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Immunology and Infection

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

doi: 10.3791/57116 Published: April 6, 2019

Summary

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

Abstract

식품 및 천연 제품에 생리 활성 구성 요소 분석 전통적인 중국 의학 및 식품 안전/독극물을 포함 한 많은 분야에서 연구의 인기 지역이 되었다. 고전 분석 기술의 많은 고가의 장비 및 전문 지식이 필요합니다. 특히, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 식품 및 천연 제품의 분석에 대 한 새로운 방법 되고있다. 이 방법은 항 체 중재 탐지 대상 구성 요소를 기반으로 합니다. 그러나, 많은 자연 제품에서 생리 활성 구성 요소는 작은 (< 1000 다)와 면역 반응을 유도 하지 마십시오, 그들에 대하여 단일 클론 항 체 (mAbs)을 만드는 것은 종종 어려운. 이 프로토콜 mAbs에 대 한 분자를 대상으로 여러 샘플에서 화합물의 빠른 분석에 대 한 관련된 간접 경쟁 (ic) ELISA를 만드는 데 필요한을 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 절차 인공 항 원 (즉, hapten-운반대 공액)의 합성, 면역, 세포 융합, 단일 클로 널 hybridoma 준비, mAb, 특성화 고는 mAb의 ELISA 기반 응용 프로그램에 설명합니다. Hapten-운반대 공액 나트륨에 의해 합성 되었다 메서드를 periodate 하 고 MALDI TOF MS에 의해 평가. 예방 접종, 후 splenocytes 가장 높은 항 체 titer로 면역된 한 마우스에서 고립 되었고 hypoxanthine aminopterin 티 미 딘 (모자)-민감한 마우스 myeloma 세포 선 s p 2/0-Ag14 융합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용 하 여-방법을 기반으로. Hybridomas 은닉 mAbs 대상 항 원에 반응 특이성 및 분에 대 한 icELISA에 의해 상영 했다. 또한, 제한 희석 메서드는 단일 클로 널 hybridomas 준비에 적용 되었습니다. 최종 mAbs icELISA 특징 추가 되었고 예제 hapten (naringin (NAR)) 자연 제품에서의 신속 하 고 편리한 검출 ELISA 기반 응용 프로그램에서 활용.

Introduction

단일 클론 항 체 (mAbs), 모노-특정 항 체로 알려진 단일 B-lymphocyte 복제에서 생산 되며 모두 동일한 epitope1에 바인딩할 여러차례 항 체의 구성. 최근 몇 년 동안, 많은 약 식물 유래 천연 제품2다양 한 질병 치료에 사용 되었습니다. 실제로, 원래 천연 제품에서 파생 된 많은 작은 분자 화합물 artemisinin 말라리아와 암2,3paciltaxel (taxol) 등 첫 줄 약으로 이제 적용 됩니다. 천연 제품의 연구는 엄청난 개발 및 기존의 분석 기술, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분석 (MS) 등의 최적화 때문에 크게 급속 한 진행을 했다. 그러나, 아직도 이러한 방법으로, 그들의 복잡 한 전처리 프로토콜, 시간, 노동/전문 지식, 및 필요한 악기4에 관하여 관련된 비용 등 관련 된 몇 가지 제한 사항이 있습니다.

최근, mAb 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 질적 및 양적 분석 음식과 자연 제품 적용 되었습니다. 사실,이 생물 학적 샘플 분석 및 임상 테스트에 적용 된 방법과 또한 다른 분석5와 관련 된 지루한 전처리 단계를 피하 면 서, 민감한, 정확 하 고 고효율로 표시 되었습니다. 6.

