Summary
여기에서 우리는 성인 쥐에 있는 9th 흉부 수준에서 믿을 수 있는 척수 측삭 측수 (HX)를 생성하기 위하여 외과 적 절차를 기술하고 그러한 일방적인 상해 후에 비대칭 적자를 검출하기 위하여 디자인된 신경 행동 평가.
Abstract
불완전한 척수 손상 (SCI)은 종종 감각 운동 기능의 손상으로 이어지며 임상적으로 SCI의 가장 빈번한 유형입니다. 인간 브라운 - 세커드 증후군은 병변으로 인한 일반적인 유형의 불완전한 SCI로 인해 척수의 절반에 대한 병변으로 인해 마비및 프로피오셉션의 손실이 발생하며(또는 ipsilesional) 측의 상해, 및 통증의 손실과 같은 측면(또는 ipsilesional) 측의 손실과 같은 측면의 통증과 같은 측면(또는 ipsilesional) 측의 손실과 같은 측면의 통증이 있습니다. 척수 측면 위축부 (HX)를 생성하고 신경 장애를 평가하기위한 적절한 방법론은 브라운 세커드 증후군의 신뢰할 수있는 동물 모델을 확립하는 데 필수적입니다. 측면 반구 모델은 기본 및 번역 연구에서 중추적 인 역할을하지만, 이러한 반구를 만들고 일방적 인 기능을 평가하기위한 표준화 된 프로토콜은 부족합니다. 이 연구의 목표는9th 흉부 (T9) 척추 수준에서 쥐 척추 측측 HX를 생산하는 단계별 절차를 설명하는 것입니다. 그런 다음 일방적인 SCI에 대한 비대칭 신경 성능에 대한 간단하고 민감한 평가를 제공하는 HX(CBS-HX)에 대한 결합된 동작 척도를 설명합니다. 0부터 18까지의 CBS-HX는 일방적인 뒷다리 스테핑(UHS), 커플링, 접촉 배치 및 그리드 워킹을 포함하는 4개의 개별 평가로 구성됩니다. CBS-HX의 경우, 동측 및 반대 측 뒷다리는 별도로 평가됩니다. 우리는 T9 HX 후에, 동측 뒷다리가 손상된 행동 기능을 보인 반면, 반대측 뒷다리는 상당한 회복을 보였다는 것을 것을을 발견했습니다. CBS-HX효과적으로 동측 및 반대 측 뒷다리 사이의 행동 기능을 차별하고 동측 뒷다리의 회복의 시간적 진행을 감지. CBS-HX 부품은 필요할 때 별도로 또는 다른 측정값과 함께 분석할 수 있습니다. 우리는 흉부 HX의 외과 적 절차 및 행동 평가의 시각적 설명을 제공하지만, 원칙은 다른 불완전한 SI및 부상의 다른 수준에 적용 될 수있다.
Introduction
불완전한 척수 상해 (SCI)는 수시로 감각 운동 기능의 가혹하고 지속적인 손상으로 이끌어 내고 임상으로 SCI1의가장 빈번한 모형입니다. 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군은 상해와 같은 (또는 ipsilesional) 측에 마비 그리고 proprioception의 손실 귀착되는 척수의 반에 병변에 기인하고, 반대에 있는2고통 및 온도 감각의 손실2,3,,4. 척추 측위 동물 모델은 인간 브라운-세쿼드 증후군을 모방하기 위해 광범위하게 사용되며, 다양한 척추 수준에서 다양한,실험실에서 쥐5,,6,7,78,,9,opossums10,및 원숭이7,11,,12,,13에서 보고되었다., 그러나, 표준 측면 반구를 생성하기 위한 상세한 가시화 절차는 기술되지 않았습니다. 측면 위면에 대한 단계별 절차를 제공하는 것은 모델을 최적화하고 기본 및 번역 연구에서 실험 결과의 비교 또는 복제를 용이하게해야합니다.
일방적인 SCI는 대칭 상해에 대한 기존의 평가를 사용하여 측정하기 어려운 비대칭 및 불균형 행동 적자를 생성합니다. 일방적인 SCI에 대한 신경학적 장애를 평가하기 위한 적절한 방법론은 일방적인 SCI 모델을 개발하는 데 필수적인 요소입니다. 일방적 인 척추 부상의 중추적 인 역할에도 불구하고, 그러한 부상을 입은 동물의 감각 운동 적자를 평가하기위한 표준화 된 프로토콜은 부족합니다. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 운동 등급 척도는 전체적으로 운동의 반정적 설명을 산출하는 성인 쥐 14에 대한 SCI 후 기능의 가장 자주 사용되는 측정되었습니다. 그러나 각 뒷다리를 독립적으로 측정하지는 않습니다.
