Summary
Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.
Abstract
Gıda ve doğal ürünler mevcut biyoaktif bileşenler analizi çalışma geleneksel Çin tıp ve gıda güvenliği/toksikoloji de dahil olmak üzere birçok alanda popüler bir alanı haline gelmiştir. Klasik analiz teknikleri çok pahalı ekipman ve/veya uzmanlık gerektirir. Özellikle, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler analizi için gelişmekte olan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yöntem hedef bileşenleri antikor aracılıklı tespiti dayanmaktadır. Ancak, birçok doğal ürünler biyoaktif bileşen olarak küçüktür (< 1000 Da) ve bağışıklık yanıtının neden değil, onlara karşı monoklonal antikorlar (mAbs) oluşturma genellikle zor. Bu protokol için biz mAbs karşı olanların bileşim içinde birden fazla örnekleri hızlı çözümlenmesi için ilişkili dolaylı rekabet (IC) ELISA oluşturmak için gerekli yanı sıra hedef molekülleri oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Yordam, yapay antijen (Yani, hapten-taşıyıcı eşlenik) sentezi, aşılama, hücre füzyon, monoklonal Hibridoma hazırlama, mAb karakterizasyonu ve mAb ELISA tabanlı uygulama açıklar. Hapten-taşıyıcı eşlenik sodyum tarafından sentez yöntemi periodate ve MALDI-TOF-MS tarafından değerlendirilir. Bağışıklama sonra splenocytes aşılı fare ile en yüksek antikor titresi yalıtılmış ve hypoxanthine-aminopterin-timidin (şapka) - hassas fare miyelom hücre kültürünü Sp2/0 - Ag14 ile erimiş polietilen glikol (PEG) kullanarak-yöntemi dayalı. MAbs hedef antijen reaktif salgılayan hybridomas özgüllük ve olan icELISA tarafından gösterildi. Ayrıca, sınırlayıcı seyreltme yöntemi monoklonal hybridomas hazırlamak için uygulandı. Son mAbs daha da icELISA tarafından karakterize ve doğal ürünler içinde örnek hapten (naringin (NAR)) hızlı ve kolay tespiti için ELISA tabanlı bir uygulamada kullanılmaktadır.
Introduction
Monoklonal antikor (mAbs) olarak da bilinen mono özel antikorlar, tek bir B-lymphocyte klon üretilir ve tümünü aynı epitope1olarak bağla monovalent antikorların oluşmaktadır. Son yıllarda çok sayıda şifalı bitki kaynaklı doğal ürünler çeşitli hastalıklar2tedavisinde kullanılmaktadır. Gerçekten de, birçok küçük moleküler bileşikleri aslında doğal ürünlerden elde edilen şimdi artemisinin için sıtma ve paciltaxel (taxol) kanser2,3gibi ilk satır ilaçlar olarak uygulanır. Doğal ürünler çalışmanın çok büyük gelişme ve geleneksel analiz teknikleri, yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) dahil olmak üzere en iyi duruma getirme büyük ölçüde nedeniyle hızlı ilerleme kaydetmiştir. Ancak, hala onların karmaşık tedavi öncesi iletişim kuralları ve ilgili maliyetler açısından zaman, emek/uzmanlık ve gerekli aletleri4gibi bu yöntemler ile ilgili bazı sınırlamalar vardır.
Son zamanlarda, mAb-esaslı enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler niteliksel ve kantitatif analiz etmek için uygulandı. Aslında, bu yöntem hem biyolojik örnekleri analiz ve klinik test için uygulanan ve ayrıca diğer analizler5ileilgili sıkıcı tedavi öncesi adımlar kaçınırken doğru duyarlı ve son derece etkili olduğu gösterilmiştir, 6.
Monoklonal antikorların hazırlanması ELISAs mAb tabanlı karmaşık doğal ürünleri incelemek için kullanırken, çekirdek adımlardan biridir. Ne yazık ki, bu tür maddeler6,7,8,9,10,11,12 mevcut küçük biyoaktif bileşenler için özel mAbs ,13,14,15 kez sınırlı protein antijenleri ile karşılaştırıldığında. Bu sorunu aşmak için özellikle mAbs karşı küçük bileşikleri oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Burada sunulan Protokolü yapay antijen sentezi, fare bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA ve monoklonal Hibridoma hazırlık içerir.
