Summary
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.
Abstract
L’analyse des composants bioactifs présents dans les aliments et produits naturels est devenu un quartier populaire d’étude dans de nombreux domaines, y compris traditionnelle sécurité/toxicologie chinoise médecine et de la nourriture. Plusieurs des techniques classiques d’analyse nécessitent des équipements coûteux ou des compétences. Notamment, les dosages immuno-enzymatiques (Elisa) sont devenus une méthode nouvelle pour l’analyse des aliments et des produits naturels. Cette méthode est basée sur médiée par les anticorps de détection des composants cible. Cependant, comme de nombreux éléments bioactifs dans les produits naturels sont de petite taille (< 1 000 Da) et ne pas provoquer une réponse immunitaire, la création d’anticorps monoclonaux (ACM) contre eux est souvent difficile. Dans ce protocole, nous fournir une explication détaillée des étapes requises pour générer des ACM contre les molécules cibles ainsi que celles nécessaires pour créer les associés indirects concurrentiel (ic) ELISA pour l’analyse rapide de ce composé dans des échantillons multiples. La procédure décrit la synthèse de l’antigène artificiel (c.-à-d., le conjugué de l’Haptène-carrier), fusion cellulaire, vaccination, préparation d’hybridome monoclonale, caractérisation du Lam et l’application par ELISA de la mAb. Le conjugué de l’Haptène-carrier a été synthétisé par le sodium periodate méthode et évaluées par MALDI-TOF-MS. Après l’immunisation, les splénocytes ont été isolés chez la souris immunisée avec le titre d’anticorps plus élevé et fusionné avec l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) - lignée de cellules d’un myélome de souris sensibles Sp2/0 - Ag14 utilisant un polyéthylène glycol (PEG)-méthode de base. Les hybridomes sécrétant mAbs réagissant à l’antigène cible ont été criblés par icELISA de spécificité et de la réactivité croisée. En outre, la méthode de dilution limite a été appliquée pour préparer les hybridomes monoclonales. Le mAbs final ont été davantage caractérisé par icELISA et ensuite utilisé dans une application par ELISA pour la détection rapide et commode de l’Haptène exemple (naringine (NAR)) en produits naturels.
Introduction
Anticorps monoclonaux (ACM), également connu sous le nom des anticorps mono spécifiques, sont produites à partir d’un seul clone de lymphocyte et sont composés d’anticorps monovalents que tous se lient au même épitope1. Ces dernières années, de nombreux produits naturels provenant de plantes médicinales ont été utilisés dans le traitement de diverses maladies2. En effet, les nombreux petits composés moléculaires initialement dérivés de produits naturels sont maintenant appliquées comme des médicaments de première ligne, tels que de l’artémisinine pour le paludisme et paciltaxel (taxol) pour cancer2,3. L’étude des produits naturels a rapidement progressé, en grande partie en raison de l’énorme développement et l’optimisation des techniques d’analyse classiques, y compris la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse (MS). Cependant, il y a encore quelques limitations associées à ces méthodes, telles que leurs protocoles complexes de prétraitement et les coûts connexes en ce qui concerne le temps, du travail et des compétences et instruments requis4.
Récemment, les analyses axées sur le mAb immuno-enzymatique (Elisa) ont été appliquées pour analyser qualitativement et quantitativement les aliments et produits naturels. En fait, cette méthode a été appliquée pour l’analyse des échantillons biologiques et des tests cliniques et a été montrée pour être précise, sensible et hautement efficace tout en évitant aussi les étapes de prétraitement fastidieux associés à d’autres analyses5, 6.
Lors de l’utilisation de tests Elisa axée sur le mAb pour étudier les produits naturels complexes, préparation des anticorps monoclonaux est une des étapes essentielles. Malheureusement, le mAbs spécifiques aux petits composants bioactifs présents dans ces types de substances6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sont souvent limitées par rapport aux antigènes protéiques. Pour contourner ce problème, nous avons développé un protocole pour générer précisément mAbs contre petits composés. Le protocole présenté ici comprend la synthèse de l’antigène artificiel, immunisation de souris, fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte et la préparation de l’hybridome monoclonale.
