Summary
Qui descriviamo le procedure chirurgiche per produrre un'emisezione laterale del midollo spinale affidabile (HX) al 9esimo livello toracico nei ratti adulti e valutazioni neurocomportamentali progettate per rilevare deficit asimmetrici dopo tale lesione unilaterale.
Abstract
Lesione incompleta del midollo spinale (SCI) spesso porta a compromissione delle funzioni sensomotorie ed è clinicamente il tipo più frequente di SCI. La sindrome di Human Brown-Séquard è un tipo comune di SCI incompleta causata da una lesione a una metà del midollo spinale che si traduce in paralisi e perdita di propriocezione sullo stesso lato (o ipsilesionale) della lesione e perdita di dolore e sensazione di temperatura sul lato opposto (o controscienziale). Metodologie adeguate per la produzione di un'emisezione laterale del midollo spinale (HX) e la valutazione dei disturbi neurologici sono essenziali per stabilire un modello animale affidabile della sindrome di Brown-Séquard. Sebbene il modello di emisezione laterale svolga un ruolo fondamentale nella ricerca di base e traslazionale, mancano protocolli standardizzati per la creazione di tale emisezione e la valutazione della funzione unilateralizzata. L'obiettivo di questo studio è descrivere le procedure passo-passo per produrre un HX spinale al ratto allivello vertebrale del torace (T9). Descriviamo quindi una scala di comportamento combinata per HX (CBS-HX) che fornisce una valutazione semplice e sensibile delle prestazioni neurologiche asimmetriche per sCI unilaterale. Il CBS-HX, che va da 0 a 18, è composto da 4 valutazioni individuali che includono il stepping unilaterale dell'arto posteriore (UHS), l'accoppiamento, il posizionamento dei contatti e la camminata della griglia. Per CBS-HX, gli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali vengono valutati separatamente. Abbiamo scoperto che, dopo un HX T9, l'arto posteriore ipsilaterale mostrava una funzione di comportamento compromessa, mentre l'arto posteriore contralaterale mostrava un recupero sostanziale. Il CBS-HX discriminava efficacemente le funzioni comportamentali tra gli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali e rilevava la progressione temporale del recupero dell'arto posteriore ipsilaterale. I componenti CBS-HX possono essere analizzati separatamente o in combinazione con altre misure quando necessario. Anche se abbiamo fornito solo descrizioni visive delle procedure chirurgiche e valutazioni comportamentali di un HX toracico, il principio può essere applicato ad altre SCI incomplete e ad altri livelli della lesione.
Introduction
Le lesioni incomplete del midollo spinale (SCI) spesso portano a gravi e persistenti menomazioni delle funzioni sensomotorie e sono clinicamente il tipo più frequente di SCI1. La sindrome di Brown-Séquard negli esseri umani è causata da una lesione a metà del midollo spinale che si traduce in paralisi e perdita di propriocezione sullo stesso lato (o ipsilesionale) come la lesione, e la perdita di dolore e sensazione di temperatura sul lato opposto (o contrale)2,3,4. I modelli animali di emisezione laterale spinale sono ampiamente utilizzati per imitare la sindrome umana di Brown-Séquard e sono stati segnalati nei ratti5,6,77,8,9, opossum10e scimmie7,11,12,13 da vari laboratori a vari livelli spinali. Tuttavia, non sono state descritte procedure dettagliate visualizzate per la produzione di un'emisezione laterale standard. La fornitura di procedure dettagliate per un'emisezione laterale dovrebbe ottimizzare il modello e facilitare il confronto o la replica dei risultati sperimentali nella ricerca di base e traslazionale.
Una SCI unilaterale produce deficit di comportamento asimmetrici e sproporzionati che sono difficili da misurare utilizzando valutazioni convenzionali per lesioni simmetriche. Una metodologia adeguata per valutare le menomazioni neurologiche per una SCI unilaterale è una componente essenziale per lo sviluppo di un modello SCI unilaterale. Nonostante il ruolo fondamentale di una lesione spinale unilaterale, mancano protocolli standardizzati per valutare i deficit sensomotori negli animali con tale lesione. La scala di valutazione locomotor Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) è stata la misurazione più frequentemente utilizzata della funzione dopo la SCI per i ratti adulti 14 che produce una descrizione semiquantitativa della locomozione nel suo complesso. Tuttavia, non misura ogni limb posteriore in modo indipendente.
In questo studio, riportiamo procedure passo-passo per produrre un HX spinale del roditore al livello vertebrale del 9thoracico (T9). Introduciamo anche una scala di comportamento combinata per l'emisezione (CBS-HX) che include il stepping unilaterale degli arti posteriori (UHS), l'accoppiamento, il contatto e le valutazioni della griglia per valutare i danni neurologici e il recupero dopo una SCI unilaterale. Ci auguriamo che questo modello sia un modello utile per esaminare i meccanismi di lesione e gli effetti terapeutici per le SIS unilaterali.
