فعل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) باستخدام غشاء الديال (كاتشين موكو 10) لمدة 3 أيام لتبادل شبكة سي بي إس.
- تحليل المتقارن هابتين الناقل باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF)-مرض التصلب العصبي المتعدد.
- مزيج بمول 1-10 من المرافق مع 103-أمثال المولى الزائدة من حمض سينابينيك محلول مائي يحتوي على حامض trifluoroacetic 0.15% (تفا). الجاف الخليط في صفيحة عينة في الهواء.
- القيام التحليل باستخدام استخدام-TOF مطياف أسلحة مزودة بليزر نيتروجين نابض يعمل في 337 شمال البحر الأبيض المتوسط. اكتساب أيون إيجابية استخدام الأطياف الشامل في الوضع الخطي ضمن النطاق الشامل (m/z) كما سبق وصف 15,000 100,00022.
2-التحصين
ملاحظة: استخدمت ما مجموعة 5 بالب/ج الفئران الإناث (8 أسابيع): 4 لنار متزاوجة التحصين و 1 للتحصين التحكم (PBS).
- للتطعيم الأولى، مزيج 50 ميكروغرام من المتقارن (مخففة في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني) مع زيادة في حجم إكمال adjuvant فروند (CFA) المساواة واستحلاب تماما. إدارة 100 ميليلتر من هذا الخليط كل الماوس عبر الظهرية تحت الجلد حقن.
- تسليم بعد أسبوعين، الداعم (100 ميليلتر) التحصين عن طريق الحقن تحت الجلد بنفس المقدار من المتقارن مختلطة مع adjuvant غير مكتملة (إيفا).
- استخراج 200 ميليلتر من الدم من الوريد ذيل الماوس كل 7 أيام في وقت لاحق للحصول على المصل.
- نقل الدم في 3,000 س ز من أجهزة الطرد المركزي للحد الأدنى 10 المصل طافية إلى أنبوب جديد.
- تحليل مصل الدم باستخدام أليسا كما هو موضح سابقا21. اختر الماوس مع عيار المصل أعلى لاستخدام لخلية الانصهار.
- في التحضير لخلية الانصهار، إدارة تحصين نابض بالماوس المختار 50 ميكروغرام عن طريق الحقن داخل المتقارن في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني دون adjuvant 3 أيام قبل الانصهار.
ملاحظة: يمكن حذف هذه الخطوة إذا كانت عيار مرتفع بما يكفي.
3-التحضير لخلية الانصهار
- خلية الانصهار إعداد متوسطة
- للمتوسط انتقائية هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-thymidine (قبعة): حل 50 x هات الملحق وسائل الإعلام في 10 مل من RPMI 1640 وأضف هذا الخليط إلى 500 مل RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% FBS.
ملاحظة: عندما يتم المخفف 10 مل الركاز 50 x في 500 مل من الثقافة المتوسطة، تركيزات النهائي هيبوكسانثيني وأمينوبتيرين و thymidine هي 100 ميكرومتر و 0.4 ميكرون و 16 ميكرومتر، على التوالي. - لوسائل الإعلام هيبوكسانثيني-thymidine (HT): حل 50 × الملحق الإعلامي HT في 10 مل من RPMI 1640 وأضف هذا الخليط إلى 500 مل RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% FBS. تركيزات النهائي هيبوكسانثيني و thymidine هي 100 ميكرومتر و 16 ميكرومتر، على التوالي.
- للمتوسط انتقائية هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-thymidine (قبعة): حل 50 x هات الملحق وسائل الإعلام في 10 مل من RPMI 1640 وأضف هذا الخليط إلى 500 مل RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% FBS.
- ثقافة الخلايا Sp2/0-Ag14.
- سرعة ذوبان 7 أيام على الأقل قبل الانصهار، قنينة من سائل النيتروجين المجمدة SP2/0-Ag14 الورم النخاعي الخلايا في المياه الدافئة.
- نقل الحل خلية إلى 5 مل من جديد الثقافة المتوسطة (ربمي-1640) وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز.