Notamment, notre groupe de recherche a été étudier la formation du mAbs contre petits composés bioactifs des médecines traditionnelles chinoises et développer leurs applications pour des années. Dans nos études en cours, nous avons développé des ACM contre baicaline16, puerarin17, acide glycyrrhizique18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121et beaucoup d’autres petites molécules. Nos protocoles d’ELISA basés sur ces mAbs ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour évaluer les propriétés pharmacocinétiques de ces petites molécules ainsi que leurs interactions avec d’autres composés bioactifs. En outre, à l’aide de ces ACM, nous avons également développé méthodes de chromatographie d’immunoaffinité pour la séparation des analogues structuraux, y compris les épimères. Récemment, nous avons préparé un immunoessai écoulement latéral à l’aide de notre mAb anti-puerarin qui a ensuite été utilisé pour la détection rapide, sur place de ce composé. Nos résultats indiquent que nos analyses mAb sont des outils indispensables et commodes pour l’étude de la biologie et la qualité de composés dérivés du naturel-produit, en particulier celles utilisées dans les médecines traditionnelles chinoises.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux dans cette étude ont été approuvés par le Comité d’examen éthique à l’Université de Pékin de médecine chinoise (agrément numéro 2016BZYYL00109).
Remarque : La souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été immunisés avec conjugués de protéines Haptène-carrier. Lorsqu’il est utilisé seul, une petite molécule (< 1 000 Da) ne peut pas déclencher une réponse immunitaire. Cependant, conjuguant la petite molécule à un résultats de macromolécule porteuse dans la synthèse de l’antigène. Dans ce contexte, la petite molécule est étiquetée un Haptène. Conjugaison de l’Haptène est une stratégie nécessaire et efficace pour la production de mAb. Pour éviter une réaction croisée, deux transporteurs protéiques, telles que l’albumine sérique bovine (BSA) et l’ovalbumine (OVA) ou l’Hémocyanine de patelle (KLH) et BSA, devrait être utilisé comme l’immunogènes (pour la vaccination animale) et les antigènes de revêtement (pour enduire la plaque pour anti-sérum détection). BSA et ovules sont utilisés à titre d’exemple dans le présent protocole.
1. préparation de l’immunogène et revêtement antigène
NOTE : Pour la synthèse de l’antigène artificiel, utilisez le groupe fonctionnel approprié (par exemple, hydroxyle, sulfhydryle carboxyle acide ou amino) comme le bras de côté pour la liaison covalente à la protéine de transporteur. La conjugaison de méthodes incluent le periodate oxydation, la méthode carbodiimide, une réaction d’anhydrides mixtes, une réaction de glutaraldéhyde et la méthode de succinate. Ce protocole utilise naringine (NAR), un glycoside flavanone bien connus, comme un exemple de composé. NAR est un composé de petit (581 Da) présent dans les agrumes ainsi que divers médicaments traditionnels chinois.
- Une méthode d’oxydation périodate permet de synthétiser NAR-BSA et NAR-OVA conjugués.
- Dissoudre 50 mg de NAR dans l’eau à une concentration finale de 1 mg/mL,22.
- Ajouter 100 µL de sodium fraîchement préparé au périodate solution (0,1 M) à 5 mL de la solution de la NAR. Incorporer le mélange à température ambiante pendant 1 h.
- Dissoudre 4 mg de BSA et ovules dans 2,0 mL de tampon de carbonate de 50 mM (pH 9,6). Ajouter cette protéine solution le NAR/sodium periodate mélange réactionnel.
- Ajuster le mélange à pH 9 avec la solution 1 M Na2CO3 et mélanger à la température ambiante pendant 6 à 8 heures.
- Dialyser le mélange réactionnel dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une membrane de dialyse (MWCO 10 kDa) pendant 3 jours afin d’échanger les obligations Convertibles.
- Analyser le conjugué de l’Haptène-carrier à l’aide de matrix assisté laser desorption/ionisation temps de vol (MALDI-TOF)-MS.
- Mélanger 1-10 pmol du conjugué avec un 103-replier un excès molaire de l’acide sinapique dans une solution aqueuse contenant de l’acide trifluoroacétique (TFA) de 0,15 %. Sécher le mélange sur une plaque d’échantillon dans l’air.