Protocol
Tutte le procedure chirurgiche e di movimentazione degli animali sono state eseguite come approvato dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Consiglio nazionale di ricerca) e le Linee guida della Scuola Universitaria di Medicina dell'Indiana, la cura e l'uso istituzionale degli animali Comitato.
1. Considerazione generale
- Usa ratti Sprague-Dawley (SD) femminili adulti (peso 200 g, n. 12) per questo studio. Animali abituati a tutti gli ambienti di test e raccogliere dati di base per tutti i test di comportamento una settimana prima della procedura chirurgica.
- Eseguire le valutazioni comportamentali da parte di due osservatori che sono accecati dai gruppi sperimentali.
2. Preparazione degli animali
- Pulire la tavola chirurgica con 70% di etanolo. Posizionare una piastra di riscaldamento preriscaldata sul tavolo chirurgico. Coprire l'area chirurgica con un drappo chirurgico sterile. Posizionare la garza sterile, tamponi di cotone, e strumenti chirurgici autoclaved sulla superficie del drappo chirurgico.
- Accendere uno sterilizzatore di microsfere per la sterilizzazione interchirurgia di strumenti chirurgici.
NOTA: Un esempio degli strumenti utilizzati in questo esperimento è illustrato nella Figura 1. - Anestesizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di ketamina (87,7 mg/kg) e xylazina (12,3 mg/kg). Assicurarsi che il piano corretto di anestesia sia raggiunto da nessuna risposta allo stimolo del pizzico. Applicare l'unguento veterinario agli occhi dell'animale per prevenire l'essiccazione corneale durante l'intervento chirurgico.
- Rimuovere i capelli sovrastanti le vertebre toraciche radendo (Figura 2A). Rimuovere la pelliccia rasata con un vuoto dotato di filtro HEPA.
- Pulire l'area chirurgica con tre scrub alternati di scrub e etanolo a base di iodio.
- Coprire l'animale con un drappo sterile con una fenestrazione sul sito di incisione proposto (Figura 2B).
Nota: < Nel video, il drappo chirurgico è stato omesso a scopo dimostrativo.
3. Emisezione spinale
- Toccare la costola 13th che è la costola più bassa del ratto e una costola galleggiante che non si collega allo sterno. Seguire la costola 13dorsalmente per identificare la sua connessione con la vertebra T13 e poi contare fino per identificare la vertebra T10.
- Utilizzare una lama bisturi (#15, Figura 1) per eseguire un'incisione cutanea media da 3 a 4 cm sul retro sovrastante i processi spinosi vertebrali 8-11th.
- Sotto un microscopio chirurgico, sezionano senza mezzi termini e separano i muscoli paraspinali lateralmente dai processi spinosi verso le sfaccettature delle vertebre T9 e T10 su entrambi i lati utilizzando la stessa lama del bisturi.
NOTA: Questo approccio prenderà in giro bene il tessuto senza causare emorragie. - Stabilizzare la colonna vertebrale utilizzando un supporto di stabilizzazione modificato. Fare una crepa su entrambi i lati dell'osso vertebrale laterale. Far scorrere i bracci in acciaio inossidabile sotto le sfaccettature del processo trasversale esposte e stringere le viti per garantire la stabilità.
- Utilizzare un retrattore per ritrattare i muscoli dall'area chirurgica (Figura 2B) ed esporre i processi laminari e spinosi T8-11 (Figura 2C).
NOTA: C'è un grande divario tra i processi spinosi T8 e T9, che sono punti di riferimento per l'identificazione di T9 (Figura 2C, vista dorsale). Dal punto di vista laterale, il processo spinoso della vertebra T9 punta caudalmente, il processo spinoso T10 punta dorsalmente e i punti di processo spinosi T11 sontuosi; così, i 3 processi spinosi formano una piramide e il processo spinoso T10 forma il picco (Figura 2D, vista laterale). - Eseguire una laminectomia dorsale sulla vertebra T9 utilizzando un rongeur. Snip via il processo spinoso T9 e rimuovere una piccola porzione della lamina sinistra alla linea mediana (Figura 3A, linea tratteggiata), e l'intera porzione destra della lamina il più lateralmente possibile (Figura 3A, linea tratteggiata). Per laminectomia, inserire delicatamente il rongeur sotto la lamina e snipare un piccolo pezzo di osso alla volta fino a quando non viene completata una regione desiderata di laminectomia (Figura 3B e Figura 3C).
- Al microscopio chirurgico, identificare la linea mediana dorsale del midollo spinale (Figura 3C). Inserire un ago (30 G) verticalmente attraverso la linea mediana nel midollo spinale con il lato smussato rivolto verso il lato destro (Figura 4A).
NOTA: L'ago deve penetrare l'intero midollo spinale per raggiungere la parete ventrale del canale vertebrale. - Fermare qualsiasi sanguinamento con un piccolo pezzo di gelfoam sterile.