- بعد الطرد المركزي، إزالة المتوسطة الثقافة وريسوسبيند خلايا جديدة ربمي-1640 تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
- نقل الخلايا والمتوسطة في قارورة2 25 سم واحتضان في 37 درجة مئوية في جو من أول أكسيد الكربون 5%2.
- توسيع نطاق الخلايا إلى 3 أو 4 75 سم2 قوارير قبل الانصهار.
- إعداد تغذية البطن طبقة الخلايا
- التضحية ماوس الممثل المدني الدولي ألبينو عمرها 12 أسبوع بخلع عنق الرحم قبل الانصهار خلية يوم 1 وتغرق في الإيثانول 75%.
- وبعد إزالة الفراء من البطن مع ملقط مرقئ، تطهير المنطقة مع الإيثانول 75%. قطع الجلد الخارجي لفضح تجويف البطن. حقن 3 مل متوسط RPMI 1640 العقيمة في البطن وتدليك البطن لفصل خلايا إضافية إلى الحل. نضح تغذية تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
- بعد سينتريفوجينج بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ز، تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا المغذية في 20 مل من قبعة المتوسطة انتقائية.
- نقل الخلايا في خلية 96-جيدا ثقافة لوحات (100 ميليلتر في البئر). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
4-خلية الانصهار
- بعد تحصين المختار الفأر قد أعد لخلية الانصهار (راجع الخطوة 2، 4)، إدارة حقن داخل 10% كلورال هيدرات (مخدر) والتضحية بالماوس المحصنين التفكك عن طريق عنق الرحم.
- جمع الدم إضافية من القلب (1 مل)، وإعداد مصل كما هو موضح في الخطوة 2.3.1 لاستخدامه كعنصر إيجابي أثناء اختيار هيبريدوما.
- إزالة أنسجة العضلات والجلد باستخدام مقص لفضح الطحال.
- عزل الطحال مع ملاقط بعناية، وغسل الطحال مع ربمي-1640. قطع الطحال إلى قطع والجنيه الطحال تريتوراتي ببطء. إعداد تعليق خلية طحال بضغط أنسجة الطحال من خلال مصفاة مش 800 خلية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي.
- أغسل تعليق خلية الطحال مع المتوسط RPMI 1640. حصاد الخلايا الطحال بالطرد المركزي (1000 x ز، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية)، ومن ثم تجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة الغسيل ثلاث مرات.
- إزالة الخلايا المزروعة وتضخيم الورم النخاعي من الحاضنة ولطف الصنبور/هزة قوارير للحصول على تعليق خلية. أغسل هذا التعليق مع المتوسط RPMI 1640 مرتين لإزالة FBS.
ملاحظة: هذا خطوة أساسية كما قد تؤثر FBS خلية الانصهار. - عد الخلايا وضبط التركيز قبل الاختلاط مع خلايا الطحال. ينبغي أن تكون نسبة خلايا الطحال لخلايا الورم النخاعي النهائي بين 1:5 و 01:10.
- مزيج الخلية الطحال الخلايا تعليق والورم النخاعي. الطرد المركزي الخليط خلية (1000 x ز، 10 دقيقة، و 4 درجات مئوية)، وإزالة المادة طافية.
- أضف 1 مل من محلول 50% البولي إثيلين غليكول (شماعة) إلى الخلايا ويقلب بلطف في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. اسمحوا الوقوف لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: الحل شماعة المستخدمة في هذه الخطوة ينبغي أن تحتوي على 50% (w/v) البولي إيثيلين غليكول 1500 و 10% (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم (Ca2 +). - إضافة 2 مل متوسط RPMI 1640 لمدة 2 دقيقة إنهاء رد فعل. إضافة 2 مل إضافية في المتوسط RPMI 1640 لآخر 1 دقيقة، ثم قم بإضافة 10 مل إضافية في المتوسط RPMI 1640.