- Effectuer l’analyse à l’aide d’un MALDI-TOF, spectromètre de masse équipé d’un laser pulsé azote fonctionnant à 337 nm. Acquisition de spectres de masse MALDI ions positifs en mode linéaire dans la gamme de masse (m/z) de 15 000-100 000 comme précédemment décrit22.
2. vaccination
Remarque : Un total de 5 souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été utilisées : 4 pour NAR-conjugue vaccination et 1 pour la vaccination de contrôle (PBS).
- Pour la première vaccination, mélanger 50 µg de conjugué (dilué dans 100 µL de PBS) avec un volume égal d’adjuvant complet de Freund (ACF) et émulsionner complètement. Administrer 100 µL de ce mélange pour chaque souris via dorsale injection sous-cutanée.
- Deux semaines plus tard, livrer une dose de rappel de vaccination (100 µL) par injection sous-cutanée avec la même quantité de conjugué mélangé avec adjuvant incomplet (IFA).
- Extrait 200 µL de sang de la veine caudale de chaque souris 7 jours plus tard pour obtenir le sérum.
- Centrifuger le sang à 3 000 x g pendant 10 min. transférer le sérum surnageant dans un nouveau tube.
- Analyser le sérum en utilisant une technique ELISA comme décrit précédemment21. Choisissez la souris avec le plus haut titre de sérum à utiliser pour la fusion cellulaire.
- En préparation de la fusion cellulaire, administrer une immunisation pulsée à la souris choisie par injection intrapéritonéale de 50 µg du conjugué dans 300 µL de PBS sans adjuvant 3 jours avant la fusion.
Remarque : Cette étape peut être omise si le titre est assez élevé.
3. préparation de la Fusion cellulaire
- Préparation moyenne de fusion de cellules
- Pour le milieu sélectif de l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (chapeau) : dissoudre le 50 x supplément de médias HAT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS.
Remarque : Lorsque les 10 mL de la solution concentrée 50 x sont dilués dans 500 mL de milieu de culture, les concentrations finales de l’hypoxanthine, aminoptérine et thymidine sont 100 µM, 0,4 µM et 16 µM, respectivement. - Pour les médias de l’hypoxanthine-thymidine (HT) : dissoudre le 50 x supplément de médias HT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS. Les concentrations finales de l’hypoxanthine et la thymidine sont de 100 µM et 16 µM, respectivement.
- Pour le milieu sélectif de l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (chapeau) : dissoudre le 50 x supplément de médias HAT dans 10 mL de milieu RPMI-1640 et ajouter ce mélange à 500 mL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % FBS.
- La culture des cellules Sp2/0-Ag14.
- Au moins 7 jours avant la fusion, décongeler rapidement un flacon de liquide azote gelé SP2/0-Ag14 cellules myélomateuses dans l’eau chaude.
- Transvaser la solution de cellule dans 5 mL de milieu de culture fraîche (RPMI-1640) et centrifuger pendant 10 min à 1000 x g.
- Après centrifugation, enlevez le milieu de culture et remettre en suspension les cellules fraîches RPMI-1640 additionné de 10 % sérum fœtal (SVF).
- Transférer les cellules et le milieu dans un ballon jaugé de 25 cm2 et incuber à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2.
- Développez les cellules 3 ou flacons2 4 75 cm avant la fusion.
- Préparation de cellules de couche de conducteur abdominale
- Sacrifier une souris ICR de 12 semaines albinos par dislocation cervicale 1 jour avant la fusion cellulaire et il immergez-la dans 75 % d’éthanol.
- Après avoir enlevé la fourrure de l’abdomen avec une pince hémostatique, désinfecter la zone avec 75 % d’éthanol. Couper la peau extérieure pour exposer la cavité abdominale. Injecter des 3 mL du milieu RPMI 1640 stérile dans l’abdomen et massage de l’abdomen pour détacher des cellules supplémentaires dans la solution. Aspirer la suspension cellulaire de mangeoire dans un tube à centrifuger 15 mL.
- Après centrifugation de la suspension cellulaire pendant 10 min à 1000 x g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules nourricières dans 20 mL de milieu sélectif de chapeau.
- Transférer les cellules dans les plaques de culture de cellules de 96 puits (100 µL/puits). Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.
