Summary
Denne artikkelen inneholder en detaljert protokoll og evaluering av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter for bruk i ulike immunanalyser. Denne fremgangsmåten inneholder immunisering, celle fusion, indirekte konkurransedyktig ELISA for positiv klone screening og monoklonalt hybridoma forberedelse. Spesifikasjonene for antistoff karakterisering ved hjelp MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis og ELISA Analyser tilbys også.
Abstract
Analyse av bioaktive komponenter i mat og naturlige produkter har blitt et populært område av studien på mange felt, inkludert tradisjonell kinesisk medisin og mat sikkerhet/toksikologi. Mange av de klassiske analyseteknikker krever dyrt utstyr og/eller kompetanse. Spesielt har enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) blitt en ny metode for analyse av mat og naturlige produkter. Denne metoden er basert på antistoff-mediert deteksjon av målkomponenter. Men som mange av bioaktive komponenter i naturlige produkter er liten (< 1000 Da) og ikke indusere en immunrespons, opprette monoklonale antistoffer (mAbs) mot dem er ofte vanskelig. I denne protokollen gir vi en detaljert forklaring av trinn kreves for å generere mAbs mot målmolekyler samt de måtte opprette forbundet indirekte konkurransedyktig (ic) ELISA for rask analyse av sammensatt i flere eksempler. Prosedyren beskriver syntese av kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugert), immunisering, cellen smelting, monoklonalt hybridoma forberedelse, karakterisering av mAb og ELISA-baserte programmet av mAb. Hapten-carrier konjugert ble syntetisert av natrium periodate metoden og vurdert av MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis. Etter immunisering, splenocytes ble isolert fra vaksineres musen med den høyeste antistoff titer og smeltet sammen med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) - sensitive musen myelom celle linje Sp2/0 - Ag14 bruker en polyetylenglykol (PEG)-basert metode. Hybridomas sekresjon mAbs reaktiv til målet antigen ble vist av icELISA for spesifisitet og kryssreaktivitet. Videre ble begrensende fortynning metoden brukt til å forberede monoklonalt hybridomas. De siste mAbs ble ytterligere preget av icELISA og deretter benyttet i en ELISA-basert applikasjon for rask og praktisk påvisning av eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturlige produkter.
Introduction
Monoklonale antistoffer (mAbs), også kjent som mono-spesifikke antistoffer, er produsert av en enkelt B-lymphocyte klone og består av monovalent antistoffer at alle binde til samme epitope1. De siste årene, har mange medisinsk plante-avledet naturlige produkter blitt brukt i behandling av ulike sykdommer2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser opprinnelig stammer fra naturlige produkter nå brukes som første linje narkotika, for eksempel artemisinin for malaria og paciltaxel (taxol) for kreft2,3. Studiet av naturlige produkter har gjort raske fremskritt, hovedsakelig på grunn av enorm utvikling og optimalisering av konvensjonelle analyseteknikker, inkludert Væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Men det er fortsatt noen begrensninger knyttet til disse metodene, for eksempel komplekse forbehandling protokoller og tilhørende kostnader med hensyn til tid, arbeidskraft/kompetanse og nødvendige instrumenter4.
MAb-baserte enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) har nylig brukt kvalitativt og kvantitativt analysere mat og naturlige produkter. Faktisk, denne metoden er brukt både biologiske prøver analyse og klinisk testing og har vist seg å være nøyaktig, følsom og svært effektiv og også unngå kjedelig forbehandling trinnene forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruker mAb-baserte ELISAs for å studere komplekse naturlige produkter, er utarbeidelse av monoklonale antistoffer en av kjernen trinnene. Dessverre, mAbs gjelder for små bioaktive komponenter i slike stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrenset sammenlignet med protein antigener. For å omgå dette problemet, har vi utviklet en protokoll for å generere spesielt mAbs mot små forbindelser. Protokollen presenteres her inkluderer kunstig antigen syntese, musen immunisering, cellen smelting, indirekte konkurransedyktig ELISA og monoklonalt hybridoma forberedelse.