Özellikle, bizim araştırma grubu mAbs karşı geleneksel Çin ilaç üzerinden küçük biyoaktif bileşiklerin oluşumunu eğitim edilmiş ve yıl boyunca onların uygulamaları geliştirme. Çalışmalarımız devam mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic asit18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121ve birçok diğer küçük moleküller karşı geliştirdik. ELISA protokolümüze bu mAbs üzerinde çalışmalar bir dizi yanı sıra diğer biyoaktif bileşiklerin onların etkileşimleri bu küçük moleküller farmakokinetik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, bu mAbs kullanarak, ayrıca epimers de dahil olmak üzere yapısal analogları ayrılması için immunoaffinity Kromatografi yöntemler geliştirdik. Son zamanlarda, daha sonra hızlı, yerinde tespiti bu bileşik için kullanılan bizim anti-puerarin mAb kullanarak bir yanal akışı immunoassay hazırladık. Bizim sonuçları bizim mAb tabanlı deneyleri Biyoloji ve doğal ürün türevi bileşikler, özellikle içinde geleneksel Çin ilaç kullanılan kalitesini çalışmak için vazgeçilmez ve uygun araçlar olduğunu gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan yordamların tümünü Çin tıbbı (onay numarası 2016BZYYL00109) Beijing Üniversitesi etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olması.
Not: Kadın BALB/c fare (8 haftalık) hapten-taşıyıcı protein conjugates ile aşı. Tek başına, küçük bir molekül kullanıldığında (< 1000 Da) bir bağışıklık yanıtı temin edemem. Ancak, bir taşıyıcı makromolekül sonuçlarında antijen sentezi için küçük molekül conjugating. Bu bağlamda, küçük molekül bir hapten etiketlenir. Hapten konjugasyon mAb üretim için gerekli ve etkili bir stratejidir. Çapraz reaktivite, sığır serum albumin (BSA) ve ovalbumin (OVA) veya anahtar deliği vantuzlu hemocyanin (KLH) gibi iki farklı protein taşıyıcıları önlemek için ve BSA, kullanılması gereken immunogens (için hayvan bağışıklama) ve kaplama antijenleri (kat plaka için anti-serumu algılama). BSA ve OVA bir örnek bu protokolü olarak kullanılır.
1. Immunogen ve kaplama antijen hazırlanması
Not: yapay antijen sentezi için taşıyıcı protein ile kovalent bağlama için yan kol uygun fonksiyonel grup (örneğin, hidroksil, sulfhydryl karboksil asit ya da amino) kullanın. Yöntemleri arasında konjugasyon periodate oksidasyon, carbodiimide yöntemi, bir karışık anhidritler tepki, bir oxazolidin tepki ve süksinat yöntemi. Bu protokol naringin (NAR), iyi bilinen flavanone glikozid bir örnek bileşik kullanır. NAR bir küçük (581 Da) narenciye yanı sıra çeşitli geleneksel Çin ilaç mevcut bileşiktir.
- NAR-BSA ve NAR-OVA conjugates sentezlemek için periodate oksidasyon yordamı kullanın.
- NAR son konsantrasyonu 1 mg/mL22, suda 50 mg geçiyoruz.
- Taze hazırlanmış sodyum 100 µL periodate çözüm (0,1 M) 5 mL için NAR çözeltisi ekleyin. 1s için oda sıcaklığında karışımı ilave edin.
- BSA ve OVA 4 mg 50 mM karbonat arabellek (pH 9,6) 2.0 ml geçiyoruz. Bu protein ekleyin çözümü NAR/sodyum periodate reaksiyon karışımı.
- PH 9 1 M Na2CO3 çözüm ile karışıma ayarlamak ve 6-8 h için oda sıcaklığında ilave edin.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) CBS değişimi için 3 gün boyunca bir Diyaliz zar (MWCO 10 kDa) kullanarak tepki karışımı diyaliz.
- Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma saat uçuş (MALDI-TOF) kullanarak hapten-taşıyıcı eşlenik analiz-MS.
- Eşlenik olmasını 1-10 pmol bir 10 ile karıştırmak3-molar sinapinic asit fazlalığı %0,15 trifluoroacetic asit (TFA) içeren sulu bir çözüm katlayın. Karışım havada bir örnek tabakta kuru.