- Inserire una punta di una forbice iridectomia/microchirurgica attraverso la pista aghi della linea mediana e l'altra punta lungo la superficie laterale dell'emi-cord destro, quindi effettuare un taglio completo sull'emi-cord destro con le forbici (Figura 4B).
NOTA: Utilizzare un microforsors affilato per il taglio del midollo spinale per ridurre al minimo la lesione di compressione al midollo spinale durante il taglio. - Utilizzare il bordo laterale dello stesso ago di un coltello per tagliare lo spazio di lesione per confermare un'emisezione completa destra. Verificare la completezza dell'emisezione destra visualizzando la parte inferiore del canale vertebrale con il microscopio chirurgico (Figura 4C, vista trasversale; Figura 4D, vista laterale; Figura 4E,vista dorsale).
- Posizionare un piccolo pezzo di spugna di gelatina sul sito di lesione (Figura 4F). Utilizzare la miscela di cemento e costruire un ponte stretto sopra la spugna e i processi spinosi di T8 e T10 (Figura 4G, H).
NOTA: Lo scopo dell'utilizzo di un ponte di cemento è duplice: 1) separa la cicatrice sviluppata nel sito di lesione dal resto del tessuto, e 2) rende più facile sezionare il segmento del midollo spinale dopo il sacrificio animale. - Suturare gli strati muscolari e cutanei separatamente con filo di seta 4-0.
- Iniettare lo 0,9% di sottocutanea salina sterile per mantenere l'idratazione. Iniettare un agente analgesico Buprenorphine (0.05-2.0mg/kg S) 8-12 h/day sottocutaneamente per 2 giorni. Premere la vescica urinaria 2-3 volte al giorno per la prima settimana e 1-2 volte nelle settimane successive fino a quando la svuotamento spontaneo della vescica ritorna.
4. Cura degli animali postoperatori
- Riportare l'animale alla sua gabbia domestica mono-ospitata. Fornire chow o gel di roditori umidi sul fondo della gabbia per aiutare nella capacità degli animali di mangiare / idratare. Posizionare un pad di riscaldamento sotto la gabbia durante il recupero post-chirurgico. Assicurarsi che il pad di riscaldamento copra solo metà del fondo della gabbia per evitare il surriscaldamento.
- Iniettare lo 0,9% di sottocutanea salina sterile per mantenere l'idratazione. Iniettare un agente analgesico Buprenorphine (0.05-2.0mg/kg S) 8-12 h/day sottocutaneamente per 2 giorni. Premere la vescica urinaria 2-3 volte al giorno per la prima settimana e 1-2 volte nelle settimane successive fino a quando la svuotamento spontaneo della vescica ritorna.
5. Valutare l'emisezione unilaterale stepping (UHS)
NOTA: Il test unilaterale del passo dell'emisezione (UHS) è una misura diretta della capacità degli animali SCI di utilizzare il loro limbh posteriore ipsilesionale nel campo aperto. Come accennato in 1.1, gli animali sono stati acclimatati ad un ambiente di campo aperto (diametro 42 pollici) 15 due volte al giorno per 7 giorni. Due osservatori accecati dai gruppi animali eseguono il test. Punteggio UHS sia al basale (7 giorni prima del T9 HX) che a i punti temporali dopo l'infortunio saranno raccolti. I passaggi per la valutazione sono descritti come segue.
- Posizionare l'animale in un ambiente aperto ed esaminare la locomozione dell'animale per 4 min.
NOTA: Durante i test, l'animale può incoraggiare a muoversi attivamente. - Con il modulo fornito nella tabella 1, assegnare un valore pari a 1 per Sì e 0 per No per ogni categoria di comportamento e quindi sommare il valore totale per assegnare un punteggio UHS finale compreso tra 0 e 8.
NOTA: Secondo la tabella 1 0: nessun movimento osservabile dell'arto posteriore; 1 – 4: movimenti isolati di 3 articolazioni dell'arto posteriore (anca, ginocchio e caviglia); 5: spazzare senza supporto di peso; 6: posizionamento senza supporto di peso; 7: posizionamento con supporto di peso; e 8: stepping con supporto di peso. - Raccogli i punteggi UHS sia al basale (7 giorni prima del T9 HX) che ai punti temporali dopo l'infortunio.
NOTA: I punteggi saranno valutati in vari momenti dopo il T9 HX.
6. Accoppiamento
- Analizza il CPL (gait coupling) con un video che registra un animale che cammina su un dispositivo di passerella stretta o un semplice campo aperto.
- Nella sezione di accoppiamento della tabella 1assegnare un punteggio pari a 0 per "No", 1 per "Irregolare/maldestro" e 2 per "Normale" per ogni categoria CPL.