Vår forskningsgruppe er spesielt studere dannelsen av mAbs mot små bioaktive forbindelser fra tradisjonell kinesisk medisin og utvikle programmene sine for år. I vår pågående studier, har vi utviklet mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Våre ELISA protokoller basert på disse mAbs har blitt brukt i en rekke studier vurdere farmakokinetikken av disse små molekyler som deres samhandling med andre bioaktive forbindelser. Videre har bruker disse mAbs, vi også utviklet immunoaffinity kromatografi metoder for separasjon av strukturelle analoger, inkludert epimers. Nylig har forberedt vi en lateral flyt immunanalyse med våre anti-puerarin mAb som ble brukt for rask, stedets påvisning av dette sammensatte. Våre resultater viser at våre mAb-baserte analyser er uunnværlig og praktisk verktøy for å studere biologi og kvalitet av naturlig-produkt-avledet forbindelser, særlig de som brukes i tradisjonell kinesisk medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer utført i denne studien har blitt godkjent av etiske gjennomgangen komiteen ved Beijing universitet, kinesisk medisin (godkjenning nummer 2016BZYYL00109).
Merk: Kvinnelige BALB/c mus (8 uker gamle) ble vaksinert med hapten-carrier protein conjugates. Når den brukes alene, et lite molekyl (< 1000 Da) kan ikke lokke fram en immunrespons. Imidlertid bøye de små molekylet til en transportør Makromolekyl resultater i antigen syntese. I denne sammenheng kalt de små molekylet en hapten. Hapten Bøyning er en nødvendig og effektiv strategi for mAb produksjon. Unngå kryssreaktivitet, to forskjellige protein bærere, som storfe serum albumin (BSA) og ovalbumin (OVA) eller keyhole albuskjell hemocyanin (KLH) og BSA, skal brukes som immunogens (for dyret immunisering) og belegg antigener (til coat platen i anti-serum gjenkjenning). BSA og OVA brukes som et eksempel i denne protokollen.
1. forberedelse av Immunogen og belegg Antigen
Merk: For kunstig antigen syntese, bruke riktig funksjonell gruppe (f.eks, hydroksyl, sulfhydryl carboxyl syre eller amino) som siden armen for kovalente binding med operatør protein. Bøyning metodene omfatter periodate oksidasjon, metoden carbodiimide, en blandet anhydrider i form reaksjon, en glutaraldehyde reaksjon og metoden succinate. Denne protokollen bruker naringin (NAR), en kjent flavanone-glycoside, som et eksempel sammensatte. NAR er et lite stoff (581 Da) finnes i sitrusfrukter samt ulike tradisjonell kinesisk medisin.
- Bruk en periodate oksidasjon prosedyre for å syntetisere NAR-BSA og NAR-OVA conjugates.
- Oppløse 50 mg NAR i vann i en siste konsentrasjon av 1 mg/mL22.
- Legg 100 µL av nylagde natrium periodate løsning (0.1 M) til 5 mL av NAR løsningen. Rør blandingen ved romtemperatur 1t.
- Oppløse 4 mg av BSA og OVA i 2.0 mL til 50 mM karbonat bufferen (pH 9.6). Legg til dette proteinet løsning NAR/natrium periodate reaksjonsblandingen.
- Justere blandingen til pH 9 med 1 M Na2CO3 løsning og røre ved romtemperatur for 6-8 h.
- Dialyze reaksjonsblandingen i fosfat-bufret saltvann (PBS) bruker en dialyse membran (MWCO 10 kDa) for 3 dager til å utveksle CBS.
- Analysere hapten-carrier konjugert bruker matrix assistert laser desorpsjon/ionisering tiden for flygningen (MALDI-TOF)-MS.