- Kütle Spektrometre pulsed azot lazer ile donatılmış 337 işletilen bir MALDI-TOF kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek nm. Pozitif iyon maldı kitle spectra aralığında kütle (m/z) 15.000-100,000 daha önce açıklanan22doğrusal modunda elde etmek.
2. bağışıklama
Not: Toplam 5 BALB/c dişi fareler (8 haftalık) kullanılmıştır: NAR için 4 eşlenik bağışıklama ve denetim (PBS) bağışıklama için 1.
- İlk aşılama için eşlenik (PBS 100 µL içinde seyreltilmiş) 50 µg Freund'ın tam adjuvan (CFA) eşit bir hacmi ile karıştırın ve tamamen emulsify. Bu karışımdan 100 µL her fare ile dorsal subkutan enjeksiyon için yönetmek.
- İki hafta sonra bir güçlendirici eksik adjuvan (IFA) ile karışık eşlenik aynı miktarda aşı (100 µL) üzerinden Subkutan Enjeksiyon teslim.
- 200 µL kan her fare kuyruğu damar 7 gün sonra serum elde etmek için ayıklayın.
- 10 dakika süreyle santrifüj 3000 x g kana Transfer süpernatant serum için taze bir tüp.
- Bir ELISA yukarıda açıklanan21kullanarak serum analiz. Hücre füzyon için kullanılacak en yüksek serum titresi fareyle seçin.
- Hücre füzyon için hazırlık olarak, seçilmiş fare ile mayi enjeksiyon 50 µg atımlı bir bağışıklama PBS 300 µL adjuvan olmadan eşlenik, 3 gün önce füzyon yönetmek.
Not: titresi yeterince yüksek ise bu adımı atlanabilir.
3. hücre füzyon için hazırlık
- Hücre Füzyon orta hazırlık
- Hypoxanthine-aminopterin-timidin (şapka) Seçmeli Orta için: 50 x şapka medya Eki'nde 10 mL RPMI-1640 dağıtılması ve 500 mL RPMI-1640 bu karışıma ekleyin % 20 içeren FBS.
Not: 50 x konsantresi 10 mL sulandırılmış zaman kültür ortamının 500 mL, hypoxanthine, aminopterin ve timidin son konsantrasyonları 100 µM, 0.4 µM ve 16 µM, sırasıyla vardır. - Hypoxanthine-timidin (HT) medya için: 50 x HT medya Eki'nde 10 mL RPMI-1640 dağıtılması ve 500 mL RPMI-1640 bu karışıma ekleyin % 20 içeren FBS. Hypoxanthine ve timidin son konsantrasyonları 100 µM ve 16 µM, sırasıyla vardır.
- Hypoxanthine-aminopterin-timidin (şapka) Seçmeli Orta için: 50 x şapka medya Eki'nde 10 mL RPMI-1640 dağıtılması ve 500 mL RPMI-1640 bu karışıma ekleyin % 20 içeren FBS.
- Sp2/0-Ag14 hücreler kültür.
- En az 7 gün önce füzyon, hızla bir şişe sıvı azot donmuş SP2/0-Ag14 miyelom hücreleri sıcak suda çözülme.
- Hücre çözümü 5 mL taze kültür orta (RPMI-1640) ve 1000 x g, 10 dk santrifüj de içine aktarın.
- Santrifüjü sonra kültür orta kaldırmak ve taze RPMI-%1640 10 fetal sığır serum ile (FBS) takıma hücrelerde resuspend.
- Bu hücreler ve orta bir 25 cm2 şişesi aktarmak ve % 5 CO2bir ortamda 37 ° C'de kuluçkaya.
- 3 veya 4 75 cm2 şişe daha önce füzyon hücreleri genişletin.
- Karın besleyici katman hücreleri hazırlanması
- Servikal çıkığı 1 gün önce hücre füzyon tarafından 12-hafta-yaşlı albino ICR fare kurban ve % 75 etanol daldırın.
- Kürk karından Kan durdurucu sargı Forseps ile kaldırıldıktan sonra alanı % 75 etanol ile dezenfekte edin. Karın boşluğu ortaya çıkarmak için dış deri kesilmiş. 3 mL steril RPMI-1640 orta karın enjekte ve ek hücreleri çözüm içine ayırmak için karın masajı. Besleyici hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpüne Aspire edin.
- Hücre süspansiyon için 10 dk 1000 x g, centrifuging sonra süpernatant atın ve şapka Seçmeli Orta 20 mL besleyici hücrelerde resuspend.