MAb 기반 ELISAs를 사용 하 여 복잡 한 천연물 연구, 단일 클론 항 체의 준비 핵심 단계 중 하나입니다. 불행히도, 이러한 유형의 물질6,7,,89,10,11,12에 작은 bioactive 구성 요소에 특정 mAbs ,13,,1415 는 제한 된 단백질 항 원에 비해. 이 문제를 회피, 특히 작은 화합물에 대하여 mAbs를 생성 하는 프로토콜을 개발 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 합성 인공 항 원, 마우스 면역, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 단일 클로 널 hybridoma 준비 포함 됩니다.

특히, 우리의 연구 그룹 mAbs 전통 중국 의약품에서 작은 생리 활성 화합물에 대 한 형성을 공부 하 고 수년간 그들의 애플 리 케이 션을 개발 되었습니다는. 우리의 지속적인 연구에 mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic 산18, paeoniflorin19, ginsenoside 다시20, ginsenoside Rh121, 그리고 다른 많은 작은 분자에 대 한 개발 했습니다. 이러한 mAbs에 따라 우리의 ELISA 프로토콜 연구의 숫자에 다른 생리 활성 화합물과 그들의 상호 작용으로 이러한 작은 분자의 약 동학을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 이러한 mAbs를 사용 하 여, 우리는 또한 개발 immunoaffinity 착 색 인쇄기 방법 epimers를 포함 하 여 구조상 아날로그의 분리에 대 한. 최근에, 우리는 우리의 안티-puerarin mAb 이후에 급속 하 고, 현장이 화합물의 검출에 사용 된를 사용 하 여 측면 흐름 immunoassay 준비. 우리의 결과 우리의 mAb 기반 분석 실험 생물학을 공부 하 고 특히 전통 중국 의약품에 사용 된 천연 제품 파생 된 화합물의 품질에 대 한 편리 하 고 필수적인 도구 나타냅니다.

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Protocol

이 연구에서 수행 하는 동물 절차의 모든 중국 의학 (승인 번호 2016BZYYL00109)의 베이징 대학에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다.

참고: 여성 BALB/c 마우스 (8 주 이전) 했다 hapten-운반대 단백질 어원이 같은 말을으로 예방 접종 혼자, 작은 분자를 사용 하는 경우 (< 1000 다) 면역 반응을 유도 수 없습니다. 그러나, 항 원 합성에 캐리어 고분자 작은 분자 변화. 이러한 맥락에서 작은 분자를 hapten을 표시 됩니다. Hapten 활용 mAb 생산을 위한 필요 하 고 효과적인 전략 이다. 교차 반응, 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 ovalbumin (OVA) 또는 열쇠 구멍 삿 hemocyanin (KLH) 등 두 명의 다른 단백질 수송을 방지 하려면 BSA, (를 위한 플레이트 코트 (동물 예방접종)을 immunogens 그리고 코팅 항으로 사용 해야 합니다 반대로 혈 청 탐지)입니다. BSA와 OVA이이 프로토콜 예제로 사용 됩니다.

1. Immunogen 및 코팅 항 원 준비

참고: 합성 인공 항 원에 대 한 사용 하 여 적절 한 기능 그룹 (, 수 산 기, 산 성, 또는 아미노 sulfhydryl carboxyl) 측 팔으로 캐리어 단백질으로 화학식 바인딩에 대 한. 활용 방법 포함 periodate 산화, carbodiimide 방법, 혼합된 anhydrides 반응, 글 반응 및 합성 방법. 이 프로토콜 예제 화합물으로 naringin (NAR)는 잘 알려진 flavanone glycoside를 사용합니다. NAR은 감귤 뿐만 아니라 다양 한 전통 중국 의약품에 작은 화합물 (581 다) 이다.