- Bland 1-10 pmol av konjugert med en 103-fold molar overskudd av sinapinic syre i en vannløsning inneholdende 0,15% trifluoroacetic acid (TFA). Tørr blandingen på en prøve plate i luften.
- Utføre analyse ved hjelp av en MALDI-TOF masse spectrometer utstyrt med en pulserende nitrogen laser operert på 337 nm. Tilegne seg positivt ion MALDI masse spectra i lineær modus i massen utvalg (m/z) 15 000-100.000 som tidligere beskrevet22.
2. immunisering
Merk: Totalt 5 BALB/c kvinnelige mus (8 uker gamle) ble brukt: 4 NAR bøy immunisering og 1 for kontroll (PBS) immunisering.
- For det første vaccination, bland 50 µg av konjugert (utvannet i 100 µL av PBS) med en lik mengde Freunds komplett adjuvant (CFA) og emulsify helt. Administrere 100 µL av denne blandingen til hver musen via dorsal injeksjon.
- To uker senere, levere en booster vaksinasjon (100 µL) via injeksjon med samme mengde konjugert blandet med ufullstendig adjuvant (IFA).
- Pakk ut 200 µL av blod fra halen åre hver musen 7 dager senere for å få serum.
- Sentrifuge blodet 3000 x g for 10 min. overføre serum supernatant til en frisk rør.
- Analysere serum bruker en ELISA som beskrevet tidligere21. Velg musen med den høyeste serum titer bruke for cellen smelting.
- I forberedelsene til cellen smelting, administrere et pulserende immunisering til valgte musen via intraperitoneal injeksjon av 50 µg av konjugert i 300 µL av PBS uten adjuvant 3 dager før fusion.
Merk: Dette trinnet kan utelates hvis titer er høy nok.
3. forberedelse til celle Fusion
- Cellen smelting middels forberedelse
- For hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) selektiv mellomstore: oppløse 50 x HAT media supplement i 10 mL av RPMI-1640 og legge til denne blandingen i 500 mL RPMI-1640 inneholder 20% FBS.
Merk: Når 10 mL av 50 x konsentrat er utvannet i 500 mL kultur medium, siste konsentrasjonen av hypoxanthine, aminopterin og thymidine er 100 µM 0,4 µM og 16 µM, henholdsvis. - Hypoxanthine-thymidine (HT) Media: oppløse 50 x HT media supplement i 10 mL av RPMI-1640 og legge til denne blandingen i 500 mL RPMI-1640 inneholder 20% FBS. De endelige konsentrasjonene av hypoxanthine og thymidine er 100 µM og 16 µM, henholdsvis.
- For hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) selektiv mellomstore: oppløse 50 x HAT media supplement i 10 mL av RPMI-1640 og legge til denne blandingen i 500 mL RPMI-1640 inneholder 20% FBS.
- Kultur Sp2/0-Ag14 cellene.
- Minst 7 dager før fusion, tine raskt ampuller med flytende nitrogen-frosne SP2/0-Ag14 myelom celler i varmt vann.
- Overføre celle løsningen til 5 mL av fersk kultur medium (RPMI-1640) og sentrifuge for 10 min 1000 x g.
- Etter sentrifugering, fjerne kultur medium og resuspend cellene i frisk RPMI-1640 supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS).
- Overføre celler og middels til en 25 cm2 kolbe og ruge på 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2.
- Utvid cellene til 3 eller 4 75 cm2 flasker før fusion.
- Utarbeidelse av abdominal mater lag celler
- Ofre en 12-uke-gamle albino ICR mus for cervical forvridning 1 dag før cellen smelting og dukke det i 75% etanol.
- Etter fjerner fur fra magen med hemostatic tang, Desinfiser området med 75% etanol. Klipp den ytre huden for å avsløre bukhulen. Injisere 3 mL steril RPMI-1640 medium i magen og massasje magen for å koble flere celler i løsningen. Sug opp mater celle suspensjon i en 15 mL sentrifuge rør.