- Hücreleri 96-şey hücre kültür kalıplara (100 µL/de) aktarın. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2tabak kuluçkaya.
4. hücre füzyon
- Seçilmiş aşı sonra fare hücre füzyon için hazırlanmıştır (bkz. Adım 2.4), % 10 kloral hidrat (anestezi) mayi bir enjeksiyon yönetmek ve servikal çıkığı aşılı fare ile kurban.
- Kan kalpten (1 mL) toplamak ve Hibridoma seçimi sırasında olumlu bir denetim olarak kullanmak üzere 2.3.1. adımda açıklandığı gibi serum hazırlamak.
- Dalak ortaya çıkarmak için makas kullanarak cilt ve kas dokusu kaldırın.
- Dalak cımbızla dikkatlice ayırın ve dalak RPMI-1640 ile yıkayın. Dalak parçalar halinde kesilmiş ve yavaş yavaş triturate dalak pound. Dalak doku bir 800 kafes hücre süzgeç aracılığıyla bir 50 mL santrifüj tüpüne tuşlarına basarak bir dalak hücre süspansiyon hazırlamak.
- Dalak hücre süspansiyon RPMI-1640 orta ile yıkayın. Santrifüjü (1000 x g, 10 min ve 4 ° C) tarafından dalak hücre hasat ve sonra süpernatant atın. Bu çamaşır üç kez tekrarlayın.
- Kuluçka makinesi ekili ve güçlendirilmiş miyelom hücreleri kaldırın ve hafifçe dokunun/Hücre süspansiyon elde etmek için şişe sallamak. Bu süspansiyon iki kez FBS kaldırmak için RPMI-1640 orta ile yıkayın.
Not: FBS hücre füzyon etkileyebilir gibi önemli bir adım bu. - Hücreleri saymak ve dalak hücrelerle karıştırma önce konsantrasyon ayarlayın. Miyelom hücreleri dalak hücrelere son oranı 1:5 ve 1:10 arasında olmalıdır.
- Dalak hücre süspansiyon ve miyelom hücreleri karıştırın. Hücre karışımı (1000 x g, 10 min ve 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Hücrelere 1 mL % 50 polietilen glikol (PEG) çözeltisi ekleyin ve 1 dakika 37 ° C'de hafifçe karıştırın. 30 için bekletin s.
Not: Bu adımda kullanılan PEG çözüm % 50 (w/v) polietilen glikol 1500 içermelidir ve % 10 (v/v) Dimetil sülfoksit (DMSO) PBS içinde kalsiyum (Ca2 +) olmadan. - RPMI-1640 orta reaksiyon sona erdirme 2 min için 2 mL ekleyin. RPMI-1640 orta başka bir 1 min için bir ek 2 mL ekleyin ve sonra ek bir 10 mL RPMI-1640 orta ekleyin.
- Hücreleri vasıl 800 x g 10 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atarak sonra şapka çözüm ekleyin ve hücreleri yetiştirmeye devam edin. Daha sonra hücre süspansiyon 100 µL besleyici tabaka plakaları her şey için ekleyin ve tabakları 37 ° c, % 5 CO27 gün kuluçkaya.
Not: Hibridoma hücreleri şapka ortamda büyümeye devam edecek, ancak bu koşullar altında unfused miyelom hücreleri ölür. Kuyu poliklonal Hibridoma içeren hücre birden çok küme varken 7 gün sonra hücre iyi, tek bir küme olarak monoklonal Hibridoma oluşturacak. - Süpernatant analiz için Aspire edin ve orta ile HT orta yerine.
Not: şapka orta yerine emin olun HT ile doğrudan unsupplemented ortamına geçiş olarak orta ilk Hibridoma için zararlıdır.
5. dolaylı rekabet ELISA (icELISA)
- 96-şey plaka NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/iyi) ile ceket ve 1 h 37 ° C'de veya gecede 4 ° C'de için kuluçkaya
- 37 ° C'de spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için 1 h için GPBS (% 1 m/v jelatin içeren PBS) 300 µL ile plaka engellemek.
- Plaka üç kez TPBS (% 0.05 v/v ara-20 içeren PBS) ile yıkayın.