  1. Periodate 산화 프로시저를 사용 하 여 NAR BSA 및 NAR OVA 어원이 같은 말을 합성.
    1. 1 mg/mL22의 최종 농도에 물에 NAR의 50 밀리 그램을 디졸브.
    2. 갓된 나트륨의 100 µ L periodate 솔루션 (0.1 M) NAR 솔루션의 5 mL을 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실내 온도에 혼합물을 저 어.
  2. 50 m m 탄산 버퍼 (pH 9.6) 2.0 mL에 BSA의 OVA 4 mg을 디졸브. 이 단백질을 추가 솔루션 NAR/나트륨을 반응 혼합물을 periodate.
  3. PH 9 1 M 나2CO3 솔루션에 혼합물을 조정 하 고 6-8 시간 실 온에서 저 어.
  4. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) CBS를 교환 하는 투 석 막 (MWCO 10 kDa) 3 일 동안을 사용 하 여에 반응 혼합물 dialyze
  5. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)를 사용 하 여 hapten-운반대 공액 분석-MS.
    1. 10 여 켤레의 1-10 pmol 혼합3-0.15 %trifluoroacetic 산 (TFA)을 포함 하는 용액에 sinapinic 산의 어 금 니 과잉을 접어. 공기에서 샘플 접시에 혼합물을 건조.
    2. 337에서 운영 하는 질량 분 서 계는 펄스 질소 레이저를 갖춘 MALDI TOF를 사용 하 여 분석을 수행 nm. 15000-100000으로 앞에서 설명한22의 대량 범위 (m/z) 선형 모드에서 긍정적인 이온 MALDI 질량 스펙트럼을 취득.

2입니다. 예방 접종

참고: 5 BALB/c 여성 쥐 (8 주 정도)의 총 사용 되었다: NAR 4 켤레 예방 접종 및 제어 (PBS) 예방 접종에 대 한 1.

  1. 첫 번째 접종 Freund의 완전 한 보조 (CFA)의 동등한 양으로 켤레 (100 µ L의 PBS에 희석)의 50 µ g을 혼합 하 고 완전히 유상으로 만들 다. 각 마우스를 통해 지 피하 주입에이 혼합물의 100 µ L를 관리 합니다.
  2. 2 주 후, 같은 양의 공액 불완전 한 보조 (IFA)와 혼합 부스터 피하 주사를 통해 예방 접종 (100 µ L) 제공 합니다.
  3. 200 µ L의 혈액에서에서 추출 모든 마우스의 꼬리 정 맥 7 일 후 혈 청을 얻기 위해.
    1. 원심 분리기 3000 x g에 피 10 분에 대 한 신선한 튜브에 혈 청 표면에 뜨는 전송.
    2. 앞에서 설명한21로 ELISA를 사용 하 여 혈 청 분석. 세포 융합에 사용할 가장 높은 혈 청 titer와 마우스를 선택 하십시오.
  4. 세포 융합에 대 한 준비, 보조 없이 PBS의 300 µ L에서 켤레의 50 µ g의 복 주입을 통해 선택한 마우스에 펄스 면역을 융합 하기 전에 3 일 관리.
    참고:이 단계는 titer 충분히 높은 경우 생략할 수 있습니다.