이 연구에서는, 우리는 9th 흉부 (T9) 척추 수준에서 설치류 척추 HX를 생성하기 위한 단계별 절차를 보고합니다. 또한 일방적인 SCI 후 신경 장애 및 회복을 평가하기 위한 일방적인 뒷다리 스테핑(UHS), 커플링, 배치 접촉 및 그리드 걷기 평가를 포함하는 반구(CBS-HX)에 대한 결합된 행동 척도를 소개합니다. 우리는 이 모형이 일방적인 SI를 위한 상해 기계장치 그리고 치료 효율성을 검토를 위한 유용한 모형이 되기를 바랍니다.
Protocol
모든 외과 및 동물 취급 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (국가 연구 위원회)와 인디애나 대학 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 승인된 대로 수행되었습니다. 위원회.
1. 일반적인 고려 사항
- 이 연구를 위해 성인 여성 스프라그-Dawley(SD) 쥐(무게 200 g, n=12)를 사용하십시오. 모든 테스트 환경에 동물을 습관화하고 수술 수술 1 주일 전에 모든 행동 테스트에 대한 기준 데이터를 수집합니다.
- 실험 그룹에 눈이 멀었던 두 관찰자에 의한 행동 평가를 수행합니다.
2. 동물 준비
- 70% 에탄올로 수술 테이블을 청소하십시오. 수술 테이블에 예열된 가열 패드를 놓습니다. 멸균 수술 용 커튼으로 수술 부위를 덮습니다. 멸균 거즈, 면봉 및 오토클레이브 수술 도구를 수술 용 커튼 표면에 놓습니다.
- 수술 도구의 수술 간 살균을 위해 미생물 멸균기를 켭니다.
참고: 이 실험에 사용된 도구의 예는 그림 1에나와 있습니다. - 쥐를 복강 내 (즉) 케타민 (87.7 mg /kg)과 자일라진 (12.3 mg / kg)의 주사로 마취시다. 발가락 핀치 자극에 대한 반응없이 마취의 적절한 평면에 도달해야합니다. 수술 중 각막 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 적용하십시오.
- 면도에 의해 흉부 척추를 덮는 머리카락을제거합니다 (그림 2A). HEPA 필터가 장착된 진공 으로 면도 된 모피를 제거하십시오.
- 요오드 기반 스크럽과 에탄올을 번갈아 가며 세 번 갈아치로 수술 부위를 청소하십시오.
- 제안된 절개 부위에 경향을 가진 멸균 드레이프로 동물을 덮습니다(그림2B). 참고; 비디오에서, 수술 드레이프는 데모 목적으로 생략되었습니다.
3. 척추 척수 절제술
- 쥐에서 가장 낮은 갈비뼈인13번째 갈비뼈와 흉골에 연결되지 않는 부동 갈비뼈를 터치합니다. T13 척추와의 연결을 식별한 다음 계산하여 T10 척추를 식별하기 위해13번째 갈비뼈를 따라가십시오.
- 메스 블레이드 (#15, 도 1)를사용하여 8-11번째 척추 척추 과정을 오버레이하는 뒷면에 3 - 4cm 미드 라인 피부 절개를 수행합니다.
- 외과 현미경으로, 무딘 해부하고 동일한 메스 블레이드를 사용하여 양쪽에 T9와 T10 척추의 측면을 향해 척추 과정에서 측면으로 패척추 근육을 분리.
참고 :이 방법은 출혈을 일으키지 않고 조직을 멋지게 애타게합니다. - 수정된 안정화 홀더를 사용하여 척추를 안정시다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 노출된 가로 공정 면 아래에 스테인리스 스틸 팔을 밀어 내고 나사를 조여 안정성을 확보합니다.
- 리트랙터를 사용하여 수술 부위로부터 근육을후퇴시키고(도 2B)T8-11 척추 라미나 및 가시 적미및 가시 적미를 노출한다(도2C).
참고 : T9(그림 2C, 등쪽보기)를 식별하기위한 랜드 마크 인 T8및 T9 가시 공정 사이에는 큰 차이가 있습니다. 측면도에서, T9 척추의 가소성 공정은 꼬도게, T10 가소공정은 등쪽을 가리키고, T11 가소공정은 장밋빛으로 포인트; 따라서, 3개의 가소공정은 피라미드를 형성하고 T10 가소공정은 피크를 형성한다(도2D,횡측도). - Rongeur를 사용하여 T9 척추에 등쪽 하부 절제술을 수행합니다. T9 가중 공정을 잘라 내고 중간선(도3A,파선)에 좌측으로 좌측층의 작은 부분을 제거하고, 라미나의 전체 오른쪽 부분을 가능한 한 측면으로 제거한다(그림3A,파선). laminectomy를 위해, lamina의 밑에 부드럽게 rongeur를 삽입하고 laminectomy의 원하는 지역이 완료될 때까지 한 번에 작은 뼈 조각을 잘라냅니다(그림 3B 및 그림 3C).
- 외과 현미경으로 척수의 등쪽 중간선을 식별합니다(그림 3C). 바늘 (30G)을 수직으로 삽입하여 중간선을 통해 척수에 경정맥을 오른쪽으로 향하게합니다(그림 4A).
