Aqui descrevemos procedimentos cirúrgicos para produzir uma hemiseção lateral medular confiável (HX) no nível9 torácico em ratos adultos e avaliações neurocomportamentais projetadas para detectar déficits assimétricos após tal lesão unilateral.
A lesão medular incompleta (SCI) muitas vezes leva a prejuízos das funções sensoriais e é clinicamente o tipo mais freqüente de SCI. A síndrome de Brown-Séquard humano é um tipo comum de SCI incompleto causado por uma lesão a metade da medula espinhal que resulta em paralisia e perda de propriocepção no mesmo lado (ou ipsilesional) como a lesão, e perda de dor e sensação de temperatura no lado oposto (ou contralelerial). Metodologias adequadas para a produção de uma hemiseção lateral da medula espinhal (HX) e avaliação de prejuízos neurológicos são essenciais para estabelecer um modelo animal confiável da síndrome brown-séquard. Embora o modelo de hemiseção lateral tenha um papel fundamental na pesquisa básica e translacional, faltam protocolos padronizados para a criação de tal hemisesecção e avaliação da função unilateralizada. O objetivo deste estudo é descrever procedimentos passo a passo para produzir um HX lateral espinhal de rato no nível vertebral do9º torácico (T9). Nós, então, descrevemos uma escala de comportamento combinada para HX (CBS-HX) que fornece uma avaliação simples e sensível do desempenho neurológico assimétrico para SCI unilateral. O CBS-HX, que varia de 0 a 18 anos, é composto por 4 avaliações individuais que incluem pisada de membro traseiro unilateral (SUS), acoplamento, colocação de contato e caminhada em grade. Para cbs-HX, os membros laterais ipsilaterais e contralaterais são avaliados separadamente. Descobrimos que, após um T9 HX, o membro traseiro ipsilateral apresentou função comportamental prejudicada, enquanto o membro traseiro contralateral apresentou recuperação substancial. O CBS-HX efetivamente discriminava funções comportamentais entre os membros laterais ipsilaterais e contralaterais e detectou progressão temporal da recuperação do membro hindilateral ipsilateral. Os componentes CBS-HX podem ser analisados separadamente ou em combinação com outras medidas quando necessário. Embora tenhamos apenas fornecido descrições visuais dos procedimentos cirúrgicos e avaliações comportamentais de um HX torácico, o princípio pode ser aplicado a outros IMc incompletos e em outros níveis da lesão.
As lesões medulares incompletas (SCI) muitas vezes levam a prejuízos graves e persistentes das funções sensoriais e são clinicamente o tipo mais freqüente de SCI1. A síndrome de Brown-Séquard em humanos é causada por uma lesão a metade da medula espinhal que resulta em paralisia e perda de propriocepção no mesmo lado (ou ipsilesional) como a lesão, e perda de dor e sensação de temperatura no lado oposto (ou contralecionista)lado 2,3,4. Os modelos animais de hemiseção lateral espinhal são usados amplamente para imitar a síndrome de Brown-Séquard humano e foram relatados em ratos5,6,7,8,9, gambás10, e macacos7,11,12,13 por vários laboratórios em vários níveis da coluna vertebral. No entanto, não foram descritos procedimentos detalhados visualizados para a produção de uma hemiseção lateral padrão. O fornecimento de procedimentos passo a passo para uma hemisesecção lateral deve otimizar o modelo e facilitar a comparação ou replicação de resultados experimentais em pesquisas básicas e translacionais.
Um SCI unilateral produz déficits de comportamento assimétricos e desproporcionais que são difíceis de medir usando avaliações convencionais para lesões simétricas. Uma metodologia adequada para avaliar os prejuízos neurológicos para um SCI unilateral é um componente essencial para o desenvolvimento de um modelo de SCI unilateral. Apesar do papel fundamental de uma lesão unilateral na coluna vertebral, faltam protocolos padronizados para avaliar déficits sensoriais em animais com tal lesão. A escala de classificação locomotor Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) tem sido a medição de função mais usada após o SCI para ratos adultos 14, o que produz uma descrição semiquantitativa da locomoção como um todo. No entanto, não mede cada membro traseiro independentemente.
Neste estudo, relatamos procedimentos passo a passo para produzir um HX espinhal de roedores no nível vertebral do9º torácico (T9). Também introduzimos uma escala de comportamento combinada para hemisesecção (CBS-HX) que inclui revisão unilateral de membros traseiros (SUS), acoplamento, colocação de avaliações de caminhada e caminhada de grade para avaliação de deficiências neurológicas e recuperação após uma SCI unilateral. Esperamos que este modelo seja um modelo útil para examinar mecanismos de lesão e eficácias terapêuticas para ASCs unilaterais.