3입니다. 세포 융합에 대 한 준비

  1. 셀 퓨전 중간 준비
    1. Hypoxanthine-aminopterin-티 미 딘 (모자) 선택적인 매체에 대 한: 모자 미디어의 보충 교재 10 ml에서 RPMI 1640 x 50을 녹이 고 RPMI 1640의 500 mL에이 혼합물을 추가 포함 하는 20 %FBS.
      참고: 50 x 집중의 10 mL 500 ml 문화 매체의 희석은 때 hypoxanthine, aminopterin, 그리고 티 미 딘의 최종 농도 0.4 µ M, 100 µ M, 16 µ m 이다, 각각.
    2. Hypoxanthine-티 미 딘 (HT) 미디어: HT 미디어의 보충 교재 10 ml에서 RPMI 1640 x 50을 녹이 고 RPMI 1640의 500 mL에이 혼합물을 추가 포함 하는 20 %FBS. Hypoxanthine 그리고 티 미 딘의 최종 농도 각각 100 µ M와 16 µ M입니다.
  2. S p 2/0-Ag14 세포 문화.
    1. 최소 7 일 전에 퓨전, 빠르게 액체 질소 냉동 s p 2/0-Ag14 myeloma 세포의 따뜻한 물에 유리병을 녹여.
    2. 신선한 문화 매체 (RPMI-1640)와 1000 x g에서 10 분 원심 분리기의 5 mL로 셀 솔루션을 전송 합니다.
    3. 원심, 후 문화 매체를 제거 하 고 신선한 RPMI-1640 년 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완에 셀 resuspend.
    4. 25 c m2 플라스 크로 셀과 매체를 전송 및 5% CO2의 분위기 속에서 37 ° C에서 품 어.
    5. 3 또는 4 75 c m2 플라스 크 융합 하기 전에 셀을 확장 합니다.
  3. 복 부 급지대 레이어 셀의 준비
    1. 자 궁 경부 전위 세포 융합에 앞서 1 일에 의해 12 주 된 흰둥이 ICR 마우스를 희생 하 고 75% 에탄올에 잠수함.
    2. Hemostatic 집게와 복 부에서 모피를 제거한 후 지역 75% 에탄올으로 소독. 복 부 구멍을 노출 외부 피부를 잘라. 복 부에 살 균 RPMI 1640 매체의 3 mL를 주입 하 고 솔루션에 추가 셀을 분리 하려면 복 부 마사지. 피더 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브로 발음.
    3. Centrifuging 1000 x g에서 10 분 동안 세포 현 탁 액, 삭제는 상쾌한 고 모자 선택적인 매체의 20 mL의 급지대 셀 resuspend.
    4. 96-잘 세포 배양 배지 (100 µ L/잘)로 셀을 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.

4. 세포 융합

  1. 예방 접종을 선택 후 마우스 세포 융합에 대 한 준비 된 (단계 2.4 참조), 10 %chloral 하이드 레이트 (마 취)의 복 주사를 관리 하 고 자 궁 경부 전위를 통해 면역된 한 마우스를 희생.
  2. 마음 (1 mL)에서 추가 혈액을 수집 하 고 혈 청 hybridoma 선택 동안 긍정적인 컨트롤로 사용할 2.3.1 단계에서 설명한 대로 준비.
  3. 피부와 근육 조직 비장 폭로 위를 사용 하 여 제거 합니다.
  4. 신중 하 게 핀셋으로 비장을 분리 하 고 세척 RPMI 1640와 비장. 조각으로는 비장 고 천천히 triturate를 비장 파운드. 50 mL 원심 분리기 관으로 비장 조직 800 메쉬 셀 스 트레이너를 통해 눌러 비장 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
  5. 워시 RPMI 1640 매체와 비장 세포 현 탁 액. 원심 (1000 x g, 10 분, 4 ° C)에 의해 비장 세포를 수확 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 이 세척 단계를 세 번 반복 합니다.
  6. 인큐베이터에서 재배 하 고 증폭 된 myeloma 세포를 제거 하 고 부드럽게 탭/흔들어 세포 현 탁 액을 얻기 위해 플라스 크. 이 정지 RPMI 1640 매체는 FBS를 제거 하려면 두 번 씻는 다.
    참고: 이것은 필수적인 단계 FBS 세포 융합에 영향을 미칠 수 있습니다.
  7. 셀을 계산 하 고 비장 세포와 혼합 하기 전에 농도 조정 합니다. 비장 세포 myeloma 세포의 최종 비율 1: 5와 1시 10분 사이 이어야 한다.
  8. 비장의 셀 펜션과 myeloma 세포를 혼합. 셀 혼합 (1000 x g, 10 분, 4 ° C), centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  9. 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 솔루션의 1 mL에 있는 셀에 추가 하 고 1 분 동안 37 ° C에서 부드럽게 저 어. 30 서 하자 s.
    참고:이 단계에서 사용 되는 말뚝 솔루션 50% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 1500을 포함 해야 합니다 및 칼슘 (캘리포니아2 +) 없이 PBS에 10% (v/v) 디 메 틸 sulfoxide (DMSO).
  10. 반응 종료를 2 분 동안 RPMI 1640 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 또 다른 1 분 RPMI 1640 매체의 추가적인 2 mL를 추가 하 고 RPMI 1640 매체의 추가적인 10 mL를 추가 합니다.
  11. 10 분 동안 800 x g에서 셀 원심 삭제는 상쾌한, 후 모자 솔루션을 추가 하 고 셀을 육성 하기 위해 계속. 다음 급지대 레이어 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 7 일에 대 한 번호판을 품 어.
    참고:이 조건 하에서 들뜬된 myeloma 세포 hybridoma 세포 모자 매체에서 성장을 계속 하는 동안 죽을 것 이다. 7 일 후, 단일 클로 널 hybridoma 우물 polyclonal hybridoma를 포함 하는 셀의 여러 클러스터 있을 것 이다 하는 동안에 잘 셀의 단일 클러스터로 형성할 것 이다.
  12. 분석에 대 한 상쾌한 발음 하 고 HT 매체와 매체를 대체 합니다.
    참고: 반드시 모자 매체를 대체할 HT와 unsupplemented 매체에 직접 전환으로 중간 첫 번째는 hybridoma에 해롭습니다.