참고 : 바늘은 척추 운하의 복부 벽에 도달하기 위해 전체 척수를 관통해야합니다. - 멸균 젤폼의 작은 조각으로 출혈을 중지합니다.
- 미드 라인 바늘 트랙을 통해 iridectomy / 미세 수술 가위의 한 팁을 삽입하고 오른쪽 헤미 코드의 측면 표면을 따라 다른 팁을 삽입 한 다음 가위로 오른쪽 헤미 코드에 완전한 절단을합니다(그림 4B).
참고: 절단 중에 척수에 대한 압축 병변을 최소화하기 위해 척수 절단에 날카로운 마이크로 가위를 사용하십시오. - 칼과 같은 바늘의 측면 가장자리를 사용하여 병변 간격을 잘라 완전한 오른쪽 하구를 확인합니다. 수술 현미경으로 척추 운하의 바닥을 시각화하여 오른쪽 반단의 완전성을 확인(도 4C,단면도; 도 4D,측면 도면; 그림 4E,등쪽 보기).
- 병변 부위 위에 젤라틴 스폰지의 작은 조각을 놓습니다(그림 4F). 시멘트 혼합물을 사용하고 T8 및 T10의 스폰지 및 가시 공정 위에 좁은 다리를 구축하십시오(그림 4G, H).
참고 : 시멘트 다리를 사용하는 목적은 두 배입니다 : 1) 손상 부위에서 개발 된 흉터를 조직의 나머지 부분과 분리하고 2) 동물 희생 후 척수 세그먼트를 쉽게 해부 할 수 있습니다. - 4-0 실크 실로 근육과 피부 층을 따로 봉합하십시오.
- 수분을 유지하기 위해 피하적으로 0.9% 멸균 식염수를 주입하십시오. 진통 제 Buprenorphine 주입 (0.05-2.0 mg/kg S) 8-12 시간/일 피하 2 일 동안. 첫 주에는 매일 2-3회, 다음 주에는 1-2회, 자발적인 방광 무효화가 돌아올 때까지 누르십시오.
4. 수술 후 동물 관리
- 동물을 단독 주택 케이지로 되돌려 놓습니다. 케이지 바닥에 촉촉한 설치류 차우 또는 젤을 제공하여 동물이 먹고 수분을 공급하는 데 도움을 줍니다. 수술 후 회복 중에 케이지 아래에 가열 패드를 놓습니다. 과열을 방지하기 위해 가열 패드가 케이지 바닥의 절반만 덮는지 확인하십시오.
- 수분을 유지하기 위해 피하적으로 0.9% 멸균 식염수를 주입하십시오. 진통 제 Buprenorphine 주입 (0.05-2.0 mg/kg S) 8-12 시간/일 피하 2 일 동안. 첫 주에는 매일 2-3회, 다음 주에는 1-2회, 자발적인 방광 무효화가 돌아올 때까지 누르십시오.
5. 일방적 인 심단 스테핑 평가 (UHS)
참고 : 일방적 인 반면 스테핑 (UHS) 테스트는 SCI 동물이 열린 필드에서 자신의 ipsilesional 뒷다리를 활용하는 능력의 직접적인 측정이다. 1.1에서 언급했듯이, 동물들은 7일 동안 하루에 두 번 15개의 개방된 필드 환경(직경 42 인치)에 적응시켰다. 동물 군에 눈을 멀게 한 두 관찰자가 테스트를 수행합니다. UHS 점수는 베이스라인(T9 HX 7일 전)과 부상 후 의 시점이 모두 수집됩니다. 평가 단계는 다음과 같이 설명됩니다.
- 동물을 탁 트인 필드 환경에 놓고 동물의 운동을 4분 동안 검사합니다.
참고: 테스트 중에 동물이 활발하게 움직이도록 격려할 수 있습니다. - 표 1에제공된 양식을 사용하여 각 동작 범주에 대해 예 에 대해 1, 아니요에 0값을 지정한 다음 총 값을 합산하여 최종 UHS 점수를 0에서 8로 지정합니다.
참고 : 표 1 0에 따르면 : 뒷다리의 관찰 가능한 움직임이 없습니다. 1 – 4: 고립 된 움직임 3 뒷다리 관절 (엉덩이, 무릎, 발목); 5 : 무게 지원없이 청소; 6 : 무게 지지대없이 배치; 7: 무게 지원으로 배치; 및 8 : 체중 지원스테핑. - 베이스라인(T9 HX 7일 전)과 부상 후 시간 모두에서 UHS 점수를 수집합니다.
참고: T9 HX 이후 다양한 시점에서 점수가 평가됩니다.
6. 커플링
- 좁은 활주로 장치 또는 간단한 오픈 필드에서 걷는 동물을 녹화하는 비디오로 CPL (걸음걸이 커플링)을 분석합니다.
- 표 1의커플링 섹션에서는 "아니요"에 0, "불규칙/서투른"에 대해 1, 각 CPL 범주에 대해 "보통"에 대해 2의 점수를 할당합니다.