4. la Fusion cellulaire
- Après l’élu immunisés souris a été établie pour la fusion cellulaire (voir étape 2,4), administrer une injection intrapéritonéale de l’hydrate de chloral 10 % (anesthésique) et sacrifier la souris immunisées par dislocation cervicale.
- Recueillir le sang supplémentaire du cœur (1 mL) et préparer le sérum comme indiqué au point 2.3.1 à utiliser comme un contrôle positif lors de la sélection des hybridomes.
- Enlever la peau et le tissu musculaire à l’aide de ciseaux pour exposer la rate.
- Isoler la rate avec des pincettes avec soin et laver la rate avec RPMI-1640. Couper la rate en morceaux, puis enfoncez lentement la rate à triturer. Préparer une suspension de cellules de rate en appuyant sur le tissu de la rate à travers une passoire à 800 maille cellules dans un tube à centrifuger 50 mL.
- Laver la suspension de cellules de rate avec milieu RPMI-1640. Récolter les cellules de la rate par centrifugation (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et puis jeter le surnageant. Répétez cette étape de laver trois fois.
- Sortir les cellules myélomateuses cultivées et amplifiés de l’incubateur et doucement robinet/secouer les fioles pour obtenir une suspension de cellules. Lavez cette suspension avec milieu RPMI 1640 deux fois pour enlever la FBS.
NOTE : Ceci est une étape essentielle car FBS peut influencer la fusion cellulaire. - Compter les cellules et ajuster la concentration avant de les mélanger avec les cellules de la rate. Le rapport final des cellules de la rate pour les cellules de myélome doit être de 1:5 à 01:10.
- Mélanger la cellule rate suspension et myélome des cellules. Centrifuger le mélange de cellules (1000 x g, 10 min et 4 ° C) et éliminer le surnageant.
- Ajouter 1 mL de solution de 50 % de polyéthylène glycol (PEG) dans les cellules et remuer doucement à 37 ° C pendant 1 min. Laisser reposer pendant 30 s.
Remarque : La solution de PEG utilisée dans cette étape doit contenir 50 % (p/v) de polyéthylène glycol 1500 et 10 % (v/v) diméthyl sulfoxyde (DMSO) dans du PBS sans calcium (Ca2 +). - Ajouter 2 mL de milieu RPMI-1640 pendant 2 min terminer la réaction. Ajouter 2 mL supplémentaire du milieu RPMI 1640 pendant 1 min et puis ajouter 10 mL de milieu RPMI-1640 supplémentaire.
- Centrifuger les cellules à 800 g pendant 10 min. Après avoir jeté le surnageant, ajouter la solution de chapeau et continuent à cultiver des cellules. Puis ajouter 100 µL de la suspension cellulaire dans chaque loge des plaques de couche de mangeoire et incuber les boîtes pendant 7 jours à 37 ° C, 5 % de CO2.
Remarque : Dans ces conditions, les cellules de myélome dont mourront tandis que les cellules hybridomes continuera de croître dans le milieu HAT. Après 7 jours, anticorps monoclonal hybridome formera comme un seul groupe de cellules dans le puits, tandis que puits contenant des hybridomes polyclonaux aura plusieurs amas de cellules. - Aspirer le surnageant pour analyse et remplacer le support par support HT.
Remarque : N’oubliez pas de remplacer le milieu HAT avec HT moyen première comme passer directement au milieu sans additifs est préjudiciable à l’hybridome.
5. indirecte ELISA concurrent (icELISA)
- Recouvrir une plaque à 96 puits avec NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/puits) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou une nuit à 4 ° C.
- Bloquer la plaque avec 300 µL de GPBS (PBS contenant la gélatine de 1 % m/v) pendant 1 h à 37 ° C pour empêcher l’adsorption non spécifique.
- Laver la plaque trois fois avec TPB (PBS contenant 0,05 % v/v Tween-20).
- Diluer la NAR en une série de concentrations de méthanol à 10 %. Ajouter 50 µL de ces dilutions à différents puits. Dans les autres puits, ajouter 50 µL de sérum ou d’hybridome surnageante (contenant du mAbs). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C.
- Ajouter 100 μL d’antisouris marqué à la peroxydase IgG dans chaque puits et incuber pendant une 1 heure supplémentaire.