5. 간접 경쟁 일 라 (icELISA)

  1. NAR-OVA (1 µ g/mL, 100 µ L/잘)와 96 잘 접시 코트와 4 ° c.에 하룻밤 또는 37 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어
  2. 일반적인 흡착을 방지 하기 위해 37 ° C에서 1 시간에 대 한 GPBS (PBS 1 %m / v 젤라틴을 포함)의 300 µ L로 플레이트를 차단 합니다.
  3. 플레이트 TPBS (PBS 0.05 %v / v 트윈-20 포함)와 세 번 씻는 다.
  4. 농도 10% 메탄올을 가진 시리즈로 결합형된 NAR을 희석. 우물을이 희석의 50 µ L를 추가 합니다. 다른 우물에서 항 혈 청 또는 hybridoma 표면에 뜨는 (mAbs 포함)의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 1 시간을 위한 접시를 품 어
  5. 과산화 효소 표시 반대로 마우스 IgG 각 우물에의 100 μ를 추가 하 고 추가 1 시간에 대 한 품 어.
  6. 씻은 후 세 번 TPBS와 접시, 100 µ L 기판 솔루션의 추가 (0.1 m M 구 연산 염 버퍼 (pH 4) 포함 0.015%의 v/v H2O2 와 3, 3', 2 mg/mL 5, 5'-tetramethyl benzidine (TMB)) 각을 잘 하 고 15 분 동안 품 어.
  7. 그래서 1 M H2의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지4 각 잘.
  8. 450에 microplate 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 nm. Hybridomas 추가 준비에 대 한 그들의 상쾌한에 NAR 항 체의 높은 농도 분 비 하는 선택 하십시오.