- Etter sentrifugering celle suspensjon i 10 min 1000 x g, forkaste nedbryting og resuspend mater cellene i 20 mL av HAT selektiv medium.
- Overføre cellene i 96-brønnen celle kultur platene (100 µL/vel). Inkuber platene overnatting på 37 ° C, 5% CO2.
4. celle Fusion
- Etter valgt vaksineres musen er klargjort for cellen smelting (se trinn 2.4), administrere en intraperitoneal injeksjon av 10% chloral hydrat (bedøvelse) og ofre vaksineres musen via cervical forvridning.
- Samle ytterligere blod fra hjertet (1 mL), og forberede serum som beskrevet i trinn 2.3.1 å bruke som en positiv kontroll under hybridoma utvalg.
- Fjerne hud og muskel vev ved hjelp av saks for å avsløre milten.
- Isolere milten med pinsett nøye og vask milten med RPMI-1640. Skjær milten i biter og sakte pund milten til triturate. Forberede en milt celle suspensjon ved å trykke milt vev gjennom en 800 mesh celle sil i et 50 mL sentrifuge rør.
- Vask milt celle suspensjon med RPMI-1640 medium. Høste milt cellene med sentrifugering (1000 x g, 10 min og 4 ° C), og deretter kaste nedbryting. Gjenta dette trinnet for vask tre ganger.
- Fjerne dyrket og forsterket myelom celler fra inkubator og forsiktig trykk/riste flasker for å få en celle suspensjon. Vask denne suspensjon med RPMI-1640 medium å fjerne FBS.
Merk: Dette er et viktig skritt som FBS kan påvirke cellen smelting. - Telle celler og justere konsentrasjonen før blande med milt celler. Den endelige forholdet milt celler myelom celler må være mellom 1:5 og 1:10.
- Bland milt cellen fjæring og myelom celler. Sentrifuge celle blandingen (1000 x g, 10 min og 4 ° C), og fjern nedbryting.
- Legg 1 mL av 50% polyetylenglykol (PEG) løsning til cellene og forsiktig røre ved 37 ° C i 1 minutt. La stå i 30 s.
Merk: Pinne løsningen i dette trinnet skal inneholde 50% (w/v) polyetylenglykol 1500 og 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) i PBS uten kalsium (Ca2 +). - Legg 2 mL av RPMI-1640 medium i 2 minutter å avslutte reaksjonen. Legge til en ekstra 2 mL av RPMI-1640 medium for en annen 1 min, og deretter legge til en ekstra 10 mL av RPMI-1640 medium.
- Sentrifuge cellene på 800 x g i 10 min. Etter forkaster nedbryting, Legg HATTEN løsning og fortsette å dyrke cellene. Deretter tilsett 100 µL av cellen suspensjon hver brønn av mater lag platene og ruge plater i 7 dager på 37 ° C, 5% CO2.
Merk: Under disse forholdene, Ufiksert myelom cellene dør mens de hybridoma cellene vil fortsette å vokse i HAT medium. Etter 7 dager, vil monoklonalt hybridoma danne som en enkelt klynge av celler i brønnen, mens brønner som inneholder polyklonale hybridoma vil ha flere klynger av celler. - Sug opp nedbryting for analyse og erstatte mediet med HT medium.
Merk: Husk å erstatte HAT mediet med HT middels første som slår direkte til unsupplemented medium er skadelig for hybridoma.
5. indirekte konkurransedyktig ELISA (icELISA)
- Coat en 96-brønns plate med NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/godt) og ruge 1t på 37 ° C eller over natten på 4 ° C.
- Blokkere platen med 300 µL av GPBS (PBS med 1% m/v gelatin) 1t på 37 ° C å hindre uspesifisert adsorpsjon.
- Vaske platen tre ganger med TPBS (PBS inneholder 0,05% v/v Tween-20).
- Fortynn unconjugated NAR i en rekke konsentrasjoner med 10% metanol. Legge til 50 µL av disse fortynninger skille brønner. I andre brønnene, legger du til 50 µL av anti-serum- eller hybridoma supernatant (med mAbs). Inkuber platen 1t på 37 ° C.