참고: 커플링(CPL) 테스트는 상동 CPL(전방 전면/후방 사지, 그림 5A),대각선 CPL(전방 좌우 또는 전방 우측 후방 좌측 사지, 도 5B)및 상측 CPL(동일한 면의 전방 후방 사지) 및 동측 CPL(도 5C)을포함한 사지의 교대 이동의 조정을 평가하는 것이다. T9 HX에 이어, ipsilesional 측의 뒷다리의 적자는 상동 CPL(도5D),대각선 CPL(도5E)및 상종 CPL(그림5F)의교대로 초래되는 가시화된다.
7. 접촉 배치
참고: 뒷다리 접촉 배치 시험은 proprioceptive 자극 (16)에대한 뒷다리 반응의 모터 통합을 평가하는 데 사용됩니다. 동물이 뒷다리를 표면 아래로 당긴 후 표면에 뒷다리로 올라가면 프로피오셉션은 그대로 유지되는 것으로 간주됩니다.
- 두 뒷다리가 배치 응답에 사용할 수 있도록 동물을 수직 위치에 잡습니다.
- 뒷다리의 등쪽 표면을 표면 가장자리(예: 동물 작업 벤치)를 향해 가볍게 앞으로 브러시합니다.
- 표면에 발 배치를 관찰하고 점수를 배치 뒷다리 접촉을 할당합니다. 0 : 배치 없음; 1: 배치.
참고: 등쪽 표면은 자극을 받고 발은 이후에 확장되어 반사가 손상되지 않은 경우 발을 표면에 놓습니다. 평가 양식은 표 1에도있습니다.
8. 그리드 걷기
참고: 그리드 보행 테스트는 정확한 스테핑, 조정 및 정확한 발 배치와 관련된 자발적인 운동 적자 및 사지 움직임을 평가합니다.
- 높은 플라스틱 코팅 와이어 메쉬 그리드 (36 × 38cm 3cm2 개구부)에 쥐를 놓고 30 단계 동안 플랫폼을 가로 질러 자유롭게 걸을 수 있습니다.
- 각 팔다리의 총 발자국 수와 발자국 수 수를 계산합니다. 비디오 녹화는 카운트를 확인하기 위해 만들어집니다.
참고: 눈을 멀게 한 두 관찰자는 동물이 걸을 때 앞다리와 뒷다리의 발 위치를 평가합니다. - 다음과 같이 각 뒷다리에 대한 그리드 걷기 점수를 할당 – 0: 15보다 큰 실수; 1: 15 이하또는 이에 해당하는 실수; 2: 10 이하또는 그 이하의 실수; 3: 5 이하 또는 그 이하의 실수.
참고: 점수 평가는 표 1을기반으로 합니다. 컷오프 점수는 모터 적자의 심각도 측정값으로 사용됩니다.
9. 관류 및 조직 처리
- 2.3단계에서 유사한 적절한 마취 후, 수화관류 프로토콜(17)을따라 동물을 조심스럽게 관류한다.
- 척수 샘플을 해부하고 수집하고 밤새 4 % PFA에서 사후 수정하십시오.
- 샘플은 30 % 자당 용액으로 옮길 수 있습니다.
- 횡단면에서 척수를 자르고 표준 절차18에따라 축색 마커 SMI-31 및 성상 세포 마커 신경교 섬유 성 단백질 (GFAP)으로 선택된 부분을 얼룩지게합니다.
Representative Results
위에서 설명한 외과 적 절차는 T9에서 일관되고 재현 가능한 측면 HX의 생산을 허용합니다. 관류 및 피부 제거 후, T9에서의 수술 부위는 잔류 봉합사에 의해 용이하게 식별될 수있었다(도 6A). 추가해면 시멘트브릿지(도6B)및 젤라틴스폰지(도 6C)를층으로 노출시킬 수 있다. 척수는 열린 척추 운하에 노출된 후 오른쪽의 측면 위편이 확인됩니다(그림4D). 부상의 수준은 노출 된 척추 몸과 갈비뼈와의 연관성에 의해 추가로 확인 될 수 있습니다(그림 6D). 상해 진원지에서 단면의 면역 형광 염색은 오른쪽 반장의 완전한 손실과 부상에 대한 왼쪽 반동 반대의 보존을 보여줍니다. 축색 마커 SMI-31 및 성상 세포 마커 신경교 섬유성 단백질(GFAP)으로 염색된섹션(도 6E).