NOTA: Il test di accoppiamento (CPL) consiste nel valutare la coordinazione dei movimenti alternati degli arti, compresi i CPL omologhi (arti anteriori/posteriori posteriori, Figura 5A),la CPL diagonale (anteriore-sinistra destra o anteriore destra-posteriore sinistra, Figura 5B) e la CPL omolaterale (arti anteriori posteriori sullo stesso lato, Figura 5C). A seguito di un HX T9, i deficit dell'arto posteriore sul lato ipsilesionale diventano visibili con conseguente alternanza della CPL omologa (Figura 5D), CPL diagonale (Figura 5E) e CPL omolaterale (Figura 5F).
7. Contatto Posizionamento
NOTA: Il test di posizionamento del contatto dell'arto posteriore viene utilizzato per valutare l'integrazione motoria delle risposte dell'arto posteriore agli stimoli propriocettivi 16. La propriocezione è considerata intatta se l'animale sale con l'arto posteriore sulla superficie dopo che l'arto posteriore è stato tirato giù sotto la superficie.
- Tenere l'animale in posizione verticale in modo che entrambi gli arti posteriori siano disponibili per la risposta di posizionamento.
- Spazzolare leggermente la superficie dorsale di un limb posteriore verso il bordo di una superficie (ad esempio, panca di lavoro animale).
- Osservare il posizionamento del piede sulla superficie e assegnare un punto di immissione del contatto dell'arto posteriore. 0: nessun posizionamento; 1: posizionamento.
NOTA: La superficie dorsale riceve stimolazione e il piede si estenderà e posizionerà il piede sulla superficie se il riflesso è intatto. Il modulo di valutazione è anch'io riportato nella tabella 1.
8. Passeggiata in griglia
NOTA: il test di marcia in griglia valuta i deficit motori spontanei e i movimenti degli arti coinvolti in azioni precise, coordinazione e posizionamento accurato delle zampe.
- Posizionare un ratto su una griglia di rete metallica rivestita in plastica elevata (36 x 38 cm con 3 cm2 aperture) e lasciarla camminare liberamente sulla piattaforma per 30 passi.
- Contare il numero totale di passi e il numero di passi falsi per ogni arto. Le registrazioni video vengono effettuate per confermare il conteggio.
NOTA: due osservatori accecati valutano il posizionamento della zampa degli arti anteriori e degli arti posteriori mentre gli animali camminano. - Assegnare i punteggi di camminata della griglia per ogni limb posteriore come segue – 0: passi falsi maggiori di 15; 1: passi falsi minori o uguali a 15; 2: passi falsi minori o uguali a 10; e 3: passi falsi inferiori o uguali a 5.
NOTA: la valutazione del punteggio si basa sulla tabella 1. I punteggi dei tagli sono utilizzati come misure di gravità dei deficit motori.
9. Perfusione e trattamento dei tessuti
- Dopo un'adeguata anestesia simile nel passaggio 2.3, perfondere attentamente gli animali seguendo il protocollo di perfusione transcardiale 17.
- Dissezionare e raccogliere i campioni del midollo spinale e post-installarli in 4% PFA durante la notte.
- I campioni possono quindi essere trasferiti alla soluzione di saccarosio del 30%.
- Tagliare il midollo spinale in sezioni trasversali e macchiare le sezioni selezionate con un marcatore assone SMI-31 e un marcatore astrocitico leal fibrillare proteina fibrillare (GFAP) secondo le procedure standard18.
Representative Results
Le procedure chirurgiche sopra descritte consentono la produzione di un HX laterale coerente e riproducibile a T9. Dopo la perfusione e la rimozione della pelle, il sito chirurgico di T9 potrebbe essere facilmente identificato da una sutura residua (Figura 6A). Un'ulteriore dissezione consente l'esposizione del ponte di cemento (Figura 6B) e della spugna di gelatina (Figura 6C) negli strati. Il midollo spinale viene quindi esposto al canale vertebrale aperto e viene confermata un'emisezione laterale sul lato destro (Figura 4D). Il livello della lesione può essere ulteriormente confermato dalla sua associazione con i corpi vertebrali esposti e le costole (Figura 6D). L'immunofluorescenza colorazione di una sezione trasversale all'epicentro infortunio mostra una completa perdita di emicordo destro e la conservazione dell'emicordone sinistra contralateralmente alla lesione. La sezione è macchiata con un marcatore assone SMI-31 e una proteina acida fibrillare fibrillare astrocitica (GFAP)(Figura 6E).