Neste estudo, relatamos procedimentos passo a passo para produzir um HX espinhal T9 simples, consistente e reprodutível em ratos adultos que imita a Síndrome Brown-Séquard em humanos. Introduzimos ainda um sistema combinado de pontuação de comportamento para hemiseção (CBS-HX) que é sensível para avaliar o comprometimento neurológico assimétrico e a progressão da recuperação, medido por uma combinação de pisada de membro traseiro unilateral (SUS), acoplamento (CPL), colocando contato, e grid andando. Embora demonstremos a lesão no nível T9, este procedimento pode ser aplicado a outras regiões da medula espinhal, incluindo as medulas cervical e lombar de forma simples e pouco exigente. Esperamos que este modelo, juntamente com avaliações comportamentais unilateralizadas, seja útil para examinar mecanismos de lesão e eficácias terapêuticas para esses tipos de SCI.
Como o modelo lateral hx só lesiona a metade ipsilateral do cordão, o lado contralateral do cordão é amplamente preservado e pode ser usado como um controle interno. Muitas vias descendentes e ascendentes são projetadas unilateralmente e uma hemiseseção lateral em muitas circunstâncias produz danos a um trato axonal de um lado e preserva o mesmo trato no lado oposto, permitindo a comparação da reorganização e consequências funcionais desses setores no mesmo animal. Além disso, produzir uma lesão mais localizada pode permitir o direcionamento de vias específicas. Por exemplo, uma lesão ventral e ventrolateral pode afetar as vias reticulospinal e vestibulosspinal. Uma lesão dorsal ou dorsolateral pode afetar as vias corticoespinhal e rubro-negra. O modelo de hemiseção ou lesão parcial também pode ser usado para estudar a anatomia e a função de outras vias, como as vias propriopsídias, noradrenergic as sorotonergicas. Assim, o modelo de hemiseção pode ser utilizado exclusivamente para estudar a compensação por aferentes sensoriais, por vias descendentes e por circuitos intrínsecos da coluna vertebral. Este modelo também é adequado para investigar mecanismos de recuperação de locomotor após HX.
O HX lateral leva a prejuízos comportamentais óbvios, que são avaliados tarefas motoras (por exemplo, Treadscan ou Esteira) paradigma para a análise automatizada da marcha 19. Além disso, a condutividade dos tratos axonais do lado contralateral da lesão poderia ser medida por meio de registros eletrofisiológicos, e esta avaliação proporciona a possibilidade de estabelecer uma reorganização funcional após vários tratamentos. Além disso, injeções unilaterais dos rastreadores anatômicos em neurônios de uma via específica permitem a visualização de fibras de cruzamento de linha média anterogradamente rotuladas e sua conexão com neurônios retrógrados20,21,22,,23,24,25.
Embora uma cirurgia típica de HX espinhal leve menos de 20 minutos para terminar, requer alguma prática para conseguir um HX preciso e consistente. Em primeiro lugar, é importante que o nível de HX espinhal seja consistente de animal para animal. Portanto, é fundamental que se identifique o segmento vertebral adequado para laminectomia. Em segundo lugar, certifique-se de que o HX está completo. Para fazer um HX completo, pode-se usar uma agulha de calibre 30 inserida verticalmente através da linha média para orientar o corte usando microtesouras. A inserção da agulha também evita danos aos vasos posteriores da coluna vertebral ou à medula sobre lesões. A segunda função da agulha de calibre 30 é que ela pode servir como uma faca para rastrear o corte para se certificar de que não há ambiguidade da lesão. Em terceiro lugar, colocar gelatina no local da lesão pode minimizar o vazamento do fluido cefalorraquidiano, e colocar o cimento em cima da gelatina e fazer a ponte da lâmina vertebral pode fortalecer a estabilidade das vértebras espinhais no local da lesão e facilitar a cicatrização da ferida. Para evitar a interferência do sinal com a aplicação de gravações eletrofisiológicas, músculos, fáscia e pele devem ser suturados em camadas com fio de seda 4-0. Finalmente, todos os esforços devem ser feitos para minimizar os danos à medula espinhal contralateral. A verificação histológica deve ser estabelecida para confirmar uma hemiseção lateral completa de um lado e a preservação da outra metade do cordão do outro lado (conforme mostrado na Figura 6E).
Para melhorar a locomoção após o SCI, estudos anteriores utilizaram uma ampla gama de estratégias, incluindo transplante celular, regeneração de axônto8, 8,18,,26,,27,e reabilitação baseada em atividade28,,29,30. Enquanto isso, vários testes comportamentais foram estabelecidos para avaliação funcional e para triagem para os melhores tratamentos após o SCI. A escala de classificação do bbb locomotor foi projetada para avaliação locomotor de lesões simétricas espinhais, como contusão na linha média ou lesões de transsecção que afetam os membros traseiros bilaterais 14,31. Certos parâmetros do BBB, como coordenação e desobstrução dos dedos, são registrados pela observação de ambos os membros traseiros. Se um membro traseiro estiver intacto e o outro mostrar déficits como visto em lesões assimétricas, então o membro traseiro intacto confundirá a pontuação do membro traseiro afetado. Uma vez que a pontuação do BBB não acomoda a pontuação de um membro traseiro do outro após a lesão unilateral, não é ideal para avaliar lesões unilaterais da medula espinhal. No entanto, se o movimento articular e o suporte de peso de cada lado forem avaliados separadamente e não forem calculados como parte do BBB, então o membro traseiro intacto (semelhante a um controle falso) não confundirá a pontuação do membro traseiro afetado. Além disso, o lado intacto não distorcerá a pontuação geral do animal, pois o membro traseiro intacto não tem déficits dramáticos no movimento articular, suporte de peso ou pisada.