신경 행동적으로, CBS-HX 시스템은 T9 HX에 따라 시간이 지남에 따라 비대칭 적자를 검출 할 수있다. HX 후, 동측 뒷다리는 걸을 수있는 능력을 잃은 반면, 반대 측 뒷다리는 걸을 수있는 능력을 유지했다. 각 행동 측정에 대해 3번의 시험을 수행하고 정량화 및 분석을 위해 3번의 시험의 평균을 사용했습니다. 우리는 우리가 다른 쥐를 사용하는 것과 비교하여 가장 정확한 통제로 고려하는 기준선으로 수술 전 측정을 이용했습니다. 4개의 개별 측정값, 즉 UHS, CPL, 접촉 배치 및 그리드 보행의 점수는 별도로 분석될 수있다(도 7A-D)또는 이들은 복합 CBS-HX(도7E)로결합될 수 있다. 양방향 ANOVA 분석은 UHS(F = 23.199, p< 0.001), 커플링(F = 8.376, p < 0.01), 접촉 배치 (F = 17.672, p & 0.001), 그리드 워킹 (F = 19.261, p < 0.001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0.001) 사이. 그림 7A는 T9 HX 후 UHS의 결과를 나타낸다. 첫 3일 동안 부상 후, 쥐는 발걸음능력을 상실하고, 입실성 뒷다리에 대해 0-2의 점수를 받았다. 단계와 같은 움직임은 대부분의 단계가 등쪽 단계인 부상 후 7-10 일 에서 ipsilesional 측에 나타나기 시작했습니다. T9 HX 후 28 일까지, 쥐는 8의 할당 된 UHS 점수와 거의 정상적인 조정과 발바닥 단계를 취할 수 있습니다. 비교로, 반대로 뒷다리는 덜 중단되었고 UHS 점수는 T9 HX 후 처음 5 일 이내에 떨어졌고 부상 후 10 일 후에 기준선 수준으로 돌아왔습니다. 총 CPL(동종, 상동 및 대각선 커플링 포함) 시험의 경우, T9 HX 후 조정의 안정성 및 적응성이 모두 현저하게 감소하였다(도7B). 부상 후 1-5 일, HX 동물은 CPL의 흔적을 보여주지 않았다. 시간이 지남에 따라, 입측 뒷다리의 CPL은 종종 서투른, 불안정, 그리고 부적절하게 자신의 속도, 힘, 방향에 변화나타났다. 접촉 배치(도 7C)및 격자 보행(그림 7D)입측 뒷다리의 특히 부상 후 처음 5 일 이내에 T9 HX에 의해 영향을 받았으며, 일반적으로 동물이 발바닥 단계를 취하기 시작했을 때 회복되었습니다. 복합 CBS-HX 시스템은 최대 18점(도7E)에대한 UHS, CPL, 접점 배치 및 그리드 보행 테스트를 포함한다. 동측 뒷다리의 운동 기능은 인간 브라운-세커드 증후군에서 볼 수 있는 적자와 일치하는 T9 측면 HX 후 CBS-HX 점수의 감소를 입증했습니다. 동측 뒷다리의 운동 기능은 T9 측측 HX 후 1일에서 4주까지의 CBS-HX 점수의 감소를 횡측 뒷다리와 비교하여 입증하였다(도7E).
따라서, UHS, CPL, 접촉 배치 및 그리드 워킹을 결합한 복합 CBS-HX 시스템은 흉척척의 측면 손상 후 랫트의 행동 기능을 최대 18의 가능한 점수로 평가하는데 사용될 수 있다.
그림 1. T9 우측 지장을 생산하는 데 사용되는 수술 도구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 외과 전posure. A) 수술 부위를 덮은 뒷면의 모발을 면도합니다. B) 리트랙터를 사용하여 수술 부위에서 근육을 후퇴시. C) T8-11 척추 라미나에 노출하고 개별 가시 공정 (화살표)을 정의합니다. T9식별의 랜드마크인 T8과 T9 스핀공정 사이에는 큰 차이가 있습니다. D) 회로도 도면은 가시 공정의 측면 뷰를 보여줍니다. T9-11 가소 공정은 T10 가소 공정이 피크인 피라미드를 형성합니다. 다시 말하지만, T8과 T9 가시 과정 사이의 큰 격차는 라미네절제술이 수행되는 T9를 식별하기위한 랜드 마크로 명확하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. Laminectomy 및 오른쪽 반두개의 노출. A) 도면은 T9 척추 내척척의 단면을 나타낸다. 파선은 양쪽의 라민 절제술의 정도를 나타냅니다. B) 회로도 도면은 왼쪽에 있는 라미나 및 오른쪽의 전체 척추 아치의 작은 부분을 제거하는 것을 보여줍니다. 화살표는 코드의 등쪽 중간선을 나타냅니다. C) 노출 된 척수의 등도보기. 등쪽 정맥은 왼쪽과 오른쪽 반경을 나누는 척수 의 중간에 위치했다. 오른쪽 반혈이 완전히 노출되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 측면 반구. A-D) 회로도 도면은 척수 (A), T9 지근 (B), 젤라틴 스폰지 및 시멘트 (C)의 덮개, 및 T9 측측의 측면 도면 (D)에 중간 선 바늘 삽입을 보여줍니다. C의 파선은 제거된 T9 척추 라미나 및 오른쪽 반경을 윤곽을 그었다. E) 오른쪽 척수 의 등도보기. F) 반면 부위에 젤라틴 스폰지의 작은 조각의 배치. G-H) 스폰지와 T8과 T10의 가시 공정 위에 지어진 심플렉스-P 시멘트 브리지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 커플링(CPL) 테스트의 개략도면. test. CPL 시험은 A) 상동 CPL(전방/후방-후방 사지), B) 대각선 CPL(전방 후방 우측/전방 후방 좌우 좌측 사지), C) 동측 CPL(같은 쪽에 있는 전방 후방 사지)을 포함한 사지의 교대 움직임의 조정을 평가하는 것이다. T9 HX(빨간색 상자, D-F) 후, 뒷다리 적자가 ipsilesional 측에서 보이게 되었고 동물들은 호모로그(D), 대각선(E), 및 상종(F) CPL에서 조정이 부족한 것으로 나타났습니다. (E),