6입니다. 단일 클로 널 Hybridomas의 준비

  1. 제한 희석 메서드를 사용 하 여 단일 클로 널 hybridomas 준비 하.
    1. 선택한 hybridomas에서 HT 매체를 제거한 후 (즉, 그 NAR 항 체 분 비에 대 한 긍정적인) RPMI-1640 년에 셀 resuspend, 그들을 계산.
    2. 셀 1 셀, 2 셀 및 96 잘 접시에서 RPMI 1640의 100 µ L에 잘 당 4 셀의 농도를 희석. 37 ° c, 5% CO2접시를 품 어.
    3. 7-10 일 후 icELISA 프로토콜 (5 단계)을 사용 하 여 표면에 뜨는 문화 NAR 항 체를 감지 합니다. NAR 24-잘 접시, 25 c m2 플라스 크, 및 75 cm2 플라스 크 배양에 대 한 항 체에 대 한 긍정적인 hybridomas에서 세포를 전송 합니다.
  2. 단일 클로 널 hybridomas cryopreserve
    1. 세포를 수확 하 고 원심 관에 그들을 전송.
    2. Centrifuging 셀 (800 x g, 10 분), 후에 상쾌한을 제거 하 고 resuspend (RPMI-1640, 20% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 그리고 10 %DMSO) 중간에 셀. Cryotubes 셀 정지 전송.
    3. 24 h-80 ° C에서 그라데이션 냉각 상자에 있는 cryotubes를 저장 합니다. 다음 장기 저장을 위한 액체 질소는 cryotubes 전송.

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Representative Results

단일 클로 널 hybridomas의 세대

Hapten-운반대 켤레의 분자량은 MALDI TOF MS 분석에 의해 확인 됐다. BSA와 NAR의 분자량 알려져 있습니다, BSA로 활용 하는 작은 분자의 수를 계산할 수 있습니다. 그림 1 은 NAR BSA22, m/z 77,058에 광범위 한 피크를 표시에 대 한 대표적인 스펙트럼 결과 보여줍니다. BSA의 평균 분자량은 66,430, 그것은 적어도 18 NAR 분자 (MW 581) BSA와 활용 했다 나타납니다 (어 금 니 커플링 비율 (NAR:BSA) = 18:1).

icELISAs는 마우스 접종22을 다음과 같은 항 혈 청 titers를 확인 하기 위해 수행 되었습니다. NAR BSA 공액 접종 4 쥐의 혈 청 항 체 titers 컨트롤 마우스 (그림 2)에 대 한 관찰 보다 훨씬 더 높은 했다 나타납니다. 가장 높은 titer로 마우스 (이상 1:5, 000) 세포 융합에 사용 되었다.

이 마우스 비장 세포 복 급지대 레이어 셀에 융합 했다, 후에 hybridomas 7 일 inselection 매체에 대 한 성장 했다. IcELISAs를 사용 하 여, 표면에 뜨는 세포 배양 시험 되었다, NAR mAbs에 대 한 긍정적인 andthehybridomas recloned 하 고 확장 했다. 그림 3 에 이미지 안정적인 단일 클로 널과 polyclonal hybridoma 세포 라인에 대 한 기존의 결과를 보여 줍니다.

심사 및 안티-NAR mAb의 응용

이 실험의 중요 한 점은 mAb 특이성의 심사입니다. 표 1 에 결과이 실험에서 mAb NAR 하지만 하지 차단 버퍼 또는 캐리어 단백질22반응 하는 방법을 보여 줍니다. 또한,는 mAb의 특이성 더 구조적으로 관련된 화합물과의 분을 테스트 하 여 평가 되었습니다. 표 2 는 계산된 분 속도 보여 줍니다. 다른 플 라 보노 이드에 대 한 분 율 테스트 모두 2% 보다 적은, 그것은 분명이 mAb NAR22에 대 한 특정 이다.

icELISA 안티 NAR mAb를 사용 하 여 개발한이 방법론의 응용 프로그램을 강조 하며 NAR의 알려진된 농도 포함 하는 솔루션을 사용 하 여 표준 곡선 이러한 솔루션의 absorbances를 사용 하 여 플롯은 그리고 S 모델 곡선의 선형 범위 (오른쪽 그림 삽입에 표시 된) 계산 했다. 선형 회귀 방정식 (y =-0.176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978)이이 곡선 알 수 없는 샘플의 정량 분석에 적용 될 수에 대 한 계산.