- الطرد المركزي الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة طافية، إضافة هات الحل والاستمرار في زراعة الخلايا. ثم إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية لكل بئر من ألواح الطبقة المغذية واحتضان اللوحات لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
ملاحظة: في ظل هذه الظروف، ستموت خلايا المايلوما أونفوسيد بينما خلايا هيبريدوما سوف يستمر في النمو على المديين المتوسط وقبعة. بعد 7 أيام، ستشكل هيبريدوما [مونوكلونل] ككتلة واحدة من الخلايا بشكل جيد، بينما سيكون الآبار التي تحتوي على هيبريدوما [بولكلونل] لمجموعات متعددة من الخلايا. - نضح المادة طافية للتحليل واستبدالها المتوسطة المتوسطة HT.
ملاحظة: تأكد من استبدال المتوسطة قبعة مع تقنية HT الأولى المتوسطة كالتبديل مباشرة إلى متوسط أونسوبليمينتيد يلحق الضرر هيبريدوما.
5-غير مباشر أليسا التنافسية (إيسيليسا)
- معطف صفيحة 96-جيدا مع البويضات نار (1 ميكروغرام/مل، 100 ميليلتر/حسنا) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- كتلة اللوحة مع 300 ميليلتر من جببس (برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% m/v الجيلاتين) ح 1 في 37 درجة مئوية لمنع الامتزاز غير محددة.
- أغسل لوحة ثلاث مرات مع TPBS (برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% v/v توين-20).
- تمييع نار أونكونجوجاتيد إلى سلسلة من تركيزات مع 10 ٪ الميثانول. إضافة 50 ميليلتر لتخفيف هذه لفصل الآبار. في آبار أخرى، إضافة 50 ميليلتر من المصل المضاد أو هيبريدوما طافية (التي تحتوي على مابس). احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميكروليتر من المسمى البيروكسيديز المضادة الماوس مفتش في كل بئر واحتضانها ح 1 إضافية.
- بعد الغسيل لوحة ثلاث مرات مع TPBS، إضافة 100 ميليلتر من الركازة الحل (0.1 M سترات المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 4) تحتوي على 0.015% v/v ح2س2 و 2 ملغ/مل من 3, 3 ', 5, 5'-ميثيل بنزيدين (TMB)) إلى كل خير واحتضان لمدة 15 دقيقة.
- وقف رد الفعل بإضافة 50 ميليلتر من م 1 ح2حتى4 لكل بئر.
- قياس امتصاص استخدام قارئ ميكروسكوبية في 450 نانومتر. اختر هيبريدوماس التي تفرز تركيزات أعلى من الأجسام المضادة نار في تلك المادة طافية لزيادة إعداد.
6-إعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]
- استخدام أسلوب تمييع الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل].
- بعد إزالة المتوسطة HT من هيبريدوماس المحددة (أي، تلك الإيجابية لإفراز جسم نار)، ريسوسبيند الخلايا في RPMI 1640 والاعتماد عليها.
- تمييع الخلايا بتركيز 1 الخلايا والخلايا 2 4 خلايا كل بئر في 100 ميليلتر من 1640 ربمي في صفيحة 96-جيدا. احتضان اللوحة على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- بعد 7-10 أيام، كشف الأجسام المضادة نار في ثقافة طافية باستخدام بروتوكول إيسيليسا (الخطوة 5). نقل الخلايا من هيبريدوماس التي إيجابية للأجسام المضادة نار إلى لوحات 24-جيدا و 25 سم2 قوارير قوارير2 75 سم لزراعة.
- كريوبريسيرفي هيبريدوماس [مونوكلونل].
- حصاد الخلايا ونقلها للطرد المركزي أنابيب.
- وبعد سينتريفوجينج الخلايا (800 x ز، 10 دقيقة)، إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في تجميد المتوسطة (ربمي-1640 ومصل العجل الجنين 20% (FCS) و [دمس] 10%). نقل تعليق الخلية إلى كريوتوبيس.