- Après avoir lavé la plaque trois fois avec TPB, ajouter 100 µL de solution de substrat (0,1 M citrate tamponné (pH 4) contenant 0,015 % v/v H2O2 et 2 mg/mL de 3, 3', 5, 5'-tétraméthyl benzidine (TMB)) à chaque puits et incuber pendant 15 min.
- Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 1 M H2SO4 dans chaque puits.
- Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 450 nm. Choisissez les hybridomes qui sécrétaient les plus fortes concentrations d’anticorps NAR dans leur surnageant pour davantage de préparation.
6. préparation des hybridomes Monoclonales
- Utilisez la méthode de dilution limite pour préparer les hybridomes monoclonales.
- Après avoir retiré le support HT des hybridomes choisis (c.-à-d. ceux positifs pour la sécrétion d’anticorps NAR), remettre en suspension les cellules en milieu RPMI 1640 et les compter.
- Diluer les cellules à une concentration de 1 cellule 2 cellules et 4 cellules / puits dans 100 µL de milieu RPMI 1640 dans une plaque à 96 puits. Incuber les plaques à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Après 7-10 jours, détecter les anticorps NAR dans la culture surnageante à l’aide du protocole d’icELISA (étape 5). Cellules de transfert depuis les hybridomes qui sont positifs aux anticorps anti-NAR plaques 24 puits, 25 cm2 flacons et fioles2 75 cm pour la culture.
- Cryoconservé les hybridomes monoclonales.
- Récolter les cellules et de les transférer pour tubes de centrifugeuse.
- Après centrifugation des cellules (800 x g, 10 min), retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de congélation moyen (RPMI-1640, sérum de veau foetal de 20 % (FCS) et 10 % DMSO). Transférer les suspensions cellulaires pour cryotubes.
- Stocker les cryotubes dans une glacière thermo-électrique dégradé à-80 ° C pendant 24 h. Puis transférez les cryotubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
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Representative Results
Génération des hybridomes monoclonales
Le poids moléculaire du conjugué Haptène-carrier a été confirmé par analyse de MALDI-TOF-MS. Comme le poids moléculaire de BSA et de la NAR sont connus, le nombre de petites molécules conjuguées avec BSA pourrait être calculé. La figure 1 montre les résultats spectrales représentatifs de la NAR-BSA22, qui affiche un pic large à m/z 77 058. La masse moléculaire moyenne de BSA est 66 430, il semble qu’au moins 18 molécules NAR (581 MW) ont été conjugués à la BSA (rapport de couplage molaire (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs ont été effectuées afin de déterminer les titres de sérum après l’immunisation de souris22. Il semble que les titres d’anticorps sériques des quatre souris immunisées avec le conjugué de NAR-BSA étaient significativement plus élevées que celle observée pour le contrôle de la souris (Figure 2). La souris avec le titre plus haut (plus 1:5 000) a été utilisé pour la fusion cellulaire.
Après que les cellules de la rate de cette souris ont été fusionnés aux cellules couche abdominale feeder, les hybridomes furent cultivés pour les moyennes inselection 7 jours. À l’aide d’icELISAs, le surnageant de culture cellulaire a été testé, andthehybridomas positives pour NAR mAbs étaient reclonés et élargies. Les images à la Figure 3 illustrent les résultats conventionnels pour les lignées cellulaires stables hybridome anticorps monoclonaux et polyclonaux.
Dépistage et demande de l’ACM anti-NAR
Le point critique de cette expérience est la projection de la spécificité de la mAb. Les résultats du tableau 1 montrent que le mAb dans cette expérience a réagi avec NAR mais pas le blocage tampon ou transporteur protéines22. En outre, la spécificité de la mAb évaluation en testant sa réaction croisée avec les composés structurellement apparentés. Le tableau 2 montre les taux de réactivité croisée calculée. Comme le taux de réactivité croisée pour les autres flavonoïdes testés étaient situés à moins de 2 %, il est clair que cette mAb est spécifique pour NAR22.