- Konsantrasyonu % 10 metanol ile bir dizi içine çekimsiz NAR sulandırmak. Kuyu ayırmak için bu dilutions 50 µL ekleyin. Diğer wells anti-serumu veya Hibridoma (mAbs içeren) süpernatant 50 µL ekleyin. 37 ° C'de 1 h plaka kuluçkaya
- Peroksidaz etiketli Anti-fare IgG her kuyuya 100 μL ekleyin ve bir ek 1 h için kuluçkaya.
- Plaka TPBS üç kez yıkadıktan sonra 100 µL substrat çözeltisi ekleyin (0.1 M sitrat tampon (pH 4) içeren %0,015 v/v H2O2 ve 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine (TMB)) her şey ve 15dk için kuluçkaya.
- 1 M H250 µL çok ekleyerek reaksiyonu durdurmak4 her şey için.
- 450 bir Mikroplaka okuyucu kullanarak Absorbans ölçmek nm. NAR antikorlar içine onların süpernatant daha fazla hazırlık için en yüksek konsantrasyonları salgılanan hybridomas seçin.
6. monoklonal Hybridomas hazırlanması
- Monoklonal hybridomas hazırlamak için sınırlayıcı seyreltme yöntemini kullanın.
- HT orta seçili hybridomas çıkardıktan sonra (Yani, NAR antikor salgılanması için pozitif olanlar), RPMI-1640 hücrelerde resuspend ve bunları kabul.
- 1 2 hücreleri ve RPMI-1640 100 µL bir 96-şey plaka bir kuyu başına 4 hücre bir konsantrasyon hücrelere sulandırmak. 37 ° c, % 5 CO2plaka kuluçkaya.
- 7-10 gün sonra kültür icELISA Protokolü (5. adım) kullanılarak süpernatant NAR antikorları algılar. Hücre pozitif NAR karşı antikorlar için 24-şey plakaları, 25 cm2 şişeler ve 75 cm2 şişe ekimi için hybridomas transfer.
- Monoklonal hybridomas cryopreserve.
- Hücreleri hasat ve tüpler santrifüj kapasitesi için aktarabilirsiniz.
- Hücreler (800 x g, 10 dk) centrifuging sonra süpernatant kaldırmak ve orta (RPMI-1640, % 20 fetal buzağı serum (FCS) ve % 10 DMSO) dondurma hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonlar cryotubes için transfer.
- Cryotubes bir degrade soğutma kutusu 24 h için-80 ° C'de depolayın. Sonra cryotubes uzun süreli depolama için sıvı azot aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonal hybridomas nesil
Hapten-taşıyıcı eşlenik molekül ağırlığı MALDI-TOF-MS analizi tarafından doğrulandı. Moleküler ağırlığı BSA ve NAR bilinen gibi küçük moleküller BSA ile Birleşik sayısı hesaplanır. NAR-BSA22geniş bir tepe m/z 77,058 görüntüler, temsilcisi spektral sonuçları şekil 1 gösterir. BSA ortalama molekül ağırlığı 66,430 olduğu için Görünüşe göre en az 18 NAR molekülleri (MW 581) BSA ile Birleşik (molar kaplin oranı (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs fare bağışıklama22aşağıdaki anti-serum titreleri belirlemek için yapıldı. Görünüşe göre serum antikor titreleri NAR-BSA eşlenik ile aşı dört farelerin kontrol fare (Şekil 2) gözlenen önemli ölçüde daha yüksektir. Fare ile en yüksek titresi (üzeri 1:5, 000) hücre füzyon için kullanıldı.
Bu fare dalak hücrelerden karın besleyici katman hücrelere erimiş sonra hybridomas 7 gün InSelection orta için yetiştirilen vardı. İcELISAs kullanarak, hücre kültürü süpernatant test edildi, andthehybridomas NAR mAbs için pozitif recloned ve genişletilmiştir. Şekil 3 Albümdeki istikrarlı monoklonal ve poliklonal Hibridoma hücre hatları için geleneksel sonuçları göstermektedir.
Tarama ve anti-NAR mAb uygulanması
MAb özgüllük ile taranması bu deneyin kritik noktasıdır. Sonuçları Tablo 1 ' deki bu deneyde mAb NAR ama değil engelleme arabellek veya taşıyıcı proteinler22ile tepki göstermektedir. Ayrıca, mAb özgüllüğü daha da onun olan yapısal olarak ilgili bileşikler ile test ederek değerlendirilmiştir. Tablo 2 hesaplanmış olan oranları gösterir. Diğer flavonoidler için olan oranı test gibi tüm % 2'den daha az, bu mAb NAR22için belirli olduğu açıktır.