- تخزين في كريوتوبيس في مربع تبريد تدرج في-80 درجة مئوية ح 24. ثم نقل كريوتوبيس للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جيل هيبريدوماس [مونوكلونل]
وأكد الوزن الجزيئي المتقارن الناقل هابتين تحليل استخدام TOF-مللي ثانية. كما هي معروفة الوزن الجزيئي لجيش صرب البوسنة والنار، يمكن حساب عدد الجزيئات الصغيرة مترافق مع جيش صرب البوسنة. ويبين الشكل 1 نتائج الطيفية الممثل لنار-جيش صرب البوسنة22، الذي يعرض ذروتها واسعة في m/z 77,058. ما هو متوسط الوزن الجزيئي لجيش صرب البوسنة 66,430، ويبدو أن مالا يقل عن 18 نار جزيئات (581 ميغاواط) كانت مترافق مع جيش صرب البوسنة (نسبة اقتران المولى (NAR:BSA) = 18:1).
وأجريت لتحديد التتر المصل المضاد بعد الماوس التحصين22إيسيليساس. ويبدو أن التتر أضداد المصل من الفئران الأربعة تحصين مع المتقارن نار-جيش صرب البوسنة كانت أعلى بكثير من التي لوحظت بالنسبة للتحكم الماوس (الشكل 2). الماوس بعيار أعلى (فوق 1:5، 000) واستخدمت لخلية الانصهار.
بعد أن كانت تنصهر فيها خلايا الطحال من هذا الفأر إلى خلايا الطبقة المغذية البطن، هيبريدوماس كانت نمت لمدة 7 أيام إينسيليكشن المتوسطة. باستخدام إيسيليساس، تم اختبار ثقافة الخلية طافية، ريكلونيد أندثيهيبريدوماس الإيجابية لنار مابس وتوسيعها. وتوضح الصور في الشكل 3 نتائج التقليدية لخطوط خلايا هيبريدوما [مونوكلونل] و [بولكلونل] مستقرة.
الفحص وتطبيق ماب مكافحة النار
النقطة الحرجة لهذه التجربة هو فحص خصوصية الإنسان والمحيط الحيوي. وتبين النتائج في الجدول 1 أن الإنسان والمحيط الحيوي في هذه التجربة رد فعل بنار ولكن لا حظر المخزن المؤقت أو الناقل البروتينات22. وعلاوة على ذلك، تم تقييم خصوصية الإنسان والمحيط الحيوي كذلك عن طريق اختبار في ه مع المركبات ذات الصلة هيكلياً. ويبين الجدول 2 أن معدلات محسوب ه. اختبار معدل ه الفلافونويد الأخرى كانت أقل من 2 ٪، فإنه من الواضح أن هذا ماب محددة لنار22.
تم تطويرها باستخدام ماب مكافحة النار إيسيليسا ويسلط الضوء على تطبيق هذه المنهجية. استخدام المحاليل المحتوية على تركيزات معروفة من نار، كان المرسومة منحنى قياسي باستخدام أبسوربانسيس لهذه الحلول وتم حساب نطاق نموذج المنحنى الخطي (المبين في اقحم الشكل العلوي الأيسر). معادلة الانحدار الخطي (y = 0.176 ln (x) + 1.1243، ص2 = 0.9978) تحسب لهذا المنحنى يمكن تطبيقها على التحليل الكمي لعينات غير معروفة.
إنتاج وتوصيف ماب ضد حمض glycyrrhizic
باستخدام هذا البروتوكول الانصهار خلية سبلينوسيتي/المايلوما، وكان هيبريدوما [مونوكلونل] إفراز ماب حمض glycyrrhizic المضادة، المسمى DF5، أيضا المنشأة18. واعتبر النوع الفرعي لهذا ماب DF5 IgG1 مع سلسلة خفيفة كابا (الجدول 3). مشابه للتحليل الوارد أعلاه، ماب استخدمت للفحص الإضافية والتطبيقات، بينما هيبريدوماس [مونوكلونل] محددة مستضد أندكريوبريسيرفيد الموسع في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
| مادة الطلاء | قيمة450 | ه (%) |
| نار-البويضات | 0.97 | 100 |
| البويضات | 0.056 | < 0.01 |
| مرض التصلب العصبي المتعدد. | 0.068 | < 0.01 |
| جيلاتين | 0.053 | < 0.01 |
| اللبن المقشود | 0.05 | < 0.01 |
الجدول 1. مفاعليه ماب مكافحة النار بالنار-البويضات والناقل البروتينات.