Neurocomportamentalmente, il sistema CBS-HX è in grado di rilevare deficit asimmetrici nel tempo a seguito di un HX T9. Dopo HX, l'arto posteriore ipsilaterale ha perso la sua capacità di passo, mentre l'arto posteriore contralaterale ha mantenuto la capacità di camminare. Per ogni misura di comportamento, abbiamo eseguito 3 prove e usato la media delle 3 prove per la quantificazione e l'analisi. Abbiamo usato la misura pre-chirurgica come una linea di base che consideriamo come il controllo più accurato rispetto all'utilizzo di altri ratti. I punteggi delle 4 misure individuali, ad esempio UHS, CPL, contatto e grid walking possono essere analizzati separatamente (Figura 7A-D) oppure possono essere combinati in un Composito CBS-HX (Figura 7E). Le analisi ANOVA bidirezionali hanno mostrato differenze significative nell'UHS (F - 23,199, p < 0,001), l'accoppiamento (F - 8,376, p < 0.01), posizionamento dei contatti (F : 17,672, p < 0,001), passeggiate in griglia (F : 19.261, p < 0,001), CBS-HX (F - 20,897, p < 0,001) tra i lati ipsilaterale e contralaterale. La figura 7A mostra i risultati di UHS dopo un HX T9. Nei primi 3 giorni postinfortuni, i ratti hanno perso la capacità di passo e hanno ricevuto un punteggio di 0-2 per l'arto posteriore ipsilesionale. I movimenti a gradini hanno cominciato ad apparire sul lato ipsilesionale a 7-10 giorni dopo la lesione, con la maggior parte dei passi sono passi dorsali. Entro 28 giorni dopo il T9 HX, i ratti potevano prendere misure plantari con coordinazione praticamente normale con un punteggio UHS assegnato di 8. A titolo di confronto, l'arto posteriore contralesele è stato meno interrotto e il punteggio UHS è sceso entro i primi 5 giorni dopo l'HX Del T9 e è tornato al livello di base dopo il giorno 10 dopo l'infortunio. Per il test totale CPL (compreso l'accoppiamento omolaterale, omologo e diagonale), sia la stabilità che l'adattabilità del coordinamento dopo il T9 HX sono state notevolmente ridotte (Figura 7B). A 1-5 giorni dopo l'infortunio, gli animali HX non mostravano alcun segno di CPL. Il posizionamento del contatto (Figura 7C) e la camminata in griglia (Figura 7D) dell'arto posteriore ipsilaterale sono stati colpiti anche dal T9 HX in particolare entro i primi 5 giorni dopo la lesione, e di solito recuperato quando l'animale ha cominciato a prendere gradini plantari. Il sistema composito CBS-HX include i test UHS, CPL, di posizionamento dei contatti e di camminata della griglia per un punteggio massimo possibile di 18 (Figura 7E). La funzione motoria degli arti posteriori ipsilaterali ha dimostrato una diminuzione dei punteggi CBS-HX dopo l'HX laterale T9, che è coerente con i deficit osservati nella sindrome umana Brown-Séquard. La funzione motoria degli arti posteriori ipsilaterali ha dimostrato una diminuzione dei punteggi CBS-HX da 1 giorno a 4 settimane dopo l'HX laterale T9 rispetto agli arti posteriori contralaterali (Figura 7E).
Così, il sistema composito CBS-HX che combina l'UHS, CPL, posizionamento di contatto, e la camminata della griglia può essere utilizzato per valutare la funzione comportamentale dei ratti dopo la lesione laterale del midollo spinale toracico per un punteggio massimo possibile di 18.
come illustrato nella Figura 1. Strumenti chirurgici utilizzati per la produzione di un'emisezione t9 lato destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Esposizione chirurgicaposure. A) Radere i capelli sul retro sovrastante la regione chirurgica. B) Ritirare i muscoli dall'area chirurgica utilizzando un retrattore. C) Esporre la laminae vertebrale T8-11 e definire i singoli processi spinosi (frecce). Si noti che c'è un grande divario tra i processi spinosi T8 e T9, che è un punto di riferimento per l'identificazione di T9. D) Il disegno schematico mostra la vista laterale dei processi spinosi. I processi spinosi T9-11 formano una piramide con il processo spinoso T10 che è il picco. Ancora una volta, un grande divario tra i processi spinosi T8 e T9 è chiaramente visto come un punto di riferimento per identificare T9 in cui viene eseguita una laminectomia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Laminectomia e l'esposizione dell'emicordone destra. A) Il disegno schematico mostra la sezione trasversale del midollo spinale all'interno della vertebra T9. La linea tratteggiata indica l'estensione della laminectomia su ciascun lato. B) Il disegno schematico mostra la rimozione di una piccola porzione della lamina sul lato sinistro e dell'intero arco vertebrale sul lato destro. Una freccia indica la linea mediana dorsale del cavo. C) Vista dorsale del midollo spinale esposto. Si noti che la vena dorsale si trovava al centro del midollo spinale che divideva gli emicordoni sinistro e destro. L'emicordo destro era completamente esposto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Emisezione laterale. A-D) I disegni schematici mostrano l'inserimento dell'ago della linea mediana nel midollo spinale (A), l'emisezione T9 (B), la copertura di spugna di gelatina e cemento (C), e la vista laterale di un'emisezione laterale T9 (D). Le linee tratteggiate in C delineano la lamina vertebrale T9 rimossa e l'emicordo destro. E) Vista dorsale di un'emisezione del midollo spinale destro. F) Posizionamento di un piccolo pezzo di spugna di gelatina sul sito dell'emisezione. G-H) Un ponte di cemento Simplex-P costruito sopra la spugna e i processi spinosi di T8 e T10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 5. Disegno schematico del test di accoppiamento (CPL). test. Il test CPL è quello di valutare la coordinazione dei movimenti alternati degli arti, tra cui A) CPL omologa (anteriore/posteriore-posteriore), B) diagonale CPL (anteriore-posteriore destra/anteriore-posteriore) e C) CPL omolaterale (arti anteriori posteriori sullo stesso lato). Dopo T9 HX (scatola rossa, D-F), il deficit dell'arto posteriore è diventato visibile sul lato ipsilesionale e gli animali Please click here to view a larger version of this figure. mostrano mancanza di coordinamento nell'omologa (D), diagonale (E) e omolaterale (F) CPL.