Un icELISA a été développé à l’aide de la mAb anti-NAR et met en évidence l’application de cette méthodologie. À l’aide de solutions contenant des concentrations connues de NAR, une courbe d’étalonnage a été tracée à l’aide des absorbances de ces solutions et la gamme de linéarité de la courbe de modèle de S a été calculée (comme illustré dans l’encart supérieur droit figure). L’équation de régression linéaire (y =-0,176 ln (x) + 1.1243, R2 = 0.9978) calculées pour cette courbe peut être appliquée à l’analyse quantitative des échantillons inconnus.
Production et caractérisation d’un mAb contre l’acide glycyrrhizique
Utilisant ce protocole de fusion de cellules de splénocytes/myélome, un anticorps monoclonal hybridome sécrétant mAb acide glycyrrhizique-anti, nommé DF5, a également été établi18. Le sous-type de cette DF5 mAb a été identifié comme IgG1 avec une chaîne légère kappa (tableau 3). Similaire à l’analyse qui précède, le mAb a été utilisé pour des contrôles supplémentaires et les applications, tandis que les hybridomes anticorps monoclonales spécifique de l’antigène andcryopreserved élargie dans l’azote liquide pour le stockage à long terme.
| Substance de revêtement | Une valeur de450 | Réactivité croisée (%) |
| NAR-OVA | 0,97 | 100 |
| OVULES | 0,056 | < 0,01 |
| BSA | 0,068 | < 0,01 |
| Gélatine | 0,053 | < 0,01 |
| Lait écrémé | 0.05 | < 0,01 |
Le tableau 1. Réactivité de la mAb anti-NAR NAR-OVA et transporteur protéines.
| Classement | Composé | Réactivité croisée (%) |
| Flavonoïdes | Naringine | 100 % |
| Puerarin | 1,26 % | |
| Néohespéridine | 18,80 % | |
| Rutine | 1,95 % | |
| Baicalein | < 0,09 % | |
| Hypéroside | < 0,09 % | |
| Terpènes | Ginsenoside Rg2 | < 0,09 % |
| Ginsenoside Rb1 | < 0,09 % | |
| Re de Ginsenoside | < 0,09 % | |
| Notoginsenoside | < 0,09 % | |
| Acide glycyrrhizique | < 0,09 % | |
| Acide Glycyrrhétique | < 0,09 % | |
| Saikosaponine | < 0,09 % | |
| Paeoniflorin | < 0,09 % | |
| Gentiopicrin | < 0,09 % | |
| Stérides | Acide cholique | < 0,09 % |
| Acide Désoxycholique | < 0,09 % | |
| Anthraquinones | Rheumemodin | < 0,09 % |
| Acide rheinic | < 0,09 % | |
| Autres | Acide Salvianolic | < 0,09 % |
| Curcumine | < 0,09 % | |
| Gastrodin | < 0,09 % | |
| Amygdaline | < 0,09 % |
Le tableau 2. Réactivité croisée (%) de la mAb anti-NAR NAR et ses composés connexes.
| isotype de chaîne lourde | isotype de chaîne légère | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | Kappa | lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tableau 3. Analyse d’isotype de mAb DF5.
Figure 1: MALDI-TOF-MS analyse du conjugué NAR-BSA. [M + H] + et [M + H 2]2 + indiquent les molécules protonées single et double NAR-BSA, respectivement. Ce chiffre a été modifié de Qu et al., 201622
Figure 2 : Analyse de anti-sérum titre d’icELISA. Souris, 1 - 4 ont été vaccinés avec le NAR-BSA conjugué, tandis que le contrôle a été immunisé avec véhicule (PBS). Les données représentent la moyenne ± écart-type (SD) (n = 3). Ce chiffre a été modifié de Qu et al., 201622. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives de stable des anticorps monoclonaux (A) et polyclonaux hybridomes b. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Demande de l’ACM anti-NAR dans un icELISA. Différentes concentrations de NAR ont été incubées avec mAb dans les puits préalablement recouvert de NAR-OVA (1 mg/mL). A est l’absorbance en présence de la NAR, alors qu’un0 est l’absorbance en l’absence de NAR. Les données représentent la moyenne ± écart-type (SD) (n = 3). Ce chiffre a été modifié de Qu et al., 201622.