| تصنيف | مجمع | ه (%) |
| فلافونيدات | نارينجين | 100 ٪ |
| بويرارين | 1.26 في المائة | |
| نيوهيسبيريدين | 18.80% | |
| ﺭﻭﺗﻳﻧ | 1.95% | |
| بايكالين | < 0.09% | |
| هايبروسيدي | < 0.09% | |
| الأساس | Rg2 جنسنوسد | < 0.09% |
| Rb1 جنسنوسد | < 0.09% | |
| إعادة جنسنوسد | < 0.09% | |
| نوتوجينسينوسيدي | < 0.09% | |
| حمض Glycyrrhizic | < 0.09% | |
| حمض جليسيرهيتيك | < 0.09% | |
| سيكوسابونين | < 0.09% | |
| بايونيفلورين | < 0.09% | |
| جينتيوبيكرين | < 0.09% | |
| ستيريديس | حمض الكوليك | < 0.09% |
| حمض Deoxycholic | < 0.09% | |
| أنثراكوينونيس | رهيوميمودين | < 0.09% |
| حمض رهينيك | < 0.09% | |
| الأخرى | حمض سالفيانوليك | < 0.09% |
| الكركمين | < 0.09% | |
| جاسترودين | < 0.09% | |
| Amygdalin | < 0.09% |
الجدول 2. ه (%) من ماب النار المضادة ضد النار ومركباته ذات الصلة.
| ايستب السلسلة الثقيلة | ايستب سلسلة الخفيفة | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | إيغا | IgM | كابا | لامدا | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
الجدول 3. تحليل ايستب ماب DF5.
الشكل 1: استخدام TOF-ماجستير تحليل المتقارن نار-جيش صرب البوسنة- [M + H] + و [م + ح 2]2 + تشير إلى أن جزيئات البروتونية مفرد، ومزدوج من نار-جيش صرب البوسنة، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من الجامعة et al.، 201622
الشكل 2 : تحليل عيار المصل المضاد من إيسيليسا- تم تحصين الفئران 1-4 مع جيش صرب البوسنة-النار متزاوجة، في حين تم تحصين عنصر التحكم مع مركبة (PBS). وتمثل البيانات يعني ± الانحراف المعياري (SD) (n = 3). لقد تم تعديل هذا الرقم من الجامعة et al.، 201622. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صور الممثل مستقرة (A) [مونوكلونل] و [بولكلونل] (ب (هيبريدوماس- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تطبيق ماب مكافحة النار في إيسيليسا- كانت المحتضنة تركيزات مختلفة من نار مع ماب في الآبار المغلفة مسبقاً مع نار-البويضات (1 ملغ/مل). هو امتصاص حضور نار، بينما0 هو امتصاص في غياب نار. وتمثل البيانات يعني ± الانحراف المعياري (SD) (n = 3). لقد تم تعديل هذا الرقم من الجامعة et al.، 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم هنا، بروتوكولا للنجاح في إنتاج مابس ضد الجزيئات الصغيرة الطبيعية المستمدة من المنتج. وقد أوجزت الخطوات الأساسية في الإجراء، وإننا قد أثبتت فائدة هذا البروتوكول استخدام نار كجزيء صغير مثال. المثال الأطياف وتحليلات مفاعليه، ونتائج إيسيليسا جميع إظهار الممثل التجريبية وبيانات التحكم التي يتم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. الصور مثلاً من هيبريدوماس توفير تمثيل مرئي لماذا الباحث يجب أن تبحث عند التفريق بين هيبريدوماس [مونوكلونل] و [بولكلونل]. أخذت معا، وقد أثبتنا أن إنتاج الإنسان والمحيط الحيوي، وتوصيف وتطبيق استراتيجية المقدمة هنا النتائج في إيجاد ماب فعالة ضد جزيء صغيرة، فضلا عن رواية أليسا استناداً إلى ماب معين يمكن استخدامه لاختبار التعبير عن الجزيء المستهدف في المنتجات الطبيعية الأخرى.