- Tilsett 100 μL peroxidase-merket anti-mus IgG i hver brønn og Inkuber en ekstra 1t.
- Etter vask platen tre ganger med TPBS, kan du legge 100 µL av substratløsningen (0.1 M citrate buffer (pH 4) inneholder 0.015% v/v H2O2 og 2 mg/mL av 3, 3', 5, 5-tetramethyl benzidine (TMB)) til hver godt og ruge i 15 min.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 50 µL av H 1 M2så4 i hver brønn.
- Måle absorbansen likner en microplate ved 450 nm. Velg hybridomas som skilles ut de høyeste konsentrasjonene av NAR antistoffer i deres nedbryting for videre utarbeidelse.
6. utarbeidelse av monoklonale Hybridomas
- Bruk begrensende fortynning metoden for å forberede de monoklonale hybridomas.
- Etter fjerner HT mediet fra de valgte hybridomas (dvs. de positivt for NAR antistoff sekresjon), resuspend cellene i RPMI-1640 og telle dem.
- Fortynne cellene til en konsentrasjon av 1 celle, 2 celler og 4 celler per brønn i 100 µL av RPMI-1640 i en 96-brønns plate. Inkuber platen ved 37 ° C, 5% CO2.
- Etter 7-10 dager, oppdage NAR antistoffer i kultur supernatant bruker icELISA protokollen (trinn 5). Overføre celler fra hybridomas som er positivt for NAR antistoffer mot 24-vel plater, 25 cm2 flasker og 75 cm2 flasker for dyrking.
- Cryopreserve de monoklonale hybridomas.
- Høste celler og overføre dem til sentrifuge rør.
- Etter sentrifugering cellene (800 x g, 10 min), fjerne nedbryting og resuspend cellene i iskaldt medium (RPMI-1640, 20% fosterets kalv serum (FCS) og 10% DMSO). Overføring av cellen suspensjon til cryotubes.
- Lagre cryotubes i en gradient kjøling boks-80 ° C i 24 timer. Deretter overføre til cryotubes til flytende nitrogen for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generasjon av monoklonale hybridomas
Molekylvekt av hapten-carrier konjugert ble bekreftet av MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis analyse. Som molekylvekt BSA og NAR er kjent, kan du beregne antall små molekyler konjugert med BSA. Figur 1 viser representant spectral resultater for NAR-BSA22, som viser en bred topp på m/z 77,058. Som den gjennomsnittlige Molekylvekten av BSA er 66,430, synes det at minst 18 NAR molekyler (MW 581) var konjugert med BSA (molar kopling forholdet (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs ble utført for å fastslå de anti-serum titers etter musen immunisering22. Det synes at serum antistoff titers av fire mus vaksinert med NAR-BSA konjugert var betydelig høyere enn observert kontroll musen (figur 2). Musen med den høyeste titer (over 1:5, 000) ble brukt for cellen smelting.
Etter milt cellene fra denne musen var smeltet til abdominal mater lag cellene, var hybridomas vokst for 7 dager inselection medium. Bruker icELISAs, cellekultur supernatant ble testet, andthehybridomas positivt for NAR mAbs var recloned og utvidet. Bildene i Figur 3 viser de konvensjonelle resultatene for stabil monoklonale og polyklonale hybridoma linjer.
Screening og bruk av anti-NAR mAb
Det kritiske punktet med dette eksperimentet er screening av mAb spesifisitet. Resultatene i tabell 1 viser at mAb i dette eksperimentet reagerte med NAR men ikke de blokkerende buffer eller carrier proteiner22. Videre ble spesifisiteten av mAb ytterligere evaluert testet sin kryssreaktivitet med strukturelt beslektede forbindelser. Tabell 2 viser beregnet kryssreaktivitet. Som kryssreaktivitet satsen for de andre flavonoider testet var alle mindre enn 2%, er det klart at dette mAb er spesifikke for NAR22.