Bir icELISA anti-NAR mAb kullanılarak geliştirilen ve uygulamanın bu metodolojinin vurgulamaktadır. NAR bilinen konsantrasyonları içeren çözümleri kullanarak, standart bir eğri bu çözümler absorbances kullanarak çizildi ve S modeli eğrisi doğrusal dizi (sağ üst rakam ilave gösterildiği) hesaplanır. Doğrusal regresyon denklemi (y =-0.176 LN + 1.1243, R2 0.9978 =) bu eğri kantitatif analiz için bilinmeyen örnekleri uygulanabilir için hesaplanır.
Üretim ve mAb glycyrrhizic asit karşı karakterizasyonu
Bu splenocyte/miyelom hücre füzyon iletişim kuralını kullanan, DF5, adlı anti-glycyrrhizic asit mAb salgılayan bir monoklonal Hibridoma da kurulan18oldu. Bu DF5 mAb alt türü Igg1 kappa hafif zincir (Tablo 3) ile tespit edilmiştir. Antijen spesifik monoklonal hybridomas uzun süreli depolama için sıvı azot genişletilmiş andcryopreserved iken yukarıdaki analiz, mAb ek seans ve uygulamaları, için Kullanılanlara benzer.
| Kaplama madde | 450 değeri | Olan (%) |
| Nar-OVA | 0,97 | 100 |
| OVA | 0.056 | < 0,01 |
| BSA | 0.068 | < 0,01 |
| Jelatin | 0.053 | < 0,01 |
| Yağsız süt | 0,05 | < 0,01 |
Tablo 1. Reaktivite anti-NAR mAb NAR-OVA ve taşıyıcı proteinler.
| Sınıflandırma | Bileşik | Olan (%) |
| Flavonoidler | Naringin | % 100 |
| Puerarin | %1.26 | |
| Neohesperidin | %18,80 | |
| Rutin | %1.95 | |
| Baicalein | < %0,09 | |
| Hyperoside | < %0,09 | |
| Alınmadım | Ginsenoside Rg2 | < %0,09 |
| Ginsenoside Rb1 | < %0,09 | |
| Ginsenoside Re | < %0,09 | |
| Notoginsenoside | < %0,09 | |
| Glycyrrhizic asit | < %0,09 | |
| Glycyrrhetic asit | < %0,09 | |
| Saikosaponin | < %0,09 | |
| Paeoniflorin | < %0,09 | |
| Gentiopicrin | < %0,09 | |
| Sterides | Kolik asit | < %0,09 |
| Deoxycholic asit | < %0,09 | |
| Anthraquinones | Rheumemodin | < %0,09 |
| Rheinic asit | < %0,09 | |
| Diğer | Salvianolic asit | < %0,09 |
| Curcumin | < %0,09 | |
| Gastrodin | < %0,09 | |
| Amigdalin | < %0,09 |
Tablo 2. Olan (%) NAR ve onun ilgili bileşikler karşı anti-NAR mAb.
| izotip ağır zincir | izotip hafif zincir | ||||||||
| Igg1 | Igg2a | Igg2b | Igg3 | Iga | IgM | Kappa | Lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tablo 3. MAb DF5 izotip analizi.
Resim 1: NAR-BSA eşlenik MALDI-TOF-Bayan analizi. [M + H] + ve [M + 2H]2 + belirtmek NAR-BSA, tek ve çift protonated molekülleri anılan sıraya göre. Bu rakam Qu vd, 201622 değiştirildi
Resim 2 : Anti-serumu titresi icELISA tarafından analizini. Fareler 1 - 4 NAR-BSA ile aşı eşlenik, denetimi ile araç (PBS) aşı iken. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) temsil eden (n = 3). Bu rakam Qu vd, 201622değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Temsilcisi görüntüleri monoklonal (A) ve poliklonal (B) hybridomas kararlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Bir icELISA anti-NAR mAb uygulanması. NAR çeşitli konsantrasyonları mAb NAR-OVA ile (1 mg/mL) ön kaplamalı Wells ile inkübe. A0 Absorbans NAR yokluğunda ise NAR, huzurunda Absorbans olduğunu. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) temsil eden (n = 3). Bu rakam Qu vd, 201622değiştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mAbs doğal ürün kaynaklı küçük moleküller karşı başarılı üretim için bir iletişim kuralı mevcut. Temel adımları yordamda açıklanan olmuştur ve biz NAR bir örnek küçük molekül bu iletişim kuralı'nı yarar göstermiştir. Örnek spectra, reaktivite analizleri ve icELISA sonuçları temsilcisi deneysel ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen denetim verileri gösterir. Hybridomas örnek görüntüleri ne araştırmacı monoklonal ve poliklonal hybridomas arasında differentiating zaman aramanız gereken görsel bir temsilini sağlar. Birlikte ele alındığında, biz mAb üretim, karakterizasyonu ve uygulama stratejisi burada sonuçları bağlanabilecek küçük bir moleküldür hem de ELISA test etmek için kullanılan belirli mAb üzerinde dayalı bir roman karşı etkili bir mAb oluşturulmasında sunulan olduğunu göstermiştir diğer doğal ürünler hedef molekül ifade.