생산 및 mAb glycyrrhizic 산에 대 한의

이 splenocyte/myeloma 세포 융합 프로토콜을 사용 하 라는 DF5, 안티 glycyrrhizic 산 mAb 은닉 단일 클로 널 hybridoma 또한 설립된18이었다. 이 DF5 mAb의 하위는 카파 경 쇄 (표 3)와 IgG1으로 확인 되었습니다. 마찬가지로 위의 분석 하는 mAb 사용 되었다 추가 검사 및 응용 프로그램에 대 한 단일 클로 널 항 원 특정 hybridomas 장기 저장을 위한 액체 질소에 확장 된 andcryopreserved 동안.

코팅 물질 450 분 (%)
Nar-OVA 0.97 100
OVA 0.056 < 0.01
BSA 0.068 < 0.01
젤라틴 0.053 < 0.01
탈지 우유 0.05 < 0.01

표 1입니다. NAR OVA와 캐리어 안티 NAR mAb의 반응성 단백질.

분류 화합물 분 (%)
플 라 보노 이드 Naringin 100%
Puerarin 1.26%
Neohesperidin 18.80%
루틴 1.95%
Baicalein < 0.09%
Hyperoside < 0.09%
Terpenes Ginsenoside Rg2 < 0.09%
Ginsenoside Rb1 < 0.09%
Ginsenoside 다시 < 0.09%
Notoginsenoside < 0.09%
Glycyrrhizic 산 < 0.09%
Glycyrrhetic 산 < 0.09%
Saikosaponin < 0.09%
Paeoniflorin < 0.09%
Gentiopicrin < 0.09%
Sterides Cholic acid < 0.09%
Deoxycholic 산 < 0.09%
Anthraquinones Rheumemodin < 0.09%
Rheinic 산 < 0.09%
다른 Salvianolic 산 < 0.09%
Curcumin < 0.09%
Gastrodin < 0.09%
Amygdalin < 0.09%

표 2입니다. 분 (%) NAR와 그 관련된 화합물에 대 한 안티-NAR mAb의.

isotype 무거운 체인의 isotype 빛 체인의
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM 카파 람다
DF5

표 3입니다. MAb DF5 Isotype 분석입니다.

Figure 1
그림 1: NAR BSA 켤레의 MALDI TOF MS 분석. [M + H] + 와 [M + 2 H]2 + NAR BSA의 단일 및 이중 protonated 분자를 각각 나타냅니다. 이 그림에서 숨어 외., 201622 수정 되었습니다. 

Figure 2
그림 2 : IcELISA에 의해 항 혈 청 titer의 분석. NAR BSA 접종 했다 쥐 1-4 켤레, 컨트롤은 차량 (PBS) 예방 접종을 하는 동안. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)를 나타냅니다 (n = 3). 이 그림은 숨어 외., 201622에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 3
그림 3 : 대표 이미지 단일 클로 널 (A) 및 polyclonal (B) hybridomas 안정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 4
그림 4 : 는 icELISA에 안티-NAR mAb의 응용. NAR의 다양 한 농도 mAb NAR-OVA (1 mg/mL)와 미리 코팅 스에서와 알을 품을 했다. A0 은 NAR의 부재에서 흡 광도, NAR의 흡 광도. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)를 나타냅니다 (n = 3). 이 그림은 숨어 외., 201622에서 수정 되었습니다. 

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Discussion

여기, 우리 제시 자연 제품에서 파생 된 작은 분자에 대하여 mAbs의 성공적인 생산을 위한 프로토콜. 절차의 필수적인 단계를 설명 하 고 우리는 예를 들어 작은 분자도 NAR을 사용 하 여이 프로토콜의 유틸리티 증명 하고있다. 예제에서는 스펙트럼, 반응 분석, 및 icELISA 결과 대표 실험 및 제어 가져온 데이터를이 프로토콜을 사용 하 여 표시 합니다. 예제 이미지는 hybridomas의 연구원 해야 있을 원하는 단일 클로 널과 polyclonal hybridomas 사이 분화 하는 때의 시각적 표현을 제공 합니다. 함께 찍은, 우리는 mAb, 특성화, 생산과 응용 전략 여기에 결과 발표 ELISA 테스트 하는 데 사용할 수 있는 특정 mAb에 따라 소설으로 서 작은 분자에 대 한 효과적인 mAb의 생성 증명 하고있다 다른 천연 제품에 대상 분자의 식입니다.