En icELISA ble utviklet ved hjelp av anti-NAR mAb og fremhever anvendelsen av denne metoden. Med løsninger som inneholder kjente konsentrasjoner av NAR en standardkurve var tegnet med absorbances av disse løsningene og lineær rekke S modell kurven ble beregnet (vist i den øvre høyre figur rammemargen). Lineær regresjonsligningen (y = 0.176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978) beregnet for denne kurven kan brukes på kvantitativ analyse av ukjent prøver.
Produksjon og karakterisering av en mAb mot glycyrrhizic syre
Bruker denne splenocyte/myelom cellen smelting protokollen, ble et monoklonalt hybridoma sekresjon anti-glycyrrhizic syre mAb, kalt DF5, også etablert18. Undertypen for denne DF5 mAb ble identifisert som IgG1 med kappa lys kjede (tabell 3). Lik fra analysen over, mAb ble brukt for ytterligere screening og programmer, mens antigen-spesifikke monoklonale hybridomas var utvidet andcryopreserved i flytende nitrogen for langtidslagring.
| Belegg stoff | En450 verdi | Kryssreaktivitet (%) |
| Nar-OVA | 0,97 | 100 |
| OVA | 0.056 | < 0,01 |
| BSA | 0.068 | < 0,01 |
| Gelatin | 0.053 | < 0,01 |
| Skummet melk | 0,05 | < 0,01 |
Tabell 1. Reaktivitet av anti-NAR mAb NAR-OVA og carrier proteiner.
| Klassifisering | Sammensatte | Kryssreaktivitet (%) |
| Flavonoider | Naringin | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| Neohesperidin | 18.80% | |
| Rutin | 1,95% | |
| Baicalein | < 0.09% | |
| Hyperoside | < 0.09% | |
| Aldehyder | Ginsenoside Rg2 | < 0.09% |
| Ginsenoside Rb1 | < 0.09% | |
| Ginsenoside Re | < 0.09% | |
| Notoginsenoside | < 0.09% | |
| Glycyrrhizic syre | < 0.09% | |
| Glycyrrhetic syre | < 0.09% | |
| Saikosaponin | < 0.09% | |
| Paeoniflorin | < 0.09% | |
| Gentiopicrin | < 0.09% | |
| Sterides | Cholic syre | < 0.09% |
| Deoxycholic syre | < 0.09% | |
| Anthraquinones | Rheumemodin | < 0.09% |
| Rheinic syre | < 0.09% | |
| Andre | Salvianolic syre | < 0.09% |
| Curcumin | < 0.09% | |
| Gastrodin | < 0.09% | |
| Amygdalin | < 0.09% |
Tabell 2. Kryssreaktivitet (%) av anti-NAR mAb mot NAR og dens beslektede forbindelser.
| isotype tunge kjede | isotype av lys | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | Kappa | lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tabell 3. Isotype analyse av mAb DF5.
Figur 1: MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis analyse av NAR-BSA konjugert. [M + H] + og [M + 2H]2 + angi enkelt - og dobbelt-protonerte molekylene i NAR-BSA, henholdsvis. Dette tallet har blitt endret fra Qu et al., 201622
Figur 2 : Analyse av anti-serum titer ved icELISA. Mus 1 - 4 ble vaksinert med NAR-BSA bøy, mens kontrollen ble vaksinert med kjøretøy (PBS). Dataene representerer gjennomsnittlig ± standardavviket (SD) (n = 3). Dette tallet er endret fra Qu et al., 201622. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representant bilder av stabil monoklonale (A) og polyklonale (B) hybridomas. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bruk av anti-NAR mAb i en icELISA. Ulike konsentrasjoner av NAR ble inkubert med mAb i brønner pre-belagt med NAR-OVA (1 mg/mL). Er absorbansen i nærvær av NAR, mens0 er absorbansen i fravær av NAR. Dataene representerer gjennomsnittlig ± standardavviket (SD) (n = 3). Dette tallet er endret fra Qu et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for vellykket produksjon av mAbs mot naturlig produkt-avledet små molekyler. De grunnleggende trinnene i prosedyren har vært skissert, og vi har vist nytten av denne protokollen bruker NAR som et eksempel små molekyl. Til eksempel spectra, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser representant eksperimentelle og kontrolldata som er hentet ved hjelp av denne protokollen. Eksempel bilder av hybridomas gir en visuell representasjon av hva hun bør se etter når skille mellom de monoklonale og polyklonale hybridomas. Sammen har vi vist at mAb produksjon, karakterisering og program strategi presenteres her resultater i etableringen av en effektiv mAb mot et lite molekyl samt romanen ELISA basert på den bestemte mAb som kan brukes til å teste uttrykk for mål molekylet i andre naturlige produkter.