Antikor her türlü ile çalışma, bu işlem sırasında ortaya çıkabilecek en yaygın sorun mAb hassasiyeti ile ilişkilidir. Nitekim, mAb düşük duyarlılık, yüksek olan veya diğer faktörler nedeniyle beklendiği gibi çalışmaz yüksek bir risk vardır. Gibi tüm prosedürü tam olarak gerçekleştirmek için en az 4 ay alır, hybridomas salgılanan mAbs başlangıç tarama sırasında dikkat çekmek önemlidir. Etkisiz bir mAb oluşturma önlemek için bir önemli yönü icELISA önce teyit için hapten ama taşıyıcı ile reaktif hücre füzyon tarafından anti-serumu ekran etmektir. Bu iki farklı protein taşıyıcıları (içinde bu durumda BSA ve OVA) immunogen ve kaplama antijen taşıyıcıları sırasıyla kullanarak gerçekleştirilir. Hapten-BSA eşlenik ile bağışıklama sırasında hayvanlar her iki hapten (örneğin, NAR) karşı antikorlar üretecek ve BSA. Böylece, anti-BSA antikorlar yanlış algılama tarama sırasında önlemek için hapten-OVA özellikle anti-hapten antikorlar algılamak için kullanılmalıdır. Bu iki protein taşıyıcıların yanı sıra onları kullanmak için açıkça iletişim kuralında vurgulandığında oluşturma.
Tüm monoklonal hücreleri içeren Wells olumlu kadar birkaç kez tekrar edilmesi monoklonal hybridomas hazırlanması sırasında sınırlayıcı seyreltme yöntemin gerekir kez unutmamak önemlidir. Bu yineleme onaylamak için yardımcı olur her stabil sırları spesifik antikor klon.
Bu yöntemin sınırlamaları Hibridoma nesil karmaşık bir süreç ve istenen antikor üreten Hibridoma seçim için gereken süreyi içerir. Ancak, bir kez mAb elde edilir ve icELISA geliştirilen, doğal ürünler hedef bileşik tespiti hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Özellikle, bu protokol bazı diğer analiz teknikleri ile ilgili maliyetleri önlemek ve pahalı aletlerin kullanımı için her doğal ürün test art arda gerektirmez.
Bir kez üretilen ve ekranlı, hapten mAb analizleri çeşitli yaygın olarak kullanılabilir. Bu protokol için onun farmakokinetik etkileşim20,22yanı sıra küçük molekül biyolojisi okumak için kullanılan bir ELISA tabanlı yöntemde mAb kullanımı üzerinde duruldu. Bu iletişim kuralı ile oluşturulan diğer mAbs aynı zamanda yapısal analogları18epimers21, aynı zamanda bir yanal akışı immunoassay23 de dahil olmak üzere, ayrılması için bir immunoaffinity mAb tabanlı Kromatografi yöntemi oluşturmak için kullanılan Hedef molekül hızlı ve yerinde algılama için. Bu çalışmalar burada özetlenen protokolü kullanılarak üretilen mAbs geniş uygulama vurgulayın. Bu nedenle, bu yordam ve mAbs oluşturulan, eylemler çeşitli geliştirilmesi için bir temel hedef olarak etkili değerlendirme ve doğa ürünler kalite kontrolü için analitik araçlar olarak kullanılabilir mAb tabanlı uzun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (grant numaraları 81573573, 81473338 ve 81503344) ve klasik reçete temel araştırma ekibi Beijing Üniversitesi'nde Çin tıbbı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