العمل مع أي نوع من الأجسام المضادة، المشكلة الأكثر شيوعاً التي قد تنشأ أثناء هذا الإجراء يرتبط بحساسية الإنسان والمحيط الحيوي. والواقع أن هناك خطرا كبيرا الإنسان والمحيط الحيوي يعمل كما هو متوقع بسبب حساسية منخفضة، ه عالية، أو غيرها من العوامل. الإجراء برمته يستغرق 4 أشهر على الأقل للقيام بالكامل، من المهم أن تأخذ الرعاية أثناء الفحص الأولى مابس ويفرز من هيبريدوماس. أحد الجوانب الأساسية تجنب خلق الإنسان والمحيط الحيوي غير فعالة الشاشة المصل المضاد من إيسيليسا قبل خلية الانصهار يؤكد رد الفعل مع هابتين ولكن ليس الناقل. يتم إجراء هذا باستخدام حاملتي البروتين المختلفة (في هذه الحالة، جيش صرب البوسنة والبويضات) إيمونوجين وطلاء مستضد الناقلين، على التوالي. أثناء التحصين مع المتقارن هابتين-جيش صرب البوسنة، سوف تنتج الحيوانات أجسام مضادة ضد كلا هابتين (مثلاً، نار) وجيش صرب البوسنة. وبالتالي، لتجنب الكشف إيجابية كاذبة من الأجسام المضادة-جيش صرب البوسنة أثناء الفحص، ينبغي استخدام البويضات هابتين للكشف عن الأجسام المضادة هابتين على وجه التحديد. إنشاء هذه الناقلات هما البروتين وكذلك عند استخدامها صراحة المميز في البروتوكول.
من المهم أيضا أن نلاحظ أنه أثناء إعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]، كثيرا ما الأسلوب تمييع الحد يحتاج إلى تكرارها عدة مرات حتى الآبار التي تحتوي على الخلايا [مونوكلونل] كلها إيجابية. هذا التكرار يساعد على التأكد من أن كل استنساخ ستابلي أسرار جسم معين.
وتشمل القيود المفروضة على هذا الأسلوب عملية معقدة من جيل هيبريدوما والوقت اللازم لاختيار هيبريدوما المنتجة للأجسام المضادة المطلوبة. ومع ذلك، حالما يتم الحصول الإنسان والمحيط الحيوي وتطويره في إيسيليسا، يمكن إجراء الكشف عن المجمع المستهدف في المنتجات الطبيعية بسرعة وكفاءة. جدير بالذكر أن هذا البروتوكول تفادي بعض التكاليف المرتبطة مع غيرها من تقنيات التحليل ولا تتطلب استخدام أدوات مكلفة مرارا وتكرارا لكل منتج طبيعي اختبارها.
متى أنتجت وفرزهم، يمكن استخدام ماب هابتين على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التحليلات. في هذا البروتوكول، ركزنا على استخدام ماب في أسلوب المستندة إلى أليسا التي استخدمت لدراسة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة، فضلا عن20،التفاعلات الحرائك الدوائية،22. كما استخدمت مابس أخرى تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول على إنشاء أسلوب لوني القائم على ماب إيمونوافينيتي لفصل نظائر الهيكلية18، بما في ذلك ابيميرس21، فضلا عن المناعة تدفق أفقي23 للكشف السريع وفي الموقع للجزيء المستهدف. هذه الدراسات الضوء على التطبيق الواسع مابس المنتجة باستخدام البروتوكول المبينة هنا. وهكذا، هذا الإجراء، ومابس إنشاء أعمال تستهدف أساسا لتطوير مختلف تحديدكم المستندة إلى ماب التي يمكن استخدامها بشكل فعال كأدوات تحليلية لتقييم ومراقبة جودة المنتجات الطبيعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل الكلاسيكي الوصفة الأساسية فريق البحث بجامعة بكين "الطب الصيني" ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منحة الأرقام 81573573 و 81473338 و 81503344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