그림 6. 조직 해부 및 조직학. 관류 후, 조직은 척수를 노출하기 위해 해부되었다. 단면은 신경교 섬유성 산성 단백질 (GFAP, 성상 세포에 대한 마커) 및 SMI31 (축산에 대한 마커)의 이중 면역 형광 염색을 위해 처리되었다. A) 부상 부위의 랜드마크로서 봉합사의 노출(노란색 화살표). B) 치과 시멘트 (노란색 화살표)의 노출. C) 젤라틴 스폰지 (노란색 화살표)의 노출. D) 오른쪽의 척추 절제술(노란색 화살표)을 식별합니다. E) GFAP (녹색) 및 SMI 31 (빨간색)으로 면역 된 부상 진원지에서 척수 단면. 오른쪽 척추 반척이 완전히 절단되었고 왼쪽 반척이 잘 보존되었다는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 신경 행동 점수의 결과. 그래프는 5가지 척도의 점수를 보여 준다: A,일방적 인 심미섹션 점수(UHS); B,커플링(CPL); C,접촉 배치; D,그리드 워킹, 및 E,T9 HX 후 입시측및 반대측 뒷다리에 결합된 행동 점수(CBS). 데이터는 평균 ±s.e.m. *: p< 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001(양방향 ANOVA, Tukey의 다중 비교 테스트, n = 12개의 쥐/그룹)을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 하위 점수 이름/범위 | 설명 | 평점 | |
| 일방적 인 뒷다리 스테핑 | 관찰 가능한 약간의 뒷다리 움직임 | 아니요 | 0 |
| (UHS) | 예 | 1 | |
| (0-8) | 발목의 움직임 | 아니요 | 0 |
| 예 | 1 | ||
| 무릎의 움직임 | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 엉덩이의 움직임 | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 스위핑(중량 지원 없음) | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 배치(중량 지지 없음) | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 배치(중량 지지체 사용) | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 스테핑 | 아니요 | 0 | |
| 예 | 1 | ||
| 커플링 | 호모 라터럴 | 아니요 | 0 |
| (0-6) | 불규칙/서투른 | 1 | |
| 정상적인 | 2 | ||
| 동종 | 아니요 | 0 | |
| 불규칙/서투른 | 1 | ||
| 정상적인 | 2 | ||
| 대각선 | 아니요 | 0 | |
| 불규칙/서투른 | 1 | ||
| 정상적인 | 2 | ||
| 접지 배치 | 아니요 | 0 | |
| (0-1) | 예 | 1 | |
| 그리드 걷기 | 미스 스텝 | >15 | 0 |
| (0-3) | ≤15 | 1 | |
| ≤10 | 2 | ||
| ≤5 | 3 | ||
| 총 CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
표 1: 반구(CBS-HX)의 복합 행동 점수
Discussion
이 연구에서는, 우리는 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군을 모방하는 성인 쥐에 있는 간단하고, 일관되고, 재현가능한 T9 척추 HX를 생성하기 위한 단계별 절차를 보고합니다. 우리는 또한 일방적 인 뒷다리 스테핑 (UHS), 커플링 (CPL)의 조합으로 측정 된 비대칭 신경 장애 및 회복 진행을 평가하는 데 민감한 hemisection (CBS-HX)에 대한 결합 된 행동 점수 시스템을 도입합니다. 접촉을 배치하고 그리드 걷기. 우리는 T9 수준에서 상해를 보여주더라도, 이 절차는 간단하고 까다로운 방법으로 자궁 경관과 요추를 포함하여 척수의 그밖 지구에 적용될 수 있습니다. 우리는 이 모형이 일방적인 행동 평가와 더불어, SCI의 그 같은 모형을 위한 상해 기계장치 및 치료 효율성을 검토하기 를 위해 유용할 것이라는 점을 희망합니다.