Arbeider med alle typer antistoff, er det vanligste problemet som kan oppstå under denne prosedyren forbundet med følsomheten til mAb. Faktisk er det en høy risiko for at mAb ikke fungerer som forventet på grunn av lav følsomhet, høy kryssreaktivitet eller andre faktorer. Som hele prosedyren tar minst 4 måneder å utføre i sin helhet, er det viktig å ta vare under første screening av mAbs skilles ut fra hybridomas. Et viktig aspekt å unngå å skape en ineffektiv mAb er å skjermen anti-serum av icELISA før cellen smelting bekreftet reaktive med hapten men ikke transportøren. Dette utføres med to forskjellige protein bærere (i dette tilfellet BSA og OVA) som immunogen og belegg antigen bærere, henholdsvis. Under immunisering med hapten-BSA konjugert, dyrene vil produsere antistoffer mot både hapten (f.eksNAR) og BSA. Således, for å unngå falske positive påvisning av anti-BSA antistoffer under screening, hapten-OVA skal brukes til å oppdage anti-hapten antistoffer spesielt. Etableringen av disse to protein bærere og å bruke dem er eksplisitt merket i protokollen.
Det er også viktig å merke seg at under forberedelse av de monoklonale hybridomas, begrensende fortynning metoden ofte må gjentas flere ganger før alle brønnene som inneholder monoklonale cellene er positive. Dette repetisjon bidrar til å bekrefte at hver klone stabilt hemmeligheter spesifikke antistoffer.
Begrensningene i denne metoden er den kompliserte prosessen med hybridoma generasjon og tiden som er nødvendig for å merke det ønskede antistoff-produserende hybridoma. Men når mAb hentes og icELISA er utviklet, kan deteksjon av mål sammensatte i naturlige produkter utføres raskt og effektivt. Spesielt denne protokollen unngår noen av kostnadene forbundet med andre analyseteknikker og krever ikke bruk av dyre instrumenter gjentatte ganger for hver naturprodukt testet.
Når produsert og vist, kan hapten mAb bli mye brukt i en rekke analyser. I denne protokollen fokuserte vi på bruk av mAb i en ELISA-basert metode som ble brukt til å studere biologi små molekyl som sin farmakokinetiske interaksjoner20,22. Andre mAbs som er opprettet med denne protokollen har også blitt brukt til å etablere en mAb-baserte immunoaffinity kromatografi metode for separasjon av strukturelle analoger18, inkludert epimers21, samt en lateral flyt immunanalyse23 rask og stedets deteksjon av mål molekylet. Disse studiene markere bred anvendelse av mAbs produsert ved hjelp av protokollen som er beskrevet her. Derfor denne fremgangsmåten, og mAbs opprettet, fungerer som grunnlag for utvikling av ulike mål mAb-baserte immunanalyser som kan brukes effektivt som analyseverktøy for evaluering og kvalitetskontroll av naturprodukter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (grant tall 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk resept grunnleggende forskningsteam ved Beijing University kinesisk medisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