O escore de comportamento combinado para hemiseção foi projetado para ser uma avaliação sensível e facilmente realizada da recuperação comportamental no modelo de rato da hemiseção lateral. Pode ser usado para avaliar comportamentos de fases iniciais e tardias de recuperação. A fase inicial é dentro de 7-10 dias após a lesão. Nos primeiros 3-5 dias pós-HX, a atividade do membro traseiro ipsilateral aumentou de forma constante e deve ser avaliada com mais freqüência para registrar recuperações espontâneas ou mediadas pelo tratamento do movimento do membro traseiro. Em 5-7 dias após o HX, os ratos começaram a fazer movimentos de membros traseiros sem suporte de peso. Em 7-10 dias, os ratos normalmente começaram a ficar em pé e pisar. Durante esta fase, deve-se prestar atenção ao padrão de passo. Na fase final (14-28 dias), a atividade do membro traseiro ipsilateral foi estável e próxima ao normal.
Deve-se também prestar muita atenção à capacidade de acoplamento (CPL). O teste CPL (acoplamento de marcha) pode ser realizado com um vídeo (por exemplo, Treadscan/Catwalk) ou um vídeo de filmagem durante um teste de campo aberto. A segunda opção oferece flexibilidade se os pesquisadores não tiverem acesso ao sistema de análise de marcha. Para ambas as sessões de gravação de vídeo, é necessário um mínimo de dois touchdowns consecutivos para cada pé para este teste. Para a análise, há três parâmetros de acoplamento: acoplamento homólogo, homólogo e diagonal (etapa 6.2). Cada acoplamento envolve um pé de referência e o pé dado. Tome o acoplamento homólogo (frente esquerda direita, ou traseira esquerda-traseira direita) por exemplo, é o primeiro tempo de touchdown do pé dado dividido por um tempo de passo inteiro do pé de referência. Uma vez que o pé esquerdo e direito deve estar fora de fase, o acoplamento perfeito deve ser 0,5. Este é o mesmo caso no acoplamento homolateral (traseiro dianteiro esquerdo ou traseiro dianteiro direito). No entanto, para o acoplamento diagonal (traseiro dianteiro esquerdo-direito, ou traseiro dianteiro direito-esquerdo), o acoplamento perfeito deve ser 0 ou 1, uma vez que os dois pés devem estar em fase. Na etapa 6.4, atribuímos uma pontuação para cada CPL de 0 a 2. Em detalhes, um placar 0 deve representar o pé dado é incapaz de se mover para concluir um touchdown, portanto, nenhum CPL; uma pontuação 1 representa qualquer CPL irregular ou desajeitado, uma vez que o pé dado termina um touchdown, mas não no acoplamento perfeito; uma pontuação 2 significa um acoplamento perfeito de 0,5. Os três conceitos de parâmetro de acoplamento estão bem descritos nas publicações anteriores32,33. O CPL pode ser combinado com as avaliações de colocação de contato e caminhada de grade. Os componentes individuais do sistema combinado de pontuação de comportamento serão mais ou menos eficazes em diferentes modelos de ratos de SCI. Para a CPL, os déficits tornaram-se obviamente visíveis na taxa de alternância e na completitude da sequência. Os déficits proprioceptivos de colocação de membros traseiros poderiam ser claramente revelados após o HX unilateral. Em nosso estudo, todos os ratos apresentaram déficits de membros traseiros ipsilesionais, enquanto a colocação do membro traseiro contralateral não apresentou déficits. O teste de caminhada da grade deve ser considerado quando a colocação de contato, que envolve o trato corticoespinhal, começa a se recuperar. Para descartar possíveis problemas de fadiga, a seqüência de testes comportamentais pode ser aleatória em cada teste.
Em conclusão, relatamos procedimentos passo a passo para criar um modelo de rato in vivo reprodutível do HX espinhal T9 que imita a Síndrome Brown-Séquard em humanos. O sistema combinado de pontuação de comportamento para hemiseção oferece uma medida mais discriminativa dos desfechos comportamentais individuais dos membros traseiros para avaliar mecanismos e tratamentos de lesões após um SCI unilateral. Embora forneçamos apenas uma descrição visual dos procedimentos cirúrgicos e avaliações comportamentais de um HX torácico, os métodos descritos aqui podem ser aplicados a outros SCIs incompletos em diferentes níveis de lesão.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Sr. Jeffrey Recchia-Rife por sua excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de Diretor do Hospital Geral da Região Militar de Jinan de Chines PLA 2016ZD03 e 2014ZX01 (XJL e TBZ). A pesquisa no laboratório Xu é apoiada pelo NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, e prêmio de revisão de mérito I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA.
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