측면 HX 모델은 코드의 동측 절반만 병변하기 때문에 코드의 반대쪽면이 크게 보존되어 내부 제어로 사용할 수 있습니다. 많은 하강 및 오름차순 경로는 일방적으로 투영되고 많은 상황에서 측면 위misection은 한쪽에 축삭 에 손상을 생성하고 반대편에 같은 지역을 보존, 재구성및 비교를 허용 같은 동물에서 이러한 지역의 기능적 결과. 또한, 보다 국소화된 병변을 생산하는 것은 특정 경로의 표적화를 허용할 수 있다. 예를 들면, 복부 및 심방 병변은 망상 척추 및 현관 병에 영향을 미칠 수 있습니다. 등측 또는 등측 병변은 코르티코피종 및 루브로스피날 경로에 영향을 줄 수 있습니다. 위면 또는 부분 상해 모형은 또한 propriospinal, noradrenergic 또는 세로토닌성 통로와 같은 그밖 통로의 해부학 그리고 기능을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 따라서, 지부장 모델은 감각 구심질, 내림차순 통로 및 본질적인 척추 회로에 의한 보상을 연구하기 위해 유일하게 사용될 수 있습니다. 이 모델은 HX 후 운동 회수 메커니즘을 조사하는 데도 적합합니다.
측면 HX는 자동 걸음걸이 분석 19에대한 모터 작업(예: 트레드스캔 또는 러닝머신) 패러다임하에서 평가가능한 명백한 행동 장애로 이어집니다. 또한, 병변에 대한 반대측의 축삭 전도도는 전기생리학적 기록을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 평가는 다양한 치료에 따른 기능적 재구성을 확립할 수 있는 가능성을 제공한다. 더욱이, 특정 통로의 뉴런에 해부학 적 추적자의 일방적 인 주사는 역행 라벨 뉴런20,,21,,22,,23,,24,,25와의 전방 표지 된 중간선 교차 섬유의 시각화를 허용한다.
일반적인 척추 HX 수술은 완료하는 데 20 분 미만이 걸리지만 정확하고 일관된 HX를 달성하기 위해서는 몇 가지 연습이 필요합니다. 첫째, 척추 HX 수준이 동물에서 동물로 일관되는 것이 중요합니다. 따라서, laminectomy를 위한 적당한 척추 세그먼트가 확인되는 것이 중요합니다. 둘째, HX가 완료되었는지 확인합니다. 완전한 HX를 만들기 위해 미드라인을 통해 수직으로 삽입된 30게이지 바늘을 사용하여 마이크로사이저를 사용하여 절단을 안내할 수 있습니다. 바늘 삽입은 또한 병변을 통해 후방 척추 혈관 또는 코드에 손상을 방지합니다. 30 게이지 바늘의 두 번째 기능은 병변의 모호성이 없는지 확인하기 위해 절단을 추적하는 칼역할을 할 수 있다는 것입니다. 셋째, 병변 부위에 젤라틴을 배치하면 뇌척수액 누출을 최소화할 수 있으며, 젤라틴 위에 시멘트를 놓고 척추 라미를 연결하면 병변 부위에서 척추 척추의 안정성을 강화하고 상처 치유를 용이하게 할 수 있습니다. 전기 생리학적 기록, 근육, 근막 및 피부의 응용 프로그램과 신호 간섭을 방지하기 위해 4-0 실크 스레드와 층으로 봉합되어야한다. 마지막으로, 반대 척수의 손상을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울여야합니다. 조직학적 검증은 한쪽에 완전한 측면 반구를 확인하고 다른 쪽에 있는 코드의 나머지 절반을 보존하기 위해 확립되어야 합니다(그림 6E와같이).
SCI 후 운동을 개선하기 위해, 이전 연구는 세포 이식, 축세포 재생 8,,18,,26,,27,및 활동 기반 재활 28,29,,30을포함한 다양한 전략을 활용했다., 한편, 기능 적 평가를 위해 그리고 SCI 다음 최고의 치료를 위해 선별하기 위해 여러 가지 행동 테스트가 확립되었습니다. BBB 운동 등급 척도는 양측 뒷다리에 영향을 미치는 중간 선 타박상 또는 transection 부상과 같은 척추 대칭 부상의 운동 평가를 위해 설계되었습니다 14,,31. 조정 및 발가락 클리어런스와 같은 BBB의 특정 매개변수는 두 뒷다리를 관찰하여 기록됩니다. 한 뒷다리가 손상되지 않고 다른 하나는 비대칭 부상에서 볼 수있는 적자를 보여줍니다 경우, 그대로 뒷다리는 영향을받는 뒷다리의 점수를 혼동합니다. BBB 점수는 일방적 인 부상 후 다른 하나의 뒷다리 점수를 수용하지 않기 때문에, 그것은 일방적 인 척수 부상을 평가하기에 적합하지 않습니다. 그러나, 각 측의 관절 운동과 체중 지지체가 별도로 평가되고 BBB의 일부로 계산되지 않으면 손상되지 않은 뒷다리 (가짜 대조군과 유사)는 영향을받는 뒷다리의 점수를 혼동하지 않습니다. 또한, 그대로 측면은 동물의 전체 점수를 편향하지 않습니다, 그대로 뒷다리는 관절 운동에 극적인 적자를 가지고 있지 않기 때문에, 체중 지원, 또는 스테핑.