come illustrato nella Figura 6. Dissezione dei tessuti e istologia. Dopo la perfusione, i tessuti sono stati sezionati per esporre il midollo spinale. Le sezioni trasversali sono state elaborate per la colorazione doppia immunofluorescente della proteina acidica fibrillare gliale (GFAP, marcatore per gli astrociti) e SMI31 (un marcatore per gli assoni). A) Esposizione della sutura come punto di riferimento per il sito dell'infortunio (freccia gialla). B) Esposizione del cemento dentale (freccia gialla). C) Esposizione della spugna di gelatina (freccia gialla). D) Identificare l'emisezione spinale sul lato destro (freccia gialla). E) Una sezione trasversale del midollo spinale all'epicentro della lesione immunostained con GFAP (verde) e SMI 31 (rosso). Essa mostra che l'emicordone spinale destra è stata completamente tagliata e l'emicordo sinistro è stato ben conservato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 7. Risultati dei punteggi neurocomportamentali. I grafici mostrano i punteggi delle 5 misure: A, il punteggio dell'emisezione unilaterale (UHS); B, accoppiamento (CPL); C, posizionamento dei contatti; D, grid walking ed E, punteggio di comportamento combinato (CBS) sugli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali dopo un T9 HX. I dati rappresentano la media , ad esempio, p < 0,05, : p < 0,01, : p < 0,001 tra gli arti posteriori ipsilaterali e contralaterali (ANOVA a due vie, test di confronto multiplo di Tukey, n - 12 ratti/gruppi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome/Intervallo sottopunteggio | Descrizione | Punteggio | |
| Passo unilaterale dell'arto posteriore | Leggero movimento dell'arto posteriore osservabile | No | 0 |
| (UHS) | Sì | 1 | |
| (0-8) | Movimento della caviglia | No | 0 |
| Sì | 1 | ||
| Movimento del ginocchio | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Movimento dell'anca | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Spazzare (nessun supporto di peso) | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Posizionamento (nessun supporto di peso) | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Posizionamento (con supporto del peso) | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Passo | No | 0 | |
| Sì | 1 | ||
| Accoppiamento | Omolaterale | No | 0 |
| (0-6) | Irregolare/goffo | 1 | |
| Normale | 2 | ||
| Omologo | No | 0 | |
| Irregolare/goffo | 1 | ||
| Normale | 2 | ||
| Diagonale | No | 0 | |
| Irregolare/goffo | 1 | ||
| Normale | 2 | ||
| Posizionamento dei contatti | No | 0 | |
| (0-1) | Sì | 1 | |
| Passeggiata in griglia | Perdere passi | >15 | 0 |
| (0-3) | 15 USD | 1 | |
| 10 USD | 2 | ||
| N. 5 (da 5) | 3 | ||
| Totale CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
Tabella 1: I punteggi di comportamento combinato per l'emisezione (CBS-HX)
Discussion
In questo studio, riportiamo procedure passo-passo per produrre un HX spinale T9 semplice, coerente e riproducibile nei ratti adulti che imita la sindrome di Brown-Séquard negli esseri umani. Introduciamo inoltre un sistema combinato di punteggio comportamentale per l'emisezione (CBS-HX) che è sensibile alla valutazione di una compromissione neurologica asimmetrica e alla progressione del recupero, misurata da una combinazione di stepping unilaterali dell'arto posteriore (UHS), accoppiamento (CPL), contatto e la camminata in griglia. Anche se dimostriamo la lesione a livello di T9, questa procedura può essere applicata ad altre regioni del midollo spinale, comprese le corde cervicali e lombari in modo semplice e poco impegnativo. Ci auguriamo che questo modello, insieme a valutazioni comportamentali unilaterali, sia utile per esaminare i meccanismi di lesione e gli effetti terapeutici per tali tipi di SCI.