모든 종류의 항 체를 사용,이 절차 중 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제는 mAb의 감도와 연결 됩니다. 실제로, mAb는 낮은 감도, 높은 분, 또는 기타 요인으로 인해 예상 대로 작동 하지 않을 위험이 있다. 전체 절차 전체에서 수행 하기 위해 4 개월 이상 소요, mAbs는 hybridomas에서 분 비의 초기 심사 동안 돌 봐 중요 하다. 효과 없는 mAb를 만들지 않도록 하 한 필수적인 측면은 세포 융합에 hapten만 아니라 캐리어 반응 확인 하기 전에 icELISA에 의해 항 혈 청을 화면입니다. 이 각각 immunogen 및 코팅 항 원 사업자, 두 명의 서로 다른 단백질 통신사 (이 경우 BSA와 OVA)을 사용 하 여 수행 됩니다. Hapten BSA 켤레와 예방 접종, 동안 동물 모두는 hapten (예를 들어, NAR)에 대 한 항 체를 생산할 예정 이다 및 BSA. 따라서, 심사 중 반대로 BSA 항 체의 허위-긍정 검색을 피하기 위해, hapten OVA 특히 안티 hapten 항 체를 검출 하 사용 되어야 한다. 이 두 단백질 사업자 뿐만 아니라 그들을 사용 하는 명시적으로 강조 표시 되 면 프로토콜에 창조.

그것은 또한 단일 클로 널 hybridomas의 준비, 동안 제한 희석 방법 자주 해야 모든 단일 클로 널 셀을 포함 하는 우물의 양수 때까지 여러 번 반복 하는 것이 중요. 이 반복을 확인 하는 데 도움이 모든 복제 안정적으로 비밀 특정 항 체.

이 방법의 한계는 hybridoma 세대의 복잡 한 과정 및 원하는 항 체 생산 hybridoma의 선택에 필요한 시간을 포함 합니다. 그러나, 일단는 mAb 취득 하 고는 icELISA 개발, 자연 제품에서 대상 화합물의 검출 수행할 수 있습니다 신속 하 고 효율적으로. 특히,이 프로토콜 다른 분석 기법와 관련 된 비용의 일부 방지 않습니다 하 고 테스트 하는 모든 천연 제품에 대 한 비싼 악기를 사용 하 여를 반복적으로 필요 하지 않습니다.

일단 제작 하 고 상영, hapten mAb 다양 한 분석에에서 널리 이용 될 수 있다. 이 프로토콜에서 우리는 작은 분자의 pharmacokinetic 상호 작용20,22의 생물학을 공부 하는 데 사용 된는 ELISA 기반 방법에서 mAb의 사용에 집중 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 만든 다른 mAbs 또한 사용 되었습니다 구조 아날로그18, epimers21, 측면 흐름 immunoassay23 등의 분리에 대 한 mAb 기반 immunoaffinity 착 색 인쇄기 방법 설정 대 한 신속 하 고 현장 대상 분자의 탐지. 이러한 연구는 mAbs 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생산의 광범위 한 응용 프로그램을 강조 표시 합니다. 따라서,이 절차와는 mAbs 생성, 행위의 다양 한 개발을 위한 기초 mAb 기반 immunoassays 평가 및 자연 제품의 품질 관리에 대 한 분석 툴으로 효과적으로 활용할 수 있는 대상으로.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81573573, 81473338, 및 81503344)와 고전 처방 기본 연구 팀 베이징 대학에서 중국 의학의 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

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References

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천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성
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Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).More

Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

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