반면에 대한 결합 된 행동 점수는 측측 의 쥐 모델에서 행동 회복에 민감하고 쉽게 수행 된 평가되도록 설계되었습니다. 그것은 복구의 초기 및 후반 단계 의 동작을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 초기 단계는 부상 후 7-10 일 이내에 있습니다. 처음 3-5 일 후 HX에서, 원소 뒷다리 활동은 꾸준히 증가하고 자발적 또는 치료 매개 뒷다리 운동 회복을 기록하기 위해 더 자주 평가되어야한다. HX 후 5-7 일, 쥐는 체중 지원없이 전면적인 뒷다리 운동을하기 시작했다. 7-10 일까지, 쥐는 전형적으로 서서 단계하기 시작했습니다. 이 단계에서는 스테핑 패턴에 주의를 기울여야 합니다. 후반 단계 (14-28 일)에서, 원소 뒷다리 활동은 안정적이고 정상에 가까웠다.
또한 CPL(커플링) 용량에 세심한 주의를 기울여야 합니다. CPL 테스트(걸음걸이 커플링)는 비디오(예: 트레드스캔/캣워크) 또는 오픈 필드 테스트 중에 촬영 비디오로 수행할 수 있습니다. 두 번째 옵션은 연구원이 걸음걸이 분석 시스템에 액세스할 수 없는 경우 유연성을 제공합니다. 두 비디오 녹화 세션 모두 이 테스트에는 각 발에 대해 최소 2번의 연속 터치다운이 필요합니다. 분석을 위해 상동, 상동 및 대각선 커플링(6.2단계)의 세 가지 커플링 매개변수가 있습니다. 각 커플링은 참조 발과 주어진 발을 포함한다. 상동 커플링 (정면 왼쪽 앞 오른쪽, 또는 뒷뒤 왼쪽 뒤 오른쪽)을 가지고, 그것은 참조 발의 하나의 전체 보폭 시간으로 나누어 주어진 발의 첫 번째 터치 다운 시간입니다. 왼쪽 과 오른쪽 발은 위상을 벗어나야하기 때문에 완벽한 결합은 0.5여야합니다. 이것은 동측 커플링 (왼쪽 앞뒤 뒷뒤 또는 오른쪽 앞뒤 뒷뒤)에서 동일한 경우입니다. 그러나 대각선 커플링(왼쪽 앞뒤-오른쪽 뒷뒤 또는 오른쪽 앞뒤 뒷다리)의 경우 두 발이 위상에 있어야 하므로 완벽한 커플링은 0 또는 1이어야 합니다. 6.4단계에서는 각 CPL에 대해 점수를 0에서 2로 할당합니다. 세부 사항에서, 점수 0은 주어진 발이 터치 다운을 완료하기 위해 이동할 수 없음을 나타내야하며, 따라서 CPL이 없습니다. 점수 1은 주어진 발이 터치다운을 완료하지만 완벽한 커플링이 아니기 때문에 불규칙하거나 서투른 CPL을 나타냅니다. 점수 2는 0.5의 완벽한 커플링을 의미합니다. 세 개의 커플링 파라미터 개념은 이전 간행물32,,33에잘 설명되어 있다. CPL은 접촉 배치 및 그리드 보행의 평가와 결합될 수 있다. 결합된 동작 스코어링 시스템의 개별 성분은 SCI의 상이한 래트 모델에서 다소 효과적일 것이다. CPL의 경우, 적자는 교대속도와 시퀀스의 완전성에서 명백하게 드러났다. 적자를 배치하는 proprioceptive 뒷다리는 명확하게 일방적 인 HX 후 공개 될 수있다. 우리의 연구에서, 모든 쥐는 반대 측 뒷다리 배치가 적자를 보여주지 않는 동안 적자를 배치 ipsilesional 뒷다리를 보여 주었다. 코르티코척추관을 수반하는 접촉 배치가 회복되기 시작할 때 그리드 보행 테스트를 고려해야합니다. 가능한 피로 문제를 배제하기 위해 각 테스트에서 행동 테스트 의 순서를 무작위로 할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군을 모방하는 T9 척추 HX의 생체 내 쥐 모형을 창조하기 위하여 단계별 절차를 보고합니다. 반구에 대한 결합 된 행동 점수 시스템은 일방적 인 SCI 후 부상 메커니즘과 치료를 평가하기위한 개별 뒷다리 행동 결과의 보다 차별적인 측정을 제공합니다. 우리는 흉부 HX의 외과 적 절차 및 행동 평가의 시각적 설명을 제공하지만, 여기에 설명 된 방법은 다른 부상 수준에서 다른 불완전한 SI에 적용 될 수있다.
Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
제프리 레키아-리무트 회장님의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 2016ZD03 및 2014ZX01 (XJL 및 TBZ)의 진안 군립 지역 원장 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Xu 실험실의 연구는 NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 및 메리트 리뷰 어워드 I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687에 의해 미국 재향 군인 사무국의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
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