Poiché il modello HX laterale lega solo la metà ipsilaterale del cavo, il lato contralaterale del cavo è in gran parte conservato e può essere utilizzato come controllo interno. Molte vie discendenti e ascendenti sono proiettate unilateralmente e un'emisezione laterale in molte circostanze produce danni a un tratto assonale da un lato e conserva lo stesso tratto sul lato opposto, consentendo il confronto della riorganizzazione e conseguenze funzionali di questi tratti nello stesso animale. Inoltre, la produzione di una lesione più localizzata può consentire il targeting di percorsi specifici. Ad esempio, una lesione ventrale e ventrolaterale può influenzare le vie reticulospinale e vestibulospinali. Una lesione dorsale o dorsolaterale può influenzare le vie corticospinali e rubrospinali. L'emisezione o il modello di lesione parziale può anche essere utilizzato per studiare l'anatomia e la funzione di altri percorsi, come le vie propriospinali, noradrenergiche o sierotonergiche. Così, il modello di emisezione può essere impiegato in modo univoco per studiare la compensazione da afferenti sensoriali, da percorsi discendenti, e da circuiti spinali intrinseci. Questo modello è adatto anche per studiare i meccanismi di recupero locomotore dopo HX.
L'HX laterale porta a evidenti menomazioni comportamentali, che sono valutabili nell'ambito di compiti motori (ad esempio, Treadscan o Treadmill) paradigma per l'analisi automatica dell'andatura 19. Inoltre, la conduttività dei tratti assonali sul lato contralaterale della lesione potrebbe essere misurata utilizzando registrazioni elettrofisiologiche, e questa valutazione offre la possibilità di stabilire una riorganizzazione funzionale a seguito di vari trattamenti. Inoltre, iniezioni unilaterali dei traccianti anatomici nei neuroni di un particolare percorso permettono la visualizzazione di fibre di attraversamento della linea mediana etichettate per viaroce e la loro connessione con neuroni retrogradelmente etichettati20,21,22,23,24,25.25
Anche se una tipica chirurgia HX spinale richiede meno di 20 minuti per finire, richiede una certa pratica per ottenere un HX preciso e coerente. In primo luogo, è importante che il livello di HX spinale sia coerente da animale a animale. Pertanto, è fondamentale identificare il segmento vertebrale appropriato per la laminectomia. In secondo luogo, assicurarsi che l'HX sia completo. Per fare un HX completo, si può usare un ago di 30 calibro inserito verticalmente attraverso la linea mediana per guidare il taglio utilizzando microscisors. L'inserimento dell'ago evita anche danni ai vasi spinali o al midollo posteriori rispetto alla consione. La seconda funzione dell'ago calibro 30 è che può servire come un coltello per tracciare il taglio per assicurarsi che non vi sia ambiguità della lesione. In terzo luogo, l'inserimento della gelatina sul sito di lesione può ridurre al minimo la perdita del liquido cerebrospinale e posizionare il cemento sopra la gelatina e colmare la lamina vertebrale può rafforzare la stabilità delle vertebre spinali nel sito di lesione e facilitare la guarigione della ferita. Per evitare l'interferenza del segnale con l'applicazione di registrazioni elettrofisiologiche, muscoli, fascia e pelle devono essere suturati in strati con filo di seta 4-0. Infine, ogni sforzo dovrebbe essere fatto per ridurre al minimo il danno al midollo spinale contralaterale. La verifica istologica deve essere stabilita per confermare una completa emisezione laterale su un lato e la conservazione dell'altra metà del cavo sull'altro lato (come mostrato nella figura 6E).
Per migliorare la locomozione dopo SCI, studi precedenti hanno utilizzato una vasta gamma di strategie tra cui il trapianto di cellule, la rigenerazione degli assoni 8,18,26,27, e la riabilitazione basata sull'attività 28,29,30. Nel frattempo, sono stati stabiliti diversi test comportamentali per la valutazione funzionale e per lo screening per i migliori trattamenti dopo SCI. La scala di valutazione locomotore BBB è stata progettata per la valutazione locomotoria di lesioni simmetriche spinali come una contusione mediana o lesioni da transezione che colpiscono le zampe posteriori bilaterali 14,31. Alcuni parametri della BBB, come il coordinamento e l'altezza delle punta, sono registrati osservando entrambi gli arti posteriori. Se un limb posteriore è intatto e l'altro mostra deficit come visto in lesioni asimmetriche, l'arto posteriore intatto confonderà il punteggio dell'arto posteriore interessato. Poiché il punteggio BBB non ospita un punteggio dell'arto posteriore dall'altro dopo la lesione unilaterale, non è ideale per valutare le lesioni unilaterali del midollo spinale. Tuttavia, se il movimento articolare e il supporto del peso su ciascun lato sono valutati separatamente e non sono calcolati come parte della BBB, l'arto posteriore intatto (simile a un controllo fittizio) non confonderà il punteggio dell'arto posteriore interessato. Inoltre, il lato intatto non smista il punteggio complessivo dell'animale, perché l'arto posteriore intatto non ha deficit drammatici nel movimento articolare, nel supporto del peso o nel passo.