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Discussion
Nous présentons ici un protocole pour le succès de la production du mAbs contre naturels produit dérivé de petites molécules. Les étapes essentielles de la procédure ont été exposées, et nous avons démontré l’utilité du présent protocole à l’aide de NAR comme une petite molécule d’exemple. Les spectres de l’exemple, les analyses de réactivité et icELISA résultats tous montrent représentant expérimental et les données de contrôle qui sont obtenues à l’aide de ce protocole. Images d’exemple des hybridomes offrent une représentation visuelle de ce que le chercheur devrait rechercher quand différencier les hybridomes anticorps monoclonaux et polyclonaux. Ensemble, nous avons démontré que la production de mAb, la caractérisation et la stratégie de demande présenté ici résultats dans la création d’un mAb efficace contre une petite molécule, mais aussi un roman QU'ELISA basée sur le mAb particulière qui peut être utilisé pour tester l’expression de la molécule cible dans d’autres produits naturels.
Fonctionne avec n’importe quel type d’anticorps, le plus commun problème survenant au cours de cette procédure est liée à la sensibilité de la mAb. En effet, il y a un risque élevé que le CCG ne fonctionnera pas comme prévu en raison de la faible sensibilité, forte réactivité croisée ou d’autres facteurs. Comme l’ensemble de la procédure prend au moins 4 mois à effectuer dans son intégralité, il est important de prendre soin au cours de l’examen initial des mAbs sécrétée par les hybridomes. Un aspect essentiel pour éviter de créer un mAb inefficace consiste à filtrer le anti-sérum en icELISA avant la fusion cellulaire confirmée réactif avec l’Haptène mais pas le transporteur. Cela est possible en utilisant les deux transporteurs protéiques (dans ce cas BSA et ovules) comme immunogène et supports de revêtement de l’antigène, respectivement. Au cours de l’immunisation avec le conjugué de l’Haptène-BSA, les animaux vont produire des anticorps dirigés contre les deux l’Haptène (p. ex., NAR) et BSA. Ainsi, pour éviter la détection de faux positifs d’anticorps anti-BSA durant la projection, Haptène-OVA devrait servir à détecter les anticorps anti-Haptène spécifiquement. La création de ces transporteurs de deux protéines, ainsi que quand s’en servir est explicitement mis en évidence dans le protocole.
Il est également important de noter que lors de la préparation de l’anticorps monoclonales hybridomes, la méthode de dilution limite doit souvent être répétée plusieurs fois jusqu'à ce que tous les puits contenant les cellules monoclonales sont positifs. Cette répétition permet de confirmer que chaque clone stablement secrets l’anticorps spécifique.
Les limites de cette méthode comprennent le processus compliqué de génération d’hybridomes et le temps nécessaire pour la sélection de l’hybridome productrices d’anticorps désiré. Cependant, une fois que le mAb est obtenu et l’icELISA est développé, la détection du composé cible dans les produits naturels peut être effectuée rapidement et efficacement. Notamment, ce protocole n’évite pas certains des coûts associés aux autres techniques d’analyse et ne nécessite pas l’utilisation des instruments coûteux à plusieurs reprises pour chaque produit naturel testé.
Une fois produite et projeté, le mAb Haptène peut être employée couramment dans une variété d’analyses. Dans ce protocole, nous nous sommes concentrés sur l’utilisation de la mAb dans une méthode ELISA-basé qui a servi à étudier la biologie de la petite molécule ainsi que ses interactions pharmacocinétiques20,22. Autres mAbs créés avec ce protocole ont également été utilisés pour établir une méthode de chromatographie d’immunoaffinité mAb-basé pour la séparation des analogues structuraux18, y compris les épimères21, ainsi qu’un écoulement latéral immuno-essai23 pour la détection rapide et sur place de la molécule cible. Ces études mettent en évidence l’application large du mAbs produites en utilisant le protocole décrit ici. Ainsi, cette procédure et le mAbs créés et actes comme une fondation pour le développement de diverses cibles mAb immunologiques qui peuvent être efficacement utilisés comme outils d’analyse pour l’évaluation et le contrôle de la qualité des produits de la nature.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de sciences naturelles de Chine (subvention numéros 81573573, 81473338 et 81503344) et le classique Prescription base équipe de recherche à l’Université de Pékin de médecine chinoise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
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