Il punteggio di comportamento combinato per l'emisezione è progettato per essere una valutazione sensibile e facilmente eseguito del recupero comportamentale nel modello di ratto dell'emisezione laterale. Può essere utilizzato per valutare i comportamenti delle fasi iniziali e tardive del ripristino. La fase iniziale è entro 7-10 giorni postinfortuni. Nei primi 3-5 giorni dopo l'HX, l'attività degli arti posteriori ipsilaterali è aumentata costantemente e deve essere valutata più frequentemente per registrare recuperi di movimento degli arti posteriori spontanei o mediati dal trattamento. Entro 5-7 giorni dopo l'HX, i ratti hanno iniziato a fare movimenti spazzare i movimenti dell'arto posteriore senza il supporto del peso. Da 7-10 giorni, i ratti in genere cominciarono a stare in piedi e a fare passo. Durante questa fase, dovrebbe essere prestata attenzione al modello di stepping. Nella fase avanzata (14-28 giorni), l'attività dell'arto posteriore ipsilaterale era stabile e vicina alla normalità.
Occorre inoltre prestare molta attenzione alla capacità di accoppiamento (CPL). Il test CPL (gait coupling) può essere eseguito sia con un video (ad esempio, Treadscan/Catwalk) sia con un video di ripresa durante un test in campo aperto. La seconda opzione offre flessibilità se i ricercatori non hanno accesso al sistema di analisi dell'andatura. Per entrambe le sessioni di registrazione video, per questo test è necessario almeno due touchdown consecutivi per ogni piede. Per l'analisi, ci sono tre parametri di accoppiamento: omologa, omolaterale e diagonale di accoppiamento (passaggio 6.2). Ogni accoppiamento comporta un piede di riferimento e il piede dato. Prendiamo l'accoppiamento omologato (anteriore-sinistro-anteriore destro, o posteriore sinistro-destra) per esempio, è il primo tempo di touchdown del piede dato diviso da un tempo intero del piede di riferimento. Poiché il piede sinistro e destro dovrebbe essere fuori fase, l'accoppiamento perfetto dovrebbe essere 0,5. Questo è lo stesso caso nell'accoppiamento omolaterale (posteriore anteriore sinistro sinistro o posteriore destro-destro). Tuttavia, per l'accoppiamento diagonale (posteriore anteriore-destro sinistro o anteriore sinistro destro posteriore), l'accoppiamento perfetto dovrebbe essere 0 o 1 poiché i due piedi dovrebbero essere in fase. Nel passaggio 6.4 assegniamo un punteggio per ogni CPL da 0 a 2. Nei dettagli, un punteggio 0 rappresenta il piede dato non è in grado di muoversi per finire un touchdown, quindi nessun CPL; un punteggio 1 rappresenta qualsiasi CPL irregolare o goffo dal momento che il piede dato termina un touchdown, ma non nell'accoppiamento perfetto; un punteggio 2 significa un accoppiamento perfetto di 0,5. I tre concetti relativi ai parametri di accoppiamento sono ben descritti nelle pubblicazioni precedenti32,33. CPL può essere combinato con le valutazioni del posizionamento dei contatti e della camminata nella griglia. I singoli componenti del sistema combinato di punteggio del comportamento saranno più o meno efficaci nei diversi modelli di ratti di SCI. Per la CPL, i disavanzi sono diventati ovviamente visibili nel tasso di alternanza e nella completezza della sequenza. I deficit di posizionamento degli arti posteriori propriocettivi potrebbero essere chiaramente rivelati dopo HX unilaterale. Nel nostro studio, tutti i ratti hanno mostrato deficit di posizionamento dell'arto posteriore ipsilesionale mentre il posizionamento degli arti posteriori contralaterale non mostrava deficit. Il test di camminata della griglia deve essere considerato quando il posizionamento di contatto, che coinvolge il tratto corticospinale, inizia a recuperare. Per escludere eventuali problemi di fatica, la sequenza dei test comportamentali potrebbe essere randomizzata ad ogni test.
In conclusione, riportiamo procedure passo-passo per creare un modello riproducibile di ratti in vivo dell'HX spinale T9 che imita la sindrome Brown-Séquard negli esseri umani. Il sistema combinato di punteggio del comportamento per l'emisezione offre una misura più discriminativa dei risultati comportamentali individuali degli arti posteriori per valutare i meccanismi e i trattamenti di lesione dopo una SCI unilaterale. Anche se forniamo solo una descrizione visiva delle procedure chirurgiche e delle valutazioni comportamentali di un HX toracico, i metodi qui descritti possono essere applicati ad altre SCI incomplete a diversi livelli di lesioni.
Disclosures
Non abbiamo niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il signor Jeffrey Recchia-Rife per la sua eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione di Direttore dell'Ospedale Generale della Regione Militare Jinan di Chines PLA 2016-D03 e 2014-X01 (XJL e TB) . La ricerca nel laboratorio Xu è supportata da NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, e meritetto Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 dal Dipartimento degli Affari Veterani degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
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